Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / O Aspergillus fumigatus é o principal agente etiológico da aspergilose invasiva, uma infecção fúngica oportunista que acomete, principalmente, pacientes de Unidades Hematológicas, como aqueles com neutropenia profunda e prolongada. Após a filamentação este fungo angioinvasivo é capaz de ativar e causar danos em células endoteliais de veia umbilical humana (HUVEC) que passam a expressar um fenótipo pró-trombótico. A ativação destas células, dependente de contato célulacélula, é mediada por TNF-α e caracterizada pela expressão de moléculas próinflamatórias, como citocinas, quimiocinas e moléculas de adesão. Recentemente, nosso grupo comparou a ativação endotelial de HUVECs desafiadas com cepas selvagens e uma cepa mutante para o gene UGM1. Nestes experimentos a cepa mutante Δugm1, que apresenta um fenótipo de maior produção de galactosaminogalactana (GAG) na parede celular, mostrou um fenótipo hiperadesivo e uma capacidade maior de ativar células endoteliais. Entretanto, os receptores e as vias de sinalização envolvidos nesta ativação permanecem desconhecidos. Assim, o objetivo deste trabalho foi verificar as proteínas envolvidas nestes processos através do estudo das proteínas diferencialmente expressas nas HUVECs após a interação com A. fumigatus, usando a técnica proteômica 2D-DIGE. Brevemente, as HUVECs foram infectadas com tubos germinativos da cepa selvagem (AF293) e da cepa Δugm1 de A. fumigatus. Em seguida, as proteínas foram marcadas com diferentes fluorocromos e separadas por eletroforese bidimensional. A análise quantitativa foi realizada utilizando o software DeCyder. Foram identificadas por MS/MS cinco proteínas diferencialmente expressas, incluindo a galectina-1 e a anexina A2, ambas mais expressas após a interação, sendo a primeira ~25% mais expressa após a interação com a mutante Δugm1. Este trabalho propõe que a galectina-1 poderia ser o receptor endotelial para polímeros de galactose presentes na parede celular do A. fumigatus, e que a Anexina A2 poderia estar envolvida na sinalização intracelular em resposta a este patógeno. No entanto, experimentos complementares, em curso, são necessários para comprovar esta hipótese. / Aspergillus fumigatus is the main etiological agent of invasive aspergillosis, the main opportunistic fungal infection of Hematologial Unitys patients, especially those with long-term neutropenia. Upon filamentation, this angioinvasive fungus can activate and damage the human umbilical vein endothelial cells (HUVEC), which in response switch to a pro-thrombotic phenotype. HUVEC activation is mediated by TNF-α once cell-cell contact occurs. This activation is characterized by the expression of pro-inflammatory molecules such cytokines, chemokines and adhesion molecules. Recently, our group performed the comparison of HUVEC activation upon interaction with a wild type and the UGM1 mutant strains of A. fumigatus. The Δugm1 strain, which presents an increased production of the cell wall galactosaminogalactan, showed a hyper adherent phenotype and an increased capability to cause endothelial cell stimulation and activation, when compared with the wild type strain. The receptors involved in the pathogen-host interaction or the signaling pathways after endothelial activation by A. fumigatus remain unknown. Thus, the aim of this study was to investigate the differentially expressed proteins in HUVECs upon interaction with A. fumigatus, using the 2D-DIGE proteomic approach. Briefly, HUVECs were challenged with germlings of A. fumigatus wild type Af293 and Δugm1 strains and then submitted to protein extraction. The total HUVEC protein extracts were labeled with different CyDyes and fractionated by 2D electrophoresis. Quantitative analysis to determine the differences in protein abundance amongst interacted cells vs. control endothelial cells was performed using the software DeCyder. Five differentially expressed proteins were identified by MS/MS including galectin-1 and annexin A2, both overexpressed after the interaction. These two proteins are described elsewhere to be associated with host-pathogen interaction. Besides, galectin-1 showed an ~25% increase after interaction with the Δugm1 strain and it is plausible that this particular protein could be a putative receptor for galactose-containing polymers of the A. fumigatus cell wall and annexin A2 could be involved in signalizing pathways upon interaction. However, other experimental evidences, under development, are necessary to confirm this hypothesis.

Orientador: Roberto da Silva / Banca: Crispin Humberto Garcia Cruz / Banca: Aneli de Melo Barbosa / Resumo: O uso de células microbianas imobilizadas para aumentar a produção de metabólitos fúngicos em processos fermentativos tem mostrado altos rendimentos. Nesse trabalho foi avaliado pela primeira vez, a imobilização de células do Botryosphaeria rhodina, um fungo ligninolitico produtor constitutivo de lacases. Três suportes foram avaliados: Fibra Acrílica Fina (FAF); Espuma de Poliuretano Expandido (EPE); Espuma de Poliuretano Fibroso (EPF). O EPF foi o melhor suporte por ter mostrado uma imobilização mais homogenia das células. Um planejamento fatorial foi desenvolvido para otimizar a produção de lacases por células livres, na presença de álcool veratrílico (AV). A análise da superfície de resposta mostrou que 18mM como a melhor concentração de AV para a produção de lacases, usando-se 3 mL de homogeinato de células como inóculo (DOλ400nm 0.4-0.6) para 25 mL de meio de cultura em frascos de 125mL, a 180 rmp, durante 126 horas a 28ºC. O perfil de crescimento do fungo, associado a produção de lacase foram comparados na presença e na ausência de AV, usando-se células livres e células imobilizadas do B. rhodina. A imobilização aumentou aproximadamente 3 vezes a produção de lacases e manteve estável o nível de produção durante 6 reciclos. A imobilização de células do B. rhodina mostrou-se útil uma vez que economizou 72horas para atingir a maior produção de lacase, quando comparada com células livres e também aumentou a tolerância do fungo a concentrações mais altas de AV (500mM) / Abstract: The use of microbial immobilized cells to increase the production of fungal metabolites in fermentation processes has showed higher yields. This work evaluated by the first time, the immobilization of Botryosphaeria rhodina cells, a ligninolytic fungus that produces laccase. Three carriers were evaluated: acrylic fine fiber (FAF), expanded polyurethane foam (EPE), and fiber polyurethane foam (EPF). The EPF was the best carrier because showed a homogeneous immobilization cells. A factorial design was developed in order to optimize the laccase production by free cells in the presence of the laccase inducer veratryl alcohol (VA). The analysis by response surface answer showed 18 mM as the best VA concentration to produce laccase using 3 mL of a cell homogenate (ODλ400nm 0.4-0.6) as inoculum, to 25 mL of culture medium in shaked flasks (125 mL) at 180 rpm, during 126 hours at 28 °C. A growth profile for laccase and fungal biomass production were compared with and without VA using free and immobilized cells of B. rhodina. The cell immobilization increased approximately 3 folds the laccase production and maintained it stable during 6 consecutive recycles. The cell immobilization of B. rhodina showed to be useful once saved 72 hours to achieve the higher laccase production when compared to the one with free cells, and also increased the fungal cell tolerance at higher VA concentrations (500 mM) / Mestre

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / O Aspergillus fumigatus é o principal agente etiológico da aspergilose invasiva, uma infecção fúngica oportunista que acomete, principalmente, pacientes de Unidades Hematológicas, como aqueles com neutropenia profunda e prolongada. Após a filamentação este fungo angioinvasivo é capaz de ativar e causar danos em células endoteliais de veia umbilical humana (HUVEC) que passam a expressar um fenótipo pró-trombótico. A ativação destas células, dependente de contato célulacélula, é mediada por TNF-α e caracterizada pela expressão de moléculas próinflamatórias, como citocinas, quimiocinas e moléculas de adesão. Recentemente, nosso grupo comparou a ativação endotelial de HUVECs desafiadas com cepas selvagens e uma cepa mutante para o gene UGM1. Nestes experimentos a cepa mutante Δugm1, que apresenta um fenótipo de maior produção de galactosaminogalactana (GAG) na parede celular, mostrou um fenótipo hiperadesivo e uma capacidade maior de ativar células endoteliais. Entretanto, os receptores e as vias de sinalização envolvidos nesta ativação permanecem desconhecidos. Assim, o objetivo deste trabalho foi verificar as proteínas envolvidas nestes processos através do estudo das proteínas diferencialmente expressas nas HUVECs após a interação com A. fumigatus, usando a técnica proteômica 2D-DIGE. Brevemente, as HUVECs foram infectadas com tubos germinativos da cepa selvagem (AF293) e da cepa Δugm1 de A. fumigatus. Em seguida, as proteínas foram marcadas com diferentes fluorocromos e separadas por eletroforese bidimensional. A análise quantitativa foi realizada utilizando o software DeCyder. Foram identificadas por MS/MS cinco proteínas diferencialmente expressas, incluindo a galectina-1 e a anexina A2, ambas mais expressas após a interação, sendo a primeira ~25% mais expressa após a interação com a mutante Δugm1. Este trabalho propõe que a galectina-1 poderia ser o receptor endotelial para polímeros de galactose presentes na parede celular do A. fumigatus, e que a Anexina A2 poderia estar envolvida na sinalização intracelular em resposta a este patógeno. No entanto, experimentos complementares, em curso, são necessários para comprovar esta hipótese. / Aspergillus fumigatus is the main etiological agent of invasive aspergillosis, the main opportunistic fungal infection of Hematologial Unitys patients, especially those with long-term neutropenia. Upon filamentation, this angioinvasive fungus can activate and damage the human umbilical vein endothelial cells (HUVEC), which in response switch to a pro-thrombotic phenotype. HUVEC activation is mediated by TNF-α once cell-cell contact occurs. This activation is characterized by the expression of pro-inflammatory molecules such cytokines, chemokines and adhesion molecules. Recently, our group performed the comparison of HUVEC activation upon interaction with a wild type and the UGM1 mutant strains of A. fumigatus. The Δugm1 strain, which presents an increased production of the cell wall galactosaminogalactan, showed a hyper adherent phenotype and an increased capability to cause endothelial cell stimulation and activation, when compared with the wild type strain. The receptors involved in the pathogen-host interaction or the signaling pathways after endothelial activation by A. fumigatus remain unknown. Thus, the aim of this study was to investigate the differentially expressed proteins in HUVECs upon interaction with A. fumigatus, using the 2D-DIGE proteomic approach. Briefly, HUVECs were challenged with germlings of A. fumigatus wild type Af293 and Δugm1 strains and then submitted to protein extraction. The total HUVEC protein extracts were labeled with different CyDyes and fractionated by 2D electrophoresis. Quantitative analysis to determine the differences in protein abundance amongst interacted cells vs. control endothelial cells was performed using the software DeCyder. Five differentially expressed proteins were identified by MS/MS including galectin-1 and annexin A2, both overexpressed after the interaction. These two proteins are described elsewhere to be associated with host-pathogen interaction. Besides, galectin-1 showed an ~25% increase after interaction with the Δugm1 strain and it is plausible that this particular protein could be a putative receptor for galactose-containing polymers of the A. fumigatus cell wall and annexin A2 could be involved in signalizing pathways upon interaction. However, other experimental evidences, under development, are necessary to confirm this hypothesis.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A incidência de infecções fúngicas invasivas vem aumentando nos últimos anos. Estas infecções, em geral, apresentam altas taxas de mortalidade. A profilaxia com antifúngicos ainda é a estratégia mais comum na contenção da mortalidade e prevenção contra infecções fúngicas invasivas, porém, apresenta baixa eficiência, e relatos de resistência às drogas. Além disso, a terapia antifúngica é limitada a um pequeno grupo de drogas, como os polienos, azóis e equinocandinas. Desta forma, a busca de novos alvos de drogas é fundamental para o desenvolvimento de novos antifúngicos. Estudos in silico indicaram quatro genes como potenciais alvo de drogas em fungos patogênicos. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi verificar a expressão das proteínas codificadas por dois destes possíveis genes alvo, a proteína erg6, na fração microssomal, e trr1, na fração citosólica, em hifas de A. fumigatus. Visando alcançar este objetivo, foram primeiramente padronizadas todas as etapas de fracionamento celular visando isolar estas duas subfrações celulares de A. fumigatus. Posteriormente, foi otimizado o protocolo de extração e reidratação de proteínas microssomais bem como reidratação de proteínas citosólicas. Estes extratos foram submetidos a diferentes protocolos de fracionamento proteico em um sistema de eletroforese OFFGEL (OGE). Os resultados de Western immunoblot mostraram que estas duas proteínas, erg6 e trr1, são de fato expressas na fase filamentosa de A. fumigatus. O extrato proteico da fração microssomal submetido ao OGE em doze subfrações apresentou três subunidades da proteína erg6, reconhecidas pelo anticorpo monoclonal, com massas moleculares e pI distintos: uma subunidade de aproximadamente 79 kDa com pI entre 5,91 e 6,49, e outras duas subunidades de aproximadamente 35 kDa e 32 kDa, ambas com pI entre 6,49 e 7,08. A enzima erg6 foi descrita como um homotetrâmero em outros fungos. Porém, nossos resultados sugerem que, em A. fumigatus, a erg6 possui uma estrutura heterotetramérica. Quanto à proteína trr1, tanto no extrato total quanto nas frações resultantes do fracionamento em OGE, uma banda única de aproximadamente 40 kDa, com pI na faixa de 4,79 e 5,33, foi reconhecida pelo anticorpo policlonal. Desta forma, esta proteína parece ter uma estrutura homodimérica, assim como descrito em outros micro-organismos. / The invasive fungal infections incidence has increased in recent years. These infections usually presents high mortality rates. Antifungal prophylaxis remains the most common clinical strategy to decrease mortality and prevent invasive fungal infections, however, it has low efficiency and drug resistance reports. Furthermore, antifungal therapy is limited to a small group of drugs such as polyenes, azoles, and echinocandins. Thus, the search for new drug targets is imperative for the new antifungal agents development. In silico studies have indicated four genes as potential drug target in pathogenic fungi. In this context, our aim was to investigate the expression of two proteins encoded by two putative target genes, erg6 in the microsomal fraction, and trr1 in the cytosolic fraction of A. fumigatus hyphae. To achieve this goal, we first standardized all steps of cell fractionation to isolate these two fractions of A. fumigatus hyphae. Subsequently, was optimized the protein extraction and rehidratation protocols of these two subfractions, such as cytosolic proteins rehidratation. These extracts were submitted to different protocols for protein fractionation in an OFFGEL electrophoresis system (OGE). The Western immunoblot results showed that these two proteins, erg6 and trr1, are expressed in filamentous phase of A. fumigatus. The microsomal protein extract submitted to the OGE in twelve fractions, showed three erg6 protein subunits recognized by monoclonal antibody, with distincts molecular weight and pI: a subunit with approximately 79 kDa, with pI in the range of 5,91 and 6,49, and others two subunits with 35 kDa and 32 kDa, both with pI between 6,49 and 7,08. The enzyme erg6 was described as a homotetramer in other fungi, however, our results suggest that in A. fumigatus the erg6 has a heterotetrameric structure. Regarding trr1 protein, in both, total and fractionated (OGE) extracts, a single band of approximately 40 kDa, with pI in the range of 4.79 and 5.33, was recognized by the polyclonal antibody, suggesting that this protein appears to have a homodimeric structure, as described in other microorganisms.

Dermatófitos são denominados os fungos filamentosos queratinofílicos e queratinolíticos responsáveis pela dermatofitose, uma importante zoonose de ocorrência mundial. Gatos são considerados hospedeiros naturais e potenciais carreadores de fungos dermatofíticos, especialmente Microsporum canis, principal agente da dermatofitose em pequenos animais e que frequentemente acomete humanos. A prevalência dos dermatófitos em gatos sem dermatopatias apresenta variações regionais atribuídas aos aspectos climáticos e às características associadas a cada população. Neste contexto, o objetivo do presente estudo foi estimar a frequência de dermatófitos isolados de gatos que não apresentavam sinais clínicos de dermatopatias na região metropolitana de Florianópolis - SC, entre julho de 2015 e outubro de 2016. Características como sexo, idade, comprimento do pelame, sorologia para FIV e FeLV, acesso à rua e contato com outros gatos foram avaliadas em associação ao isolamento de dermatófitos. Amostras do pelame de 198 gatos foram obtidas através da técnica de MacKenzie que consiste na escovação vigorosa dos pelos, por todo corpo do animal, utilizando escova dental estéril. Cento e dez amostras (55,6%) foram colhidas em clínicas veterinárias e 88 (44,4%) em domicílios com numerosos gatos (11 em média). O cultivo micológico foi realizado em Sabouraud Agar Cloranfenicol-Ciclo-hexamida (SCC) e a incubação realizada a 25-27°C, durante 21-28 dias. O diagnóstico foi baseado nas características macro e micromorfológicas do dermatófito isolado. A frequência de dermatófitos correspondeu a 3,0% (6/198), onde apenas o gênero Microsporum foi observado com predomínio de M. canis (66,7%; 4/6), seguido de M. gypseum (33,3%; 2/6). Fungos saprotróficos foram observados em 94,4% das culturas e 5,6% das amostras não tiveram crescimento fúngico. A maior parte dos isolados ocorreu de gatos adultos (66,7%; 4/6), fêmeas (83,3%; 5/6) e de pelame longo (5,4%; 3/55), em comparação às amostras de pelame curto (2,1%; 3/143). Uma parcela dos gatos (30,0%; 59/198) havia sido testada para FIV/FeLV e destes, 27,0% (16/59) eram positivos: 22,0% para FeLV e 5,0% para FIV. Microsporum gypseum foi isolado de um gato FeLV positivo. Dermatófitos foram isolados de gatos em contato com outros gatos (5/165). No entanto, gatos provenientes de domicílios com alta densidade populacional não apresentaram cultura positiva para dermatófitos, fato atribuído à intensa contaminação por espécies saprotróficas. Na ausência de sinais clínicos, há o desafio de detectar fungos dermatofíticos nas criações, o que ressalta a necessidade de controle entre os felinos. O cultivo micológico é um método eficaz, econômico e deve ser indicado pelos médicos veterinários que atuam na clínica médica, tanto no âmbito doméstico, como em abrigos para prevenção e controle da infecção em animais e humanos. / Dermatophytes are the filamentous fungi keratinophilic and keratinolytic responsible for dermatophytosis, an important worldwide zoonosis. Cats are considered natural hosts and potential carriers of dermatophytes especially Microsporum canis, the main agent of dermatophytosis in small animals and frequently affects humans. The prevalence of dermatophytes in cats without dermatopathies presents regional variations attributed to the climatic aspects and the characteristics associated with each population. In this context, the aim of this study was to estimate the frequency of dermatophytes isolated from cats that had no clinical signs of dermatopathies in the Metropolitan Area of Florianópolis - SC between July 2015 and October 2016. Sex, age, length of hair, serology for FIV and FeLV, outdoors access and contact with other cats were evaluated in association with the isolation of dermatophytes. Hair samples of 198 cats were obtained through the MacKenzie brush technique consisting of vigorous brushing of the hairs, throughout the animal's body, using a sterile toothbrush. One hundred and ten samples (55.6%) were collected in veterinary clinics and 88 (44.4%) in multiple household cats (average 11). Mycological culture was performed onto Sabouraud Agar Chloramphenicol- Cyclohexamide (SCC), and incubated at 25-27°C for 21-28 days. The diagnosis was based on the macro and micromorphological characteristics of the isolated dermatophyte. The frequency of dermatophytes corresponded to 3.0% (6/198). Only the genus Microsporum was observed with predominance of M. canis (66.7%; 4/6), followed by M. gypseum (33.3%; 2/6). Saprotrophic fungi were observed in 94.4% of the cultures and 5.6% of the samples did not occurred fungal growth. Most of the isolates occurred in adult (66.7%; 4/6), female (83.3%; 5/6) and long hair cats (5.4%; 3/55) compared to the short hair (2.1%). Part of this cats (30.0%, 59/198) had been tested for FIV / FeLV and, among them, 27.0% were positive (22.0% FeLV and 5.0% FIV). Microsporum gypseum was isolated from one FeLV positive cat. Dermatophytes were isolated from cats in contact with other cats (5/165). However, multiple household cats had no positive cultures and this outcome can be associated to high contamination by saprotrophic fungi. In the absence of clinical signs, the challenge of detecting dermatophytic fungi in the creations, which highlights the needs of control among the felines. Mycological cultivation is an effective, economical method and should be indicated by veterinarians working in the medical clinic, both at home and in shelters for the prevention and control of animal and human infection.

A cromoblastomicose é uma infecção fúngica subcutânea causada por fungos da família Dematiceae sendo o principal agente etiológico o fungo Fonsecaea pedrosoi (F. pedrosoi). Estes fungos induzem uma lesão crônica na pele de freqüente recidivas. O objetivo do trabalho foi avaliar alguns aspectos imunológicos na cromoblastomicose experimental através de dois modelos de infecção pelas vias: intraperitoneal (i.p.) e subcutânea (s.c.). No primeiro modelo de infecção pela via s.c. em camundongos BALB/c infectados com 106 conídios de F. pedrosoi, ocorreu a cura espontânea da infecção em aproximadamente 4 semanas. Na subtipagem de linfócitos T em linfonodos regionais ocorreu um predomínio de células T CD4+ que foi constante até a 4ª semana de infecção, no entanto, observamos aumento significativo de linfócitos T CD8+ ao longo da infecção sugerindo que essa população tenha também uma importante participação no controle da doença. Os ensaios de linfoproliferação demonstraram, na 1ª semana de infecção, elevado índice de proliferação celular quando as células de linfonodos foram estimuladas in vitro com antígenos de F. pedrosoi, além da liberação principalmente da citocina IFN-γ, já na 4ª semana de infecção não foi detectado proliferação celular. Esses resultados sugerem que no início da infecção a resposta celular seja mediada principalmente por linfócitos T CD4+ produtores de IFN-γ, o que nos sugere, que neste modelo experimental, polarize uma resposta de células T do tipo Th1. No segundo modelo de infecção, via intraperitoneal (i.p.), camundongos BALB/c infectados com 106 conídios de F. pedrosoi mostraram desenvolvimento de infecção crônica com preservação da imunidade celular mesmo após a 8ª semana. Ainda pela via i.p., os camundongos C57BL/6 nocautes de T CD4+ apresentaram uma maior carga fúngica no início da infecção e em tempos mais tardios a carga fúngica foi semelhante aos camundongos controles (C57BL/6); esses mesmos animais nocautes não apresentaram uma ativação da resposta celular medida pelo teste de HTT (Hipersensibilidade do Tipo Tardio). Quando avaliamos o padrão de citocinas, a citocina IFN-γ produzida pelos órgãos baço e fígado apresentou menores níveis no início da infecção quando comparado ao camundongos controle. Já os níveis de IL-10 aumentaram gradativamente ao longo da infecção e IL-4 não apresentou diferenças em relação ao controle. Nos camundongos nocautes para coa (C57BL/6 CD8 \"KO\"), a carga fúngica, os níveis de citocinas e o teste de HTT foram semelhantes aos animais controle. Esses resultados mostraram que pela via i.p. os linfócitos T, principalmente células T CD4+ são importantes no controle inicial da infecção. Em tempos mais tardios a infecção foi controlada mesmo em camundongos deficientes de linfócitos TCD 4+ ou T CD8+, sugerido que outras células como macrófagos ou NK, estariam atuando de forma mais efetiva no controle da infecção. / Abstract not available.

Made available in DSpace on 2014-08-20T14:38:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_anelise_fonseca.pdf: 491914 bytes, checksum: 8a83df75d47a2e939c6105d239739d8d (MD5) Previous issue date: 2011-03-10 / This study aimed to determine the chemical composition and evaluate the antifungal essential oils of Origanum vulgare (oregano) and Rosmarinus officinalis (rosemary). The oils were analyzed by gas chromatography and identified by comparison with the retention time of standards. To evaluate the antifungal activity method was used in broth, and used nine isolates of dermatophytes and nine isolates of Pythium insidiosum from clinical cases in animals. The oils were subjected to a series of ten dilutions in logarithm base 2, in RPMI 1640, resulting in concentrations from 30 to 0, 03 μlmL-1. The microplates were incubated at 32°C for 72 h and susceptibility was expressed by the minimum inhibitory concentration (MIC). The main oil constituents R. officinalis were camphor (51.52%), verbenone (11.84%), 1,8-cineole (8.94%), myrcene (4.50%), α-terpineol (4.39%) and borneol (2.68%) and O. vulgare were 4-terpineol (27.67%), gamma-terpinene (4.10%), thymol (0.58%) and carvacrol (21.58%). For dermatophytes the MIC R. Officinallis ranged from 30 to 3 μ/lmL and O. vulgare varied from 3 to 0.3 μL/ml. In the case of P. insidiosum MIC R. Officinallis ranged from 3 to 1.5 μl/mL and O. vulgare varied from 3 to 0.75 μl/mL. According to the results obtained, it can be argued that the tested oils have antifungal activity on dermatophytes and P. insidiosum. The results should stimulate further research, especially in relation to P. insidiosum, as yet no effective treatment is available. / O presente estudo teve como objetivos determinar a composição química e avaliar a ação antifúngica dos óleos essenciais de Origanum vulgare (orégano) e Rosmarinus officinalis (alecrim). Os óleos foram analisados por cromatografia gasosa e identificados por comparação com o tempo de retenção de padrões. A avaliação da atividade antifúngica foi realisado o método de microdiluição em caldo, sendo utilizados nove isolados de dermatófitos e nove isolados de Pythium insidiosum provenientes de casos clínicos em animais. Os óleos foram submetidos a uma série de dez diluições em logaritmo de base 2, no meio RPMI 1640, obtendo-se concentrações de 30- 0,03μl/mL. As microplacas foram incubadas a 32ºC por 72 h e a susceptibilidade foi expressa pela concentração inibitória mínima (CIM). Os principais constituintes dos óleos de R. oficinalis foram cânfora (51,52%), verbenona (11,84%), 1,8-cineol (8,94%), mirceno (4,50%), α-terpineol (4,39%) e borneol (2,68%) e para o O. vulgare foram 4-terpineol (27,67%), gama-terpineno (4,10%), timol (0,58%) e carvacrol (21,58%). Para os Dermatófitos o CIM do R. Officinallis variou entre 30 a 3 μl/ml e para o O. vulgare variou entre 3 a 0,3 μl/mL. No caso do P. insidiosum o CIM do R. Officinallis variou entre 3 a 1,5 μl/ml e para o O. vulgare variou entre 3 a 0,75 μl/mL. De acordo com os resultados obtidos, pode-se afirmar que o óleos testados apresentam atividade antifúngica em dermatófitos e P. insidiosum. Os resultados estimulam novos estudos, especialmente em relação a P. insidiosum, já que ainda não está disponível nenhum tratamento eficaz.

Made available in DSpace on 2017-06-01T18:20:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Antonio Silva_Dissert.pdf: 1945870 bytes, checksum: dbd64698da19e5ee591cda716481f00d (MD5) Previous issue date: 2007-07-27 / Inquiries had been carried out with submerged fermentation of Rhizopus arrhizus for production of biomass and copolymers chitin and chitosan, using the culture in synthetic medium for Mucoralean and corn steep liquor, as alternative substratum. In this direction, fermentations in Erlenmyers flasks of 250mL had been carried out, contend 50 mL of the media had been inoculated in duplicates with 1% of a suspension of 107/spores/mL, incubated under orbital shaker of 150rpm. To each 24 h had been carried out the content in biomass, glucose consumption, production and characterization of chitin and chitosan, and pH was monitored in elapsing of the studies (96h). The dates had been validated using an analysis for not linear regression, aiming at to explore the potential and versatility of Mucoralean in the production of copolymers. The results obtained with the synthetic medium for Mucoralean had demonstrated a maximum increase of biomass at 72 h of submerged culture. The total of glucose total was consumed by the metabolism of fungus at 96h, with pH 3,2 and consequence period of behavior of cellular decline. The maximum production of chitin and chitosan was 73.5mg and 158 mg, respectively, for gram of biomass with 48 h of cultivation, and maximum speed of growth of µMax 0.036 (h-1) and generation time of 4.6h. On the other hand, the submerged culture of R. arrhizus in corn steep liquor, concentrations of 4, 8 and 16%, as alternative medium and of low cost showed maximum growth of 16.8 g/L, in the concentration of 8% of corn steep liquor, observing a µMax 0.064h-1. High yields of chitin (575 mg/g biomass) and chitosan (416mg/g biomass) could be achieved using the medium containing corn steep liquor at 8%, with 72 h of cultivation, respectively, and pH varying of 6.5 to 8.2. All the isolated copolym rs in both culture media were characterized by index of crystallinity and absorption to the infra-red ray peaks, and were confirmed using the chitin and chitosan standards. The experimental data obtained with chitin and chitosan were validated by the estimation of not linear regression, demonstrating to a good adjustment of the equations and reproducibility. The results with the submerged fermentation of R. arrhizus were compared corn steep liquor at 8% with synthetic medium for Mucoralean fungi, and was observed an increase of 782% and 263% respectively, for chitin and chitosan production. The results obtained suggest R. arrhizus as source of production of the copolymers and as well as the corn steep liquor, considering the nutritional potential and the low cost / Investigações foram realizadas com fermentação submersa de Rhizopus arrhizus para produção de biomassa e dos co-polímeros quitina e quitosana, através do cultivo em meio sintético para Mucorales e milhocina, como substrato alternativo. Neste sentido, foram realizadas fermentações em frascos de Erlenmyers de 250 mL de capacidade, contendo 50 mL dos meios, foram inoculados em duplicatas com 1% de uma suspensão de 107/esporos por mL, incubados sob agitação orbital de 150rpm. A cada 24 h foram realizados conteúdo em biomassa, consumo de glicose, além da estimação e caracterização de quitina e quitosana e o pH foi monitorado no decorrer dos estudos (96h). Os dados obtidos foram validados utilizando uma análise por regressão não linear, visando explorar o potencial e versatilidade dos mucorales na produção dos co-polímeros. Os resultados obtidos com o meio sintético para Mucorales demonstraram um aumento máximo de biomassa com 72 h de cultivo submerso. A glicose foi totalmente consumida pelo metabolismo do fungo com 96h, com pH 3,2 e conseqüente estágio de declínio celular. A produção máxima de quitina e de quitosana por R. arrhizus foi de 73,5 mg e 158 mg, respectivamente, por grama de biomassa em 48 h de cultivo, com velocidade máxima de crescimento de µMax 0,036(h-1)e tempo de geração de 4,6 h. Por outro lado, o cultivo submerso de R. arrhizus em milhocina, nas concentrações de 4,8 e 16%, como meio alternativo e de baixo custo, demonstrou crescimento máximo de 16,8 g/L, na concentração de 8% de milhocina, observando-se µMax 0,064(h-1. Altos rendimentos de quitina (575mg/g de biomassa) e quitosana (416 mg/g de biomassa) foram obtidos com milhocina a 8%, com 72 h de cultivo, respectivamente, e pH variando de 6,5 para 8,2. Todos os copolímeros isolados foram caracterizados pelo índice de cristalinidade e espectro de absorção ao raio infravermelho, confirmando um alto grau de pureza quando comparados aos padrões de quitina e quitosana. Os dados obtidos experimentalmente de produção de quitina e quitosana foram validados pela estimativa de regressão não linear, demonstrando um bom ajuste das equações e reprodutibilidade. Os resultados com a fermentação submersa de R. arrhizus comparando milhocina a 8% com o meio sintético para Mucorales observou-se um aumento considerável de 782% e 263%, respectivamente, para a produção de quitina e quitosana. Assim, os resultados obtidos sugerem R. arrhizus como fonte de produção dos co-polímeros, como também a milhocina, considerando o potencial nutritivo e o baixo custo

O objetivo deste trabalho foi avaliar o potencial antifúngico contra o fungo Aspergillus flavus, dos extratos de folhas de Eucalyptus staigeriana F. Muell., preparados a partir de folhas frescas, liofilizadas e secas ao ambiente, sob diferentes tempos de extração e por diferentes solventes extratores, tais como metanol, etanol e água a temperatura ambiente e água a 60ºC. Para mensurar o potencial antifúngico foi utilizada a técnica de poisoned food em meio BDA e o crescimento radial fúngico foi avaliado por seis dias. O percentual de inibição foi avaliado comparando-se as medidas do diâmetro radial de crescimento fúngico dos extratos com as placas controle contendo apenas os solventes. Como controle positivo foi utilizado o óleo essencial de E. staigeriana. Os extratos metanólicos apresentaram o melhor potencial antifúngico, seguido pelos extratos etanólicos e aquosos. A utilização das folhas frescas mostrou-se a melhor forma de preparação e não houve diferença significativa entre os tempos de extração 1h e 24h, indicando como processamento mais viável a extração em 1h. A Concentração Inibitória Mínima (MIC) foi mensurada para o extrato de melhor desempenho pela técnica de micropoços, aonde o crescimento fúngico foi monitorado por fluorescência derivada da reação da esterase fúngica com o diacetado de fluorescina. E o extrato que obteve o melhor resultado foi o extrato metanólico, com 1h de extração, a partir de folhas liofilizadas de E. staigeriana, e sua MIC foi de 26,75 L/mL, enquanto a do seu óleo essencial foi de 12,5 L/mL, demonstrando a eficiência relativa da extração com solventes extratores e sua praticidade e operacionalidade, quando se comparam com a extração de óleos essenciais. / This study aimed to evaluate the antifungal potential of Eucalyptus staigeriana F. Muell. leaf extracts against Aspergillus flavus. The extracts were prepared using fresh, lyophilized, and air-dried leaves, different extraction times, and different solvents, such as methanol, ethanol, water at room temperature, and water at 60ºC. To measure the antifungal potential, the poisoned food technique was used in PDA medium, and the radial growth of the fungus was evaluated for six days. The percentage of inhibition was assessed by comparing the measurements of the radial growth diameter of the fungus in the extracts with the control plates containing only the solvents. The essential oil of E. staigeriana was used as a positive control. The methanolic extracts presented the best antifungal potential, followed by the ethanolic and aqueous extracts. The use of fresh leaves was the best type of preparation and no statistically significant difference between 1-h and 24-h solvent extraction was found, indicating the 1-h extraction process as the most feasible. The extract presenting the best performance using the microwell technique had the minimum inhibitory concentration (MIC) measured, and the fungal growth was monitored by fluorescence derived from the fungal esterase reaction with fluorescein diacetate. The extract that achieved the best result the methanolic extract, with 1-h extraction from lyophilized leaves of E. staigeriana, and the MIC was 26.75 L/mL, while the essential oil was 12.5 L/mL, demonstrating the relative efficiency of the solvent extraction and its practicality and easy implementation when compared with the extraction of essential oils.

INTRODUÇÃO: A frequência de Candida parapsilosistem apresentado considerável aumento em UTIs neonatais. Embora a taxa de resistência dessa espécie aos azólicos seja baixa, recentemente têm sido relatados surtos de candidemia por isolados resistentes. A capacidade de adesão e formação de biofilme por essa espécie confere maior potencial patogênico e resistência aos antifúngicos. Portanto, a vigilância epidemiológica, tanto da resistência aos antifúngicos como da virulência dos isolados, é fundamental para o controle e prevenção das infecções e surtoshospitalares. A técnica de MALDI-TOF MS pode ser uma ferramenta útil para realizar análises proteômicas das células planctônicas e sésseis de Candida parapsilosis,e identificar possíveis alvos terapêuticos ou biomarcadores, específicos do biofilme. MÉTODOS: Isolados clínicos do complexo Candida parapsilosis de dois hospitais universitários públicos brasileiros, foram submetidos à identificação por RAPD, RFLP e MALDI-TOF MS e aos testes de suscetibilidade aos antifúngicos. Ensaios de formação de biofilme foram realizados para quantificar a biomassa, a atividade metabólica e ainda, avaliar atividade in vitrodos antifúngicos contra as células sésseis dos isolados com alta formação de biofilme. A análise proteômica por MALDI-TOF MS das células planctônicas e sésseis dos isolados com alta formação de biofilme, foi realizada nas plataformas VITEK-MS(TM) e Microflex(TM). Isolados de Candida parapsilosis (sensu stricto) foram genotipados por PFGE e análise de microssatélites. Os genótipos foram correlacionados com dadosclínicos, para investigar a ocorrência de um surto em CTI adulto, e as sequências do gene ERG11dos isolados não suscetíveis aos azólicos (NSA) foram analisadas. RESULTADOS: Foram obtidos 38 isolados do complexo Candida parapsilosis, sendo Candida parapsilosis(sensu stricto) a espécie de maior frequência, superando 80% em ambos os hospitais, seguida de C. orthopsilosis e C. metapsilosis. Embora todos os isolados tenham sido suscetíveis à anfotericina B ( < 2 mg/L) e apresentado suscetibilidade intermediária à anidulafungina, caspofungina e micafungina ( > 0,002 mg/L), elevada frequência de não suscetibilidade (resistência ou suscetibilidade intermediária) ao fluconazol e voriconazol foi observada entre isolados de um dos hospitais. Alta formação de biofilme foi observada apenas entre os isolados da espécie Candida parapsilosis(sensu stricto). Por outro lado, a maioria dos isolados NSA, apresentou baixa formação de biofilme e baixa atividade metabólica. Apenas anfotericina B apresentou atividade contra os biofilmes de Candida parapsilosis. As duas plataformas de MALDI-TOF MS conseguiram diferenciar os perfis proteômicos das células planctônicas e sésseis dos isolados. A genotipagem de Candida parapsilosis(sensu stricto) revelou a persistência de isolados clonais NSA e a mutação A395T no gene ERG11foi identificada exclusivamente entre os isolados resistentes ao azólicos. O uso de corticosteroide foi associado, estatisticamente, com a ocorrência de isolados clonais NSA. CONCLUSÕES: Candida parapsilosis (sensu stricto) se mantém como a principal espécie do complexo em infecções sanguíneas. Isolados resistentes aos azólicos, com mutações no gene ERG11, ocorreram nos dois hospitais avaliados. A correlação dos genótipos com os dados clínicos evidenciou a ocorrência de um surto envolvendo isolados clonais NSA, com associação estatisticamente significativa, ao uso prévio de corticosteroides. Candida parapsilosis (sensu stricto) foi a única espécie que apresentou alta formação de biofilme, o qual demonstrou elevada resistência às equinocandinas. As duas plataformas de MALDI-TOF MS, diferenciaram os perfis proteômicos, das células planctônicas e sésseis de Candida parapsilosis, demonstrando o potencial emprego dessa tecnologia na identificação de possíveis alvos terapêuticos ou biomarcadores, específicos de biofilmes / INTRODUCTION: The frequency of Candida parapsilosis isolates has increased considerably in neonatal ICUs. Although resistance to azoles is usually low in this species, candidemia outbreaks by resistant isolates have been recently reported. Theability of adhesion and biofilm formation by this species confers higher pathogenic potential and resistance to antifungal agents. Therefore, establishment of profiles of antifungal susceptibility and virulence, besides the epidemiological surveillance ofC. parapsilosisisolates are essential for the control and prevention of nosocomial infections and outbreaks. The MALDI-TOF MS technique can be a useful tool to perform proteomic analyzes of the planktonic and sessile cells of Candida parapsilosis, identifying possible biofilm-specific therapeutic targets or biomarkers. METHODS: Candida parapsilosisclinical isolates from two Brazilian public university hospitals were identified by RAPD, RFLP and MALDI-TOF MS and submitted to antifungal susceptibility tests. Biofilm formation assays were carried out to quantify the biomass and metabolic activity, and to evaluate the in vitroactivity of antifungal drugs against the sessile cells of the isolates with high biofilm formation. Proteomic analysis of the planktonic and sessile cells of the isolates with high biofilm formation was performed in two MALDI-TOF MS platforms, VITEK-MS(TM) and Microflex(TM). Candida parapsilosis(sensu stricto) isolates were genotyped by PFGE and microsatellite analysis. The genotypes were correlated with clinical data to investigate the occurrence of an outbreak in the adult ICU andERG11gene sequences from non-susceptible to azoles (NSA) isolates were also analyzed. RESULTS: 38 clinical isolates of the Candida parapsilosiscomplex were obtained, with Candida parapsilosis(sensu stricto) being the most frequent species (exceeding 80% in both hospitals), followed by C. orthopsilosisand C. metapsilosis. Although all isolates were susceptible to amphotericin B ( < 2 mg/L) and showed intermediate susceptibility to anidulafungin, caspofungin e micafungin ( > 0,002 mg/L), high frequency of non-susceptibility (resistance or intermediate susceptibility) to fluconazole and voriconazole was observed among isolates from one of the hospitals. High biofilm formation was only observed among isolates of the Candida parapsilosis. (sensu stricto) species. On the other hand, most of the NSA isolates presented low biofilm formation and low metabolic activity. Only amphotericin B showed activity against Candida parapsilosisbiofilms. The two MALDI-TOF MS platforms were able to differentiate the proteomic profiles of planktonic and sessile cells of isolates. Candida parapsilosis(sensu stricto) genotyping revealed the persistence of clonal NSA isolates. The A395T mutation in the ERG11gene was identified exclusively among azole resistant isolates. The use of corticosteroid was statistically associated with the occurrence of clonal NSA isolates. CONCLUSIONS: Candida parapsilosis(sensu stricto) remains the main species of the complex in bloodstream infections. Azole-resistant isolates with mutations in the ERG11gene are emerging in the two hospitals evaluated. Additionally, the correlation between the genotypes and the clinical data showed the occurrence of an outbreak involving isolates resistant to azoles, with a statistically significant association with previous use of corticosteroids. Candida parapsilosis(sensu stricto) was the only species that presented high biofilm formation and resistance against echinocandins. The two MALDI-TOF MS platforms differentiated the proteomic profiles of the planktonic and sessile cells of Candida parapsilosis, demonstrating the potential use of this technology to identify possible biofilm-specific therapeutic targets or biomarkers