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Análise estrutural e funcional do genoma de Xanthomonas axonopodis pv. citri / Structural and functional analyses of Xanthomonas axonopodis pv. citri genome

Leandro Marcio Moreira 11 October 2006 (has links)
O cancro cítrico é uma doença que afeta diversas espécies de Citrus, cujo agente causal é Xanthomonas axonopodis pv citri (XAC). O genoma desta fitobactéria consiste de um cromossomo de ~5 Mpb e dois plasmídeos, que juntos codificam 4313 CDS (seqüências codificadoras), das quais 2710 apresentam similaridade com proteínas conhecidas. Neste trabalho realizamos uma análise comparativa detalhada do genoma de XAC com genomas de três fitopatógenos, Xanthomonas campestris campestris, Xylella fastidiosa 9a5c e Xylella fastidiosa temecula. Com esta análise identificamos genes espécie e gênero-específicos, potencialmente relevantes para adaptação aos seus respectivos nichos ou hospedeiros, além de ilhas de inserção e deleção genômica putativas. Também identificamos vias metabólicas relacionadas com osmoproteção/osmorregulação e com degradação de compostos aromáticos em XAC, que possivelmente são determinantes na eficácia de sua interação com o hospedeiro. Analisamos o nível de expressão de 9 CDS após crescimento de XAC em diferentes concentrações de glicose e verificamos que este açúcar modula positivamente a expressão de CDS relacionadas à síntese de goma e ao sistema de osmoproteção. Além disso, descrevemos a construção de microarranjos de DNA representando 2760 CDS de XAC, constituindo-se uma nova ferramenta para estudos de genômica comparativa e expressão gênica deste fitopatógeno. / Xanthomonas axonopodis pv citri (XAC) is the bacterial pathogen that causes citrus canker disease in several species of Citrus plants. XAC genome consists of a main cromosome of ~5 Mpb and two plasmids that together encode 4313 CDS (coding sequences). Approximately 63% of the CDS have assigned biological functions. In this work, we present a detailed genomic comparison between the genomes of XAC and of three other phytopathogens, X. campestris campestris, Xylella fastidiosa 9a5c and X. fastidiosa Temecula. Based on this analysis, we identified species and genus-specific genes that might be relevant for adaptation to their niches and hosts. We mapped putative insertion/deletion regions in the XAC genome possibly related to gene gains and losses during the divergence of the four bacterial lineages. We have identified the metabolic pathways related to osmoprotection/osmoregulation and aromatic compound degradation important for XAC efficient host colonization and interaction. Expression levels of 9 CDS were analyzed after XAC growth under different glucose concentrations revealing that this sugar upregulates the expression of CDS related to gum synthesis and to osmoregulation. In addition, we describe here the construction of a DNA microarray representing 2760 CDS of XAC as a new tool for comparative genomic and gene expression studies in this phytopathogen.
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Expressão gênica diferencial durante a esporulação de Blastocladiella emersonii e estudo da sinalização por GMP cíclico / Differential gene expression during Blastocladiella emersonii sporulation and analysis of the cyclic GMP signaling pathway

Vieira, André Luiz Gomes 24 April 2009 (has links)
Neste trabalho realizamos a análise das variações na expressão gênica global durante a fase de esporulação do fungo aquático Blastocladiella emersonii utilizando a tecnologia dos microarranjos de cDNA em lâminas contendo 3.773 genes distintos. Ao todo 615 genes foram classificados como induzidos enquanto 645 foram classificados como reprimidos ao longo da esporulação. As categorias funcionais mais representadas entre os genes induzidos foram: microtúbulo e citoesqueleto, transmissão de sinal, atividade de ligação ao íon Ca2+, proteólise (apenas no início da esporulação) e biogênese e organização do cromossomo (apenas no final da esporulação). Dentre os genes reprimidos, as categorias funcionais mais representadas foram: biossíntese de proteína, transporte de carboidratos e metabolismo energético. A comparação dos dados de expressão gênica da esporulação com aqueles obtidos recentemente em nosso laboratório para a germinação mostrou um grande número de genes regulados inversamente ao longo das duas fases de diferenciação do ciclo de vida de B. emersonii. Muitos genes induzidos na esporulação são reprimidos na germinação e vice versa. Analisamos também o efeito de glicose e triptofano sobre a expressão gênica durante a formação dos zoósporos, tendo em vista que tais nutrientes são capazes de inibir a esporulação de B. emersonii. Nossos resultados mostraram que na presença de glicose (1%) genes envolvidos na composição e atividade do citoesqueleto foram superexpressos, enquanto na presença do aminoácido triptofano houve um aumento na expressão de genes envolvidos no processo de enovelamento de proteínas e proteólise, e na resposta ao estresse oxidativo. Além disso, genes envolvidos no processo de esporulação propriamente dito foram reprimidos durante o tratamento com triptofano. Investigamos também a via de sinalização por GMP cíclico (cGMP), cujos níveis aumentam consideravelmente durante a esporulação de B. emersonii. Iniciamos o estudo com uma busca no banco de ESTs de B. emersonii (http://blasto.iq.usp.br) por seqüências que codificassem enzimas envolvidas na síntese e degradação de cGMP. Foram encontradas três ESTs que codificam domínios catalíticos que parecem pertencer a três diferentes guanilato ciclases e uma EST codificando uma fosfodiesterase com alta similaridade com fosfodiesterases que possuem alta afinidade por cGMP. Experimentos de microarranjos de cDNA validados por RT-PCR quantitativo em tempo real mostraram que os quatro transcritos são expressos durante esporulação, com picos de indução durante a fase tardia da esporulação, momento em que ocorre a biogênese dos zoósporos. Além disso, dados obtidos a partir de experimentos in vivo e in vitro utilizando inibidores das enzimas guanilato ciclase e óxido nítrico sintase, sugeriram a participação do íon Ca2+ e do radical livre óxido nítrico (•NO) na atividade de guanilato ciclase, em uma via do tipo Ca2+-•NO-cGMP. / In the present work, we analyzed global gene expression changes during the sporulation phase of the aquatic fungus Blastocladiella emersonii using cDNA microarray technology with chips containing 3773 distinct genes. A total of 615 genes were upregulated and 645 were down-regulated along the sporulation of the fungus. The overrepresented functional categories among the induced genes were: microtubule and cytoskeleton, signal transduction, Ca2+ binding activity, proteolysis (only at the beginning of sporulation), and chromosome biogenesis and organization (only at the end of sporulation). Among the down-regulated genes, the over-represented functional categories were: protein biosynthesis, carbohydrate transport, and energetic metabolism. Sporulation gene expression data were compared with those obtained recently in our laboratory for the germination phase, showing that a great number of genes are inversely regulated along the two differentiation stages of B. emersonii life cycle. We also analyzed the effects of glucose and tryptophan on gene expression during biogenesis of the zoospores, as such nutrients are able to inhibit B. emersonii sporulation. Our results showed that in the presence of glucose (1%) genes related to activity and composition of cytoskeleton were over-expressed, while in the presence of tryptophan genes involved in protein folding, proteolysis and oxidative stress were induced. In addition, genes involved in the sporulation process per se were downregulated by tryptophan treatment. We also investigated the cyclic GMP signaling pathway, as the levels of this cyclic nucleotide increase considerably during B. emersonii sporulation. Firstly, we searched for sequences encoding enzymes involved in cGMP synthesis and degradation using the B. emersonii EST databank (http://blasto.iq.usp.br). Three sequences were found encoding distinct guanylate cyclase catalytic domains, and one showed high similarity with phosphodiesterases that exhibit high affinity for cGMP. Microarray experiments, validated by real time quantitative RT-PCR, showed that the four transcripts are induced during sporulation, reaching maximum levels at the late stages of sporulation, when zoospore biogenesis occurs. In addition, data obtained from in vivo and in vitro experiments using inhibitors for the enzymes guanylate cyclase and nitric oxide synthase indicated the involvement of the ion Ca2+ and the free radical nitric oxide (•NO) in guanylate cyclase activity, suggesting the existence of a Ca2+-• NO-cGMP signaling pathway.
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Planejamento, gerenciamento e análise de dados de microarranjos de DNA para identificação de biomarcadores de diagnóstico e prognóstico de cânceres humanos / Planning, management and analysis of DNA microarray data aiming at discovery of biomarkers for diagnosis and prognosis of human cancers.

Simões, Ana Carolina Quirino 12 May 2009 (has links)
Nesta tese, apresentamos nossas estratégias para desenvolver um ambiente matemático e computacional para análises em larga-escala de dados de expressão gênica obtidos pela tecnologia de microarranjos de DNA. As análises realizadas visaram principalmente à identificação de marcadores moleculares de diagnóstico e prognóstico de cânceres humanos. Apresentamos o resultado de diversas análises implementadas através do ambiente desenvolvido, as quais conduziram a implementação de uma ferramenta computacional para a anotação automática de plataformas de microarranjos de DNA e de outra ferramenta destinada ao rastreamento da análise de dados realizada em ambiente R. Programação eXtrema (eXtreme Programming, XP) foi utilizada como técnica de planejamento e gerenciamento dos projetos de análise dados de expressão gênica. Todos os conjuntos de dados foram obtidos por nossos colaboradores, utilizando-se duas diferentes plataformas de microarranjos de DNA: a primeira enriquecida em regiões não-codificantes do genoma humano, em particular regiões intrônicas, e a segunda representando regiões exônicas de genes humanos. A primeira plataforma foi utilizada para avaliação do perfil de expressão gênica em tumores de próstata e rim humanos, sendo que análises utilizando SAM (Significance Analysis of Microarrays) permitiram a proposição de um conjunto de 49 sequências como potenciais biomarcadores de prognóstico de tumores de próstata. A segunda plataforma foi utilizada para avaliação do perfil de transcritos expressos em sarcomas, carcinomas epidermóide e carcinomas epidermóides de cabeça e pescoço. As análises com sarcomas permitiram a identificação de um conjunto de 12 genes relacionados à agressividade local e metástase. As análises com carcinomas epidermóides de cabeça e pescoço permitiram a identificação de 7 genes relacionados à metástase linfonodal. / In this PhD Thesis, we present our strategies to the development of a mathematical and computational environment aiming the analysis of large-scale microarray datasets. The analyses focused mainly on the identification of molecular markers for diagnosis and prognosis of human cancers. Here we show the results of several analyses implemented using this environment, which led to the development of a computational tool for automatic annotation of DNA microarray platforms and a tool for tracking the analysis within R environment. We also applied eXtreme Programming (XP) as a tool for planning and management of gene expression analyses projects. All data sets were obtained by our collaborators using two different microarray platforms. The first is enriched in non-coding human sequences, particularly intronic sequences. The second one represents exonic regions of human genes. Using the first platform, we evaluated gene expression profiles of prostate and kidney human tumors. Applying SAM to prostate tumor data revealed 49 potential molecular markers for prognosis of this disease. Gene expression in samples of sarcomas, epidermoid carcinomas and head and neck epidermoid carcinomas was investigated using the second platform. A set of 12 genes were identified as potential biomarkers for local aggressiveness and metastasis in sarcoma. In addition, the analyses of data obtained from head and neck epidermoid carcinomas allowed the identification of 7 potential biomarkers for lymph-nodal metastases.
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Regulação da expressão gênica pela toxina da aranha Phoneutria nigriventer no corpo cavernoso in vivo / In vivo regulation of gene expression in the corpus cavernosum by the Phoneutria nigriventer toxin

Villanova, Fabiola Elizabeth 04 September 2009 (has links)
INTRODUÇÃO: O aracnídeo Phoneutria nigriventer, também conhecido por aranha-armadeira, possui um veneno complexo, contendo vários peptídeos que ativam canais iônicos nas células. Dentre estes, só dois neuropeptídeos, Tx2-5 e Tx2-6, destacam-se por relaxar o músculo liso trabecular do corpo cavernoso, induzindo ereção peniana em camundongos e ratos. Este efeito tem sido associado à produção de oxido nítrico pela ativação de óxido nítrico sintases. No entanto, faltam estudos mais amplos para determinar o papel de Tx2-6 na indução da ereção. OBJETIVOS: Identificar os genes diferencialmente expressos no tecido erétil de camundongos após indução da ereção pela Tx2-6 utilizando microarranjos de oligonucleotídeos. Validação dos resultados obtidos nos microarranjos por PCR quantitativa e imuno-histoquímica. MATERIAIS E MÉTODOS: Camundongos machos e adultos da linhagem Swiss foram divididos em dois grupos: controle (n=10), inoculados pela via intracavernosa com 20 l de solução salina; e tratado (n=10), os quais receberam 0,006gg/animal do peptídeo Tx2-6 diluído em 20 l de salina pela via intracavernosa. Uma hora após o início da ereção no grupo tratado todos os animais foram sacrificados e retirou-se o pênis. Este último foi dividido em dois fragmentos, uma parte do material foi congelada em nitrogênio líquido e mantida a 80°C até a extração do RNA para os experimentos de microarranjos e PCR quantitativa; outra parte foi utilizada para avaliação imuno-histoquímica. RESULTADOS: No grupo tratado a ereção foi observada 30-45 minutos após aplicação de Tx2-6 e mantida durante 120 minutos. Os camundongos de grupo controle não apresentaram nenhum indício de ereção. Nos experimentos de microarranjos, onde foram analisados 34.000 genes representando o genoma total do camundongo, identificou-se 3.803 (12,3%) genes com expressão diferencial de pelo menos ±1,5 vez entre os grupos (1.823 genes superexpressos e 1.980 genes subexpressos no grupo tratado comparado ao controle). Os genes ednrb, sparc, fn1, sstr2, pdgfr foram selecionados para validação dos microarranjos por PCR quantitativa e confirmaram a superexpressão em relação aos controles. As proteínas Fn1, Sstr2 e Pdgfr resultaram aumentadas no grupo tratado após avaliação imuno-histoquímica. CONCLUSÕES: A inoculação de Tx2-6 pela via intracavernosa alterou o perfil de expressão gênica no tecido erétil de camundongos. O número de genes superexpressos foi similar ao de genes subexpressos. Serão necessários outros estudos para entender melhor as vias moleculares que Tx2-6 afeta na indução da ereção peniana. / INTRODUCTION: The Phoneutria nigriventer arachnid, also known as armed-spider, has a complex venom, composed by several peptides that affect cellular ionic channels. Among these, only two neuropeptides, Tx2-5 and Tx2-6 induce penile erection in mice and rats and this effect has been associated with the production of nitric oxide by the activation of nitric oxide synthases. Moreover, there is a scarcity of studies focusing on the role of Tx2-6 in the induction of erection. OBJECTIVES: To identify the differently expressed genes in the erectile tissue of mice after erection induction by Tx2-6 using oligonucleotide microarrays. To validate microarray results by quantitative PCR and immunohistochemistry. MATERIALS AND METHODS: Swiss adult male mice were divided in two groups: control (n=10) were injected intracavernously with 20 gl of saline solution; and treated (n=10) were injected intracavernously with 0.006gg/mouse of the Tx2-6 peptide diluted in 20 gl of saline solution. After checking the penile erection in the treated group, all mice were sacrificed one hour after the beginning of erection for the removal of the penis. Penile organ was divided into two fragments, one piece was immediately frozen in liquid-nitrogen and stored at -80°C until RNA extraction to make the microarray and quantitative PCR experiments; the other was reserved for immunohistochemistry analysis. RESULTS: In the treated group, erection was noticed 30-45 minutes after Tx2-6 inoculation and lasted for 120 minutes. Control mice did not present any sign of erection. Considering as differentially expressed genes with a ±1.5 fold expression difference, of the 34,000 genes on the microarray we identified 3,803 (12.3%) genes differentially expressed between the groups (1,823 genes up-regulated and 1,980 genes down-regulated in the treated group compared to controls). The ednrb, sparc, fn1, sstr2, pdgfr genes were selected for validation of microarray results by using quantitative PCR and confirmed the up-regulation when compared to controls. After immunohistochemistry analysis the Fn1, Sstr2 and Pdgfr proteins were found increased in the treated group. CONCLUSIONS: The intracavernous inoculation of Tx2-6 modified the gene expression profile of erectile tissue of mice. The number of upregulated and down-regulated genes was similar. Further studies are needed to understand the molecular pathways that Tx2-6 affect to induce penile erection.
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Identificação de perfis de expressão de RNAs codificadores e não codificadores de proteína como preditores de recorrência de câncer de próstata / Identification of protein-coding and non-coding RNA expression profiles as prognostic marker of prostate cancer biochemical recurrence

Moreira, Yuri José de Camargo Barros 27 August 2010 (has links)
O câncer de próstata é o quinto tipo mais comum de câncer no mundo e o mais comum em homens. Fatores clínicos e anatomopatológicos atualmente usados na clínica não são capazes de distinguir entre a doença indolente e a agressiva. Existe uma grande necessidade de novos marcadores de prognóstico, a fim de melhorar o gerenciamento clínico de pacientes de câncer de próstata. Além das anormalidades em genes codificadores de proteínas, alterações em RNAs não codificadores (ncRNAs) contribuem para a patogênese do câncer e, portanto, representam outra fonte potencial de biomarcadores de câncer de próstata. Entretanto, até o momento, poucos estudos de perfis de expressão de ncRNAs foram publicados. Este projeto teve como principal objetivo identificar perfis de expressão de genes codificadores e não codificadores de proteína correlacionados com recorrência de tumor de próstata, a fim de gerar um perfil prognóstico com potencial uso como biomarcadores e elucidar o possível papel de ncRNAs no desenvolvimento do câncer. Para isso, foram analisados os perfis de expressão de genes codificadores e não codificadores de proteína de um conjunto de 42 amostras de tecido tumoral de câncer de próstata de pacientes de amostras de pacientes submetidos à prostatectomia radical, com longo acompanhamento clínico (cinco anos) e conhecida evolução da doença Nós utilizamos microarranjos por nós desenhados e fabricados pela Agilent sob encomenda, interrogando aproximadamente 18.709 transcritos não codificadores longos (>500 nt), sem evidência de splicing, que mapeiam em regiões intrônicas dentro de 5.660 loci genômicos. Os dados de expressão foram extraídos de cada arranjo, normalizados entre todas as 42 amostras de pacientes. Usando uma estratégia de múltipla amostragem, foi identificado um perfil de expressão de mau prognóstico, contendo 51 transcritos intrônicos não codificadores de proteína. O perfil prognóstico de ncRNAs foi aplicado a um conjunto teste independente de 22 pacientes, classificando corretamente 82% das amostras. Uma análise de Kaplan-Meier dos pacientes do conjunto teste indicou que as curvas de sobrevida dos grupos de alto e baixo risco foram significativamente distintas (Log-rank test p = 0,0009; Hazard ratio = 23,4, 95% CI = 3,62 a 151,2), confirmando assim que este classificador é útil para identificar pacientes com alto risco de recorrência. Além disso, estas descobertas indicam um potencial papel destes RNAs intrônicos não codificadores na progressão do tumor de próstata e apontam para os RNAs intrônicos como potenciais novos marcadores de câncer / Prostate cancer is the fifth most common type of cancer in the world, and the most common in men. Clinical and anatomo-pathological factors currently used in clinic are not able to distinguish between the indolent and the aggressive disease. There is a major need of new prognostic makers in order to improve the clinical management of prostate cancer patients. Apart from abnormalities in protein-coding genes, changes in non-coding RNAs (ncRNAs) contribute to the pathogenesis of cancer and thus represent another potential source of prostate cancer biomarkers. However, few studies of expression profiles of ncRNAs have been published. This project aimed to identify expression profiles of protein-coding and non-coding genes correlated to prostate cancer biochemical recurrence. For this, we analyzed the expression profile of 42 prostate cancer samples from patients undergoing radical prostatectomy, with long follow-up (five years), and know disease outcome. We used a custom microarray designed by us and printed by Agilent, that probes 18,709 long (>500 nt) ncRNAs mapping to intronic regions within 5,660 genomic loci. The expression data were extracted from each array and normalized across all 42 samples. Using a multiple random sampling validation strategy, we identified an expression profile of poor prognosis, comprising 51 ncRNAs. The prognostic profile of ncRNAs was applied to an independent test set of 22 patients, correctly classifying 82% of the samples. A Kaplan-Meier analysis of the test set of patients indicated that the survival curves of high and low risk groups were significantly different (Log-rank test p = 0.0009, Hazard ratio = 23.4, 95% CI = 3.62 to 151.2) thus confirming that this classifier is useful for identifying patients at high risk of recurrence. Furthermore, these findings indicate a potential role of these intronic non-coding RNAs in the progression of prostate tumors and points to the intronic ncRNAs as potential new markers of cancer.
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Identificação e análise da expressão de genes relacioanados com tolerância à seca em soja através de microarranjos de DNA e PCR em tempo real

Stolf, Renata [UNESP] 19 December 2007 (has links) (PDF)
Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:16Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-12-19Bitstream added on 2014-06-13T19:42:46Z : No. of bitstreams: 1 stolf_r_dr_jabo.pdf: 614846 bytes, checksum: 82111cb3ffddd8bb8eb4829df0158e4a (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A seca é, atualmente, o principal fator responsável por perdas na produção brasileira de soja. Em situações de déficit hídrico, vários mecanismos são acionados pela planta para aumentar a tolerância à seca. Conhecer esses mecanismos e como é regulada a expressão dos genes relacionados com resposta à seca, é essencial na identificação de rotas metabólicas envolvidas nos processos de defesa, e, conseqüentemente, no desenvolvimento de estratégias moleculares para obtenção de plantas mais tolerantes a essa condição. O estudo da expressão gênica em plantas requer a quantificação precisa de RNAm expressos em diferentes situações. Assim, inicialmente foram usados os eventos de soja geneticamente modificados para tolerância à seca, P58 e P1333, contendo a construção rd29a: Atdreb1a, em condições de 15% de umidade gravimétrica (UG) para hibridização em chips contendo 44 Kb de oligonucleotídeos, sendo possível identificar 100 genes diferencialmente expressos em cada evento, quando comparados com a planta controle. Posteriormente, foram utilizadas cultivares de soja contrastantes para a tolerância à seca, em diferentes condições de déficit hídrico no sistema de hidroponia, e construídos arranjos de cDNA a partir de biblioteca gerada, obtendo-se 145 genes diferencialmente expressos que codificam proteínas envolvidas direta elou indiretamente em rotas metabólicas de resposta a estresses bióticos e abióticos. Os grupos de genes identificados como diferencialmente expressos durante os tratamentos aplicados em ambos os experimentos foram classificados em categorias funcionais, entre eles genes envolvidos na produção de energia, fatores de transcrição, genes envolvidos em diferentes vias anabólicas e/ou catabólicas como aminoácidos, lipídeos, carboidratos e no metabolismo fotossintético, genes de respostas a estresses, genes que participam... / The drought is currently the main responsible factor for losses Brazilian soybeans production. In water stress situation, several mechanisms are triggered by the plant to increase tolerance to drought. Knowing these mechanisms and how is regulated the expression of genes related to the drought response is essential in identifying routes involved in the metabolic processes of defense, and, therefore, the development of molecular strategies to obtain more tolerant plants to this condition. The study of gene expression in plants requires the quantification of RNAm expressed in different situations. So, initially, two methodologies of DNA microarray for analysis in large scale of differential gene expression were conducted. First, soybeans events genetically modified for tolerance to drought, P58 and P1333 containing the construction rd29a: Atdreb1a under conditions of 15% gravimetric humidity (GH) were used in chips containing 44 Kb of oligonucleotides, being able to identify 100 differential gene expression in each event, compared with the control plant. Subsequently, contrasting cultivars to drought were used, in different conditions of water stress in the hidroponic system, and cDNA arrays were constructed, getting 145 differential gene expression that encode proteins involved directly and I or indirectly on routes of metabolic response to biotic and abiotic stresses. The groups of genes identified with differential expression during the treatments applied in both experiments were classified into functional categories, including genes involved in the production of energy, of transcription factors, genes involved in different ways anabolics and I or catabolics as amino acids, lipids, carbohydrates and the photosynthetic metabolism, gene responses to stresses, genes that participate in the synthesis of proteins, cell communication, the cell cycle, cellular transport genes with... (Complete abstract click electronic access below)
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Expressão gênica diferencial durante a esporulação de Blastocladiella emersonii e estudo da sinalização por GMP cíclico / Differential gene expression during Blastocladiella emersonii sporulation and analysis of the cyclic GMP signaling pathway

André Luiz Gomes Vieira 24 April 2009 (has links)
Neste trabalho realizamos a análise das variações na expressão gênica global durante a fase de esporulação do fungo aquático Blastocladiella emersonii utilizando a tecnologia dos microarranjos de cDNA em lâminas contendo 3.773 genes distintos. Ao todo 615 genes foram classificados como induzidos enquanto 645 foram classificados como reprimidos ao longo da esporulação. As categorias funcionais mais representadas entre os genes induzidos foram: microtúbulo e citoesqueleto, transmissão de sinal, atividade de ligação ao íon Ca2+, proteólise (apenas no início da esporulação) e biogênese e organização do cromossomo (apenas no final da esporulação). Dentre os genes reprimidos, as categorias funcionais mais representadas foram: biossíntese de proteína, transporte de carboidratos e metabolismo energético. A comparação dos dados de expressão gênica da esporulação com aqueles obtidos recentemente em nosso laboratório para a germinação mostrou um grande número de genes regulados inversamente ao longo das duas fases de diferenciação do ciclo de vida de B. emersonii. Muitos genes induzidos na esporulação são reprimidos na germinação e vice versa. Analisamos também o efeito de glicose e triptofano sobre a expressão gênica durante a formação dos zoósporos, tendo em vista que tais nutrientes são capazes de inibir a esporulação de B. emersonii. Nossos resultados mostraram que na presença de glicose (1%) genes envolvidos na composição e atividade do citoesqueleto foram superexpressos, enquanto na presença do aminoácido triptofano houve um aumento na expressão de genes envolvidos no processo de enovelamento de proteínas e proteólise, e na resposta ao estresse oxidativo. Além disso, genes envolvidos no processo de esporulação propriamente dito foram reprimidos durante o tratamento com triptofano. Investigamos também a via de sinalização por GMP cíclico (cGMP), cujos níveis aumentam consideravelmente durante a esporulação de B. emersonii. Iniciamos o estudo com uma busca no banco de ESTs de B. emersonii (http://blasto.iq.usp.br) por seqüências que codificassem enzimas envolvidas na síntese e degradação de cGMP. Foram encontradas três ESTs que codificam domínios catalíticos que parecem pertencer a três diferentes guanilato ciclases e uma EST codificando uma fosfodiesterase com alta similaridade com fosfodiesterases que possuem alta afinidade por cGMP. Experimentos de microarranjos de cDNA validados por RT-PCR quantitativo em tempo real mostraram que os quatro transcritos são expressos durante esporulação, com picos de indução durante a fase tardia da esporulação, momento em que ocorre a biogênese dos zoósporos. Além disso, dados obtidos a partir de experimentos in vivo e in vitro utilizando inibidores das enzimas guanilato ciclase e óxido nítrico sintase, sugeriram a participação do íon Ca2+ e do radical livre óxido nítrico (•NO) na atividade de guanilato ciclase, em uma via do tipo Ca2+-•NO-cGMP. / In the present work, we analyzed global gene expression changes during the sporulation phase of the aquatic fungus Blastocladiella emersonii using cDNA microarray technology with chips containing 3773 distinct genes. A total of 615 genes were upregulated and 645 were down-regulated along the sporulation of the fungus. The overrepresented functional categories among the induced genes were: microtubule and cytoskeleton, signal transduction, Ca2+ binding activity, proteolysis (only at the beginning of sporulation), and chromosome biogenesis and organization (only at the end of sporulation). Among the down-regulated genes, the over-represented functional categories were: protein biosynthesis, carbohydrate transport, and energetic metabolism. Sporulation gene expression data were compared with those obtained recently in our laboratory for the germination phase, showing that a great number of genes are inversely regulated along the two differentiation stages of B. emersonii life cycle. We also analyzed the effects of glucose and tryptophan on gene expression during biogenesis of the zoospores, as such nutrients are able to inhibit B. emersonii sporulation. Our results showed that in the presence of glucose (1%) genes related to activity and composition of cytoskeleton were over-expressed, while in the presence of tryptophan genes involved in protein folding, proteolysis and oxidative stress were induced. In addition, genes involved in the sporulation process per se were downregulated by tryptophan treatment. We also investigated the cyclic GMP signaling pathway, as the levels of this cyclic nucleotide increase considerably during B. emersonii sporulation. Firstly, we searched for sequences encoding enzymes involved in cGMP synthesis and degradation using the B. emersonii EST databank (http://blasto.iq.usp.br). Three sequences were found encoding distinct guanylate cyclase catalytic domains, and one showed high similarity with phosphodiesterases that exhibit high affinity for cGMP. Microarray experiments, validated by real time quantitative RT-PCR, showed that the four transcripts are induced during sporulation, reaching maximum levels at the late stages of sporulation, when zoospore biogenesis occurs. In addition, data obtained from in vivo and in vitro experiments using inhibitors for the enzymes guanylate cyclase and nitric oxide synthase indicated the involvement of the ion Ca2+ and the free radical nitric oxide (•NO) in guanylate cyclase activity, suggesting the existence of a Ca2+-• NO-cGMP signaling pathway.
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Regulação da expressão gênica pela toxina da aranha Phoneutria nigriventer no corpo cavernoso in vivo / In vivo regulation of gene expression in the corpus cavernosum by the Phoneutria nigriventer toxin

Fabiola Elizabeth Villanova 04 September 2009 (has links)
INTRODUÇÃO: O aracnídeo Phoneutria nigriventer, também conhecido por aranha-armadeira, possui um veneno complexo, contendo vários peptídeos que ativam canais iônicos nas células. Dentre estes, só dois neuropeptídeos, Tx2-5 e Tx2-6, destacam-se por relaxar o músculo liso trabecular do corpo cavernoso, induzindo ereção peniana em camundongos e ratos. Este efeito tem sido associado à produção de oxido nítrico pela ativação de óxido nítrico sintases. No entanto, faltam estudos mais amplos para determinar o papel de Tx2-6 na indução da ereção. OBJETIVOS: Identificar os genes diferencialmente expressos no tecido erétil de camundongos após indução da ereção pela Tx2-6 utilizando microarranjos de oligonucleotídeos. Validação dos resultados obtidos nos microarranjos por PCR quantitativa e imuno-histoquímica. MATERIAIS E MÉTODOS: Camundongos machos e adultos da linhagem Swiss foram divididos em dois grupos: controle (n=10), inoculados pela via intracavernosa com 20 l de solução salina; e tratado (n=10), os quais receberam 0,006gg/animal do peptídeo Tx2-6 diluído em 20 l de salina pela via intracavernosa. Uma hora após o início da ereção no grupo tratado todos os animais foram sacrificados e retirou-se o pênis. Este último foi dividido em dois fragmentos, uma parte do material foi congelada em nitrogênio líquido e mantida a 80°C até a extração do RNA para os experimentos de microarranjos e PCR quantitativa; outra parte foi utilizada para avaliação imuno-histoquímica. RESULTADOS: No grupo tratado a ereção foi observada 30-45 minutos após aplicação de Tx2-6 e mantida durante 120 minutos. Os camundongos de grupo controle não apresentaram nenhum indício de ereção. Nos experimentos de microarranjos, onde foram analisados 34.000 genes representando o genoma total do camundongo, identificou-se 3.803 (12,3%) genes com expressão diferencial de pelo menos ±1,5 vez entre os grupos (1.823 genes superexpressos e 1.980 genes subexpressos no grupo tratado comparado ao controle). Os genes ednrb, sparc, fn1, sstr2, pdgfr foram selecionados para validação dos microarranjos por PCR quantitativa e confirmaram a superexpressão em relação aos controles. As proteínas Fn1, Sstr2 e Pdgfr resultaram aumentadas no grupo tratado após avaliação imuno-histoquímica. CONCLUSÕES: A inoculação de Tx2-6 pela via intracavernosa alterou o perfil de expressão gênica no tecido erétil de camundongos. O número de genes superexpressos foi similar ao de genes subexpressos. Serão necessários outros estudos para entender melhor as vias moleculares que Tx2-6 afeta na indução da ereção peniana. / INTRODUCTION: The Phoneutria nigriventer arachnid, also known as armed-spider, has a complex venom, composed by several peptides that affect cellular ionic channels. Among these, only two neuropeptides, Tx2-5 and Tx2-6 induce penile erection in mice and rats and this effect has been associated with the production of nitric oxide by the activation of nitric oxide synthases. Moreover, there is a scarcity of studies focusing on the role of Tx2-6 in the induction of erection. OBJECTIVES: To identify the differently expressed genes in the erectile tissue of mice after erection induction by Tx2-6 using oligonucleotide microarrays. To validate microarray results by quantitative PCR and immunohistochemistry. MATERIALS AND METHODS: Swiss adult male mice were divided in two groups: control (n=10) were injected intracavernously with 20 gl of saline solution; and treated (n=10) were injected intracavernously with 0.006gg/mouse of the Tx2-6 peptide diluted in 20 gl of saline solution. After checking the penile erection in the treated group, all mice were sacrificed one hour after the beginning of erection for the removal of the penis. Penile organ was divided into two fragments, one piece was immediately frozen in liquid-nitrogen and stored at -80°C until RNA extraction to make the microarray and quantitative PCR experiments; the other was reserved for immunohistochemistry analysis. RESULTS: In the treated group, erection was noticed 30-45 minutes after Tx2-6 inoculation and lasted for 120 minutes. Control mice did not present any sign of erection. Considering as differentially expressed genes with a ±1.5 fold expression difference, of the 34,000 genes on the microarray we identified 3,803 (12.3%) genes differentially expressed between the groups (1,823 genes up-regulated and 1,980 genes down-regulated in the treated group compared to controls). The ednrb, sparc, fn1, sstr2, pdgfr genes were selected for validation of microarray results by using quantitative PCR and confirmed the up-regulation when compared to controls. After immunohistochemistry analysis the Fn1, Sstr2 and Pdgfr proteins were found increased in the treated group. CONCLUSIONS: The intracavernous inoculation of Tx2-6 modified the gene expression profile of erectile tissue of mice. The number of upregulated and down-regulated genes was similar. Further studies are needed to understand the molecular pathways that Tx2-6 affect to induce penile erection.
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Estudos funcionais da proteína reguladora humana Ki-1/57 e seus parceiros de interação / Functional studies of the human regulatory protein Ki-1/57 and its interaction partners

Gonçalves, Kaliandra de Almeida, 1984- 07 December 2011 (has links)
Orientador: Jörg Kobarg / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-18T16:47:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Goncalves_KaliandradeAlmeida_D.pdf: 14162647 bytes, checksum: a062a24283fc9889ec54663e0b624c2f (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: A proteína Ki-1/57 foi descoberta através da reação cruzada do anticorpo monoclonal Ki-1 em células do linfoma de Hodgkin. Estudos anteriores demonstraram que Ki-1/57 interage com a proteína RACK-1, sofre fosforilação por PKCs e metilação por PRMT1, uma arginino metiltransferase que modula diversas proteínas ligantes ao RNA. Estudos mostraram que Ki- 1/57 é capaz de controlar o splicing do pré-mRNA do gene viral E1A. Análises por SAXS, gel filtração analítica e ultracentrifugação analítica indicaram uma estrutura bastante alongada e flexível para a construção C-terminal 6xhis-(122-413)Ki-1/57. Ensaios de proteólise limitada também mostraram uma baixa composição de núcleos hidrofóbicos estáveis e compactos, sugerindo que a proteína é intrinsecamente desordenada, o que pode explicar o elevado número de diferentes proteínas parceiras que ela é capaz de interagir. Neste trabalho foi identificada a interação de Ki-1/57 com proteínas da Família do X frágil, e sua localização no Perfil Ribossomal, além de ser capaz de ativar a tradução quando conectada ao gene repórter da Luciferase. Outra observação importante é que Ki-1/57 é sumoilada in vitro e in vivo, sendo as lisinas alvos desta sumoilação identificadas, e a proteína não sumoilada é incapaz de atuar no splicing do pré-mRNA do gene viral E1A. Mais experimentos foram feitos no sentido de caracterizar a interação RACK-Ki-1/57. A interação entre as duas proteínas é forte, possuindo uma constante de dissociação de 0,7 ?M, seguindo uma estequiometria de 1:1 observada em experimentos de sedimentação em equilíbrio. Experimentos de ultracentrifugação analítica mostraram que a proteína RACK1 tem propriedades hidrodinâmicas similares ao seu modelo predito por homologia, e que em solução ela é encontrada em sua forma monomérica, possuindo uma leve tendência a agregação. A superexpressão de Ki-1/57 e CGI-55 provocou a alteração de 413 e 217 genes respectivamente, que em sua grande maioria foram regulados negativamente. A maioria dos genes, que foram inibidos pela superexpressão de Ki-1/57, estão envolvidos na proliferação celular, muitos sendo expressos em diferentes tumores. Os dados obtidos no teste do MTS confirmam que houve uma diminuição na proliferação celular em células superexpressando as proteínas Ki-1/57 e CGI-55. Com base nos resultados obtidos neste trabalho, novas funções da proteína Ki-1/57 foram descritas, tais como: a influência de Ki-1/57 na proliferação celular, na tradução proteica e o papel importante que a modificação pós traducional, como a sumoilação, representa para que a proteína Ki-1/57 desempenhe sua função / Abstract: The protein Ki-1/57 was discovered through cross reactivity of the monoclonal antibody Ki-1 in cells of Hodgkin lymphoma. Previously studies demonstrated that Ki-1/57 interacts with RACK-1 protein, undergoes phosphorylation by PKCs and methylation by PRMT1, an arginine methyltransferase that modulates several RNA binding proteins. Studies have shown that Ki- 1/57 is able to control the pre-mRNA splicing of the viral E1A gene. SAXS analysis, analytical gel filtration and analytical ultracentrifugation indicate a rather elongated and flexible structure to build C-terminal 6xhis-(122-413) Ki-1/57. Limited proteolysis assays also showed a low composition of stable and compact hydrophobic cores, suggesting that the protein is intrinsically unstructured, it could explain the wide array of protein partners with which it is able to interact. In this work we identified the interaction of Ki-1/57 proteins with Family fragile X, and its location on Ribosomal profile, besides being able to increase the translation when tethered to the reporter gene Luciferase. Another important observation is that Ki-1/57 is sumoylated in vitro and in vivo, the targets of this lysine sumoylated were identified, and the not somoylated protein is unable to act in the pre-mRNA splicing of E1A. More experiments were made to characterize the interaction of RACK1 with Ki-1/57. The interaction between the two proteins is strong, possessing a dissociation constant of 0.7 ?M and follows the stoichiometry of 1:1 as observed by sedimentation equilibrium experiments. Analytical ultracentrifugation experiments showed that human RACK1 has similar hydrodynamic properties to that predicted to homology model, and that in solution it is found in its monomeric form, with a slight tendency to aggregation. Overexpression of Ki-1/57 and CGI-55 caused changes in 413 and 217 genes respectively, which were mostly negative regulated. Most genes that were inhibited by overexpression of Ki-1/57 are involved in cell proliferation, and expressed in different types tumors. The MTS data obtained confirm a decrease in cell proliferation through overexpressing of Ki-1/57 and CGI-55 protein. Based on the results of this study new functions for Ki-1/57 protein have been described such as: the influence of Ki- 1/57 in cell proliferation, in protein translation and the important role that the post translational modification, such as sumoylation, represents so that the protein Ki-1/57 performs its function / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular
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Planejamento, gerenciamento e análise de dados de microarranjos de DNA para identificação de biomarcadores de diagnóstico e prognóstico de cânceres humanos / Planning, management and analysis of DNA microarray data aiming at discovery of biomarkers for diagnosis and prognosis of human cancers.

Ana Carolina Quirino Simões 12 May 2009 (has links)
Nesta tese, apresentamos nossas estratégias para desenvolver um ambiente matemático e computacional para análises em larga-escala de dados de expressão gênica obtidos pela tecnologia de microarranjos de DNA. As análises realizadas visaram principalmente à identificação de marcadores moleculares de diagnóstico e prognóstico de cânceres humanos. Apresentamos o resultado de diversas análises implementadas através do ambiente desenvolvido, as quais conduziram a implementação de uma ferramenta computacional para a anotação automática de plataformas de microarranjos de DNA e de outra ferramenta destinada ao rastreamento da análise de dados realizada em ambiente R. Programação eXtrema (eXtreme Programming, XP) foi utilizada como técnica de planejamento e gerenciamento dos projetos de análise dados de expressão gênica. Todos os conjuntos de dados foram obtidos por nossos colaboradores, utilizando-se duas diferentes plataformas de microarranjos de DNA: a primeira enriquecida em regiões não-codificantes do genoma humano, em particular regiões intrônicas, e a segunda representando regiões exônicas de genes humanos. A primeira plataforma foi utilizada para avaliação do perfil de expressão gênica em tumores de próstata e rim humanos, sendo que análises utilizando SAM (Significance Analysis of Microarrays) permitiram a proposição de um conjunto de 49 sequências como potenciais biomarcadores de prognóstico de tumores de próstata. A segunda plataforma foi utilizada para avaliação do perfil de transcritos expressos em sarcomas, carcinomas epidermóide e carcinomas epidermóides de cabeça e pescoço. As análises com sarcomas permitiram a identificação de um conjunto de 12 genes relacionados à agressividade local e metástase. As análises com carcinomas epidermóides de cabeça e pescoço permitiram a identificação de 7 genes relacionados à metástase linfonodal. / In this PhD Thesis, we present our strategies to the development of a mathematical and computational environment aiming the analysis of large-scale microarray datasets. The analyses focused mainly on the identification of molecular markers for diagnosis and prognosis of human cancers. Here we show the results of several analyses implemented using this environment, which led to the development of a computational tool for automatic annotation of DNA microarray platforms and a tool for tracking the analysis within R environment. We also applied eXtreme Programming (XP) as a tool for planning and management of gene expression analyses projects. All data sets were obtained by our collaborators using two different microarray platforms. The first is enriched in non-coding human sequences, particularly intronic sequences. The second one represents exonic regions of human genes. Using the first platform, we evaluated gene expression profiles of prostate and kidney human tumors. Applying SAM to prostate tumor data revealed 49 potential molecular markers for prognosis of this disease. Gene expression in samples of sarcomas, epidermoid carcinomas and head and neck epidermoid carcinomas was investigated using the second platform. A set of 12 genes were identified as potential biomarkers for local aggressiveness and metastasis in sarcoma. In addition, the analyses of data obtained from head and neck epidermoid carcinomas allowed the identification of 7 potential biomarkers for lymph-nodal metastases.

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