S'estudien diferents aspectes relacionats amb les característiques anatòmiques, histològiques, ultraestructurals i morfomètriques de les estructures que formen l'òrgan de la visió de sis espècies d'insectívors (Sorex minutus, S. araneus, S. coronatus, Neomys fodiens, Crocidura russula i Talpa europaea) i de deu espècies de rosegadors (Clethrionomys glareolus, Arvicola terrestris, Chionomys nivalis, Microtus gerbei, M. duodecimcostatus, M. arvalis, Apodemus sylvaticus, Mus domesticus, M. Spretus i Eliomys quercinus) capturats en els seus hàbitats naturals. Els objectius concrets de la memòria consisteixen en relacionar les diferències i similituds interespecífiques de l'òrgan de la visió amb els hàbitats i els patrons d'activitat temporal de cada espècie, tant des del punt de vista funcional com filogenètic. En definitiva, es realitza un estudi sobre l'ecologia de la visió de les espècies considerades.Excepte a T. Europaea, a on apareixen estructures oculars en estat regressiu com a resposta a la seva activitat hipogea, els ulls de les espècies d'insectívors analitzades, estan ben desenvolupats, tot i les seves reduïdes dimensions. La còrnia està coberta per una capa multilaminar formada per cèl·lules mortes que podria augmentar l'índex de refracció de la còrnia i, per tant, el poder diòptric de l'ull. A més, presenten característiques que afavoreixen la visió diürna, com una distància nodal posterior del globus ocular proporcionalment gran, un cristal·lí voluminós però amb la cara posterior més aplanada que l'anterior, i un percentatge de cons que, en general, supera el 5% del total de cèl·lules fotoreceptores, particularment en els representants del gènere Sorex. En les espècies d'aquest mateix gènere s'ha detectat la presència de mitocondris gegants (megamitocondris) als el·lipsoides dels cons. En mamífers, aquests orgànuls només han estat descrits prèviament als cons de les retines del gènere Tupaia (Scandentia) i, probablement incrementen l'eficàcia òptica d'aquests fotoreceptors. L'ull de N. Fodiens mostra adaptacions oculars pròpies dels animals semiaquàtics, i li permeten veure-hi tant a dins com a fora de l'aigua. En el cas dels rosegadors, les espècies d'arvicolins estudiades mostren millors adaptacions a una visió crepuscular o diürna que els ulls dels murins considerats, particularment M. Arvalis. Així, la densitat de bastonets és inferior a la dels murins pel que la seva sensibilitat a la llum serà també inferior. Per contra, la proporció més elevada de cons els dotarà d'una major agudesa visual. A més, els ulls són proporcionalment més petits degut a la seva activitat cavadora. Els globus oculars d'A. Terrestris conserven característiques oculars, tant anatòmiques com morfomètriques que indicarien un primer origen semiaquàtic i diürn, seguides per una readaptació a les condicions de baixa il·luminació de l'interior de les galeries. En canvi, els murins mostren característiques oculars eminentment nocturnes, no només per la seva mida, els ulls d'A. Sylvaticus són tan grans que li sobresurten del cap, sinó també per la forma dels seus dioptris i l'estructura histològica de totes les túniques oculars, especialment de la retina.Els resultats obtinguts corroboren la relació entre la morfologia i la biometria de les estructures oculars amb els hàbits i els hàbitats de les espècies considerades. S'estableix que malgrat les reduïdes dimensions oculars, les modificacions en la mida i forma de l'ull i dels seus dioptris (còrnia i cristal·lí) permeten aconseguir una visió adequada per tal que les espècies estudiades puguin adaptar-se a diferents condicions de llum ambiental. També es constata que les espècies filogenèticament emparentades comparteixen un mateix model d'ull i que és aquest model el que ha anat variant, tant des del punt de vista biològic com òptic, per permetre una millor adaptació de les espècies a nous hàbitats.

After an intense development of optical tweezers as a biophysical tool during the last decades, quantitative experiments in living cells have not found in this technique its best ally, due, in part, to the lack of a reliable method to measure forces in complex environments. The attempts to overcome this problem either require complicated in situ calibrations, which make their use impossible in the study of dynamic processes, or they are inaccurate. Using a different approach, Steven Smith at Carlos Bustamante’s lab at the University of Berkeley developed a method based on the direct measurement of the momentum change of the trapping beam. However, its diffusion has been modest mainly because it requires a counter-propagating optical trapping system, which is difficult to implement and combine with other techniques. Although it has not been used for this purpose yet, it seems a more suitable method for in vivo experiments since the measurement depends only on some properties of the sensor apparatus but not on the experiment itself. On the other hand, the use of holographic optical tweezers in molecular biology experiments involving force and position measurements is still far from established. The existence of different effects associated to the use of spatial light modulators to create the optical traps has restricted their use. In this thesis, I present the work that I carried out in the Optical Trapping Lab – Grup de Biofotònica at the University of Barcelona related to these two subjects. During these years, I have focused on the implementation of the force detection method based on the conservation of the light momentum in single-beam optical traps, and on the analysis of several aspects of holographic tweezers oriented to their use in quantitative experiments.

La microscopía confocal de reflectancia in vivo (MCR) es una técnica no invasiva que permite obtener un diagnóstico de forma inmediata y en tiempo real de patología cutánea tumoral con una precisión diagnóstica que se acerca al diagnóstico histológico convencional. La MCR puede permitir un seguimiento clínico de respuesta a tratamientos no invasivos de patología tumoral, como la terapia fotodinámica, sin necesidad de realizar biopsias. El presente trabajo reúne cuatro estudios realizados con el fin de demostrar la utilidad de la técnica de MCR en el estudio y manejo clínico de las neoplasias cutáneas. En el primer estudio se incluyeron de forma prospectiva 154 tumores cutáneos para establecer qué parámetros de microscopía confocal se relacionaban con cada tumor, analizar si estos criterios eran reproducibles y finalmente evaluar la correlación de estos parámetros con la dermatoscopia y la histología convencional. Según los resultados de este primer trabajo, cuatro características observables mediante MCR permitían diferenciar las lesiones melanocíticas (LM) de las no melanocíticas (LNM): patrón epidérmico en empedrado, crecimiento pagetoide, presencia de nidos celulares en la dermis y presencia de papilas dérmicas bien definidas en toda la lesión. Dentro de las LM, la presencia de células redondas en estratos suprabasales y de células nucleadas atípicas en la dermis se asociaban al diagnóstico de melanoma; mientras la presencia de papilas dérmicas con contorno reflectante (anillos basales) así como la observación de células basales típicas, se asociaban a nevus. Basándonos en la reproducibilidad y correlación histológica y dermatoscópica de los criterios de MCR, se desarrolló un algoritmo en dos etapas para el diagnóstico de melanoma consiguiendo una sensibilidad del 86,1% y una especificidad del 95.3% (J Am Acad Dermatol. 2009;61:216-29). En el segundo trabajo, se estudiaron los parámetros de microscopía confocal en melanomas de extensión superficial (MES) en fase de crecimiento vertical y en melanomas nodulares (MNs). Para ello se incluyeron de forma prospectiva 10 MNs, 10 MES con área nodular y 10 MES con área palpable. Se realizó un análisis sistemático y estudio estadístico de las características dermatoscópicas, confocales e histológicas de los 3 grupos de lesiones. Mientras los MNs mostraban patrones de dermatoscopia inespecíficos, los MES exhibían patrones multicomponente y puntuaciones más altas en los algoritmos de dermatoscopia. Por MCR, los MNs tenían poco crecimiento pagetoide y presentan a menudo un patrón normal de la epidermis, a diferencia de los MES que se caracterizaban por un patrón desestructurado de la epidermis y la presencia de abundantes células en estratos suprabasales Tanto en los MNs como en las áreas nodulares de los MES, en la unión dermo-epidérmica no se visualizaban las papilas dérmicas, en su lugar se observa una proliferación de células reflectantes atípicas no agregadas. En la dermis, los MNs exhibían a menudo unos agregados celulares característicos de aspecto cerebriforme, que podían observarse también en las áreas nodulares de algunos MES (Arch Dermatol. 2008;144:1311-20). En un tercer artículo estudiamos las características del carcinoma basocelular pigmentado (CBC) mediante MCR, histología e inmunohistoquímica (S-100, MelanA, HMB-45 y CD1a).Mediante MCR demostramos la presencia de estructuras reflectantes muy características de aspecto dendrítico dentro de los nidos tumorales situados en la dermis de los CBC estudiados, que correspondían por estudio inmunohistoquímico a melanocitos no neoplásicos que poblaban los nidos (Arch Dermatol. 2007;143:883-6). Finalmente, en un cuarto trabajo estudiamos la aplicabilidad de la MCR en el diagnóstico y seguimiento de pacientes con genodermatosis de alto riesgo de desarrollar cáncer cutáneo (síndrome de Gorlin -SG- y Xeroderma pigmentoso -XP-) afectos de CBCs múltiples y tratados con terapia fotodinámica con metil-aminolevulinato (MAL). Se incluyeron 4 pacientes con SG y 2 hermanos con XP. Se trataron lesiones únicas o múltiples en zonas localizadas con 1 a 3 ciclos de TFD-MAL. La exploración con MCR se realizó antes y 3 meses después del tratamiento en las lesiones diana. Se trataron 13 CBCs pigmentados faciales en los pacientes afectos de XP y múltiples lesiones en cara o tronco (hasta 200) en los afectos de SG. Globalmente se obtuvo una remisión clínica completa en un 25- 67% de las lesiones. La respuesta al tratamiento puedo ser correctamente evaluada mediante MCR (J Eur Acad Dermatol Venereol. 2011;25:819-27). En conclusión, la MCR parece ser útil en el diagnóstico diferencial de las lesiones pigmentadas y complementa a la dermatoscopia en el diagnóstico del melanoma. Esta técnica permite caracterizar subtipos de melanoma como el melanoma nodular. También sirve de ayuda en el diagnóstico y caracterización del carcinoma basocelular pigmentado y en su monitorización tras tratamiento con terapias no invasivas como la terapia fotodinámica. / This work brings together four studies to demonstrate the clinical utility of reflectance confocal microscopy (RCM) in the clinical management of cutaneous neoplasms. In the first study we prospectively included 154 skin tumors in order to develop an algorithm for the in vivo diagnosis of skin tumors. We analyzed RCM features on stored images before excision and performed statistical analyses to determine the association of RCM features with tumor types. Four confocal features differentiated melanocytic lesions (ML) from non-melanocytic lesions (NML): cobblestone pattern of epidermal layers, pagetoid spread, mesh appearance of the dermoepidermal junction, and the presence of dermal nests. Within ML, the presence of roundish suprabasal cells and atypical nucleated cells in the dermis was associated with melanoma, and the presence of edged papillae and typical basal cells was associated with nevi. Based on the reproducibility and histological and dermoscopic correlation of MCR criteria, we developed a two-step algorithm for the diagnosis of melanoma, achieving a sensitivity of 86.1% and specificity of 95.3% (J Am Acad Dermatol. 2009; 61: 216-29). In the second work we characterized nodular melanoma (NM) by dermoscopy, RCM and histopathology. We included 10NMs, 10 superficial spreading melanomas (SSMs) with a nodular area, and 10 SSMs with a blue palpable area but not yet nodular. Whereas NMs had predominantly nonspecific global dermoscopic patterns, SSMs exhibited a multicomponent pattern and higher dermoscopic scores. By RCM, distinctive confocal features were observed at all cutaneous levels in NMs compared with SSMs, suggesting different biological behavior. (Arch Dermatol. 2008, 144:1311-20). In the third article we explored the confocal features of pigmented basal cell carcinoma (BCC) and correlated the findings with histology and immunohistochemistry. RCM revealed highly refractive dendritic structures within tumor nests that corresponded to the presence of melanocytes within the tumor. RCM allowed the study of pigmented BCC and the identification of specific criteria. (Arch Dermatol. 2007; 143:883-6). Finally, in the fourth paper we aimed to evaluate the efficacy of methyl-aminolevulinate (MAL) photodynamic therapy (PDT) in basal cell carcinomas (BCCs) from patients with Gorlin syndrome (GS) and Xeroderma pigmentosum (XP), and to determine the utility of RCM in the diagnosis and the evaluation of therapeutic response. We included 4 patients with GS and 2 siblings with XP. Single or multiple lesions in localized areas were treated with 1 to 3 cycles of MAL PDT. RCM was performed before and 3 months after the treatment in target lesions. Overall, we obtained a complete clinical remission in 25 to 67% of the lesions. RCM could identify confocal features for BCC and assess tumor remissions after treatment (J Eur Acad Dermatol Venereol. 2011; 25:819-27).