Thesis (Ph. D.)--University of Virginia, 2008. / Includes bibliographical references. Also available online through Digital Dissertations.

Thesis (Ph. D.)--University of Washington, 2002. / Vita. Includes bibliographical references (leaves 90-103).

Résumé Les protéines XMAP215/ch-TOG appartiennent à une famille de protéines associées aux microtubules (MAPs), bien conservée tout au long de l'évolution, la famille XMAP215/Dis1. Cette famille joue un rôle dans la régulation du cytosquelette des microtubules (MT), en particulier pendant la division cellulaire. Chez l'humain, ch-TOG est la protéine surexprimée dans les tumeurs du colon et du foie, une protéine qui provient de cellules blastiques et de plusieurs formes de cancer. Certaines protéines XMAP215/ch-TOG ont été retrouvées dans différentes localisations cellulaires, toujours reliées aux MTs, donnant origine à une activité spécifique. Cependant, la localisation exacte de XMAP215/ch-TOG ainsi que son activité restait à être déterminées. Dans ce contexte scientifique, nous avons développé une série d'anticorps monoclonaux (mcAB) qui nous ont permis d'identifier deux populations différentes de la famille des protéines XMAP215/Dis1. Les images de microscopie confocale des cellules fixées ont montré une première localisation, la colocalisation bien connue XMAP215-microtubulaire (MT-XMAP215) qui s'observe pendant l'interphase et pendant la mitose (fuseau mitotique). Une deuxième localisation a été identifiée sur le bout plus des MTs, donnant XMAP215/ch-TOG comme faisant parti de la famille des protéines de bout plus (+TIPs). Cette deuxième colocalisation a été identifiée comme +TIP XMAP215/ch-TOG. La +TIP XMAP215 est la protéine la plus distale du bout des MTs. La hiérarchie a été établie en faisant la comparaison de la localisation de XMAP215/ch-TOG avec les protéines les plus connues du bout plus, telles qu'EB1, CLIP170 et p150Glued. Dans l'extrait mitotique de Xenopus laevis, les images obtenues in vivo par la microscopie de fluorescence par réflexion totale interne (TIRF) ont permis d'identifier une +TIP XMAP215 présente au bout des MTs qui polymérisent et dépolymérisent. Les images de microscopie cryo-électronique (Cryo-EM) ont montré une activité spécifique de la population +TIP XMAP215. Dans les solutions de tubuline pure, XMAP215 induit la formation de structures au bout des MTs, cette activité est compatible avec les mécanismes de croissance des MTs. Sur la base de nos résultats, nous proposons un modèle où XMAP215 se charge des dimères de tubuline en devenant une structure de type protofilament. Cette structure se lie au bout du MT en utilisant son domaine C-terminal, en rajoutant les dimères de tubuline et aussi certainement en participant à la fermeture de la structure microtubulaire même. La protéine interviendrait donc dans la dépolymérisation et aurait un rôle dans le mécanisme de dépolymérisation contrôlée. Une fois que l'addition de tubuline a eu lieu, la +TIP XMAP215 pourrait évoluer en MT-XMAP215, la forme la plus connue de la protéine qui a été associée au trafic des granules d'ARN. Mots cles : XMAP215, ch-TOG, microtubules, anticorps monoclonaux. / Summary XMAP215/ch-TOG are members of an evolutionary conserved family of microtubule-associated proteins (MAPs), the XMAP215/Dis1 family. This family of proteins plays a key role in the regulation of the microtubule (MT) cytoskeleton, particularly during the cell division. In humans, ch-TOG is the colon-hepatic tumor overexpresed gene, a protein whose sequence was originally reported from blastic cells and from several forms of cancer. A few members of the XMAP215/ch-TOG family have been found to be present in different cell localizations, always MT-related, perhaps providing in this way a selected activity. However, the XMAP215/ch-TOG exact localization and activity has remained as a theory to be probed. In this scientifical context, we developed a series of monoclonal antibodies (mcABs) that allow us to identify two different populations of the XMAP215/ Dis1 family of proteins. Confocal images of fixed cells revealed a first and well known XMAP215/ch-TOG population, a microtubular-XMAP215 (MT-XMAP215), co-localizing with microtubules (MTs) in interphase and mitotic spindle. A second localization was identified at the tips of growing MTs, placing XMAP215/ch-TOG as one more member of the known microtubule plus end tracking proteins (+TIPs). This second population was identified as the +TIP XMAP215/ch-TOG. The + TIP XMAP215 is the most distal +TIP protein at the tip of MTs. The + TIPs hierarchy was established comparing the XMAP215/ch-TOG localization with other well known + TIPs proteins such as EB1, CLIP170 and p150Glued. In the Xenopus laevis mitotic egg extract, the Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) In vivo images, identified a +TIP XMAP215 that is present at the tip of polymerizing and depolymerising MTs. Cryo-electron microscopy (Cryo-EM) images probed a selective activity for the +TIP XMAP215 population. In pure tubulin solutions XMAP215 shown to promote the formation of outwardly sheet structures at the tip of MTs, compatible with growing mechanisms in MTs. Based in our results we propose a model where free XMAP215 is previously loaded with tubulin dimers to become a protofilament-like structure. This structure joins the MT tip using its C-terminal domain, not only adding the tubulin dimmers but also perhaps participating in the MT sheet closure. The possibility that the protein participates in the MT depolymerization could be associated to a “controlled” depolymerization mechanism. Once the tubulin addition has taken place, the +TIP XMAP215 protein could evolve to a MT-XMAP215, the well know form of the protein that has been related to the RNA granules traffic. Key words: XMAP215, ch-TOG, microtubules, monoclonal antibodies.

<p> </p><p>In previous studies the carboxyl-terminus of microtubule-associated protein 1S was shown to interact with the <em>N</em>-methyl-D-aspartate receptor subunit NR3A (Eriksson <em>et. al.</em>)¹.  In this study, interactions between three truncations of the microtubule-associated proteins 1B and one truncation of the microtubule-associated protein 1S carboxyl-terminus and the <em>N</em>-methyl-D-aspartate receptor subunits NR1 and NR3A were examined. The study showed that an interaction occurred between amino acids 2167 to 2365 of the microtubule-associated protein 1B and NR3A.  That region of microtubule associated protein 1B corresponds to a microtubule-binding region in the light chain. It has been shown in earlier studies (Reviewed in Halpain S. <em>et a1²</em>, Riederer, BM<em>.  et.al³</em>.) that the light chain is a active part of the protein that have been post translational cleaved. The MAP 1 proteins are present in all tissue but has higher concentrations in the Post Synaptic Density of neurons in the central nervous system.  The <em>N</em>-methyl-D-aspartate receptors are present in glial cells and in the dendritic shafts of the central nervous system neurons (Eriksson <em>et. al.</em>)¹. The diseases were these proteins may play a part is mainly memory destructive diseases such as Alzheimers disease and in muscular dystrophy, but these assumptions are still being speculated.</p><p> </p>

In previous studies the carboxyl-terminus of microtubule-associated protein 1S was shown to interact with the N-methyl-D-aspartate receptor subunit NR3A (Eriksson et. al.)1.  In this study, interactions between three truncations of the microtubule-associated proteins 1B and one truncation of the microtubule-associated protein 1S carboxyl-terminus and the N-methyl-D-aspartate receptor subunits NR1 and NR3A were examined. The study showed that an interaction occurred between amino acids 2167 to 2365 of the microtubule-associated protein 1B and NR3A.  That region of microtubule associated protein 1B corresponds to a microtubule-binding region in the light chain. It has been shown in earlier studies (Reviewed in Halpain S. et a12, Riederer, BM.  et.al3.) that the light chain is a active part of the protein that have been post translational cleaved. The MAP 1 proteins are present in all tissue but has higher concentrations in the Post Synaptic Density of neurons in the central nervous system.  The N-methyl-D-aspartate receptors are present in glial cells and in the dendritic shafts of the central nervous system neurons (Eriksson et. al.)1 . The diseases were these proteins may play a part is mainly memory destructive diseases such as Alzheimers disease and in muscular dystrophy, but these assumptions are still being speculated.

Oocytes of most species assemble and maintain a functional bipolar spindle in the absence of centrosomes. Strikingly, after bipolar spindle formation, oocytes arrest in metaphase for several hours before fertilisation. How the dynamic spindle maintains its bipolarity during this long arrest is poorly understood. I hypothesise that the bipolar spindle is stably maintained by changes in the distribution of microtubule-associated proteins (MAPs) on the spindle during the long oocyte arrest. To test this, I generated transgenic flies expressing GFP-tagged microtubule-associated proteins (MAPs), and found that 13 out of 24 proteins change localisation between early and late oocytes. I refer to these changes in MAP localisation after establishment of bipolarity as 'spindle maturation'. In order to identify the molecular mechanisms triggering MAP relocalisation, I manipulated the kinase activity of the cell cycle regulator Cdk1 by over-expressing non-degradable cyclin A or B, the major activators of Cdk1. Their expression prevented re-localisation of distinct sets of MAPs, and disrupted spindle bipolarity and accurate chromosome segregation in oocytes. Kinesin-6 Pavarotti/MKlp1 localised strongly to the spindle equator in late oocytes, whilst nearly always absent from this region in early oocytes. The localisation of Pavarotti to the spindle equator in late oocytes was reduced when cyclin B is over-expressed in oocytes, suggesting a role for Cdk1/cyclin B complex in regulating Pavarotti localisation. Indeed, a Pavarotti/Mklp1 mutant non-phosphorylatable by Cdk1 prematurely localised to the meiotic spindle and disrupted spindle bipolarity. Moreover, removal of Pavarotti from the metaphase-I spindle by RNAi induced spindle defects in oocytes. Therefore, it is likely that the microtubule cross-linking activity of Pavarotti enhances the stability of the metaphase-I spindle during the long arrest. Consistent with this, I found that the microtubule density in the spindle equator is higher in late oocytes. Altogether, I propose that remodelling the molecular architecture of the spindle during the long oocyte arrest is important to stabilise the bipolar spindle without centrosomes.

Or Man Wai. / "January 2002." / "glued" in title is superscript. / Thesis (Ph.D.)--Chinese University of Hong Kong, 2002. / Includes bibliographical references. / Electronic reproduction. Hong Kong : Chinese University of Hong Kong, [2012] System requirements: Adobe Acrobat Reader. Available via World Wide Web. / Mode of access: World Wide Web.

Résumé Les protéines XMAP215/ch-TOG appartiennent à une famille de protéines associées aux microtubules (MAPs), bien conservée tout au long de l'évolution, la famille XMAP215/Dis1. Cette famille joue un rôle dans la régulation du cytosquelette des microtubules (MT), en particulier pendant la division cellulaire. Chez l'humain, ch-TOG est la protéine surexprimée dans les tumeurs du colon et du foie, une protéine qui provient de cellules blastiques et de plusieurs formes de cancer. Certaines protéines XMAP215/ch-TOG ont été retrouvées dans différentes localisations cellulaires, toujours reliées aux MTs, donnant origine à une activité spécifique. Cependant, la localisation exacte de XMAP215/ch-TOG ainsi que son activité restait à être déterminées. Dans ce contexte scientifique, nous avons développé une série d'anticorps monoclonaux (mcAB) qui nous ont permis d'identifier deux populations différentes de la famille des protéines XMAP215/Dis1. Les images de microscopie confocale des cellules fixées ont montré une première localisation, la colocalisation bien connue XMAP215-microtubulaire (MT-XMAP215) qui s'observe pendant l'interphase et pendant la mitose (fuseau mitotique). Une deuxième localisation a été identifiée sur le bout plus des MTs, donnant XMAP215/ch-TOG comme faisant parti de la famille des protéines de bout plus (+TIPs). Cette deuxième colocalisation a été identifiée comme +TIP XMAP215/ch-TOG. La +TIP XMAP215 est la protéine la plus distale du bout des MTs. La hiérarchie a été établie en faisant la comparaison de la localisation de XMAP215/ch-TOG avec les protéines les plus connues du bout plus, telles qu'EB1, CLIP170 et p150Glued. Dans l'extrait mitotique de Xenopus laevis, les images obtenues in vivo par la microscopie de fluorescence par réflexion totale interne (TIRF) ont permis d'identifier une +TIP XMAP215 présente au bout des MTs qui polymérisent et dépolymérisent. Les images de microscopie cryo-électronique (Cryo-EM) ont montré une activité spécifique de la population +TIP XMAP215. Dans les solutions de tubuline pure, XMAP215 induit la formation de structures au bout des MTs, cette activité est compatible avec les mécanismes de croissance des MTs. Sur la base de nos résultats, nous proposons un modèle où XMAP215 se charge des dimères de tubuline en devenant une structure de type protofilament. Cette structure se lie au bout du MT en utilisant son domaine C-terminal, en rajoutant les dimères de tubuline et aussi certainement en participant à la fermeture de la structure microtubulaire même. La protéine interviendrait donc dans la dépolymérisation et aurait un rôle dans le mécanisme de dépolymérisation contrôlée. Une fois que l'addition de tubuline a eu lieu, la +TIP XMAP215 pourrait évoluer en MT-XMAP215, la forme la plus connue de la protéine qui a été associée au trafic des granules d'ARN. Mots cles : XMAP215, ch-TOG, microtubules, anticorps monoclonaux.

Thesis (M.Sc.). / Written for the Dept. of Biochemistry. Title from title page of PDF (viewed 2008/07/30). Includes bibliographical references.

Thesis (Ph.D.). / Written for the Dept. of Biology. Title from title page of PDF (viewed 2008/01/12). Includes bibliographical references.