Introdução: As doenças mitocondriais apresentam características heterogêneas devido à própria natureza e função da mitocôndria, que possui o seu próprio DNA (mtDNA). A disfunção mitocondrial pode afetar um único órgão ou ser uma doença multissistêmica, de manifestação na infância ou na vida adulta, podendo ter um padrão de herança materna ou mendeliana. O diagnóstico é complexo e requer uma investigação criteriosa, passo-a-passo, com atenção a história clínica, exames laboratoriais, neuroimagem e, muitas vezes, a biópsia muscular para análise histoquímica, bioquímica e genética. A análise molecular é fundamental na definição do diagnóstico e os protocolos propostos até o momento são, geralmente, direcionados para um grupo de pacientes com características clínicas homogêneas. Objetivos: os objetivos deste trabalho foram: a) propor um protocolo combinando dados clínicos e laboratoriais para indicar a melhor forma de investigação molecular de pacientes com suspeita clínica de doença do DNA mitocondrial, b) Comparar os achados clínicos e laboratoriais nos pacientes com e sem mutação no mtDNA, c) avaliar quais são os fatores clínicos preditivos de mutação no mtDNA que podem ser utilizados como sinalizadores para o médico decidir quando deve ser realizado um procedimento diagnóstico invasivo e de alto custo, c) estimar a proporção de mtDNA mutado, através da técnica PCR em tempo real em um grupo de pacientes com deleção, correlacionando com a idade de início dos sintomas e gravidade de manifestações clínicas, d) relatar achados de RNM com espectroscopia por emissão de prótons em pacientes com deleção no mtDNA. Pacientes, material e métodos: Foram selecionados, no ambulatório de doenças mitocondriais do HCPA, 43 pacientes com suspeita clínica de doença mitocondrial. Esse pacientes foram submetidos à análise, por etapas, de 5 mutações de ponto no mtDNA de leucócitos, de deleção no mtDNA de músculo e ao sequenciamento do tRNAleu e tRNAlys. Os pacientes com resultados positivos e negativos para mutações do mtDNA foram então comparados em relação às suas características clínicas e laboratoriais. Foram selecionados 11 pacientes para a determinação da percentagem relativa de deleção do mtDNA no tecido muscular e 3 pacientes para a descrição da RNM com espectroscopia. Resultados – Foram encontradas mutações no mtDNA em 17 pacientes (39.9%) distribuídas da seguinte forma: 4 pacientes com MELAS (A3243G), 1 paciente com síndrome de Leigh (T8993C) e 12 pacientes com deleções no mtDNA. As características significativamente mais freqüentes no grupo de pacientes com mutação no mtDNA comparados com os demais foram: miopatia (p=0,032), retinopatia pigmentar (p=0,007), oftalmoplegia e ptose (p=0,002), baixa estatura (p=0,04), hipotrofismo (p=0,033) e acidose lática (p=0,006). A quantificação do mtDNA pela técnica de PCR em tempo real foi realizada em 11 amostras de músculo de pacientes com deleção no mtDNA e com diferentes manifestações clínicas. Não houve correlação entre a percentagem relativa de deleção no mtDNA com os fenótipos clínicos (PEO, KSS e encefalomiopatia associado à doença multissistêmica), bem como com a idade de início das manifestações clínicas. A RNM com espectroscopia por emissão de prótons realizada em três pacientes com deleção no mtDNA associada a um quadro clínico não clássico mostrou achados distintos para cada paciente, sendo comum a todos as lesões cerebrais e a presença do pico invertido de lactato. Conclusões - A criteriosa seleção clínica e laboratorial se mostrou apropriada e o protocolo empregado se mostrou eficiente, uma vez que a mutação no mtDNA pode ser detectada em 17 dos 43 pacientes com suspeita de doença mitocondrial. Os pacientes positivos para deleção no mtDNA apresentaram algumas características clínicas preditivas para doença do mtDNA, o que pode ser importante na indicação de um procedimento invasivo (biópsia muscular) e de alto custo. A técnica e PCR em tempo real pode ser utilizado para quantificar a percentagem relativa de mtDNA deletado, porém para o diagnóstico das deleções, essa técnica deve ser realizada de forma complementar à técnica tradicional (Southern blot). O número amostral ainda é pequeno para correlacionar a quantidade relativa de mtDNA deletado com as síndromes mitocondriais clássicas e não clássicas. A RNM com espectroscopia por emissão de prótons, por possibilitar a detecção do lactato cerebral, parece ter utilidade na avaliação clínica de pacientes com suspeita clínica de doença mitocondrial, mesmo quando o quadro não é clássico.

Resumo não disponível

Introdução: As doenças mitocondriais apresentam características heterogêneas devido à própria natureza e função da mitocôndria, que possui o seu próprio DNA (mtDNA). A disfunção mitocondrial pode afetar um único órgão ou ser uma doença multissistêmica, de manifestação na infância ou na vida adulta, podendo ter um padrão de herança materna ou mendeliana. O diagnóstico é complexo e requer uma investigação criteriosa, passo-a-passo, com atenção a história clínica, exames laboratoriais, neuroimagem e, muitas vezes, a biópsia muscular para análise histoquímica, bioquímica e genética. A análise molecular é fundamental na definição do diagnóstico e os protocolos propostos até o momento são, geralmente, direcionados para um grupo de pacientes com características clínicas homogêneas. Objetivos: os objetivos deste trabalho foram: a) propor um protocolo combinando dados clínicos e laboratoriais para indicar a melhor forma de investigação molecular de pacientes com suspeita clínica de doença do DNA mitocondrial, b) Comparar os achados clínicos e laboratoriais nos pacientes com e sem mutação no mtDNA, c) avaliar quais são os fatores clínicos preditivos de mutação no mtDNA que podem ser utilizados como sinalizadores para o médico decidir quando deve ser realizado um procedimento diagnóstico invasivo e de alto custo, c) estimar a proporção de mtDNA mutado, através da técnica PCR em tempo real em um grupo de pacientes com deleção, correlacionando com a idade de início dos sintomas e gravidade de manifestações clínicas, d) relatar achados de RNM com espectroscopia por emissão de prótons em pacientes com deleção no mtDNA. Pacientes, material e métodos: Foram selecionados, no ambulatório de doenças mitocondriais do HCPA, 43 pacientes com suspeita clínica de doença mitocondrial. Esse pacientes foram submetidos à análise, por etapas, de 5 mutações de ponto no mtDNA de leucócitos, de deleção no mtDNA de músculo e ao sequenciamento do tRNAleu e tRNAlys. Os pacientes com resultados positivos e negativos para mutações do mtDNA foram então comparados em relação às suas características clínicas e laboratoriais. Foram selecionados 11 pacientes para a determinação da percentagem relativa de deleção do mtDNA no tecido muscular e 3 pacientes para a descrição da RNM com espectroscopia. Resultados – Foram encontradas mutações no mtDNA em 17 pacientes (39.9%) distribuídas da seguinte forma: 4 pacientes com MELAS (A3243G), 1 paciente com síndrome de Leigh (T8993C) e 12 pacientes com deleções no mtDNA. As características significativamente mais freqüentes no grupo de pacientes com mutação no mtDNA comparados com os demais foram: miopatia (p=0,032), retinopatia pigmentar (p=0,007), oftalmoplegia e ptose (p=0,002), baixa estatura (p=0,04), hipotrofismo (p=0,033) e acidose lática (p=0,006). A quantificação do mtDNA pela técnica de PCR em tempo real foi realizada em 11 amostras de músculo de pacientes com deleção no mtDNA e com diferentes manifestações clínicas. Não houve correlação entre a percentagem relativa de deleção no mtDNA com os fenótipos clínicos (PEO, KSS e encefalomiopatia associado à doença multissistêmica), bem como com a idade de início das manifestações clínicas. A RNM com espectroscopia por emissão de prótons realizada em três pacientes com deleção no mtDNA associada a um quadro clínico não clássico mostrou achados distintos para cada paciente, sendo comum a todos as lesões cerebrais e a presença do pico invertido de lactato. Conclusões - A criteriosa seleção clínica e laboratorial se mostrou apropriada e o protocolo empregado se mostrou eficiente, uma vez que a mutação no mtDNA pode ser detectada em 17 dos 43 pacientes com suspeita de doença mitocondrial. Os pacientes positivos para deleção no mtDNA apresentaram algumas características clínicas preditivas para doença do mtDNA, o que pode ser importante na indicação de um procedimento invasivo (biópsia muscular) e de alto custo. A técnica e PCR em tempo real pode ser utilizado para quantificar a percentagem relativa de mtDNA deletado, porém para o diagnóstico das deleções, essa técnica deve ser realizada de forma complementar à técnica tradicional (Southern blot). O número amostral ainda é pequeno para correlacionar a quantidade relativa de mtDNA deletado com as síndromes mitocondriais clássicas e não clássicas. A RNM com espectroscopia por emissão de prótons, por possibilitar a detecção do lactato cerebral, parece ter utilidade na avaliação clínica de pacientes com suspeita clínica de doença mitocondrial, mesmo quando o quadro não é clássico.

Ferramentas moleculares têm sido amplamente utilizadas em estudos de caracterização de populações. Dentre essas ferramentas destaca-se o DNA mitocondrial (DNAmt) e os microssatélites. Em abelhas Apis mellifera esses dois marcadores têm auxiliado no entendimento da dinâmica de populações, caracterização de subespécie, filogeografia e relações filogenéticas. Neste trabalho, nosso objetivo foi caracterizar populações da abelha nativa Plebeia remota com os marcadores moleculares acima citados para uma possível correlação entre suas composições genéticas e biogeografia. Foram estudadas amostras de quatro populações (SP, PRp, PRc e SC) pertencentes a três estados brasileiros: SP, PR e SC. Foi caracterizado o DNAmt de 70 colméias dessa espécie, e pudemos observar a existência de 15 haplótipos distintos. Diferentes métodos estatísticos revelaram isolamento entre as quatro populações estudadas, indicando a ausência de fluxo gênico via fêmea. Com relação ao uso dos microssatélites, sete locos foram selecionados e analisados em 360 indivíduos de 72 colméias. Análises realizadas com cinco indivíduos por colméia mostraram ser menos eficientes do que as realizadas com um indivíduo por colméia, cujo resultado não mostrou diferenciação entre as populações de SP e PRc, e entre PRc e SC. Essa ausência de isolamento pode ser devida ao pequeno número amostral de PRc. As topologias dos fenogramas construídos com base nos dados do DNAmt e dos microssatélites, relacionando as quatro populações estudadas, foram concordantes. / Molecular tools have been widely applied in studies of population characterization. Among those tools, the mitochondrial DNA (mtDNA) and the microsatellites are the most successfully used. In honeybees Apis mellifera these two molecular markers have added new and important informations about population dynamics, subspecies characterization, phylogeography and phylogenetic relationships. In this work, our objective was to characterize populations of the native bee Plebeia remota using the molecular markers mentioned above and make correlation between their genetic compositions and biogeography. Samples from four populations (SP, PRp, PRc and SC) were studied, belonging to three Brazilian states: SP, PR and SC. The mtDNA from 70 colonies was characterized, and 15 distinct haplotypes were determined. Through statistical methods, isolation among the four populations studied was shown, indicating the absence of female gene flow. For the microsatellites, seven loci were selectioned and 360 individuals from 72 colonies were analyzed. The data obtained using five individuals per colony showed to be lees efficient than the analysis made with one individual per colony. The microsatellite data from one individual did not show isolation between SP and PRc populations neither between PRc and SC populations. The apparent lack of population structure might be due to the small number of samples from PRc. The topologies of the phenograms built based on the data from mtDNA and microsatellites, were similar.

Memoria para optar al título de Antropóloga Física / El ADN mitocondrial como marcador genético uniparental ha sido utilizado con éxito para estudiar el poblamiento, historia y orígenes de distintas poblaciones. Es dentro de este contexto, donde el estudio del poblamiento americano, y en particular el continente suramericano cobran vital importancia debido a una serie de eventos que han marcado una heterogeneidad geográfica, cultural, y una estructuración genética que es diferenciada, destacando zonas como los Andes y el Amazonas. Bajo la premisa anterior, el sector del Norte Grande de Chile dentro del contexto sur andino se convierte en un punto válido de interés de estudio, ya que evidencias arqueológicas, etnohistóricas e históricas lo vinculan fuertemente en el área circumpuneña. Desde un punto de vista genético, las investigaciones en materias moleculares en población chilena han usado el ADN mitocondrial como herramienta de estudio para caracterizar mayoritariamente a las poblaciones del centro y sur del país, a diferencia de las poblaciones del Norte Grande. En base al análisis de la región hipervariable del ADN mitocondrial de muestras de saliva de individuos provenientes de las ciudades de Antofagasta y Calama; se registró la predominancia de haplogrupos amerindios y, en particular, una alta proporción del haplogrupo B2, siendo las localidades aledañas a Calama las que muestran una mayor representación de linajes derivados de B2. La ejecución del presente estudio permitió inferir que las ciudades de la costa de la región de Antofagasta se relacionan genéticamente con otras poblaciones nativas del centro y sur del país, mientras que los pueblos aledaños a Calama son cercanos genéticamente a poblaciones nativas del norte de Chile, Noroeste de Argentina (NOA) y Andes bolivianos

Orientador: José Mauricio Barbanti Duarte / Resumo: Mazama temama (Temamaçame) é o veado vermelho de menor tamanho da América central. Foi uma das primeiras espécies descritas para o gênero que devido à grande similaridade morfológica com Mazama americana foi considerada como sinônimo por muitos autores até final do século passado. Os estudos citogenéticos de animais em cativeiro mostraram cariótipos diferenciados que levaram ao reconhecimento como espécie única. Os estudos filogenéticos têm sustentado a monofilia da espécie, embora existam algumas incongruências devido à sua grande distribuição geográfica. Assim, o objetivo do trabalho foi propor um neótipo para M. temama a partir da caracterização de um topótipo de Veracruz e da mesma forma, caracterizar três parátipos da localidade de Campeche. Com isso, foi possível descrevê-los morfologicamente (medidas cranianas, coloração da pele e biometria corporal), obter cariótipos de animais de vida livre com origem conhecida para análises citogenéticas (banda C, banda G, coloração Ag-NOR e coloração convencional Giemsa) e realizar análises filogenéticas de genes mitocondriais. Os resultados morfológicos separaram a espécie de Mazama americana mas não conseguiram diferenciar M.temama dos outros pequenos Mazama. As árvores filogenéticas comprovaram a monofilia do grupo mostrando um resultado similar a outros autores. O cariótipo do neótipo é significativamente diferenciado do anteriormente descrito para à espécie, sendo que os parátipos de Campeche apresentam variantes cariotípicas ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Mestre

Submitted by CAROLINE DA SILVA HYPPOLITO null (carol_hyppolito2@hotmail.com) on 2017-03-22T15:08:26Z No. of bitstreams: 1 exemplar dissertação com folha de apro e ficha.pdf: 1553652 bytes, checksum: 449d648e29f62dcdebad15b56f220e51 (MD5) / Approved for entry into archive by Luiz Galeffi (luizgaleffi@gmail.com) on 2017-03-22T19:48:33Z (GMT) No. of bitstreams: 1 hyppolito_cs_me_araiq.pdf: 1553652 bytes, checksum: 449d648e29f62dcdebad15b56f220e51 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-22T19:48:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 hyppolito_cs_me_araiq.pdf: 1553652 bytes, checksum: 449d648e29f62dcdebad15b56f220e51 (MD5) Previous issue date: 2017-02-14 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / O DNA mitocondrial é uma molécula circular, dupla fita, que se encontra na mitocôndria, uma organela responsável pela respiração e produção de energia da célula. Este DNA é herdado exclusivamente por via materna e possui polimorfismos que permitem diferenciar indivíduos, auxiliando nas investigações forenses e corroborando com outros exames de identificação humana. Devido à possibilidade de compatibilidade deste DNA entre indivíduos não relacionados por via materna, é necessário estimar as frequências haplotípicas utilizando bancos de dados populacionais. Com a finalidade de se compilar e avaliar a utilização do DNA mitocondrial no Brasil realizou-se um estudo sobre os haplótipos depositados no banco de dados do European DNA Profiling Mitochondrial DNA Population Database (EMPOP) e acessando artigos científicos sobre dados de populações brasileiras, observando os países participantes e seus respectivos dados depositados. Na avaliação dos dados do EMPOP, a América do Norte foi o continente com maior número de haplótipos depositados no banco, principalmente pela participação dos Estados Unidos. A América do Sul contém 3172 haplótipos, sendo 782 desse total correspondentes ao Brasil. Esses números parecem insuficientes para representar a população grande e miscigenada do país. Na literatura, encontrou-se um total de 2367 haplótipos, os quais foram organizados por haplogrupos e as regiões brasileiras correspondentes: Sudeste e Nordeste apresentaram-se similares, com predomínio de ancestralidade africana (44%), enquanto o Sul apresentou uma origem predominantemente europeia (68,4%) e a região Norte de nativo-americanos (58,8%). As regiões Centro-Oeste, Norte e Nordeste carecem de mais estudos, pois os dados referentes a essas regiões são muito escassos. A população brasileira demonstrou alta diversidade genética que reflete sua miscigenação, sendo que na avaliação da distância genética, as populações do Sul do Brasil ficaram mais próximas da população portuguesa, enquanto que as do Norte se aproximaram da africana. Os dados da literatura permitem concluir que, a matrilinhagem do Brasil é predominantemente de origem africana (37%), seguida da europeia (35%) e de nativo-americanos (28%). Além disso, a diferença entre as quantidades de dados brasileiros no banco e na literatura indica a dificuldade dos laboratórios em atender aos controles de qualidade exigidos para deposição de amostras no EMPOP. Para avaliação da complexidade da metodologia de análise do DNA mitocondrial, cinco amostras de referência foram sequenciadas para as regiões HV1, HV2 e HV3 e os resultados confirmaram as sequências informadas previamente. Isto permitiu verificar que, com a utilização de uma metodologia adequadamente padronizada para análise de DNA mitocondrial foi possível obter resultados satisfatórios, mesmo que o operador tenha pouca experiência na técnica. Assim, a utilização correta de uma metodologia padronizada permitirá atender aos controles de qualidade exigidos pelo EMPOP, ainda que a técnica apresente várias etapas críticas para a obtenção do sequenciamento de qualidade. / Mitochondrial DNA is a circular and double-stranded molecule found in the mitochondria, an organelle responsible for breathing and energy production of the cell. This DNA is exclusively inherited through maternal and has polymorphisms that allow differentiating individuals, it assists in forensic investigations and corroborates with other tests of human identification. Due to the possibility of compatibility of this DNA between unrelated individuals, it is necessary to estimate the haplotype frequencies through population databases. In order to compile and evaluate the use of mitochondrial DNA in Brazil, a study was carried out about the haplotypes deposited in the European DNA Profiling Mitochondrial DNA Population Database (EMPOP), and acessing scientific articles with data from Brazilian populations, verifying participating countries and their respective deposited data. In the evaluation of EMPOP data, North America was the continent with the highest number of data deposited in the bank, mainly by the participation of the United States. South America contains 3172 haplotypes, 782 of which correspond to Brazil. These numbers seem insufficient to represent the large and mixed population of this country. In the literature, a total of 2367 haplotypes were found, which were organized by haplogroups and the corresponding Brazilian regions: the Southeast and Northeast were similar, with predominance of African ancestry (44%), while the South had a predominantly European origin (68.4%) and the North of Native Americans (58.8%). The Center-West, North and Northeast regions need further studies,therefore, the data for these regions are very scarce. Brazilian population have shown high genetic diversity that reflects your miscegenation, and in the genetic distance evaluation, the populations of the South of Brazil are genetically closer to the Portuguese population, while those from the North are closer to the African ones. According to literature data, it is possible to conclude that Brazil's matriarchy is predominantly African (37%), followed by European (35%) and Native American (28%). In addition, the difference between the Brazilian data in the database and the literature indicates the difficulty of the laboratories to meet the quality controls required for EMPOP deposition. To evaluate the complexity of the mitochondrial DNA analysis methodology, five reference samples had the HV1, HV2 and HV3 regions sequenced and the results confirmed the previously reported sequences. This allows to verify that with the use of a adequately standardized methodology for mitochondrial DNA analysis it is possible to obtain satisfactory results, even the operator having little experience in the technique. Therefore, the correct use of a standardized methodology, allows to meet the quality controls required by EMPOP, even the technique presents several critical steps to obtain quality sequencing. / CNPq: 132108/2015-1

El genoma mitocondrial humano es una molécula circular de doble cadena de 16,5 kb. En su secuencia existe información para 13 polipéptidos de diferentes subunidades de los complejos de la cadena de transporte electrónico (CTE), para 22 ARNt y para 2 ARNr. Una mutación en cualquiera de estos genes puede provocar que la CTE no funcione correctamente, dando lugar a una disfunción del sistema de fosforilación oxidativa. Todo ello puede provocar por un lado un déficit de energía en las células o tejidos, o por otro lado un incremento de la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS). Según la demanda energética de cada tejido este déficit de producción de energía será más o menos importante, pudiendo incluso provocar graves trastornos fisiopatológicos.El incremento de la producción de ROS por parte de la cadena de transporte electrónico puede ser eliminado con ayuda de las defensas antioxidantes celulares. Si la producción de ROS es más importante que la acción de estas defensas, ello puede llegar a provocar lesiones en diferentes componentes celulares tales como lípidos, proteínas o al propio ADNmt. Para profundizar en este campo, en este trabajo en primer lugar se han diagnosticado a cuatro pacientes con enfermedad mitocondrial, portadores de una mutación en su genoma mitocondrial. A partir de plaquetas de estos pacientes se han generado cíbridos transmitocondriales, que se han utilizado como modelo de estudio. Se han estudiado las siguientes mutaciones en genes mitocondriales: T14487C en la subunidad ND6 del complejo I, A3243G en el ARN de transferencia Leu (UUR), A8344G en el ARN de transferencia Lys y G6930A en la subunidad COXI del complejo IV. Analizando la producción de peróxido de hidrógeno como medida de la producción de ROS en estas cuatro líneas, hemos observado que las líneas portadoras de una mutación que afectase al funcionamiento del complejo I y III (descritos ampliamente en la literatura como principales productores de ROS en la mitocondria) es decir A3243G, A8344G y T144874C, sí provocan un incremento de la producción, mientras que la mutación que no afectaba a estos complejos (G6930A) no provocaba incremento. Posteriormente se ha estudiado si este incremento producía daño oxidativo a diferentes componentes celulares, tales como lípidos, proteínas y el propio ADNmt. Previamente, debido a que en la literatura no existía un consenso claro sobre el mejor método de análisis de la peroxidación lipídica, se realizó un pequeño estudio sobre cuál era el mejor inhibidor de la peroxidación lipídica a utilizar y en que concentración, obteniendo que el mejor a utilizar era el BHT a una concentración de 3mM.En cuanto los resultados de daño oxidativo se observó que en los lípidos solo se observaba daño oxidativo en la línea portadora de la mutación T144874C, mientras que las otras no lo presentaban. En la oxidación de proteínas no se observó daño en ninguna de las cuatro líneas portadoras de la mutación y en cuanto a la oxidación del ADNmt, se observó daño oxidativo en las líneas portadoras de las mutaciones A8344G y T14487C. Con estos resultados se observa que en algunas mutaciones en el genoma mitocondrial la producción de ROS generada es superior a la capacidad detoxificadora de la célula, provocando daño oxidativo, mientras que en otras la producción de ROS no supera la acción de las enzimas antioxidantes. / Mitochondrial encephalomyopathies caused by mutations in mitochondrial DNA (mtDNA) are a heterogeneous group of disorders characterized by primary dysfunction of the oxidative phosphorylation system (OXPHOS) with a decrease in ATP production. Clinical and biochemical heterogeneity of mitochondrial disorders is due to the ubiquitous nature of mitochondria and the dual genetic (mitochondrial and nuclear DNA) control of OXPHOS. Some unique features of mitochondrial genetics, such as heteroplasmy and tissue segregation, contribute to this phenomenon. However, the precise mechanisms leading to this heterogeneity are still largely unclear.Mitochondria are the major source of reactive oxygen species (ROS), which are generated as toxic by-products of redox-coupled reactions in the electron transport chain (ETC). Inhibition of the ETC in vitro using some respiratory complex inhibitors results in a significant increase in the mitochondrial production of ROS. This increase suggests that when dysfunction of the respiratory chain complexes occurs, electrons can be transferred directly to the molecular oxygen. However, cells are well protected by antioxidant enzymes: the manganese superoxide dismutase (Mn-SOD) and copper-Zinc superoxide dismutase (CuZn-SOD) to eliminate superoxide anion (O2.-) and the glutahione peroxidase (GSH-Px) and catalase (CAT) to eliminate hydrogen peroxide. Oxidative stress results when the balance of prooxidants and antioxidants is altered in favour of the prooxidants. In turn, an excess of ROS may contribute to OXPHOS damage. Thus, to define the relationship between mtDNA mutations and production of ROS, several transmitochondrial cell lines (cybrids) carrying different mutations in their mtDNA were obtained from different mitochondrial patients. These included two common and well characterized mtDNA mutations in tRNA genes, the A3243G transition in the tRNALeu(UUR) derived from a patient with MELAS syndrome (mitochondrial encephalomyopathy with lactic acidosis and stroke-like episodes), and the A8344G mutation in the tRNALys, derived from a patient with the MERRF syndrome (myoclonus epilepsy with ragged-red fibers). In addition, another two cybrids cell lines were studied, harbouring the G6930A mutation in the gene encoding the subunit I (COI) of the cytochrome c oxidase (COX). This mutation changes the amino acid glycine into a premature termination codon, resulting in the loss of the last 170 amino acids (33%) of the polypeptide, thus causing a complete disruption in the COX assembly. The last cybrid cell line studied carried the mutation T144874C in the subunit 6 of the complex I of the ETC.Hydrogen peroxide production was increased in cybrids harbouring tRNA and complex I mutations, but no changes were observed in cybrids harbouring the mutation in complex IV. No oxidative damage to lipids, proteins or mtDNA was detected in cybrids harbouring A3243G and G6930A mutations. In the cybrid cell line harbouring A8344G mutation, only oxidative damage to mtDNA was observed and in the cybrids harbouring the mutation in complex I, mtDNA and lipid oxidative damage were detected.These results suggest that some mutations in mtDNA may increase the production of hydrogen peroxide (i.e., those mutations which affect complex I or III of the ETC) meanwhile other mutations do not. Furthermore this increase can sometimes override the antioxidant defences of the cells and produce oxidative damage to key cellular components.

Abstract Acetes is a kind of macroholozooplankton. We can use the "genetic analysis to know its evolution, zooplankton population structure and taxa. The step is :ampified the 16S rDNA of the mitochondrial DNA and the COI fragment DNA in Acetes, and then sequence. We get the genetic distance between species of the 16S rDNA is 2.65~13.16%, and it's 1.43~25.42% of the COI fragment gene in Acetes. These results show that the diversity of COI fragment DNA in Acetes is more than the 16S rDNA of the mitochondria DNA. If we translated the COI gene DNA to amino acid sequence, the genetic distance between species of the amino acid sequence is about 1.83%~8.97%. By the way, we know that the genetic distance between species of the amino acid sequences are clearly less then the DNA sequences. Using the genetic data, we constructure a phylogenetic tree. The tree divided the Acetes into two group : Japonicus group and Erythraeus group, we can find the Acetes japonicus is the most permitive species and the A. erythraeus is the last specation species in the Acetes under the DNA sequences. But under the tree which was made from the amino acid sequence, we found the Acetes erythraeus is the most permitive species in the Acetes. The genetic distance between A. intermedius and A. erythreaus were 5.44% and 18.01% of the 16S rDNA and COI gene which indicated that the A. intermedius is true species. The population of A. japonicus between Japon Sea and Taiwan showed 0.24% and 2.36% of the 16S rDNA and COI gene that reveled two population should have gene-flow. The populations diversity of the A. intermedius in Taiwan showed the same way which had no different and the populations in Taiwan should be a single population.

Este trabajo, pretende ofrecer nuevos conocimientos acerca de los mecanismos moleculares que provocan afectación celular en los desordenes mitocondriales provocados por las mutaciones m.14487T>C, m.8993T>G, m.3243A>G y m.8344A>G del ADN mitocondrial. Para conseguir nuestro objetivo, como modelo de estudio se obtuvieron líneas de cíbridos transmitocondriales para las diferentes mutaciones de estudio, las cuales fueron cultivadas en unas condiciones de cultivo que permitiesen manifestar el defecto en el sistema OXPHOS (sistema de fosforilación oxidativa) manteniendo la viabilidad, incluso en aquellas mutaciones que afectan a ARNt. En estas condiciones de cultivo, se estudiaron parámetros que nos permitieron valorar la función mitocondrial como la concentración de lactato, succinato, ATP, ADP, AMP, Adenosina y el potencial de membrana mitocondrial, evidenciando el gran defecto en el sistema OXPHOS causado por las mutaciones que afectan a ARNt no siendo tan evidente en aquellas mutaciones que afectan a subunidades del sistema OXPHOS. Además los estudios de expresión génica realizados nos permitieron identificar la posible activación de procesos autofágicos y apoptóticos como posibles mecanismos moleculares responsables de los desordenes mitocondriales causados por las mutaciones m.3243A>G y m.8344A>G. Así como, evidenciar la no inducción de biogénesis mitocondrial en ninguna de las cuatro mutaciones estudiadas, incluso en aquellas mutaciones que afectan a ARNt con una mayor depleción en el contenido de ATP. Toda la información que se derivó de los estudios de expresión génica, no solo mostró una respuesta transcripcional diferencial entre mutaciones que afectan a ARNt y subunidades sino que además se observó una respuesta nuclear específica para cada una de las mutaciones del ADNmt estudiadas. Poniendo de manifiesto la complejidad de la fisiopatología de las enfermedades mitocondriales. Nosotros en este estudio intentamos poner de manifiesto esta complejidad y a la vez intentar esclarecer los mecanismos fisiopatológicos implicados en las mutaciones estudiadas, en algunos casos, como en las mutaciones en ARNt (gracias a las condiciones de cultivo utilizadas) hemos propuesto posibles mecanismos (que deben ser ratificados) que podrían explicar la degeneración celular causada por estas mutaciones y en otros, como en las mutaciones que afectan a subunidades hemos identificado aspectos a tener en cuenta en la fisiopatología de estas mutaciones. / This work aims to provide new insights into the molecular mechanisms that cause cell involvement in mitochondrial disorders caused by mutations m.14487T>C, m.8993T>G, m.3243A>G and m.8344A>G in mitochondrial DNA. To achieve our goal, as a study model lines cybrids were obtained to study the different mutations, which were grown in culture conditions that allowed the defect state in the OXPHOS system (oxidative phosphorylation system) maintaining the viability, even in those mutations that affect tRNA. In these culture conditions were studied parameters were allowed assess mitochondrial function as the lactate concentration, succinate, ATP, ADP, AMP, adenosine and mitochondrial membrane potential, demonstrating the great defect in the OXPHOS system caused by mutations tRNA affecting not be so apparent in those subunits mutations affecting OXPHOS system. Furthermore gene expression studies allowed us to identify made possible activation of apoptotic and autophagic processes as potential molecular mechanisms responsible for mitochondrial disorders caused by mutations m.3243A>G and m.8344A>G. So as not show the induction of mitochondrial biogenesis in any of the four mutations studied, even those mutations that affect tRNA in a greater depletion of ATP content. All information derived from studies of gene expression, not only showed a differential transcriptional response mutations that affect tRNA and subunits but also showed a specific nuclear response to each of the mitochondrial DNA mutations studied. Noting the complexity of the pathophysiology of mitochondrial diseases. We in this study we manifest this complexity while trying to clarify the pathophysiological mechanisms involved in the mutations studied, in some cases, such as mutations in tRNA (thanks to the culture conditions used) have proposed possible mechanisms (which should be ratified) that may explain the cellular degeneration caused by these and other mutations, such as mutations affecting subunits have identified aspects to consider in the pathophysiology of these mutations.