Submitted by Geandra Rodrigues (geandrar@gmail.com) on 2018-01-10T17:17:06Z No. of bitstreams: 1 brunaceleidasilvasantos.pdf: 5993103 bytes, checksum: 7eedadf4d8bccdd543fe319f2058cbd4 (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2018-01-23T11:54:04Z (GMT) No. of bitstreams: 1 brunaceleidasilvasantos.pdf: 5993103 bytes, checksum: 7eedadf4d8bccdd543fe319f2058cbd4 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-01-23T11:54:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 brunaceleidasilvasantos.pdf: 5993103 bytes, checksum: 7eedadf4d8bccdd543fe319f2058cbd4 (MD5) Previous issue date: 2017-02-24 / Metil chavicol é um fenilpropanoide encontrado em óleos essenciais e suas atividades antimicrobiana, anti-inflamatória, anestésica local e inseticida têm sido destacadas. O objetivo deste estudo foi sintetizar e avaliar o perfil de interação molecular do metil chavicol e análogos, assim como investigar as atividades antioxidante, antilipidêmica e anti-inflamatória tópica usando métodos in vivo, in vitro e in silico. A síntese dos análogos foi realizada por reações clássicas da química orgânica. A atividade antioxidante foi determinada pelos métodos DPPH e peroxidação lipídica, enquanto o efeito antilipidêmico foi testado contra a enzima lipase pancreática. O efeito anti-inflamatório tópico foi avaliado pelo método de edema de orelha usando óleo de Cróton, fenol e histamine como agentes irritantes. Análises histopatológicas e ensaios de mieloperoxidase (MPO), N-acetil-β-D-glicosaminidase (NAG), óxido nitrico, fator necrose tumoral (TNF-α), interleucina 6 (IL-6) e ciclooxigenase in vitro foram realizados. Os ligantes foram gerados pelo Programa Marvin Sketch e refinado por método PM7 presente no Programa MOPAC2012. As enzimas foram obtidas do Protein Data Bank sob os códigos 1EQG e 5IKT (COX-1 e -2), 1R35 (iNOS) e 1LPA (lipase pancreática). O reconhecimento molecular foi definido usando o programa Discovery Studio v 4.5 2016. 2-[(4-metoxifenil)metil] oxirano (2), 3-(4-metoxifenil)propan-1,2-diol (8), 2-metoxi-3-(4 metoxifenil)propan-1-ol (10), 1-metoxi-3-(4 metoxifenil)propan-2-ol (17) e 3-(4-metoxifenil)propanal (18) foram os análogos sintetizados. Metil chavicol reduziu significativamente (p < 0,001) a espessura e a massa do edema de orelha induzido por óleo de Cróton, fenol e histamina. Houve uma redução significativa de mieloperoxidase, N-acetil-β-D-glicosaminidase, óxido nítrico, fator necrose tumoral (TNF-α) e interleucina 6 (IL-6). Metil chavicol foi incapaz de inibir COX-1 e -2 em estudo in vitro e o docking molecular mostrou ausência de interação, incluindo os análogos 2, 8, 17 e 18. Além disso, os estudos in vitro e de docking molecular revelaram que o metil chavicol e seus análogos inibiram a enzima lipase pancreática. Os resultados obtidos sugerem que o metil chavicol e seus análogos são promissores agentes terapêuticos que podem ser utilizados em doenças associadas a processos inflamatórios, oxidativos e metabólicos. / Methyl chavicol is a phenylpropanoid found in essential oils and its antimicrobial, anti-inflammatory, local anesthetic and insecticide activities have been highlighted. The objective of this study was to synthesize and evaluate the molecular interaction profile of the methyl chavicol and analogues, as well as to investigate the antioxidant, antilipidemic and topical anti-inflammatory activities using in vivo, in vitro and in silico methods. Synthesis of the analogues was performed by classical reactions of organic chemistry. Antioxidant activity was determined by DPPH and lipid peroxidation methods, while the antilipidemic effect was essayed against to pancreatic lipase. Anti-inflammatory activity was evaluated using Croton oil-, phenol-, and histamine-induced ear edema models in mice. Histopathological analyzes and the myeloperoxidase (MPO), N-acetyl-β-D-glucosaminidase (NAG), nitric oxide, tumor necrosis tumor (TNF-α), interleukin 6 (IL-6) and cyclooxygenase assays were determined. The bindings were generated by the Marvin Sketch Program and refined by PM7 method present in the MOPAC2012 Program. Enzymes were obtained from protein database under 1EQG and 5IKT (COX-1 and -2), 1R35 (iNOS) and 1LPA (pancreatic lipase) codes. Molecular recognition was determined using the program Discovery Studio v 4.5 2016. 2 - [(4-methoxyphenyl) methyl] oxirane (2), 3-(4-methoxyphenyl) propane-1,2-diol (8), 2- Methoxy-3-(4-methoxyphenyl) propan-1-ol), 1-methoxy-3-(4-methoxyphenyl) propan-2-ol (17) and 3-(4-methoxyphenyl) propanal (18) were the synthesized analogues. Methyl chavicol significantly decreased the thickness and mass of ear edema induced by irritants (p < 0.001). A significant reduction on myeloperoxidase, N-acetyl-β-D-glucosaminidase, nitric oxide, tumor necrosis tumor (TNF-α) and interleukin 6 (IL-6) was revealed (p < 0.05, p < 0.01 or p < 0.001). Methyl chavicol was unable to inhibit COX-1 and-2 in in vitro test and the molecular docking showed no interaction, including the analogues 2, 8, 17 and 18. In addition, molecular docking showed an inhibitory effect of the methyl chavicol and its analogues on the pancreatic lipase. The results indicate that methyl chavicol and its analogues are promising therapeutic agents that can be used in diseases associated with inflammatory, oxidative and metabolic processes.

Muitas espécies do gênero Aristolochia (Familia Aristolochiaceae) têm sido usadas na medicina tradicional e folclórica como medicamentos e tônicos, as quais demonstravam atividades farmacológicas de interesse clínica e medica como anti-hemorrágica, anti-parasita, antibacteriano, antifúngico, analgésico, antitumoral entre outras. Visando a obtenção de mais informações sobre essas plantas e na procura por substâncias com efeitos antiofídicos, neste trabalho avaliou-se à ação de extratos aquoso, metanólico e de acetato de etila de folhas e caule contra as ações tóxicas da peçonha de Bothrops asper, ambos procedentes do Panamá e contra o efeito miotóxico da peçonha de Bothrops jararacussu e das miotoxinas BthTX-I (isolada de B. jararacussu) e Mtx-II (isolada de B. asper). O extrato das folhas em acetato de etila apresentou a melhor inibição da atividade fosfolipásica da peçonha de B. asper, demonstrando inibição de 45%, 35% e 33% nas proporções de 1:5, 1:10 e 1:30 (m/m), respectivamente. Enquanto que, o extrato de caule em acetato de etila demonstrou maior eficácia na neutralização da atividade coagulante, e, além disso, inibiu 96%, 92% e 87% do edema, da miotoxicidade e hemorragia induzidas pela peçonha de B. asper, respectivamente. Os percentuais diferenciados na neutralização das ações tóxicas da peçonha de Bothrops asper, revelam diferentes perfis do potencial antiofídico de Aristolochia sprucei. Um dos componentes bioativos foi isolado do extrato de caule desta planta por CLAE, e a caracterização química, por ressonância magnética nuclear, demonstrou ser o ácido aristolóquio que inibiu a atividade miotóxica das peçonhas de B. jararacussu e de B. asper em 80% e 85% e assim como a atividade miotóxica da BthTX-I e Mtx-II em 64% e 60%, respectivamente. A atividade hemolítica indireta da peçonha de B. asper foi inibida em 43% pelo o ácido aristolóquio. A análise dos espectros de dicroísmo circular e os estudos de interação por modelagem molecular sugerem que o ácido aristolóquio forma um complexo com a Mtx-II de B. asper inibindo sua atividade. A ligação do ácido aristoloquio com as miotoxinas (MjTX-1, BthTX-II) modificou a forma e a intensidade dos espectros de dicroísmo circular da miotoxina e induziu alterações na porcentagem dos diversos domínios que constituem a estrutura secundária desta miotoxina. Os resultados obtidos confirmam que os extratos de A. sprucei possuem propriedades antiofídicas e sugerem a necessidade de aprofundar estudos que permitam utilizar com segurança os extratos e o principio ativo isolado como suplementos dos antisoros para aumentar a eficácia na neutralização dos efeitos tóxicos locais da peçonha das serpentes. / A lot of species of genus Aristolochia (Familia Aristolochiacheae) have been used in traditional medicine and folk, such as medicaments and tonics, which show pharmacological activities of clinic and medical interest, like antihemorragic, antiparasitic, antibacterial, antifungic, analgesic, antitumoral between others. Expecting to get more information about these plants and in the search by substances with antiophidic effects, in this work was evaluated the action of aqueous, metanolic and ethyl acetate extracts from leaves and stems of Aristolochia sprucei against the toxic action of Bothrops asper venom, both native from Panamá and against the myotoxic effect of Bothrops jararacussu venom and BthTX1 (isolated from B. jararacussu) and Mtx-II (isolated from Bothorps asper). The leaves extracts in ethyl acetate showed the best inhibition registered of PLA2 activity of venom de B. asper showing inhibition of 45 %, 35 % and 33 %, in proportion (m/m) of 1:5, 1:10 and 1:30 respectively. As regards to stem extract in ethyl acetate, it showed high efficacy in neutralization of coagulant activity, besides It inhibited 96 %, 92 % and 87 % of edema, myotoxicity and hemorrhage induced by B. asper venom, respectively. One of bioactives components was isolated from stem extract of this plant by CLAE and the chemical characterization by nuclear magnetic resonance, this showed that the compound is the aristolochic acid. This compound inhibited the myotoxic activity of B. jararacussu and B. asper venom in 80 % and 85 %, so like myotoxic activity of BthTx-I and MTx-II in 64 % and 60 % respectively. The indirect hemolytic activity of B. asper venom was inhibited in 43 % by the aristolochic acid. The analyze of spectrum of circular dichroism and the studies of interaction by molecular modelagem suggest that the aristolochic acid forms a complex 1:1 with the miotoxin inhibiting their activity. The joint of aristolochic acid with the miotoxins (MjTX-1, BthTx-II) changes the way and the intensity of spectra from dichroism circular of miotoxin and It induced alteration in percentage of several domains that constitute a secondary structure from this toxin. The results obtained confirm that the extracts of A. sprucei have antiophidic properties and it suggest the necessity of deepen studies that allow to use with safety the extracts and the isolated active principle, like antiserum supplements to increase the efficacy in the neutralization of local toxics effects of snakes venoms.

Nesta pesquisa, calculou-se, por meio da modelagem molecular, parâmetros físico-químicos importantes à capacidade anti-radicalar de compostos fenólicos extraídos de plantas da flora nacional, Chimarrhis turbinata e Arrabidaea samydoides. As propriedades eletrônicas também podem ser analisadas por meio de superfícies representadas por legendas de cores no campo 3D. Mapa de potencial eletrostático, distribuição orbitalar de HOMO e de LUMO e densidade de spin foram superfícies avaliadas neste trabalho. Em adição, estudos de QSAR (Quantitative Structure-Activity Relationships), cálculos de descritores moleculares holísticos por meio dos programas DRAGON e VOLSURF, cálculos estatísticos incluindo algoritmo genético e PLS (Partial Least Squares), demonstraram a influência de determinadas características moleculares como fundamentais à atividade biológica. A pesquisa concluiu que o grupo farmacofórico favorável à atividade antioxidante é estrutura que apresenta predominantemente características hidrofílicas, grupos hidroxila como substituintes, características eletrônicas favoráveis à doação de elétron e à estabilização do radical fenóxi formado, além de reduzido comprometimento estérico. Consideramos que os métodos empregados no trabalho podem ser considerados como abordagem inovadora para a Ciência Cosmética, indicando potencial ação antioxidante, que poderá ser utilizada em formulações antienvelhecimento. / In this research, the calculated physico-chemical parameters, by molecular modelling, have been reported in the literature for supplying important information about the antiradicalar behavior of phenolic compounds, as the studied herein from Chimarrhis turbinata sp. and Arrabidaea samydoides sp. The electronic properties also can be analyzed by means of surfaces represented by legends of colors in the 3D field. Map of electrostatic potential, HOMO and LUMO distribution orbitalar and spin density have been used in this work. In addition, QSAR studies (Quantitative Structure-Activity Relationships), calculations of holistic molecular descriptors by softwares DRAGON and VOLSURF, statistical analysis including genetic algorithm and PLS (Partial Least Squares), demonstrate the influence of the molecular structure in the biological activity. Therefore, pharmacofor favorable to the antioxidant activity structure that presents predominantly characteristic hydrophilic, groups hydroxyl as substituintes, electronic characteristics favorable to the donation of electron and the stabilization of the radical formed, besides reduced inibition esteric. These recent methods can be considered as an innovative approach for Cosmetic Science toward antioxidant action that could be used in antiaging products.

Orientadora: Profa. Dra. Káthia Maria Honório / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia/Química, Santo André, 2018. / Um dos alvos biologicos relacionado ao controle da glicemia e a enzima dipeptidil peptidase-IV (DPP-IV); ela esta associada com a estimulacao do pancreas na producao de insulina, sendo, portanto, um alvo de interesse da pesquisa e da industria farmaceutica para o tratamento do diabetes tipo 2. O diabetes e uma doenca cronica que se caracteriza por um aumento da glicemia causando uma serie de complicacoes fisiologicas com destaque para as doencas cardiacas como a aterosclerose; estima-se que 425 milhoes de pessoas sejam portadoras da doenca. Estudos indicam que inibidores da DPP-IV tambem podem apresentar acao sobre a FAP¿¿, uma enzima que esta relacionada com reparacao de tecidos e crescimento de tumores. Este trabalho consiste em utilizar metodos de modelagem molecular, como a construcao e analise de modelos de HQSAR (Hologram Quantitative Structure-Activity) e de CoMFA (analise comparativa de campos de interacao molecular); acoplamento molecular (docking), analise de propriedades eletronicas e deteccao e caracterizacao de sitios de ligacao da enzima FAP¿¿, com intuito de compreender as principais caracteristicas de ambas as enzimas, assim como a interacao das mesmas com uma serie de compostos bioativos. Os modelos CoMFA construidos apresentaram significativos valores de validacao interna (0,768) e externa (0,986); o alinhamento obtido utilizando a tecnica de acoplamento molecular e complementada com o uso da tecnica BINANA delineou as principais interacoes das enzimas com o conjunto de ligantes; identificou-se tres sitios de ligacao da enzima FAP¿¿ utilizando os servidores FTSite e FTMap. Desta forma, com informacoes sobre ambos os alvos e as interacoes estabelecidas com os ligantes, sera possivel propor com maior seguranca modificacoes moleculares para tais compostos candidatos a farmacos mais seguros para o tratamento do diabetes tipo 2. / One of the biological targets related to glycemic control is the dipeptidyl peptidase IV (DPP-IV) enzyme; it is associated with stimulation of the pancreas in insulin production and it is a target of interest for the researches related to the treatment of type 2 diabetes. Diabetes is a chronic disease characterized by an increase in blood glucose causing a series of physiological complications such as atherosclerosis, it is estimated that 425 million people have this disease. Studies have indicated that DPP-IV inhibitors may also have action on FAPá, an enzyme that is related to tissue repair and tumor growth. This work consists of using molecular modeling methods, such as the construction and analysis of HQSAR (Hologram Quantitative Structure-Activity) and CoMFA (comparative analysis of molecular interaction fields) models; molecular docking, analysis of electronic properties, detection and characterization of FAPá enzyme binding sites, and pharmacokinetic and pharmacodynamic properties studies; in order to understand the main characteristics of both enzymes, as well as their interaction with a series of bioactive compounds. The CoMFA models presented significant values of internal validation (0,768) and external (0,986) and the alignment obtained using the molecular docking technique outlined the main interactions of the enzymes with the set of ligands. With information on both targets and the interactions established with the ligands, it will be possible to more safely propose molecular modifications for such safer drug candidates for the treatment of type 2 diabetes.

Theoretical studies of the molecular mechanisms responsible for the formation and stability of protein complexes have gained importance due to their practical applications in the understanding of the molecular basis of several diseases, in protein engineering and biotechnology. The objective of this project is to critically analyze and refine a coarse-grained force field for protein-protein interactions based on experimental thermodynamic properties and to apply it to cancer-related S100A4 protein system. Our ultimate goal is to generate knowledge for a better understanding of the physical mechanisms responsible for the association of particular proteins in different environments. We studied the role of short and long-range interactions on the complexation of homo-associations. Furthermore, we analyzed the influence of the pH and its correlation with the charge regulation mechanism. We analyzed and refined the adjustable Lennard-Jones parameter for a mesoscopic model based on experimental second virial data for lysozyme, chymotrypsinogen, and ribonuclease A via Monte Carlo simulations. From of that, the S100A3 protein was used to test the new calibrated parameters. Finally, we evaluated the dimerization process of S100A4 proteins, observing the role of physical-chemistry variables involved in the thermodynamical stability of different oligomers. / Estudos teóricos dos mecanismos moleculares responsáveis pela formação e estabilidade dos complexos de proteínas vêm ganhando importância devido às suas aplicações práticas no entendimento da base molecular de várias doenças, em engenharia de proteínas e biotecnologia. O objetivo deste projeto é analisar criticamente e aperfeiçoar um campo de força de granulidade grossa para interação proteína-proteína com base em propriedades termodinâmicas experimentais e aplicá-lo ao sistema proteico S100A4 relacionado com o câncer. Nosso objetivo final é gerar conhecimento para uma melhor compreensão dos mecanismos físicos responsáveis pelas associações de proteínas particulares em diferentes ambientes. Estudamos o papel das interações de curto e longo alcance na complexação de homo-associações. Além disso, analisamos a influência do pH e sua correlação com o mecanismo de regulação de cargas. Por meio de simulações Monte Carlo, analisamos e refinamos o parametro ajustável de Lennard-Jones para um modelo mesoscópico, usando dados experimentais do segundo virial para a lisozima, o quimotripsinogênio e a ribonuclease A. A partir disso, a proteína S100A3 foi usada para testar os novos parâmetros calibrados. Finalmente, foi avaliado o processo de dimerização das proteínas S100A4, observando o papel de algumas variáveis físico-químicas envolvidas na estabilidade termondinâmica de diferentes oligómeros.

Diversas proteínas de superfície de merozoítas (MSPs) de Plasmodium têm sido consideradas candidatas a compor uma vacina contra a malária. Nos últimos anos estudamos diversos aspectos da resposta imune naturalmente adquirida contra proteínas recombinantes baseadas nas MSPs de P. vivax. Estes estudos demonstraram que estas proteínas recombinantes mantêm suas funções imunológicas, podendo servir como base para a caracterização de suas estruturas tridimensionais. Com o objetivo de obter informações estruturais sobre as MSPs de P. vivax, 10 proteínas recombinantes, correspondentes à região C-terminal da MSP-1 (MSP119), e diferentes regiões da MSP-3&#945; e MSP-3&#946; foram expressas em Escherichia coli. Os dados estruturais da MSP119 foram obtidos por modelagem molecular com base nas coordenadas cristalográficas da MSP19 de P. cynomolgi. Por outro lado, existem poucas informações estruturais sobre as proteínas da família MSP-3 de Plasmodium. A análise da estrutura primária dessas proteínas indica que elas apresentam um domínio central rico em alaninas que estão organizadas como motivos \"heptads\". Esse tipo de estrutura primária favorece a formação de estruturas do tipo &#945;-hélices e \"coiled-coil\" (CC). No presente estudo, a composição da estrutura secundária de cada proteína recombinante foi caracterizada preliminarmente por ensaio de Dicroísmo Circular, realizado na região do UV distante. Com base nos resultados obtidos, selecionamos duas proteínas recombinantes baseadas na região C-terminal da MSP-3&#945; (CC4 e CC5) para análises biofísicas mais detalhadas. Inicialmente, demonstramos por espectrometria de massa que ambas as proteínas têm massa molecular esperada. Entretanto, os dados obtidos por cromatografia em gel filtração sugeriram que essas proteínas formam oligômeros. No caso específico da proteína CC5, estes dados foram confirmados por ultracentrifugação analítica que indicou a formação de tetrâmeros elongados, corroborando com a formação de estrutura do tipo \"coiled-coil\". Como o papel biológico dessas proteínas não é conhecido, os dados estruturais obtidos neste estudo podem servir como base para o entendimento da função dessas proteínas. Na segunda parte deste projeto, selecionamos cinco proteínas recombinantes para estudos comparativos de reconhecimento por anticorpos IgG de indivíduos procedentes de áreas endêmicas de malária vivax. Tais estudos confirmaram dados prévios que as MSPs são imunogênicas em infecções naturais. Em conjunto, nossos resultados sugerem que, assim como a MSP119, proteínas recombinantes baseadas na MSP-3a e MSP-313 podem ser exploradas em futuros estudos de indução de imunidade protetora contra a malária vivax em primatas não humanos. / Several merozoite surface proteins (MSPs) of Plasmodium have been considered candidates to compose a vaccine against malaria. In the last years, we have studied severaI aspects of the natural/y acquired immune response against recombinant proteins based on MSPs of P. vivax. These studies demonstrated that the recombinant proteins maintain their immunological functions and could be used for the characterization of their three-dimensional structure. To gain structural information on the MSPs of P. vivax, 10 recombinant proteins corresponding to the C-terminal region of MSP-1 (MSP119) and to different regions of the MSP-3&#945; and MSP-3&#946; were expressed in Escherichia coli. The structural data of the MSP119 were obtained by molecular modeling based on the crystallographic coordinates of the P. cynomolgi MSP119. On the other hand, there is limited structural information available for MSP-3 family of Plasmodium. The analysis of the primary structure of these proteins indicates that they present a central alanine-rich domain organized as heptads repeats. This type of primary structure favors the formation of &#945;-helices and coiled-coil (CC) structures. In the present study, the composition of the secondary structure of each recombinant protein was characterized preliminarily by circular dichroism monitored in the far-UV region. On the basis of the obtained results, we selected two recombinant proteins based on C-terminal region of the MSP-3&#945; (CC4 and CC5) for detailed biophysical analyses. Initially, we demonstrated that the monomer mass assigned for the two recombinant proteins corresponded exactly to those predicted from the primary sequence. However, during size exclusion chromatography, the proteins eluted at volumes corresponding to molecular weights that were much larger than their monomeric masses, suggesting that both proteins are oligomeric molecules. Interestingly, analytical ultracentrifugation experiments showed that the CC5 oligomers are elongated molecules. As the function of these proteins is not known, the structural data obtained in this study can be used to understand the function of these proteins. In the second part of this study, we selected five recombinant proteins for comparative recognition by IgG antibodies of the individuais from endemic areas of malaria vivax. These studies confirmed previous data that the MSPs are imunogenic in natural infections. Together, our results suggest that, as well as the MSP119, that recombinant proteins based on the MSP-3&#945; and MSP-3&#946; can be explored in future studies for the induction of protective immunity against malaria vivax.

Mapeamento dos subsítios de &#945;-amilase de Xanthomonas axonopodis pv. Citri envolvidos na interação com o substrato A família das enzimas &#945;-amilases é um modelo experimental interessante para o estudo das interações entre os aminoácidos e seus ligantes, já que estas enzimas apresentam especificidade variável, são frequentemente alvos de estudos por mutagênese e há estruturas cristalinas disponíveis para alguns membros da família. A proposta deste trabalho foi o mapear subsítios da &#945;-amilase de Xanthomonas axonopodis pv. citri (AXA) envolvidos na interação com substratos, através de comparações estruturais, mutagêneses sítio-dirigidas, análises de parâmetros cinéticos sobre amido e do padrão de clivagem sobre p-nitrofenil malto-oligossacarideos (PNPG7, PNPG5, PNPG4). Foi criado um modelo estrutural para AXA a partir da estrutura tridimensional da &#945;-amilase de Alteromonas haloplanctis (Aghajari et al., 1998). O modelo de AXA foi sobreposto na estrutura da &#945;-amilase pancreática de porco (Qian et al., 1994) e 11 resíduos foram selecionados e mutados para alanina. As &#945;-amilases recombinantes mutantes e selvagem foram secretadas pela levedura Pichia pastoris GS115, apresentando uma massa molecular aparente de 45 kDa. Todos os mutantes analisados reduziram em maior ou menor grau a atividade catalítica da enzima sobre amido e p-nitrofenil maltooligossacarideos. Mutações dos resíduos H88, F136, D196, E223, D295 e N299, deletaram a atividade enzimática, indicando que suas cadeias laterais são essenciais para o desempenho catalítico da enzima. As análises cinéticas e estruturais sugerem fortemente que D196, E223 e D295 são os resíduos catalíticos. Substituições das cadeias laterais de C157, H200, G227, T230 e H294 reduziram a eficiência catalítica (kcat/Km) da &#945;-amilase sobre o substrato amido para, respectivamente, 28%, 41%, 84%, 81% e 51%. As mutações em G227 e T230 foram menos importantes para a atividade da enzima e afinidade pelo amido, entretanto, estes resíduos mostraram-se importantes para a estabilização de complexos com substratos curtos (pNPG4). Os resultados indicam que o sítio ativo de AXA é formado por, no mínimo, seis subsítios. As interações dos anéis de glicose com os subsítios +2 e -2 são favorecidas em relação às interações nos subsítios -3 e +3, respectivamente, e a interação do anel de glicose no subsítio -3 é favorecida em relação à interação no subsítio +3. A enzima selvagem diva preferencialmente a terceira ligação glicosídica de p-nitrofenil maltooligossacarideos. Como produtos de hidrólise a enzima libera maltopentaose, maltotetraose, maltotriose, maltose e glicose. / The &#945;-amylase family is an interesting group for structure/function relationship investigation, as this family exhibits a variable deavage patterm, several crystal structures are available, and its members were studied by mutagenesis. The aim of this study was the mapping of Xanthomonas axonopodis pv. Citri &#945;-amylase (AXA) subsites involved in substrate binding, using structural comparison, site-directed mutagenesis and lcinetics analyses. A structural model for AXA was created from the three-dimensional structure of the &#945;-amylase from Alteromonas haloplanctis (Aghajari et al., 1998). This model was superimposed on the structure ofthe pig pancreatic &#945;-amylase, PPA (Qian et. al., 1994), and 11 residues were selected and changed to alanine. Wild type and mutant AXA were secreted by Pichia pastoris strain GS115 cells and showed apparent molecular mass of 45 kDa. All mutants have reduced &#945;-amylase activity on starch and 4-nitrophenyl maltooligosaccharides (pNPG7, PNPG5 and PNPG4) at different levels. Mutation of residues H88, F136, D196, E223, D295 and N299 indicate their essential role by complete loss of activity. Kinetic and structural analyses strongly suggested that D196, E223 and D295 are the catalytic residues. The substitution of the side chain of C157, H200, G227, T230 and H294 reduced the catalytic efficiency (kcat/Km) of &#945;-amylase on starch to respectively 28%, 41%, 84%, 81% and 51%. Although G227 and T230 were not much important for activity and binding on starch, these residues were important for stabilization of complexes with short substrates (PNPG4). The results indicate that AXA\'s active site is composed of at least six sugar binding subsites. The binding of the glucoses at subsites +2 and -2 are favored against binding at subsites -3 and +3, respectively. The binding of glucose at subsite -3 is favored against binding at subsite +3. The wild type enzyme primarily hydrolyzes the third glucosidic bond in PNPG7, PNPG5 and PNPG4 and the products of hydrolysis were maltopentaose, maltotetraose, maltotriose, maltose and glucose.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:19:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 AMARANTE_Adriano_2013.pdf: 11925080 bytes, checksum: 6de5e4ba7ae233d30b78c7f1d927740a (MD5) Previous issue date: 2013-03-19 / Universidade Federal de Sao Carlos / In this work was developed a prototype of a new nanobiosensor with molecular specificity through a study of theoretical models of Chemical Force Microscope. For the sensing were used molecular modeling techniques as well as experimental models of the functionalized Atomic Force Microscope tip with the Acetil co-A Carboxylase (ACC) attached. Specific and non-specific inhibitors were used to evaluate substrate-enzyme interactions. The nanobiosensor investigates specific enzymatic inhibition characteristics of the ACC enzyme through the herbicide Diclofop by reversing this process applying a force in a determined direction. The force is theoretically calculated by using molecular dynamic techniques associated to the adhesion force experimentally obtained. Theoretical and experimental questions involving nanobiosensors of AFM tips still obscure until now, such as, the number of functional enzymes attached on the AFM tip, the number of the active sites available to interact after immobilization process, the consequences of the enzyme immobilization as well as the substrate and theoretical adhesion between AFM tip and substrate were analyzed here. / Este trabalho teve como objetivo principal desenvolver o protótipo de um novo nanobiossensor de alta especificidade por intermédio do estudo e desenvolvimento de modelos teóricos específicos para a Microscopia de Força Química (MFQ). Para o sensoriamento foram utilizadas técnicas de Modelagem Molecular Computacional (MMC) e resultados experimentais de MFQ, do qual a ponta do Microscópio de Força Atômica (AFM, do inglês Atomic Force Microscopy) foi funcionalizada com enzimas Acetil-coA Carboxilase (ACC). O nanobiossensor foi utilizado para detectar especificamente substratos de herbicidas específicos e não-específicos. O nanobiossensor explora as características de inibição enzimática específica da enzima ACC pelo herbicida Diclofop revertendo esse processo aplicando-se uma força numa determinada direção. Essa força foi calculada teoricamente por intermédio de cálculos de técnicas de Dinâmica Molecular e associada à força de adesão experimental. Os resultados experimentais validaram os modelos teóricos de forma inequívoca. Questões teóricas e experimentais envolvendo nanobiossensores de ponta de AFM não respondidas até o momento (número de enzimas úteis na ponta do AFM que podem interagir com o substrato, o número de sítios ativos disponíveis, consequências da imobilização das enzimas e do substrato, força de adesão teórica entre a ponta do AFM e o substrato de herbicidas, etc.) foram solucionadas neste trabalho.

Mapeamento dos subsítios de &#945;-amilase de Xanthomonas axonopodis pv. Citri envolvidos na interação com o substrato A família das enzimas &#945;-amilases é um modelo experimental interessante para o estudo das interações entre os aminoácidos e seus ligantes, já que estas enzimas apresentam especificidade variável, são frequentemente alvos de estudos por mutagênese e há estruturas cristalinas disponíveis para alguns membros da família. A proposta deste trabalho foi o mapear subsítios da &#945;-amilase de Xanthomonas axonopodis pv. citri (AXA) envolvidos na interação com substratos, através de comparações estruturais, mutagêneses sítio-dirigidas, análises de parâmetros cinéticos sobre amido e do padrão de clivagem sobre p-nitrofenil malto-oligossacarideos (PNPG7, PNPG5, PNPG4). Foi criado um modelo estrutural para AXA a partir da estrutura tridimensional da &#945;-amilase de Alteromonas haloplanctis (Aghajari et al., 1998). O modelo de AXA foi sobreposto na estrutura da &#945;-amilase pancreática de porco (Qian et al., 1994) e 11 resíduos foram selecionados e mutados para alanina. As &#945;-amilases recombinantes mutantes e selvagem foram secretadas pela levedura Pichia pastoris GS115, apresentando uma massa molecular aparente de 45 kDa. Todos os mutantes analisados reduziram em maior ou menor grau a atividade catalítica da enzima sobre amido e p-nitrofenil maltooligossacarideos. Mutações dos resíduos H88, F136, D196, E223, D295 e N299, deletaram a atividade enzimática, indicando que suas cadeias laterais são essenciais para o desempenho catalítico da enzima. As análises cinéticas e estruturais sugerem fortemente que D196, E223 e D295 são os resíduos catalíticos. Substituições das cadeias laterais de C157, H200, G227, T230 e H294 reduziram a eficiência catalítica (kcat/Km) da &#945;-amilase sobre o substrato amido para, respectivamente, 28%, 41%, 84%, 81% e 51%. As mutações em G227 e T230 foram menos importantes para a atividade da enzima e afinidade pelo amido, entretanto, estes resíduos mostraram-se importantes para a estabilização de complexos com substratos curtos (pNPG4). Os resultados indicam que o sítio ativo de AXA é formado por, no mínimo, seis subsítios. As interações dos anéis de glicose com os subsítios +2 e -2 são favorecidas em relação às interações nos subsítios -3 e +3, respectivamente, e a interação do anel de glicose no subsítio -3 é favorecida em relação à interação no subsítio +3. A enzima selvagem diva preferencialmente a terceira ligação glicosídica de p-nitrofenil maltooligossacarideos. Como produtos de hidrólise a enzima libera maltopentaose, maltotetraose, maltotriose, maltose e glicose. / The &#945;-amylase family is an interesting group for structure/function relationship investigation, as this family exhibits a variable deavage patterm, several crystal structures are available, and its members were studied by mutagenesis. The aim of this study was the mapping of Xanthomonas axonopodis pv. Citri &#945;-amylase (AXA) subsites involved in substrate binding, using structural comparison, site-directed mutagenesis and lcinetics analyses. A structural model for AXA was created from the three-dimensional structure of the &#945;-amylase from Alteromonas haloplanctis (Aghajari et al., 1998). This model was superimposed on the structure ofthe pig pancreatic &#945;-amylase, PPA (Qian et. al., 1994), and 11 residues were selected and changed to alanine. Wild type and mutant AXA were secreted by Pichia pastoris strain GS115 cells and showed apparent molecular mass of 45 kDa. All mutants have reduced &#945;-amylase activity on starch and 4-nitrophenyl maltooligosaccharides (pNPG7, PNPG5 and PNPG4) at different levels. Mutation of residues H88, F136, D196, E223, D295 and N299 indicate their essential role by complete loss of activity. Kinetic and structural analyses strongly suggested that D196, E223 and D295 are the catalytic residues. The substitution of the side chain of C157, H200, G227, T230 and H294 reduced the catalytic efficiency (kcat/Km) of &#945;-amylase on starch to respectively 28%, 41%, 84%, 81% and 51%. Although G227 and T230 were not much important for activity and binding on starch, these residues were important for stabilization of complexes with short substrates (PNPG4). The results indicate that AXA\'s active site is composed of at least six sugar binding subsites. The binding of the glucoses at subsites +2 and -2 are favored against binding at subsites -3 and +3, respectively. The binding of glucose at subsite -3 is favored against binding at subsite +3. The wild type enzyme primarily hydrolyzes the third glucosidic bond in PNPG7, PNPG5 and PNPG4 and the products of hydrolysis were maltopentaose, maltotetraose, maltotriose, maltose and glucose.

Diversas proteínas de superfície de merozoítas (MSPs) de Plasmodium têm sido consideradas candidatas a compor uma vacina contra a malária. Nos últimos anos estudamos diversos aspectos da resposta imune naturalmente adquirida contra proteínas recombinantes baseadas nas MSPs de P. vivax. Estes estudos demonstraram que estas proteínas recombinantes mantêm suas funções imunológicas, podendo servir como base para a caracterização de suas estruturas tridimensionais. Com o objetivo de obter informações estruturais sobre as MSPs de P. vivax, 10 proteínas recombinantes, correspondentes à região C-terminal da MSP-1 (MSP119), e diferentes regiões da MSP-3&#945; e MSP-3&#946; foram expressas em Escherichia coli. Os dados estruturais da MSP119 foram obtidos por modelagem molecular com base nas coordenadas cristalográficas da MSP19 de P. cynomolgi. Por outro lado, existem poucas informações estruturais sobre as proteínas da família MSP-3 de Plasmodium. A análise da estrutura primária dessas proteínas indica que elas apresentam um domínio central rico em alaninas que estão organizadas como motivos \"heptads\". Esse tipo de estrutura primária favorece a formação de estruturas do tipo &#945;-hélices e \"coiled-coil\" (CC). No presente estudo, a composição da estrutura secundária de cada proteína recombinante foi caracterizada preliminarmente por ensaio de Dicroísmo Circular, realizado na região do UV distante. Com base nos resultados obtidos, selecionamos duas proteínas recombinantes baseadas na região C-terminal da MSP-3&#945; (CC4 e CC5) para análises biofísicas mais detalhadas. Inicialmente, demonstramos por espectrometria de massa que ambas as proteínas têm massa molecular esperada. Entretanto, os dados obtidos por cromatografia em gel filtração sugeriram que essas proteínas formam oligômeros. No caso específico da proteína CC5, estes dados foram confirmados por ultracentrifugação analítica que indicou a formação de tetrâmeros elongados, corroborando com a formação de estrutura do tipo \"coiled-coil\". Como o papel biológico dessas proteínas não é conhecido, os dados estruturais obtidos neste estudo podem servir como base para o entendimento da função dessas proteínas. Na segunda parte deste projeto, selecionamos cinco proteínas recombinantes para estudos comparativos de reconhecimento por anticorpos IgG de indivíduos procedentes de áreas endêmicas de malária vivax. Tais estudos confirmaram dados prévios que as MSPs são imunogênicas em infecções naturais. Em conjunto, nossos resultados sugerem que, assim como a MSP119, proteínas recombinantes baseadas na MSP-3a e MSP-313 podem ser exploradas em futuros estudos de indução de imunidade protetora contra a malária vivax em primatas não humanos. / Several merozoite surface proteins (MSPs) of Plasmodium have been considered candidates to compose a vaccine against malaria. In the last years, we have studied severaI aspects of the natural/y acquired immune response against recombinant proteins based on MSPs of P. vivax. These studies demonstrated that the recombinant proteins maintain their immunological functions and could be used for the characterization of their three-dimensional structure. To gain structural information on the MSPs of P. vivax, 10 recombinant proteins corresponding to the C-terminal region of MSP-1 (MSP119) and to different regions of the MSP-3&#945; and MSP-3&#946; were expressed in Escherichia coli. The structural data of the MSP119 were obtained by molecular modeling based on the crystallographic coordinates of the P. cynomolgi MSP119. On the other hand, there is limited structural information available for MSP-3 family of Plasmodium. The analysis of the primary structure of these proteins indicates that they present a central alanine-rich domain organized as heptads repeats. This type of primary structure favors the formation of &#945;-helices and coiled-coil (CC) structures. In the present study, the composition of the secondary structure of each recombinant protein was characterized preliminarily by circular dichroism monitored in the far-UV region. On the basis of the obtained results, we selected two recombinant proteins based on C-terminal region of the MSP-3&#945; (CC4 and CC5) for detailed biophysical analyses. Initially, we demonstrated that the monomer mass assigned for the two recombinant proteins corresponded exactly to those predicted from the primary sequence. However, during size exclusion chromatography, the proteins eluted at volumes corresponding to molecular weights that were much larger than their monomeric masses, suggesting that both proteins are oligomeric molecules. Interestingly, analytical ultracentrifugation experiments showed that the CC5 oligomers are elongated molecules. As the function of these proteins is not known, the structural data obtained in this study can be used to understand the function of these proteins. In the second part of this study, we selected five recombinant proteins for comparative recognition by IgG antibodies of the individuais from endemic areas of malaria vivax. These studies confirmed previous data that the MSPs are imunogenic in natural infections. Together, our results suggest that, as well as the MSP119, that recombinant proteins based on the MSP-3&#945; and MSP-3&#946; can be explored in future studies for the induction of protective immunity against malaria vivax.