Infiltration of myeloid cells in the tumor microenvironment is often associated with enhanced angiogenesis and tumor progression, resulting in poor prognosis in many types of cancer. The polypeptide chemokine PK2 (Bv8, PROK2) has been shown to regulate myeloid cell mobilization from the bone marrow, leading to activation of the angiogenic process, as well as accumulation of macrophages and neutrophils in the tumor site. Neutralizing antibodies against PK2 were shown to display potent anti-tumor efficacy, illustrating the potential of PK2-antagonists as therapeutic agents for the treatment of cancer. In this study we demonstrate the anti-tumor activity of a small molecule PK2 antagonist, PKRA7, in the context of glioblastoma and pancreatic cancer xenograft tumor models. For the highly vascularized glioblastoma, PKRA7 was associated with decreased blood vessel density and increased necrotic areas in the tumor mass. Consistent with the anti-angiogenic activity of PKRA7 in vivo, this compound effectively reduced PK2-induced microvascular endothelial cell branching in vitro. For the poorly vascularized pancreatic cancer, the primary anti-tumor effect of PKRA7 appears to be mediated by the blockage of myeloid cell migration/infiltration. At the molecular level, PKRA7 inhibits PK2-induced expression of certain pro-migratory chemokines and chemokine receptors in macrophages. Combining PKRA7 treatment with standard chemotherapeutic agents resulted in enhanced effects in xenograft models for both types of tumor. Taken together, our results indicate that the anti-tumor activity of PKRA7 can be mediated by two distinct mechanisms that are relevant to the pathological features of the specific type of cancer. This small molecule PK2 antagonist holds the promise to be further developed as an effective agent for combinational cancer therapy. / Dissertation

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / Hepatic encephalopathy (HE) is a neuropsychiatric disorder occurring in both acute and chronic liver diseases. Depending on the duration and degree of hepatic dysfunction, HE may be present as one of two major types; portal-systemic encephalopathy (PSE) (chronic liver failure) and fulminant hepatic failure (FHF) (acute liver failure). Hyperammonemia is a key feature of both PSE and FHF and it is strongly suggested that ammonia toxicity is implicated directly or indirectly in the pathogenesis of both forms of HE. The present thesis comprises 5 articles demonstrating various aspects of the pathophysiology and new approaches to the treatment of HE. In chapter 2.1; article 1, using in vivo microdialysis, brain extracellular glutamate levels were found to be increased in correlation with arterial ammonia levels and the degree of neurological impairment in rats with FHF due to liver devascularization. N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor binding was found to be unchanged in rats with liver devascularization compared to control rats. Treatments for both forms of HE continue to focus on ammonia-lowering strategies. When administered to portacaval shunted (PCS) rats, L-ornithine-Laspartate (OA), two substrates of the urea cycle, was observed to result in a lowering of plasma ammonia and increased plasma urea levels as well as protection against ammonia-induced coma (chapter 2.2; article 2). In acute liver failure, peripheral ammonia is removed via muscle glutamine synthetase (GS). This was confirmed in the study (chapter 2.3; article 3) in rats with liver devascularization where OA also lowered plasma ammonia and protected rats against coma and brain edema. GS activity in muscle was increased following OA treatment. Mild hypothermia was shown to be protective against coma and brain edema in rats with liver devascularization (chapter 2.5; article 5). In mildly hypothermie rats, plasma ammonia levels were unaffected whereas cerebrospinal fluid (CSF) ammonia levels were lowered suggesting that hypothermia prevents increased ammonia uptake into brain. This protective effect was associated with a decrease in extracellular brain glutamate levels, supporting the proposal that glutamate may be implicated in the pathogenesis of brain edema in FHF. Although the precise pathophysiologic mechanisms responsible for HE in FHF are not completely understood, an increased glutamatergic neurotransmission could contribute to this phenomenon. Another potential neurotoxin, manganese, is believed to be implicated in the pathogenesis of PSE. Manganese levels were found to be increased in both autopsied brain tissue from patients and in brain tissue from experimental animal models of PSE (chapter 2.4; article 4). It is suggested that manganese deposition is responsible for the signal hyperintensities on T1-weighted magnetic resonance (MR) images and the extrapyramidal symptoms found in PSE. / L'encéphalopathie hépatique (EH) est un désordre neuropsychiatrique que l'on retrouve soit dans la période aiguë ou la phase chronique d'une maladie du foie. Ainsi, selon la durée de l'atteinte hépatique, l'EH peut se présenter de 2 façons : la première étant l'encéphalopathie porto-systémique et la seconde l'encéphalopathie rencontrée au cours des hépatites fulminantes. L'encéphalopathie porto-systémique est secondaire à la dérivation portosystémique du sang veineux tel que rencontré spontanément lors de l'hypertension portale ou soit suite à une anastomose portocave chirurgicale ou radiologique (shunt intra-hépatique porto systémique transjugulaire ou TIPS). Cliniquement, l'EH portosystémique est un syndrome neurologique qui se développe lentement; le stade précoce est souvent peu apparent et se caractérise par des modifications du cycle du sommeil ainsi que des changements mineurs de personnalité. Une baisse du niveau d’attention ainsi qu'une incoordination musculaire apparaissent ensuite, progressant lentement vers la léthargie, la stupeur et le coma. Du point de vue anatomopathologique, l'EH porto-systémique est caractérisée par une astrocytose sans évidence d'altérations neuronales structurelles. L'hyperammonémie est une caractéristique importante de l'EH portosystémique et de l'encéphalopathie aiguë des hépatites fulminantes. Il est admis que l'ammoniaque est impliquée directement et/ou indirectement dans la pathogénèse dans ces deux types d'EH. À forte concentration, l'ammoniaque a le potentiel d'affecter le système nerveux central de diverses façons. Il y a d'abord un effet direct de l'ion ammonium sur la neurotransmission inhibitrice ou excitatrice ainsi qu'une inhibition de l'enzyme a-cétoglutarate déshydrogénase dans le cycle de Krebs, ce qui a comme conséquence directe d'altérer le métabolisme énergétique du cerveau. Cependant, le métabolisme énergétique du cerveau ne semble affecté que dans les stades très avancés de l'EH porto-systémique ou d'encéphalopathie aiguë des hépatites fulminantes. L'insuffisance hépatique chronique se traduit par une augmentation des concentrations de manganèse dans le sang et le cerveau. Une sélectivité des dépôts de manganèse est l'hypothèse la plus probable afin d'expliquer les signaux hyperintenses localisés dans le pallidum tel que démontré par l'imagerie par résonance magnétique chez les patients cirrhotiques. La section 2.5 démontre que les dépôts de manganèse sont augmentés dans les globus pallidus prélevés à partir d’autopsie du tissu cérébral chez des patients cirrhotiques. La concentration de manganèse est aussi élevée dans le globus pallidus dans deux modèles animaux d'insuffisance hépatique chronique. De plus, une corrélation a été établie entre le degré de dérivation porto-systémique et la quantité de dépôts de manganèse. Au contraire, le manganèse cérébral n'est pas augmenté dans un modèle animal d'hépatite fulminante, ce qui suggère que l'accumulation découle de l'insuffisance hépatique chronique, plus particulièrement suite à une dérivation porto-systémique. L'EH est caractérisée par des perturbations de plusieurs systèmes de neurotransmission cérébrale. Le système glutamatergique est celui qui a été le plus étudié et on croit qu'il est impliqué dans la pathogénèse de l'EH. Des nouveaux traitements sont requis pour traiter ou stabiliser l'EH chez les patients atteints d'EH porto-systémique ou d'encéphalopathie aiguë afin d'augmenter la période de temps nécessaire pour pouvoir effectuer une transplantation. Les traitements actuels sont soit inefficaces ou comportent des effets secondaires très néfastes. Afin de traiter l'EH porto-systémique, on préconise comme thérapie des stratégies axées sur la diminution de l'ammoniaque sérique. La L-ornithine-L-aspartate (OA) est composée de deux substrats du cycle de l'urée qui se sont avérés efficaces pour réduire l'ammoniaque et améliorer les symptômes cliniques chez des patients hyperammonémiques ayant une EH portosystémique. Nous avons démontré un effet protecteur de l'OA sur le coma précipité par une infusion d'ammoniaque chez des rats ayant une dérivation porto-cave. L'effet protecteur s'accompagne d'une réduction significative de l'ammoniaque plasmatique ainsi que d'une augmentation significative de l'urée plasmatique, ce qui suggère que la réduction de la concentration plasmatique de l'ammoniaque est en partie le résultat d'une augmentation de la synthèse d'urée par le foie. Nous croyons aussi que l'OA peut, par l'intermédiaire des transaminases, mener à la production de trois molécules de glutamate. Ce substrat (le glutamate) peut ensuite stimuler l'activité de la glutamine synthétase dans les muscles, le foie et le cerveau pour ainsi former de la glutamine. Cette possibilité est soutenue par l'augmentation du glutamate et de la glutamine dans le plasma et le liquide céphalo-rachidien (LCR). Contrairement à l'EH porto-systémique, l’insuffisance hépatique fulminante (HF) progresse très rapidement en quelques heures ou jours seulement, vers un état mental altéré, la stupeur et finalement le coma. Les convulsions sont rares mais des myoclonies sont souvent rencontrées avant le coma. Dans cette condition, le taux de mortalité est élevé et la mort est souvent causée par une hernie du tronc cérébral secondaire à une hypertension intracrânienne causée par un oedème cérébral massif. L'oedème cellulaire des astrocytes est fréquemment observé mais l'astrocytose Alzheimer de Type II (voir insuffisance hépatique chronique) n'est pas une caractéristique neuropathologique de l'hépatite fulminante. L'ammoniaque est aussi incriminée dans la physiopathologie de ce type d'encéphalopathie. Afin d'élucider davantage la pathophysiologie de l'encéphalopathie des HF, nous avons mesuré, par le biais d'une microdialyse cérébrale in vivo, les concentrations extracellulaires des acides aminés dans le cortex frontal de rats atteints d'HF induite par dévascularisation hépatique afin d'établir une relation avec le degré d'atteinte neurologique. Dans ce modèle, on retrouve un oedème cérébral accompagné d'une augmentation de l'eau, tel que mesurée dans le cortex frontal. Les concentrations extracellulaires de glutamate sont significativement élevées trois heures avant le début du stade précoma et continuent à augmenter jusqu'à l'état comateux. Ces données suggèrent que l'HF mène à une augmentation de la libération de glutamate et/ou une diminution de la recapture du glutamate de l'espace extracellulaire. Récemment, des études sur le tissu cérébral de rats encéphalopathiques suite à une HF ont révélé une diminution de la concentration protéique et de l'expression génique de GLT-1, un transporteur astrocytaire du glutamate. L'augmentation de la production de la glutamine via la glutamine synthétase est aussi possiblement impliquée dans la pathogénèse de ce type d'encéphalopathie. Cependant, l'augmentation constante des concentrations de glutamine extracellulaire n'est pas corrélée avec la sévérité de l'encéphalopathie. Ceci suggère que la glutamine joue un rôle plutôt mineur dans la pathogénèse de l'oedème cérébral. Les traitements de l'encéphalopathie des HF sont axés sur le contrôle de l'hypertension intracrânienne. La transplantation hépatique demeure le traitement ultime mais d'autres traitements sont nécessaires afin de prolonger la vie des patients en attente de transplantation. Des stratégies visant à diminuer les taux d'ammoniaque ont été développées depuis qu'une étude récente a démontré que la survenue d'hernie cérébrale chez les patients souffrant d'HF était corrélée à la concentration artérielle d'ammoniaque. Nous avons démontré que l'infusion d'OA chez des rats ayant subi une dévascularisation hépatique entraînait un délai significatif avant l'apparition du coma, et une diminution significative de l'ammoniaque du plasma et du LCR comparativement aux contrôles. Cette diminution d'ammoniaque était accompagnée d'une réduction du contenu cérébral en eau. Le glutamate et la glutamine plasmatiques furent aussi significativement augmentés et puisque le cycle de l'urée est non-fonctionnel dans un foie dévascularisé, la réduction d'ammoniaque ne pouvait donc être induite que par la stimulation de la glutamine synthétase des muscles squelettiques. Le glutamate présent dans le LCR diminue parallèlement à la réduction du contenu cérébral en eau. Un autre des traitements qui fut récemment développé pour contrôler l'encéphalopathie des HF est l'hypothermie modérée. En réduisant la température corporelle de rats ayant subi une dévascularisation hépatique à 34°C, nous avons démontré un effet protecteur de cette procédure sur l'apparition du coma et de l'oedème cérébral. Les niveaux des acides aminés furent aussi mesurés en utilisant la méthode de microdialyse cérébrale in vivo et nous avons démontré une diminution du glutamate extracellulaire chez les rats protégés par l’hypothermie. Les mécanismes possiblement impliqués dans l'action bénéfique de l'hypothermie modérée incluent la diminution du transfert de l'ammoniaque sanguin vers le cerveau et la diminution des concentrations extracellulaires cérébrales d'acides aminés excitateurs tels que le glutamate. Ces résultats ajoutent davantage de crédibilité à la notion que la disponibilité élevée du glutamate dans l'espace extracellulaire et donc, une neurotransmission glutamatergique élevée, est impliquée dans la pathogénèse de certaines des complications cérébrales rencontrées au cours de l'HF. Ces résultats appuient aussi l'hypothèse que l'hypothermie modérée peut s'avérer une méthode efficace de prévention de l'encéphalopathie et de l'oedème cérébral, deux complications cérébrales très sévères de l'HF.

Der wichtigste exzitatorische Neurotransmitter Glutamat spielt eine grosse Rolle in der Gehirnentwicklung, wie neuronale Migration und Synaptogenese. Ob glutamaterge Stimulation für das Überleben entwickelnder Neuronen notwendig ist, war bislang jedoch unbekannt. Um zu untersuchen, ob eine Hemmung von Glutamatrezeptoren im unreifen Gehirn zu Neurodegeneration führt, wurden Ratten im Alter von 1 bis 31 Tagen für 24 Stunden mit dem N-Methyl-D-Aspartat-(NMDA) Glutamatrezeptorantagonisten Dizocilpin (MK801) behandelt. Die Dichte neuronaler Degeneration wurde mikroskopisch in Kupfer-Silber- und TUNEL- gefärbten Hirnschnittpräparaten ermittelt und Unterschiede mittels ANOVA analysiert (Signifikanzniveau p / The predominant excitatory neurotransmitter glutamate plays a major role in certain aspects of neural development. However, whether developing neurons depend on glutamate for survival remains unknown. To investigate if deprivation of glutamate stimulation in the immature mammalian brain causes neuronal cell death (apoptosis), rat pups aged 0 to 30 days were treated for 24 hours with dizocilpine maleate (MK801), an N-methyl-D-aspartate-(NMDA) glutamate receptor antagonist. Density of neural degeneration was evaluated by a stereological dissector method in cupric-silver and TUNEL-stained brain slices. Groups were compared by ANOVA and significance considered at p