Orientador: Antonio Condino Neto / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-04T23:42:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Gomez_LinaAndrea_D.pdf: 4776023 bytes, checksum: a1c947f4c3db64220a2153a255069581 (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: A NADPH oxidase das células fagocíticas é um sistema enzimático encarregado da produção de espécies reativas do oxigênio, as quais são essenciais durante a resposta imune inata contra uma grande variedade de microorganismos como bactérias e fungos. Um dos principais componentes deste sistema é a proteína citosólica p67PHOX codificada pelo gene NCF2 localizado no braço longo do cromossomo 1. Mutações no gene NCF2 resultam em uma das formas autossômicas recessivas da doença granulomatosa crônica (DGC), uma imunodeficiência primária caracterizada por infecções graves e recorrentes. Recentemente descrevemos mudanças nucleotídicas em alguns pacientes deficientes de p67PHOX onde aparentemente essas alterações não foram responsáveis pelo fenótipo, mas que poderiam modificar de alguma forma a expressão do gene. Para determinar se essas alterações correspondem a polimorfismos gênicos, analisamos sua ocorrência na população normal. A primeira substituição é uma transição C ? T na posição -23 da região 5' reguladora do gene. Dos 100 sujeitos avaliados, 67% foram homozigotos para o alelo C, 32% foram heterozigotos e só 1% foram homozigotos para o alelo T. A segunda mudança nucleotídica corresponde à transição A->G na posição -21 da região 3' terminal do íntron 10 (IVS10-21A?G), essa substituição foi analisada em 114 indivíduos dos quais 41% foram homozigotos para A, 49% foram heterozigotos e 24% homozigotos para G. Esses dois polimorfismos estão localizados dentro de seqüências necessárias para o início da transcrição (C?T at -23) e para a formação do splicing (IVS10-21A?G) e por isto podem alterar a expressão do gene p67PHOX, e conseqüentemente diminuir a atividade do sistema NADPH oxidase. Na análise da seqüência com o polimorfismo no intron 10 (IVS10-21A->G), observamos espécies anormais de mRNA nos indivíduos sadios. Nos genótipos analisados algumas moléculas de RNAm não possuem o exon 11. O efeito funcional do polimorfismo -23C/T no gene p67PHOX foi analisado medindo a atividade da luciferase entre construtos, contendo toda a região promotora com o alelo T e com o alelo C, mas não se observaram diferenças / Abstract: The NADPH oxidase of phagocytic cells is an enzymatic system that through the production of reactive oxygen species is essential for the innate immune response against a variety of bacteria and fungi. One of its essential components is pfyf"0*, a 67-kDa cytosolic protein encoded by the NCF2 gene located in the long arm of chromosome 1. Varied mutations involving the NCF2 gene result in an autosomal recessive form of chronic granulomatous disease (CGD), a primary immunodeficiency characterized by severe and recurrent infections. We have recently described different nucleotide changes in some p67-^jAor-deficient patients that apparently were not responsible for the CGD phenotype, but they could modify to some extent gene expression. To determine if two of these changes corresponded to genetic polymorphisms, we analyzed their occurrence in healthy donors. The first substitution corresponded to C-"T transition at position -23 of the 5' regulatory region of the gene. Among 100 evaluated subjects, 67% were homozygous for the allele containing C, 32% were heterozygous, and 1% were homozygous for T. The second nucleotide change corresponded to A >G transition in position -21 of the 3' end of intron 10 (TVSlf>-21A-"G). This substitution was analyzed in 114 subjects: 41% were homozygous for A, 49% were heterozygous, and 24% were homozygous for G Both polymorphisms are located within sequences necessary for initiating gene transcription (C-"T at -23) and for RNA splicing (IVS10-21A->G). Therefore, they may alter 067¿°^ gene expression and consequently decrease the activity of NADPH oxidase system. The sequence analysis for the polymorphism located in the intron 10 (TVS 10-21 A -Kr) show generation of the abnormal mRNA species in normal individuals; some molecules of the mRNA do not contain the intron 11 in all subject genotypes. The functional effect of the -23 07 polymorphism in the p67-PHOX was evaluated measuring luciferase activity of the T allelic p67-PHOX promoter and C allelic promoter, but no differences were observed / Doutorado / Saude da Criança e do Adolescente / Doutor em Saude da Criança e do Adolescente

Orientador: Antonio Condino Neto / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-12T09:19:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Prando_CarolinaCardosodeMello_D.pdf: 7021288 bytes, checksum: e93bf24a96be00102eb5a19f5d7c8880 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: O sistema NADPH oxidase fagocítico humano possui um papel importante na defesa contra microorganismos intracelulares, incluindo micobactérias. Mutações nas subunidades deste sistema resultam na Doença Granulomatosa Crônica (DGC). O gene CYBB, localizado no cromossomo X, codifica a subunidade gp91phox, e mutações neste gene são responsáveis por cerca de 60% dos casos de DGC. Cerca de 40 anos depois da identificação de DGC, foi identificado o primeiro dos 13 defeitos genéticos associados à Susceptibilidade Mendeliana à Micobacteriose, participantes do eixo IL12/23-IFN-?. Baseado no fato de que ambas as doenças predispõem a infecções por micobactérias e que o IFN-? is é um importante ativador do gene CYBB os autores se propuseram a estudar as características clinicas de pacientes latino-americanos com DGC e o sistema NADPH oxidase e expressão do gene CYBB em pacientes com defeitos no eixo IL-12/23-IFN-?. Em relação às características clínicas: história familiar de infecções graves e/ou de repetição, bem como reação adversa à vacina BCG, linfadenopatia, abscessos de pele e profundos estavam associados à DGC, em comparação com não-DGC avaliados pelo laboratório. Defeitos nos receptores IFNGR1 e IFNGR2 e cadeia B1 do receptor de IL-12 podem apresentar expressão do gene CYBB e atividade do sistema NADPH oxidas e diminuída ou abolida, chegando a níveis comparáveis a um paciente com DGC. O IFN- ? e seus receptores são essenciais para o desenvolvimento e ativação do sistema NADPH oxidase, e pacientes com comprometimento da função deste sistema devem também ser avaliados para defeitos do eixo IL12/23-IFN-? afetando secundariamente o sistema NADPH oxidase. / Abstract: The NADPH phagocytic oxidase system plays a crucial role in host defense against intracellular microorganisms, including mycobacteria. Mutations affecting subunits of this system result in Chronic Granulomatous Disease (CGD). The CYEE gene, located in the X chromosome, encodes gp91 phox, and mutations on this gene account for more than 60% of CGD cases. Almost 40 years after, the first of 13 different genetic disorders associated with Mendelian Susceptibility to Mycobacterial Diseases (MSMD), was identified. The genes responsible for MSMD are part of the IL12/23-IFN-? axis. Based on the fact that both the diseases predispose to mycobacterial infections and that IFN-? is an important activator of CYBB gene, the authors aimed to describe clinical aspects of Latin American CGD patients and investigate ifthe NADPH oxidase system function and gp91phox expression would be affected in patients with defects in the IL-12/23-IFN-? axis. Regarding clinical features familial history of recurrent and sever infections, as well as adverse reactions to BCG vaccine, lymphadenopathy, skin and profound abscess were associated to DGC when compared to clinical features of non-CGD evaluated in the laboratory. Defects of IFNGR1 and IFNGR2 and IL12RB1 may present diminish.ed or abolished gene expression of CYBB and activity of NADPH oxidase system ate levels of a CGD patient. Based on that, we can conclude that IFN- ? and its receptor are essential for development and activation 9f NADPH oxidase system. In addition, patients who present an impaired superoxide release and/or failure on expressing gp91phox should also be evaluated for IL12/23-IFN-? axis affecting secondarily the NADPH oxidase system. / Doutorado / Doutor em Farmacologia

Orientador: Antonio Condino Neto / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-12T09:56:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Blanco_MarcosLuengo_D.pdf: 1688728 bytes, checksum: fc6f41e84fcfcc3055bd8f9334a45c46 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: Neste trabalho, estudou-se o papel funcional de fator nuclear kappa B (NF-?B), sobre a regulação do gene CYBB e, conseqüentemente, a influência que esse fator exerce sobre o desenvolvimento do sistema NADPH oxidase humano. Células mielocíticas da linhagem U937 transformadas com um vetor carregando o gene repressor de, NF-?B (I-?Ba-S32A/ S36A) demonstraram uma redução na liberação de ânion superóxido e uma diminuição nos níveis de expressão do gene CYBB comparado ao grupo controle de células U937 selvagens. Em paralelo, os mesmos parâmetros foram avaliados em linfócitos B de pacientes com Displasia Anidrótica Ectodérmica com Imunodeficiênca (DAE-ID) transformadas com vírus de Epstein-Barr (EBV), (EBV-DAE-ID?B S32I e DAE-ID NEMO/IKK? X420W), e células de um paciente portador de Doença Granulomatosa Crônica (DGC), com mutação ligada ao X (EBV-DGC-X91°). Esses experimentos também mostraram os mesmos efeitos inibidores da atividade NADPH oxidase, assim como a redução dos níveis de expressão do gene CYBB. Os ensaios de EMSA supershift (anti-p50 humano) demonstraram ausência da ligação do complexo protéico à seqüência consenso para NF-?B 5' do gene do CYBB, confirmando o bloqueio da translocação deste fator para o interior do compartimento nuclear das células U937 transformadas e das células EBV-DAE-ID?B S32I e DAE-ID NEMO/IKK? X420W. Diante destes resultados, conclui-se que o NF-?B é necessário para a ativação da expressão do gene CYBB e conseqüentemente para o desenvolvimento do sistema NADPH oxidase de fagócitos humanos. / Abstract: This work investigated the functional role of nuclear factor-? B (NF-?B) in respiratory burst activity and in expression of the human phagocyte nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) oxidase gene CYBB. U937 cells with a stably transfected repressor of NF-?B (I-?Ba-S32A/ S36A) demonstrated significantly lower superoxide release and lower CYBB gene expression compared with control U937 cells. We further tested Epstein-Barr virus (EBV)-transformed B cells from patients with anhidrotic ectodermal dysplasia with immunodeficiency (EDAID), an inherited disorder of NF-?B function (DAE-IDI?B S32I e DAE-ID NEMO/IKK? X420W). Superoxide release and CYBB gene expression by EDA-ID cells were significantly decreased compared with healthy cells and similar to cells from patients with X-linked chronic granulomatous disease (X91° CGD). Gel shift assays demonstrated loss of recombinant human p50 binding to a NF-?B site 5' to the CYBB gene inU937 cells treated with NF-?B inhibitors, repressor-transfected U937 cells, and EDA-ID patients' cells. These studies show that NF-?B is necessary for CYBB gene expression and activation of the phagocyte NADPH oxidase in this model system. / Doutorado / Doutor em Farmacologia