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Avaliação funcional da proteína anônima relacionada à trombospondina 2 de Neospora caninum (NcMIC2-like1) / Functional evaluation of the thrombospondin related anonymous protein 2 from Neospora caninum (NcMIC2-like1)

Pereira, Luiz Miguel 30 August 2013 (has links)
Neospora caninum é um protozoário Apicomplexa, parasita intracelular obrigatório que possui o cão e outros canídeos como hospedeiros definitivos e os bovinos como principais hospedeiros intermediários. Causa nos primeiros encefalopatia e nos últimos abortos com perda da fertilidade, gerando prejuízos significativos na pecuária mundial. Como Toxoplasma gondii e Plasmodium, N. caninum possui um sistema específico de secreção que permite a invasão ativa do parasita na célula hospedeira, formação do vacúolo parasitóforo e replicação. Devido ao seu ciclo intracelular, várias estratégias foram desenvolvidas para caracterizar o processo de invasão no filo, como deleção ou controle da expressão de genes envolvidos. Entre os genes com papel importante no processo invasivo, NcMic2-like1 possui destaque já que o soro contra essa proteína recombinante inibiu 60% da invasão de N. caninum in-vitro. Essa proteína micronêmica possui domínios adesivos (uma integrina e seis trombospondinas) que atuam na ligação entre os receptores da célula hospedeira e o motor de actina e miosina do parasita, possibilitando a invasão ativa. O objetivo central do trabalho foi o desenvolvimento de ferramentas genéticas para a deleção e hiperexpressão de NcMic2-like1 e outras proteínas em N. caninum para a compreensão profunda desse mecanismo, além da caracterização, localização e expressão de NcMic2-like1. Para isso dois modelos baseados na resistência a drogas e integração ao genoma do parasita foram construídos. Um se baseia na resistência contra cloranfenicol (pelo gene Cloranfenicol Acetil Transferase - CAT) e o outro contra pirimetamina (pela mutação da Diidrofolato Redutase-Timidilato Sintase - DHFRM2M3). As sequências que conferem resistência foram ligadas ao promotor e região 3\' UTR de três genes de N. caninum, NcSAG1 (ou SAG1-like); NcDHFR ou NcHXGPRT conferindo resistência às drogas após transfecção. A esses vetores de resistência foram ligadas duas sequências do controle de expressão por tetraciclina, o sistema TetR/tetO. Adaptando o sistema de T. gondii para N. caninum, TetR foi expresso sob controle do promotor RPS13 ou Tubulina de N. caninum e tetO controlou a expressão de Lac-Z (?-galactosidase), ii uma enzima repórter. TetR e tetO foram transfectados de modo estável utilizando os vetores CAT e DHFRM2M3. O sistema foi responsivo à adição de tetraciclina, além de indicar um meio provavelmente independente de TetR quando apenas tetO foi avaliado em N. caninum. Foi possível expressar Lac-Z em N. caninum, possibilitando o desenvolvimento e padronização de ensaios de invasão, crescimento e detecção do taquizoíta. Também foi realizada a detecção de YFP (proteína amarelo fluorescente) nos taquizoítas transfectados com YFP fundida em TetR. Essas ferramentas de inserção e deleção de genes possibilitaram a construção de vetores para a hiper expressão ou deleção de NcMic2-like1. Para hiper expressão o vetor foi obtido pela substituição de Lac-Z pelo gene NcMic2-like1. Para deleção de NcMic2-like1 o vetor foi desenvolvido pela ligação do seu promotor e região 3\' UTR ä CAT ou NcDHFRM2M3, que promove a substituição do gene alvo pelos de resistência por recombinação homóloga. Adicionalmente foram desenvolvidas formas para a expressão e purificação de proteínas em N. caninum. Também foi obtida a solubilização de NcMIC2-like1 recombinante pelo sistema pET28 após a adição de uma cauda solúvel amplificada do genoma de N. caninum. O desenvolvimento de métodos de manipulação genética é um fato inédito para N. caninum e possibilitará estudos moleculares mais profundos sobre os mecanismos de invasão e replicação, onde NcMic2-like1 aparece como primeira candidata para esses ensaios. / The Apicomplexa protozoan Neospora caninum is an obligate and intracellular parasite that has the dog and other canides as definitive host and especially cattle as intermediate hosts. It causes respectively encephalopathy. abortions and loss of fertility causing deep economic impact at the world livestock. As Plasmodium and Toxoplasma gondii, N. caninum has a specific system of active secretion, which allows the invasion of the parasite into the host cell, the establishment of parasitophorous vacuole and replication. Due to the intracellular cycle of parasite, several strategies have been developed to characterize the invasion process of the phylum, such as deletion or control of expression of related genes. Among the genes with an important role in the invasive process, NcMic2-like1 stands out, once the serum against the recombinant form inhibited the in vitro invasion of N. caninum up to 69%. This microneme protein has adhesive domains (one integrin and six thrombospondins) acting between the host cell receptors and the actin/myosin motor of the parasite, allowing the active invasion. The main aim of this work was the development of genetic tools for deletion and overexpression of NcMic2-like1 and other proteins in N. caninum for a deep understanding of this mechanism, in addition to the characterization, localization and expression of NcMic2-like1. Therefore two models based on the drug resistance and integration into the genome of the parasite were constructed. One was based on the resistance against chloramphenicol (chloramphenicol acetyl transferase gene by - CAT) and the other against pyrimethamine (by mutation of dihydrofolate reductase-thymidylate synthase - DHFRM2M3). The sequences that confer these two drug resistance patterns have been ligated to the promoter and the 3\' UTR region of three genes from N. caninum, NcSAG1 (or SAG1-like); NcDHFR or NcHXGPRT, conferring resistance to the drugs after transfection. These vectors were ligated to two sequences that confer resistance controlled by tetracycline, the TetR / tetO system. The T. gondii system was adapted for N. caninum. TetR was expressed under the control of N. caninum tubulin promoter and tetO controlled the expression of Lac-Z (?-galactosidase), a reporter enzyme. TetR and tetO were stably inserted in N. caninum after transfection iv with the vectors based on CAT and DHFRM2M3.The system was responsive following tetracycline presence, in addition to a TetR independent mechanism in N. caninum . Moreover, it was possible to express Lac-Z in N. caninum enabling the development and standardization of invasion, growth and detection tachyzoite assays. It was also possible to detect through fluorescence microscopy the YFP (yellow fluorescent protein) in tachyzoites transfected with YFP fused to TetR.. The tools for gene insertion and deletion allowed the construction of vectors for hiperexpression or deletion of NcMic2-like1. For hiperexpression the vector was obtained by the replacement of the Lac-Z by the NcMic2-like1 gene. For the NcMic2-like1 deletion the vector was achieved after the ligation of its promoter and 3 \'UTR region to CAT or NcDHFRM2M3. This approach leads to the replacement of the target gene by the resistance gene through homologous recombination. Furthermore approaches for expression and purification of proteins in N. caninum were developed. Also, a soluble recombinant NcMIC2-like1 form was obtained with pET28 system added with a soluble tail amplified from a genome region of N. caninum. The development of genetic manipulation methods is an unprecedented event for N. caninum and will enable deeper molecular studies over mechanisms of invasion and replication, where NcMic2-like1 is the first candidate for these assays.
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Isolamento e caracterização molecular e biológica de Toxoplasma gondii e pesquisa de Neospora caninum em roedores urbanos da Grande São Paulo (SP) / Isolation, molecular and biological characterization of Toxoplasma gondii and survey for Neospora caninum in urban rodents from Great São Paulo (SP)

Muradian, Vanessa 08 May 2009 (has links)
Com o objetivo de identificar Toxoplasma gondii e Neospora caninum em roedores urbanos da Grande São Paulo (SP) 217 roedores (quatro camundongos -Mus musculus, 20 ratazanas - Rattus norvegicus e 193 ratos de telhado - Rattus rattus) foram capturados entre abril de 2005 e fevereiro de 2008, para realização do diagnóstico biológico e molecular. Das 20 ratazanas (Rattus norvegicus) capturadas apenas uma foi positiva para T. gondii pelo bioensaio, correspondendo a 5% de positividade entre as ratazanas e 0,46% entre todos os roedores capturados. O isolado obtido dessa ratazana foi caracterizado como genótipo recombinante I, III e u-1 por PCR-RFLP, similar ao isolado previamente descrito e obtido de duas ovelhas e um gato, todos do Estado de São Paulo. Quatro amostras de roedores negativos ao bioensaio resultaram como positivas ao T. gondii pela nested PCR B1. Entretanto, quando submetidas à nested PCR ITS1 e à restrição enzimática (RFLP) não houve confirmação desse resultado em três delas. Em relação ao N. caninum, amostras de tecido cerebral e cardíaco de 121 roedores foram examinadas por nested PCR Nc5, tendo sido encontradas 12 amostras positivas, provenientes de 10 roedores. Quando submetidas à nested PCR ITS1 e à restrição enzimática (RFLP) N. caninum não foi confirmado em nenhuma das amostras. Este estudo conclui que a ocorrência de T. gondii e N. caninum em roedores urbanos da Grande São Paulo (SP) é baixa, sugerindo que estes animais não possuem papel importante na cadeia epidemiológica como reservatórios desses agentes para predadores como os cães e gatos urbanos. / In order to identify Toxoplasma gondii and Neospora caninum in urban rodents from the Great São Paulo (SP) 217 rodents (four Mus musculus, 20 Rattus norvegicus and 193 Rattus rattus) were captured between April 2005 and February 2008 to biological and molecular diagnosis. One out of the 20 Rattus norvegicus was considered positive by bioassay in mice, corresponding to a 5% positivity among Rattus norvegicus and a 0.46% positivity considering all captured rodents. The isolate from this rat was characterized as a recombinant I, III and u-1 genotype by RFLP-PCR. This characterization had been previously described from isolates obtained from two sheep and one cat also from São Paulo state. Four samples from rodents with negative results by bioassay were positive to T. gondii by nested PCR B1. However, when tested with nested PCR ITS1 and RFLP these results were not confirmed in three of these samples. Regarding N. caninum, brain and heart samples of 121 rodents were examined by nested PCR Nc5 and 12 samples from 10 rodents were positive. When tested with nested PCR ITS1 and RFLP all of these samples turned out to be negative. This study concludes that T. gondii and N. caninum have low occurrence in urban rodents in the Great São Paulo area, and they are not important as T. gondii and/or N. caninum reservoirs to predators like urban cats and dogs.
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Aspectos epidemiológicos da infecção por Neospora caninum em bovinos leiteiros da região do Vale do Paraíba Paulista / Epidemiological aspects od Neospora caninum infection in dairy cattle from the Vale do Paraíba Paulista region

Cardoso, José Márcio Sbruzzi 03 September 2010 (has links)
O protozoário intracelular Neospora caninum é um parasito importante em bovinos, nos quais pode causar abortamentos e infecção congênita. Os cães e alguns outros canídeos são os hospedeiros definitivos e vários pontos na cadeia epidemiológica ainda são pouco conhecidos. Esta tese tem por objetivos estudar aspectos da epidemiologia do N. caninum em bovinos leiteiros de rebanhos do Vale do Paraíba Paulista, São Paulo, Brasil. Para tanto um estudo prospectivo, com duração de dois anos e nove colheitas de sangue de todos os bovinos de três propriedades, foi realizado. Dados sobre: ocorrência de anticorpos anti- N .caninum, ocorrência e períodos de abortamentos, intervalo entre partos e número de serviços foram avaliados. Associação entre o estatus sorológico dos pares mães-filhas, bem como variação dos títulos de anticorpos durante a gestação em vacas positivas foi estudada. Um último estudo avaliou a permanência dos anticorpos anti-N. caninum, adquiridos passivamente através do colostro, em bezerros nascidos negativos. Os estudos permitiram concluir que a ocorrência de anticorpos anti-N. caninum variou entre os rebanhos e dentro de cada rebanho nas diferentes colheitas; resultados sorológicos transitórios, não caracterizando soroconversão, foram observados; altas taxas de transmissão vertical e baixas taxas de transmissão horizontal foram encontradas; risco relativo de abortamentos em vacas soropositivas em relação às negativas foi observado em algumas ocasiões; dentre os índices reprodutivos avaliados somente os abortamentos foram significativos; anticorpos colostrais foram detectados nos bezerros até a 21ª semana pós-nascimento e vacas gestantes apresentaram variação nos títulos de anticorpos, com mais altos níveis no 2º e 3º trimestre de gestação, sem associação com abortamentos. Este foi o primeiro estudo prospectivo sobre aspectos epidemiológicos do N. caninum em bovinos no Brasil / The intracellular protozoan parasite Neospora caninum is an important parasite in cattle, in which can cause miscarriages and congenital infection. Dogs and some other canids are the definitive hosts and various points in the epidemiology of this parasite are still obscure. This thesis aims to study aspects of the epidemiology of N. caninum in dairy cattle from herds in the Vale do Paraíba Paulista, São Paulo, Brazil. Therefore, a prospective study lasting two years and nine blood samples of all cattle from three farms was conducted and data from existence of anti-N. caninum antibodies in the herds, occurrence and periods of miscarriages, calving interval and number of services were assessed. Association between the serological status of the mother-daughter pairs, and variation in antibody titers during pregnancy in positive cows was studied. A final study evaluated the persistence of anti-N. caninum antibodies, passively acquired through colostrum, in calves born negative. The studies showed that the occurrence of anti-N. caninum antibodies ranged between herds and within herds in the different groups; transient serological results, not characterizing seroconversion, were observed; high vertical and low horizontal rates of transmission were found; relative risk of abortion in seropositive cows in relation to negative was observed in some occasions; among the reproductive indices evaluated only abortions were analised as significant; colostral antibodies were detected in calves until weeks 21 post-birth, and pregnant cows showed variation in antibody titers, with highest levels in the 2nd and 3rd trimester or the pregnancy and this found was not associated with miscarriages. This was the first prospective study on epidemiology of N. caninum in cattle in Brazil
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Experimental oral infection in chickens (Gallus gallus domesticus) with Neospora caninum (NC-SP1) oocysts / Infecção experimental oral de galináceos (Gallus gallus domesticus) com oocistos de Neospora caninum (NC-SP1)

Oliveira, Solange de 15 December 2017 (has links)
Neospora caninum is a tissue-cyst forming parasite that belongs to the phylum Apicomplexa. Dogs and other canids are the definitive hosts of N. caninum and they are responsible to excrete oocysts, the environmentally resistant stage of the parasite. Viable parasites have been isolated from a variety of species, especially herbivorous, confirming their role as intermediate hosts. The importance of birds in the life cycle of N. caninum is not clear. Several experiments, using tachyzoites as inoculum, were conducted in domestic and wild birds and the results were not conclusive. In nature, the possible mode of transmission in chickens is the ingestion of oocysts. This work aimed to evaluate the infection by N. caninum in chickens orally inoculated with oocysts obtained from a new isolate of N. caninum. For that, approximately 400 g of brain from a naturally infected adult cattle, showing anti-N. caninum antibodies by means of the immunfluorescent antibody test - IFAT (titre = 200), were fed to a 2-month-old dog. Neospora-like oocysts were observed on day 7 post-inoculation (p.i.). The DNA obtained from oocysts was molecularly characterized using the ITS-1 marker and the final sequence was 99% identical to homologous sequences of N. caninum. Gerbils (Meriones unguiculatus) were orally inoculated with different doses of oocysts (10, 100 and 1000 oocysts), and all of them remained clinically normal and developed N. caninum antibodies 14 days p.i. (titre ≥ 50 by IFAT). Brain homogenate from an infected gerbil was seeded into a monolayer of Vero cells and tachyzoites were visualized at 24 days p.i.. Microsatellite genotyping using DNA from the tachyzoites revealed a unique genetic profile for this new reference isolate, named NC-SP1. Thirty White Leghorn chickens (Gallus gallus domesticus) were orally inoculated with viable N. caninum oocysts from the NC-SP1 isolate (200 oocysts per bird) via the crop at 21 days of age. Groups of three birds were euthanized at intervals of 7 days during 9 weeks; one group was challenged with the same oocysts dose at 37 days p.i. and observed for 11 weeks. Blood samples were collected weekly, and sera were tested by IFAT. Chicken tissues were analyzed using PCR, quantitative PCR and immunohistochemistry (IHC). Two mongrel dogs, approximately 45 days of age were fed with tissues from chickens euthanized at 138 and 159 days p.i.. The chickens did not seroconvert (titre < 5), and neither DNA (PCR and qPCR) nor antigen (IHC) of N. caninum was detected in inoculated chicken tissues. In addition, no oocyst excretion by the dogs was observed. In these experimental conditions, the chickens were resistant to N. caninum infection. / Neospora caninum é um parasita formador de cistos teciduais que pertence ao filo Apicomplexa. O cão doméstico e outros canídeos são os hospedeiros definitivos de N. caninum, pois podem excretar nas fezes os oocistos, o estágio ambientalmente resistente do parasita. Parasitas viáveis foram isolados de diversas espécies, principalmente herbívoros, confirmando seu papel como hospedeiros intermediários. A importância das aves no ciclo biológico de N. caninum ainda não está bem definida. Vários experimentos, utilizando taquizoítas como inóculo, foram realizados em aves domésticas e silvestres e os resultados não foram conclusivos. Na natureza, a via de transmissão mais provável para as galinhas é a ingestão de oocistos. Este trabalho teve como objetivo avaliar a infecção por N. caninum em galináceos infectados por via oral com oocistos de um novo isolado de referência de N. caninum. Inicialmente, 400g de cérebro de um bovino adulto naturalmente infectado, apresentando anticorpos anti-N. caninum por meio da reação de imunofluorescência indireta - RIFI (título = 200), foram oferecidos para um cão de 2 meses de idade. Oocistos Neospora-like foram visualizados 7 dias pós inoculação (p.i.). A sequência final obtida a partir do DNA extraído dos oocistos, baseada no marcador ITS-1, teve 99% de similaridade com sequências homólogas de N. caninum. Gerbilos (Meriones unguiculatus) foram inoculados com diferentes doses de oocistos (10, 100 e 1000 oocistos) por via oral, e todos eles permaneceram clinicamente normais e anticorpos contra N. caninum foram detectados 14 dias p.i. por meio da RIFI (título ≥ 50). O homogenado do cérebro de um gerbilo infectado foi inoculado em uma monocamada de células da linhagem celular Vero e taquizoítas foram observados no cultivo celular 24 dias p.i.. A genotipagem por microssatélites do DNA extraído desses taquizoítas revelou um perfil genético único ao novo isolado de referência, designado NC-SP1. Trinta galináceos (Gallus gallus domesticus) da linhagem White Leghorn foram então inoculados via papo aos 21 dias de idade com oocistos de NC-SP1 (200 oocistos por ave). As eutanásias foram realizadas em intervalos de 7 dias para cada grupo de três aves, durante 9 semanas, e um grupo foi desafiado com a mesma dose de oocistos aos 37 dias p.i. e acompanhado por 11 semanas. Amostras de sangue foram colhidas semanalmente, e os soros testados por meio da RIFI. Os tecidos das aves foram analisados por meio da PCR, PCR quantitativa (qPCR) e imunohistoquímica (IHQ). Dois grupos de aves foram eutanasiados aos 138 e 159 dias p.i. e os tecidos foram oferecidos para dois cães sem raça definida com aproximadamente 45 dias de idade. Os galináceos não soroconverteram (título < 5), e o DNA (PCR e qPCR) e o antígeno (IHQ) de N. caninum não foram detectados nos tecidos das aves. Oocistos de N. caninum não foram excretados pelos cães. Nestas condições experimentais, os galináceos foram resistentes à infecção por N. caninum.
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Função da galectina-1 na resistência do hospedeiro contra a infecção experimental por Neospora caninum / The function of Galectin-1 on host resistance against experimental Neospora caninum infection

Ferreira, Isabel Cristina Costa Vigato 17 February 2017 (has links)
Neospora caninum (Nc) é um protozoário Apicomplexa, parasita intracelular obrigatório, causador da neosporose, uma doença clínica indicada como uma das principais causas de aborto, morte neonatal e infertilidade em bovinos, representando um importante problema de saúde veterinária com grande impacto econômico no mundo todo. Galectina-1 (gal-1), uma proteína ligante de ?-galactosídeos, exibe diversas atividades biológicas em muitas doenças inflamatórias, mas nada foi descrito até o momento sobre a gal-1 na infecção por Nc. Este trabalho foi desenvolvido para avaliar o efeito da gal-1 (tanto endógena quanto exógena) na infecção experimental murina por N. caninum e o efeito da gal-1 exógena sobre a invasão celular de N. caninum em ensaios in vitro. Primeiramente, foram realizados ensaios para investigar a capacidade de ligação da gal-1 com taquizoítas de Nc e seu papel na invasão in vitro por Nc em diferentes modelos celulares. Nesses ensaios, gal-1 mostrou ligar-se aos taquizoítas de Nc via CRD (domínio de reconhecimento de carboidrato) de maneira dose-dependente. Tanto células VERO, quanto macrófagos e esplenócitos mostraram ser modelos eficazes para o estudo in vitro do processo de invasão e proliferação de Nc, porém, gal-1 não interfere no processo de invasão. Para os ensaios in vivo, camundongos C57BL/6 machos selvagens (WTgal-1+/+) e geneticamente deficientes de gal-1 (KOgal-1-/-) foram infectados com taquizoítas de Nc1-lacZ, por via intraperitoneal, e tratados com gal-1 exógena por 7 dias. Aos 5, 8 e 15 dias pós-infecção, foram avaliados diversos parâmetros imunológicos, como carga parasitária peritoneal e produção de óxido nítrico por células da cavidade peritoneal, perfil celular do peritônio e baço, produção de citocinas por células T, quantificação de anticorpos específicos anti-Nc e quantificação de citocinas nos sobrenadantes de cultura de células esplênicas. A ausência de galectina-1 endógena levou ao aumento da produção de óxido nítrico (NO), da população de macrófagos F4/80+ peritoneais e da secreção de IL-6. Porém, essa deficiência de gal-1 levou à redução da população de linfócitos T (CD4+ e CD8+) produtores de IFN- ?, diminuição da ativação de linfócitos B e da secreção de IFN-? e IL-10. Com relação aos camundongos WTgal-1+/+, foi destacada a contribuição da gal-1 exógena para estimular a produção de NO, promover o aumento do número de células F4/80+, induzir a secreção de IFN- ?, IL-10, IL-4 e IL-6, além de aumentar a produção de IgG e IgM. Em animais KOgal-1-/-, em contrapartida, foi observado um efeito imunorregulatório dessa galectina exógena sobre a resposta à infecção, caracterizado pelo aumento da carga parasitária peritoneal e diminuição da população de macrófagos (F4/80+) produção de NO na cavidade peritoneal. Além disso, e em conformidade com o perfil regulatório da resposta, foi possível observar a diminuição da população de linfócitos TCD8+ produtores de IFN-? e aumento das células T (CD4+ e CD8+) produtoras de IL-10 nos animais infectados e tratados, que corroborou com a secreção destas citocinas por células esplênicas. Com base nestes resultados, sugerimos que a gal-1 endógena medeia perfis imunológicos da resposta do hospedeiro, inibindo mecanismos efetores da resposta inata e estimulando a resposta adaptativa contra o parasita N. caninum e que a suplementação com gal-1 exógena gera uma imunorregulação na reposta do hospedeiro contra o parasita N. caninum. Nosso trabalho é pioneiro no estudo da interação da gal-1 na infecção com Nc e, embora seja um investigação inicial dos mecanismos imunológicos envolvidos nesse processo, sugere uma ação da gal-1 na modulação da resposta imunológica contra N. caninum. / Neospora caninum (Nc) is an apicomplexa protozoan, an obligate intracellular parasite that causes neosporosis, a clinical disease indicated as one of the main causes of abortion, neonatal death and infertility in cattle, representing an important veterinary health problem with great economic impact worldwide. Galectin-1 (gal-1), a ?-galactosidase binding protein, exhibits several biological activities in many inflammatory diseases. This work was aimed to evaluating the effect of gal-1 (both endogenous and exogenous) on N. caninum infection and the effect of exogenous gal-1 on the in vitro cellular invasion of N. caninum. Firstly, assays were developed to investigate the binding capacity of gal-1 with Nc tachyzoites and the role of this lectin in in vitro invasion process by Nc. Different cell models were used and VERO cells, macrophages and splenocytes proved to be effective models for the study of the Nc invasion and proliferation process. However, although galectin-1 has the ability to bind to Nc via CRD in a dose-dependent manner, this lectin does not interfere with the invasion process. For the in vivo assays, wild-type (WTgal-1+/+) and genetically deficient gal-1 mice (KOgal-1-/-) were intraperitoneally infected with Nc1-lacZ tachyzoites and treated with gal-1 for 7 days. At 5, 8 and 15 days post infection, various immunological parameters were evaluated, such as peritoneal parasite load and nitric oxide production by peritoneal cells, peritoneal and spleen cell profile, cytokine production by T cells, quantification of specific anti-Nc and quantification of cytokines in splenic cell culture supernatants. The absence of endogenous galectin-1 led to increased nitric oxide, peritoneal F4/80+ macrophage population and IL-6 secretion. However, gal-1 deficiency decreased the population of T cells (CD4+ and CD8+) producing IFN-?, the B lymphocyte activation and the secretion of IFN-? and IL-10. With respect to WTgal-1+/+ mice, we can highlight a contribution of exogenous gal-1 to stimulating NO production, promoting the increase of F4/80+ cells, inducing the secretion of IFN-?, IL-10, IL-4 and IL-6, in addition to increasing the production of IgG and IgM. In contrast, an immunoregulatory effect of this galectin in response to infection was observed in the KOgal-1-/- animals. It was observed an increased peritoneal parasite burden, decreased macrophage (F4/80+) population and NO production by these cells in the peritoneal cavity. In addition, in agreement with the regulatory profile of the response, it was observed a decrease of the CD8+ T cells population producing IFN-? and increased T cells (CD4+ and CD8+) producing IL-10, which corroborated with the secretion of these cytokines by the splenic cells. Based on these results, we suggest that endogenous gal-1 mediates immunological profiles of host response by inhibiting innate effector mechanisms and stimulating an adaptive response against N. caninum. Furthermore, exogenous gal-1 immunoregulate the host immune response against the parasite. Our work is a pioneer in studying the interaction of gal-1 in Nc infection and, although it is an initial investigation of the immunological mechanisms, our data suggests role of gal-1 in the modulation of the immune response against N. caninum
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Caracterização da proteína anônima relacionada à trombospondina 2 (TRAP 2) do protozoário Neospora caninum no processo de invasão celular / Characterization of the thrombospondin related anonymous protein 2 (TRAP 2) of the protozoan Neospora caninum in the cell invasion process.

Pereira, Luiz Miguel 28 April 2009 (has links)
Neospora caninum é um protozoário Apicomplexa, parasita intracelular obrigatório que possui o cão como hospedeiro definitivo e principalmente os bovinos como hospedeiros intermediários, causando nos primeiros encefalopatia e nos últimos abortos com perda da fertilidade, o que acarreta prejuízos significativos na pecuária mundial. O parasita necessita multiplicar de modo intra-celular, utilizando a descarga de proteínas contidas em organelas filo-específicas, como as micronemas que liberam proteínas relacionadas a adesão e invasão ativa, além das roptrias e os grânulos densos. Este trabalho foi realizado sobre um tipo de proteína micronêmica denominada proteína Anônima Relacionada à Trombospondina (TRAP), relacionada à adesão e ligação com o motor intracelular, responsável pelo processo ativo de invasão. TRAP 1 já havia sido descrita pela literatura e o objetivo deste trabalho foi a caracterização molecular do até então desconhecido homólogo TRAP 2, com expressão de suas formas recombinantes e o uso de seus respectivos anti-soros para ensaios funcionais e localização da proteína nativa. Com base em banco dados de ESTs e genômicos de N. caninum e fazendo uso de RLM-RACE (Reação mediada por RNA ligase- amplificação rápida dos términos de cDNA-RNA,) foi possível a obtenção da sequencia completa do gene NcTrap 2, que possui quatro éxons separados por três íntrons. Sua forma protéica, como seu homológo, é formado por um peptídeo sinal, uma integrina, cinco trombospondinas, uma região transmembrana e a cauda citoplasmática. A integrina e as trombospondinas são motivos relacionados à adesão para início do processo invasivo e foram os alvos deste trabalho. Foram expressos dois recombinantes a partir deste cerne funcional (integrina e trombospondinas), com 52 e 78 kDa, e seus respectivos anti-soros foram obtidos. Estes foram utilizados em western blots 1D e 2D para localização da forma nativa de NcTRAP 2 de aproximadamente 80 kDa no extrato total e de sua forma processada no ESA (extrato secretado, simulando o momento invasivo do taquizoíta) com 70 kDa. O soro contra o recombinante 1 teve a capacidade de inibir o processo invasivo em valores de 53 a 61%, dependendo do método utilizado (contagem manual ou real time PCR). NcTRAP 2 foi encontrada no complexo apical parasitário do taquizoíta por imunofluorêscencia confocal, evidenciando sua provável localização nas micronemas. A nova molécula, NcTRAP 2 possui características que a diferencia de NcTRAP 1 o suficiente para ser considerada homóloga. O soro contra sua forma recombinante detectou as formas nativas integral e secretada e demonstrou que NcTRAP 2 possui capacidade de inibir a invasão dos taquizoítas, o que a torna um interessante alvo vacinal. / Neospora caninum is an Apicomplexan protozoan, obligatory intracellular parasite that has the dog as definitive host and especially cattle as intermediate hosts, causing in the first ones encephalopathy and in the last ones abortion with fertility losses. Such facts lead to significant losses to livestock worldwide. The parasite must invade the cells for its development, using the discharge of proteins contained in phylum-specific organelles, like the micronemes proteins related with adhesion and active invasion, besides the proteins from rhoptries and dense granules. This work was performed on a type of micronemic protein, a thrombospondin-related anonymous protein (TRAP), related with adhesion and connection with the intracellular motor responsible for the active process of invasion. Based on the homologue previously described in the literature, TRAP 1, the aim of this study was the characterization of the undescribed TRAP 2 homologue, the expression of its recombinant forms, the use of its anti-sera for functional assays, and detection of its native form. Based on ESTs and genomic data from N. caninum, and using the RLM-RACE (ligase mediated rapid amplification of cDNA ends) technique, the complete sequence of NcTRAP 2 was obtained, which had four exons separated by three introns. As NcTRAP 1, the protein sequence is composed of a signal peptide, an integrin, five thrombospondin, a transmembrane region and a cytoplasmatic tail. The integrin and thrombospondin motifs are related to adhesion for initiation of the invasive process and were the targets of this work. We expressed two recombinant fragments from the functional core (thrombospondin and integrin), with 52 and 78 kDa, which were utilized for antisera production. The anti-sera localized the native form NcTRAP 2 which had approximately 80 kDa, and its processed form in ESA (Excreted/Secreted Antigen) with 70 kDa, both in western blot 1D and 2D. The serum against recombinant 1 had the ability to inhibit the invasive process from 53 to 61%, depending on the experimental method used (manual counting or real time PCR). NcTRAP 2 was localized at the apical complex of the parasite of the tachyzoites by confocal immunofluorescence, pointing towards its micronemal localization. The new molecule, NcTRAP 2, holds features that differentiates it from NcTRAP 1 in a substantial way to be considered homologue. The serum against the recombinant form detected the native full length and secreted forms of NcTRAP 2 and demonstrated that NcTRAP 2 has the ability to inhibit the invasion of tachyzoites, turning it into an interesting vaccine target to be investigated.
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Avaliação da infecção experimental por Neospora caninum em fêmeas bubalinas e bovinas, no terço inicial da gestação / Evaluation of experimental infection with Neospora caninum in bubaline and bovine females, in the first third of pregnancy

Chryssafidis, Andreas Lazaros 23 March 2012 (has links)
Neospora caninum é um protozoário parasita de grande importância em todo o mundo, sendo considerado a principal causa de abortamento bovino em algumas localidades. Enquanto a implicação deste parasita em distúrbios reprodutivos na espécie bovina seja conhecida, as informações disponíveis com a espécie bubalina são escassas. Este estudo avaliou e comparou as consequências da infecção experimental por N. caninum em búfalas e vacas, no estágio inicial da gestação, o de maior importância no que se refere à ocorrência de morte fetal. Protocolos de inseminação artificial em tempo fixo foram utilizados para maior controle da fecundação. Foram utilizados para inoculação dois isolados distintos, Nc-Bahia e Nc-1, possibilitando a comparação entre o isolado nacional e o isolado padrão. Todos os animais foram inoculados com 5 x 108 taquizoítos, pela via endovenosa, no 70º dia de gestação. Três búfalas e cinco vacas foram infectadas com o isolado Nc-Bahia, sendo detectado abortamento 42 dias pós-infecção (DPI) em somente uma das vacas inoculadas. Três búfalas e duas vacas foram inoculadas com o isolado Nc-1 e morte fetal foi detectada 35 DPI em todas as búfalas e vacas. Uma búfala e uma vaca permaneceram como controles negativos, sem infecção. A transmissão vertical foi verificada por semi-nested PCR nos animais infectados com Nc-Bahia e Nc-1. Diferentes graus de inflamação não-supurativa foram detectados em tecidos maternos, fetais e placentários. Todas as fêmeas inoculadas apresentaram resposta humoral frente à infecção. Embora a infecção estivesse mais disseminada pelo organismo das búfalas (p<0,05), a resposta humoral foi menor (p<0,05) e as lesões histológicas foram menos frequentes (p<0,05), indicando haver maior adaptação entre N. caninum e as búfalas, em comparação com os resultados obtidos nas vacas. O isolado Nc-Bahia foi menos patogênico que o Nc-1, por causar menos abortamentos (p<0,05) e menor frequência de lesões histológicas (p<0,05). A patogenicidade do agente na espécie bubalina foi confirmada, consideradas as lesões encontradas na análise histopatológica e a detecção da presença do agente por semi-nested PCR nos diversos tecidos estudados, além da positividade por imunoistoquímica em placenta e cérebro fetal bubalino. Esta é a primeira detecção de abortamento causado por N. caninum na espécie bubalina, em fêmeas infectadas experimentalmente com o protozoário, confirmando que problemas reprodutivos podem ser causados pelo N. caninum em búfalas. / Neospora caninum is a protozoan parasite with big importance all over the world, being considered the main cause of bovine abortion in some locations. While the implication of this parasite in bovine reproductive disorders is known, the available information within the buffalo species is scarce. This study evaluated and compared the consequences of experimental infection with N. caninum in buffaloes and cows on the initial stage of pregnancy, the most important regarding to the occurrence of fetal death. Protocols for fixed-time artificial insemination were used for greater control of fertilization. Two different isolates, Nc-Bahia and Nc-1, were utilized for inoculation, allowing the comparison between the national isolate and the standard isolate. All animals were inoculated with 5 x 108 tachyzoites, by endovenous route, at the 70th day of pregnancy. Three buffaloes and five cows were infected with the isolate Nc-Bahia and abortion was detected 42 days post-infection (DPI) in only one inoculated cow. Three buffaloes and two cows were inoculated with the isolate Nc-1 and fetal death was detected 35 DPI in all buffaloes and cows. A buffalo and a cow remained as negative controls, without infection. Vertical transmission was verified by semi-nested PCR in animals infected with Nc-Bahia and Nc-1. Different degrees of nonsuppurative inflamation were detected in maternal, foetal and placental tissues. All inoculated females showed humoral response against the infection. Although the infection was more disseminated withn the body of buffaloes (p <0.05), the humoral response was lower (p <0.05) and histological lesions were less frequent (p <0.05), indicating bigger adaptation between N. caninum and the buffaloes, in comparison with the results obtained in cows. Nc-Bahia isolate was less pathogenic than the Nc- 1, as it caused less abortions (p <0.05) and lower frequency of histological lesions (p<0.05). The pathogenicity of the agent in the bubaline species was confirmed, considering the lesions found on histopathology analysis and the detection of the agent´s presence by semi-nested PCR in the different studied tissues, in addition to the positivity by immunohistochemistry test in bubaline placenta and foetal brain. This is the first detection of abortion caused by N. caninum in buffalo species, in females experimentally infected with the protozoan, confirming that reproductive disorders can be caused by N. caninum in buffaloes.
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Infecção experimental de cães (Canis familiaris) com oocistos esporulados de Neospora caninum. / Exprimental infection of dogs (Canis familiaris) with sporulated oocysts of Neospora caninum.

Bandini, Luciana Ahlf 08 December 2009 (has links)
O objetivo deste estudo foi infectar experimentalmente cães com oocistos esporulados de N. caninum, via oral e avaliar a ocorrência ou não da infecção. Os oocistos utilizados como inóculo foram obtidos através de bioensaio em cães, usando cérebro de búfalos soropositivos para anticorpos anti-N. caninum. Os oocistos obtidos foram confirmados ser de N. caninum por métodos moleculares e por bioensaio em gerbilos. Oocistos esporulados, com no máximo 90 dias, foram utilizados na infecção de quatro cães, com oito semanas de vida e negativos para anticorpos anti-N. caninum e Toxoplasma gondii. Os cães 1 e 4 receberam um inóculo com 10.000 oocistos esporulados cada um; o cão 2 um inóculo com 5.000 oocistos esporulados e o cão 3 recebeu 1.000 oocistos esporulados de N. caninum. O total de fezes foi coletado e examinado diariamente durante um período de 30 dias. Nenhum oocisto foi encontrado nas fezes desses animais. Durante seis meses os cães foram acompanhados para observar uma possível soroconversão e quando esta ocorria os animais eram eliminados do experimento. / The objective of this study was to evaluate the acquisition of infection in dogs experimentally infected with sporulated oocysts. The oocysts used as inoculum were obtained by bioassay in dogs using brain of buffaloes positive for anti-N. caninum antibodies. The oocysts were confirmed to be N. caninum by molecular methods and by bioassay in gerbils. Sporulated oocysts with a maximum of 90 days were used in the infection of four dogs. The dogs were eight weeks old and were negative for anti-N. caninum and Toxoplasma gondii antibodies. Dogs 1 and 4 received an inoculum of 10,000 sporulated oocysts each, dog 2 an inoculum with 5,000 sporulated oocysts and dog 3 received 1,000 sporulated oocysts of N. caninum. The total feces eliminated by the dogs were collected and examined daily for a period of 30 days. No oocysts were found in the feces of these animals. For six months the dogs were monitored to observe a possible seroconversion and when this occurred the animals were eliminated from the experiment.
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Prevalência das infecções por Toxoplasma gondii e Neospora caninum em matrizes e reprodutores ovinos de rebanhos comerciais do Distrito Federal, Brasil / Prevalence of Toxoplasma gondii and Neospora caninum infections in ewes and rams of commercial flocks from Distrito Federal, Brazil

Ueno, Tatiana Evelyn Hayama 16 December 2005 (has links)
Foram colhidas, de março a junho de 2004, amostras de sangue de 108 carneiros e 920 matrizes de 32 propriedades comerciais de ovinos do Distrito Federal, totalizando 1028 amostras. Os soros foram submetidos à reação de imunofluorescência indireta (RIFI), utilizando-se as diluições 1:64 e 1:50 como ponto de corte para, respectivamente, T. gondii e N. caninum. A prevalência observada para T. gondii foi de 38,22% (26,81% < IC 0,95 < 49,62%). Os títulos variaram de 64 a 65536, e o título com maior freqüência foi 2048 (21,15%). Para N. caninum, a prevalência foi de 8,81% (7,08% < IC 0,95 < 10,53%), com títulos variando de 50 a 51200, sendo o título mais freqüente 50 (21,11%). Ovinos reagentes a ambos os parasitas corresponderam a 4,67%. A análise dos possíveis fatores de risco não foi possível, pois todas as propriedades possuíam ao menos um animal positivo para T. gondii e a maioria (87,50%) das propriedades foram positivas para N. caninum. A prevalência para T. gondii foi significativamente maior entre os machos que entre as fêmeas. Utilizando-se reação em cadeia pela polimerase e enzimas de restrição para o locus SAG2, em uma amostra de cérebro dentre 11 colhidas em um abatedouro da região foi identificado T. gondii tipo I. Os resultados demonstram que as infecções pelos dois parasitas estão presentes e disseminadas no rebanho ovino do Distrito Federal. / From March to June 2004, serum samples from 108 rams and 920 ewes were collected from 32 herds within Distrito Federal, Brazil. The samples were tested by Immunofluorescent Antibody Test, using sera diluted 1:64 and 1: 50 as cut-off values for the detection of antibodies against Toxoplasma gondii and Neospora caninum, respectively. The observed prevalence for T. gondii infection was 38.22% (26.81%<IC 0,95<49.62%). The titers encountered ranged from 64 to 65536, with the most prevalent titer being 2048 (21.15%). The observed prevalence for N. caninum infection was 8.81% (7.08%<IC 0,95<10,53%). The titers ranged from 50 to 51200, being 50 the most frequent titer value (21.11%). The reactant sera to both pathogens corresponded to 4.67% of the samples. The risk factors for T. gondii and N. caninum infections were not determined because of the absence of negative herds for T. gondii infection and the high proportion of herds positive for N. caninum infection (87.50%). The prevalence for T. gondii infection was significantly higher among males than in females. By using the polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism of locus SAG2 on 11 brain samples collected in a regional slaughterhouse, only one sample was positive and proved to be archetype I. The results show that infection by both parasites is widespread in the ovine population from Distrito Federal.
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Isolamento e caracterização molecular e biológica de Toxoplasma gondii e pesquisa de Neospora caninum em roedores urbanos da Grande São Paulo (SP) / Isolation, molecular and biological characterization of Toxoplasma gondii and survey for Neospora caninum in urban rodents from Great São Paulo (SP)

Vanessa Muradian 08 May 2009 (has links)
Com o objetivo de identificar Toxoplasma gondii e Neospora caninum em roedores urbanos da Grande São Paulo (SP) 217 roedores (quatro camundongos -Mus musculus, 20 ratazanas - Rattus norvegicus e 193 ratos de telhado - Rattus rattus) foram capturados entre abril de 2005 e fevereiro de 2008, para realização do diagnóstico biológico e molecular. Das 20 ratazanas (Rattus norvegicus) capturadas apenas uma foi positiva para T. gondii pelo bioensaio, correspondendo a 5% de positividade entre as ratazanas e 0,46% entre todos os roedores capturados. O isolado obtido dessa ratazana foi caracterizado como genótipo recombinante I, III e u-1 por PCR-RFLP, similar ao isolado previamente descrito e obtido de duas ovelhas e um gato, todos do Estado de São Paulo. Quatro amostras de roedores negativos ao bioensaio resultaram como positivas ao T. gondii pela nested PCR B1. Entretanto, quando submetidas à nested PCR ITS1 e à restrição enzimática (RFLP) não houve confirmação desse resultado em três delas. Em relação ao N. caninum, amostras de tecido cerebral e cardíaco de 121 roedores foram examinadas por nested PCR Nc5, tendo sido encontradas 12 amostras positivas, provenientes de 10 roedores. Quando submetidas à nested PCR ITS1 e à restrição enzimática (RFLP) N. caninum não foi confirmado em nenhuma das amostras. Este estudo conclui que a ocorrência de T. gondii e N. caninum em roedores urbanos da Grande São Paulo (SP) é baixa, sugerindo que estes animais não possuem papel importante na cadeia epidemiológica como reservatórios desses agentes para predadores como os cães e gatos urbanos. / In order to identify Toxoplasma gondii and Neospora caninum in urban rodents from the Great São Paulo (SP) 217 rodents (four Mus musculus, 20 Rattus norvegicus and 193 Rattus rattus) were captured between April 2005 and February 2008 to biological and molecular diagnosis. One out of the 20 Rattus norvegicus was considered positive by bioassay in mice, corresponding to a 5% positivity among Rattus norvegicus and a 0.46% positivity considering all captured rodents. The isolate from this rat was characterized as a recombinant I, III and u-1 genotype by RFLP-PCR. This characterization had been previously described from isolates obtained from two sheep and one cat also from São Paulo state. Four samples from rodents with negative results by bioassay were positive to T. gondii by nested PCR B1. However, when tested with nested PCR ITS1 and RFLP these results were not confirmed in three of these samples. Regarding N. caninum, brain and heart samples of 121 rodents were examined by nested PCR Nc5 and 12 samples from 10 rodents were positive. When tested with nested PCR ITS1 and RFLP all of these samples turned out to be negative. This study concludes that T. gondii and N. caninum have low occurrence in urban rodents in the Great São Paulo area, and they are not important as T. gondii and/or N. caninum reservoirs to predators like urban cats and dogs.

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