Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2017. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2017-08-22T14:42:46Z No. of bitstreams: 1 2017_MicaellaPereiradaFonseca.pdf: 4630281 bytes, checksum: 0e37678d479f619b59d863660a07a446 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2017-09-26T19:21:19Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_MicaellaPereiradaFonseca.pdf: 4630281 bytes, checksum: 0e37678d479f619b59d863660a07a446 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-26T19:21:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_MicaellaPereiradaFonseca.pdf: 4630281 bytes, checksum: 0e37678d479f619b59d863660a07a446 (MD5) Previous issue date: 2017-09-26 / Os neutrófilos são granulócitos polimorfonucleares que utilizam mecanismos intra e extracelulares para eliminar patógenos. A ativação de neutrófilos pela N-formil-Metionil-Leucyl-Phenylalanine (fMLP), uma molécula quimiotáctica liberada de bactérias Gram-positivas, disparadores de explosão respiratória, modificações morfológicas, degranulação e liberação de NETs. No entanto, a desregulamentação de neutrófilos está envolvida com várias patologias, em parte, devido à exacerbação da descarga de espécies reativas de oxigênio e enzimas citolíticas Embora haja um número considerável de estudos sobre condições, as questões sobre como essas desregulações permanecem sem resposta; Para os caminhos exatos que são percorridos por esses caminhos intracelulares ainda estão preenchidos com lacunas. Atualmente, a comunidade científica vem usando uma ferramenta de análise conhecida como espectrometria de massa (MS) para desempenhar melhor o papel dos neutrófilos na resposta imune; a realização de estudos relacionados aos neutrófilos de proteômica comparativa são ferramentas essenciais para a compreensão dos mecanismos intracelulares que regem a resposta inflamatória. Usando ferramentas proteômicas de alta resolução, o presente trabalho identificou 8362 proteínas no total, na ativação de neutrófilos por fmp de 100 nmL / L. Em conclusão este trabalho representa a eficiência dos métodos de análise proteômica proporcionaram a identificação de 8362 proteínas, sendo 301 proteínas reguladas diante do estímulo com fMLP. Pois, proteínas importantes para a resposta inflamatória dos neutrófilos foram identificadas, mostrando que a análise comparativa dos mapas proteômicos utilizando diferentes métodos de aquisição e extração proteicas atuaram de forma complementar na robustez da identificação mais abrangente de proteínas de neutrófilos, tanto quiescentes quanto ativados com fMLP. Ademais, E que existe uma forte conexão entre a família das pequenas GTPases com a maioria dos processo desencadeados pela ativação de vias por fMLP, como por exemplo as evidências de alterações estruturais em MEV. Com as análises conjugadas será possível sugerir pontos de modulação da resposta inflamatória promovidas por agentes ativadores relacionados a receptores ligados a proteína G. A identificação de regulações por subunidades do proteassoma 26S tendo extensa participação nas vias reguladas, o que pode ser um indicativo para um mecanismo de regulação por esse complexo. Outrossim, a proteômica se mostra uma ferramenta essencial para a análise de vias, pois proporciona a identificação de proteínas que estão em pequenas quantidades como citocinas liberadas pela ativação. No mais, os mecanismos de morte celular programada com divergência entre vias de ativação e bloqueio da apoptose, podendo acarretar desregulação pois os dados tentem a sugerir um fino balanço entre as vias de vida e morte. O presente trabalho apresenta um conjunto de proteínas com diversas funções relacionadas aos processos da resposta inflamatória, que incluem a atividade oxidativa, motilidade, metabolismo energético e sinalização intra e intercelular. Este estudo adiciona dados relacionados à ativação de neutrófilos por fMLP, também revelando proteínas que não foram previamente identificadas em neutrófilos, ampliando as possibilidades de modulação da resposta inflamatória. Nosso estudo também comtempla o maior número de proteínas nos neutrófilos ativados por fMLP, ampliando assim as possibilidades de sugerir uma modulação da resposta inflamatória em neutrófilos. / Neutrophils are polymorphonuclear granulocytes that use intra- and extracellular mechanisms to eliminate pathogens. Activation of neutrophils by N-formyl-Methionyl-Leucyl-Phenylalanine (fMLP), a chemotactic molecule released from gram-positive bacteria, triggers respiratory burst, morphological modifications, degranulation and NETs´ release. However, neutrophils´ deregulation are involved with several pathologies, in part, due to the exacerbated discharge of reactive oxygen species and cytolytic enzymes; in other words, prolonged lifespan of activated neutrophils and their migration to non-injured tissues may result in severe clinical conditions. Although there are a considerable number of studies on conditions, questions about how such deregulations still remain unanswered; For the exact pathways that are traversed by these intracellular pathways are still filled with gaps. Currently, the scientific community has been using an analysis tool known as mass spectrometry (MS) to better play the role of neutrophils in the immune response; studies related to comparative proteomics neutrophils are essential tools for understanding the intracellular mechanisms governing the inflammatory response. In conclusion, this work represents the efficiency of the methods of proteomic analysis, which allowed the identification of 8362 proteins, 301 of which were regulated proteins before the stimulation with fMLP. Because proteins important for the inflammatory response of neutrophils were identified, showing that the comparative analysis of proteomic maps using different methods of protein acquisition and extraction acted in a complementary way in the robustness of the more comprehensive identification of neutrophil proteins, both quiescent and activated with fMLP . In addition, there is a strong connection between the family of small GTPases with most of the processes triggered by the activation of fMLP pathways, such as the evidence of structural alterations in SEM. With the conjugated analyzes it will be possible to suggest modulation points of the inflammatory response promoted by activating agents related to G protein-linked receptors. The identification of 26S proteasome subunit regimens having extensive participation in the regulated pathways, which may be indicative of a mechanism of regulation by this complex. In addition, the mechanisms of programmed cell death with divergence between activation pathways and apoptosis blockade, may lead to deregulation as the data try to suggest a fine balance between the life and death pathways. The present work presents a set of proteins with diverse functions related to the processes of the inflammatory response, which include oxidative activity, motility, energetic metabolism and intra and intercellular signaling. This study adds data related to the activation of neutrophils by fMLP, also revealing proteins that were not previously identified in neutrophils, increasing the possibilities of modulation of the inflammatory response. Our study also contemplates the largest number of proteins in the neutrophils activated by fMLP, thus increasing the possibilities of suggesting a modulation of the inflammatory response in neutrophils.

Magíster en Bioquímica / Los neutrófilos polimorfonucleares (PMNs) son un tipo de leucocito que tiene participación en la primera etapa de la inmunidad innata. Constituyen la primera línea de defensa del hospedero frente a un agente patógeno, pero la liberación de sus componentes puede causar destrucción de tejido. Estas células al activarse secretan citoquinas inflamatorias, fagocitan a las bacterias y las destruyen a través de agentes microbicidas como intermediarios de oxígeno reactivo (ROS) y óxido nítrico (NO) y, también, a través de la secreción de metaloproteinasas (MMPs). Las MMPs son enzimas hidrolíticas con características neutras que degradan colágeno, gelatina, laminina y otros componentes de la matriz extracelular, secretándose desde neutrófilos la MMP-8 (colagenasa) y la MMP-9 (gelatinasa B). La periodontitis es una enfermedad que causa la destrucción del colágeno en el ligamento periodontal provocando inflamación. El proceso destructivo es el resultado de una compleja interacción entre estas bacterias, la inmunidad del hospedero y los sistemas inflamatorios.Las principales bacterias implicadas en la enfermedad periodontal son anaeróbicas y gram-negativaseincluyen Porphyromonas gingivalis (Pg) y Actinobacillus actinomycetemcomitans(Aa), entre otras. El reconocimiento de patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP), por parte de los neutrófilos lo realiza una importante familia de receptores llamada receptores de tipo Toll (TLR). Los objetivos de esta tesis fueron: 1) estudiar la respuesta de los neutrófilos periféricos (circulantes) frente a periodontopatógenos como Pg y Aa y, además, de algunos de los PAMPs más conocidos como LPS de Escherichia coli (componente de la pared celular), Zymosan A (extracto de Saccharomyces cerevisiae) y la lectina fitohemaglutinina (PHA); y 2) comparar la respuesta de neutrófilos provenientes de pacientes con periodontitis con la de individuos sanos. La respuesta de los neutrófilos frente a agentes potencialmente estimuladores o activadores se estudió, tanto en sangre completa como en neutrófilos purificados, a través del análisis de la secreción de la enzima MMP-9 y la citoquina IL-8, intentándose además medir la liberación al medio de óxido nítrico (NO). La actividad de MMP-9 se determinó por zimografía en geles de poliacrilamida en presencia de gelatina (colágeno desnaturalizado) como sustrato, en condiciones desnaturantes, lo que permite evaluar las formas activa y latente de la gelatinasa. Los niveles de IL-8 se determinaron utilizando el método ELISA. Los intentos de demostrar un aumento de liberación de NO en respuesta a los estimuladores fueron infructuosos, no obstante se trataron de cuantificar los niveles de sus metabolitos estables (nitrito y nitrato) por el sensible método de electroforesis capilar. En sangre completa, al comparar la condición estimulada con la condición basal en ausencia de estimulador, PHA aumentó la liberación de MMP-9 en ambos grupos (sanos y pacientes). Por otra parte, LPS y Pg estimularon la secreción de IL-8 sólo en el grupo de pacientes. No se encontraron diferencias significativas entre el grupo de pacientes con enfermedad periodontal y el grupo control de los individuos sanos en cuanto la liberación de MMP-9 e IL-8. Al trabajar con neutrófilos purificados, en ambos grupos LPS y Pg aumentó significativamente la liberación de MMP-9 respecto a la condición basal, encontrándose además un aumento significativo en el grupo de pacientes comparado con el grupo sano. La secreción de IL-8 respecto a la condición basal aumentó sólo en pacientes por efecto de LPS y Zymosan A. La comparación entre los dos grupos mostró diferencias significativas en la liberación de IL-8 al incubar con LPS, Pg, Aa y Zymosan A, observándose una mayor activación en los neutrófilos de los pacientes. La secreción de IL-8 se encontró atenuada en pacientes, pero se observó una gran aumento en su secreción (activación) por todos los estimuladores estudiados (entre 3 y 7 veces), a diferencia del grupo control. Los resultados en neutrófilos purificados apoyan la hipótesis propuesta de que este tipo de leucocitos periféricos en pacientes con periodontitis son más reactivos (hiper-reactivos) que los de individuos sanos. La determinación de la respuesta de los neutrófilos periféricos podría ser una herramienta útil para el seguimiento de la eficacia del tratamiento en los pacientes con periodontitis. La baja proporción de neutrófilos en las muestras de sangre completa no permitió observar esta hiper-reactividad, ni tampoco la respuesta estimuladora en general / Polymorphonuclear neutrophils (PMN) are a kind of leukocyte involved in the early innate immune response. They constitute the first line of host defense against a pathogenic agent, but the release of their components may cause tissue destruction. When these cells are activated they release proinflammatory cytokines, they phagocyte bacteria and destroy them through microbicidal agents like oxygen intermediates (ROS), nitric oxide (NO) and, also, through the release of metalloproteinases (MMPs). MMPs are hydrolytic enzymes with neutral characteristics which are able to degradate collagen, gelatin, laminin and other extracellular matrix components, releasing from neutrophils MMP-8 (collagenase) and MMP-9 (gelatinase B). Periodontitis is a disease that destroys collagen in the periodontal ligament producing inflammation. The destructive process is the result of a complex interaction between these bacteria, the host immunity and the inflammatory systems. The main bacteria involved in the periodontal disease are anaerobic and gram-negative and they include Porphyromonas gingivalis (Pg) and Actinobacillus actinomycetemcomitans (Aa), among others. Recognition of pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) by neutrophils is carried out by an important family of receptors called Toll like receptors (TLR). The objectives of this thesis were two: 1) to study the response of peripheric (circulating) neutrophils against periodontopathogens Pg and Aa and, also against some of well known PAMPs such like LPS from Escherichia coli (cell wall component), Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae extract) and the lectin phytohemagglutinin (PHA); and 2) to compare the response of neutrophils from patients with periodontitis to those from healthy individuals. The response of neutrophils against potentially stimulating agents or activators was studied in both whole blood and purified neutrophils, through the analysis of the release of the MMP-9 enzyme and the cytokine IL-8, trying to measure also the release of nitric oxide (NO) to the incubation medium. The activity of the MMP-9 was determinated by zymography on polyacrylamide gels, including gelatin (denaturalized collagen) as a substrate, in denaturating conditions, to evaluate both the active and latent forms of the gelatinase. The IL-8 levels were assayed using the ELISA method. Attempts to demonstrate an increase in the release of NO in response to the stimulators were unsuccessful, even though the nitrite and nitrate determination was used in an attempt to quantify the levels of its stable metabolites by the sensitive method of capillary electrophoresis. In whole blood, when comparing the stimulated condition with the basal condition in absence of a stimulator, PHA increased the release of MMP-9 in both groups (healthy and patients). On the other hand, LPS and Pg stimulated the release of IL-8 only in the patient group. Significant differences between the group of patients with periodontal disease and the control group of healthy individuals in terms of the release of MMP-9 and IL-8 were not found. When working with purified neutrophils, in both groups LPS and Pg significantly increased the release of MMP-9 with respect to the basal condition; a significant increase in the patients group compared to the healthy group was also found. The release of IL-8 with respect to the basal condition increased only in patients due to the effects of LPS and Zymosan A. The comparison between the two groups showed significant differences in the release of IL-8, during incubation with LPS, Pg, Aa and Zymosan, with a greater activation in the neutrophils from patients. The secretion of IL-8 was reduced in patients, but with all the stimulators studied a larger secretion (activation) between 3 and 7 fold was observed in patient neutrophils as compared to that of the healthy group. The results in purified neutrophils support the proposed hypothesis that this type of peripheric leucocyte in patients with periodontitis is more reactive (hyper-reactive) than in healthy individuals. Determination of peripheral neutrophil response can be an useful tool for monitoring the efficacy of the treatment in periodontitis-affected patients. The proportion of neutrophils in whole blood samples was too low to observe this hyper-reactivity, or the stimulating response in general

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2012. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2013-01-25T13:04:19Z No. of bitstreams: 1 2012_EvertonLuisSantosRosa.pdf: 14261948 bytes, checksum: a595deada5e0408cb827506c88a1d850 (MD5) / Approved for entry into archive by Luanna Maia(luanna@bce.unb.br) on 2013-01-28T10:34:59Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_EvertonLuisSantosRosa.pdf: 14261948 bytes, checksum: a595deada5e0408cb827506c88a1d850 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-01-28T10:34:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_EvertonLuisSantosRosa.pdf: 14261948 bytes, checksum: a595deada5e0408cb827506c88a1d850 (MD5) / O crescente uso de nanomateriais como dióxido de titânio (TiO 2) em seres humanos na área biomédica, cosmética, alimentícia entre outras, tem estimulado pesquisas sobre toxicidade pelo potencial risco à saúde humana. Alguns aspectos da resposta inflamatória ao titânio no organismo ainda não foram completamente elucidados. Sabe-se que a exposição celular a nanopartículas (NPs) de TiO 2 pode induzir estresse oxidativo que desencadeia uma cascata de eventos com sinalização celular, respostas inflamatórias, proliferativas e genotóxicas. Os neutrófilos (PMNs) representam a primeira linha de defesa celular imunológica do organismo, sendo ativados e rapidamente recrutados para as regiões onde as NPs de TiO 2 foram implantadas. Este estudo teve como objetivo analisar as interações de neutrófilos humanos com NPs de TiO 2 in vitro, em diferentes tempos de exposição (1, 5, 30 e 60 minutos). A análise morfológica da interação foi obtida por microscopias de luz, eletrônica de varredura e de transmissão enquanto a espectroscopia de força atômica permitiu a análise das modificações mecânicas dos PMNs. A expressão de moléculas de adesão, CD-11b e CD-62L foi analisada por Citometria de Fluxo e o teste do Nitroblue tetrazolium (NBT) possibilitou a avaliação da produção de ânion superóxido pelos PMNs após incubação com NPs de TiO 2 . A eletroforese bidimensional de extratos protéicos de neutrófilos quiescentes e ativados por TiO 2 no tempo 30 minutos permitiu a comparação de mapas proteômicos e a identificação de proteínas por PMF (Peptide Mass Fingerprinting). As análises por microscopia de luz, de varredura e transmissão demonstraram que o fator tempo teve um efeito significativo sobre a capacidade de fagocitose e as alterações da morfologia dos PMNs. As análises de citometria de fluxo não demonstraram correlação entre as alterações morfológicas e do citoesqueleto e a expressão de moléculas de adesão (CD-11b e CD-62L). Ativação celular e produção de ânion superóxido foram demonstrados pelo teste do NBT ao longo do tempo. A espectroscopia de força atômica demonstrou aumento das forças de atração, de adesão bem como da rigidez, elasticidade e energia dissipada nos PMNs. A análise comparativa dos géis bidimensionais resultou em 7 spots com diferença significativa de abundância (p≤0,05), dos quais 3 proteínas foram identificadas por PMF. Tais proteínas têm funções relacionadas à regulação da organização do citoesqueleto, fagocitose e ao ciclo celular. O presente estudo representa uma contribuição para o esclarecimento dos mecanismos fisiológicos celulares envolvidos na interação de nanomateriais com o organismo. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The increasing use of nanomaterials such as titanium dioxide (TiO 2) in humans in the biomedical, cosmetics, food and other fields, has stimulated the research on toxicity, due to the potential risk to human health. Some molecular aspects of the inflammatory response after implantation of titanium in the body has not yet been fully elucidated. It is known that the exposure of cells to nanoparticles (NPs) can induce oxidative stress that triggers a cascade of events resulting in cell signaling, inflammatory, proliferative and genotoxic responses. Neutrophils are the first line of cellular immunological defense and are quickly recruited to the titanium implantation areas. The present study aimed to analyze the interactions of human neutrophils with TiO 2 NPs in vitro at different incubation times (1, 5, 30 and 60 minutes). The morphological characteristics of this interaction were analyzed by light, electron scanning and transmission microscopy, whilst atomic force spectroscopy allowed PMNs mechanical forces analysis. The expression of adhesion molecules, CD-11b and CD-62L, was analyzed by Flow Cytometry and the Nitroblue tetrazolium (NBT) test enabled the evaluation of superoxide anion production by PMN after incubation with TiO 2 NPs. The two-dimensional electrophoresis of protein extracts from quiescent and TiO 2 activated neutrophils after 30 minutes of incubation allowed the comparison of proteomic maps and protein identification by PMF (Peptide Mass Fingerprint). Light, scanning and transmission microscopies results showed that the time factor had a significant effect on PMNs phagocytosis and morphology changes. Flow cytometry analysis showed no correlation between adhesion molecules expression (CD-11b and CD-62L) and morphological alterations. The NBT test demonstrated PMNs activation and superoxide anion production after exposure to TiO 2 NPs. Moreover, atomic force spectroscopy demonstrated increased parameters for attractive and adhesion forces, stiffness, elasticity and dissipated energy in PMNs along the time course. The comparative analysis of two-dimensional gels resulted in 7 spots with statistically significant abundance (p ≤ 0.05), among which 3 proteins were identified by PMF. The identified proteins are related to the regulation of cytoskeleton organization, phagocytosis and cell cycle. This study represents a contribution to the elucidation of the physiological mechanisms involved in cellular interactions of nanomaterials with the body.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2012. / Submitted by Alaíde Gonçalves dos Santos (alaide@unb.br) on 2013-02-28T13:32:44Z No. of bitstreams: 1 2012_ElaineNascimentoAquino (2).pdf: 9008075 bytes, checksum: c569ceb054814e541f3b633f843c0317 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2013-02-28T15:17:22Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_ElaineNascimentoAquino (2).pdf: 9008075 bytes, checksum: c569ceb054814e541f3b633f843c0317 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-02-28T15:17:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_ElaineNascimentoAquino (2).pdf: 9008075 bytes, checksum: c569ceb054814e541f3b633f843c0317 (MD5) / A imunidade inata é o primeiro sistema ativado contra a invasão de microorganismos e partícula ao organismo. Esse sistema compreende a resposta humoral e celular. Os neutrófilos, partícipes da resposta imune celular, são encontrados na circulação sanguínea e se movimentam para o tecido quando são estimulados ou ativados por quimioatraentres. A ativação e/ou estimulação provocam mudanças celulares em prol da movimentação, fagocitose e destruição dos microorganismo. Essa ativação pode ser exacerbada provocando até injúrias teciduais. O processo de ativação pode ser subdividido em três estados fenotípicos distintos: quiescentes, estimulados ou ativados e esses estados podem ser desencadeados por substâncias como PAF e fMLP respectivamente. No presente estudo, tais condições foram comparadas. Ensaios que comprovaram a estimulação e ativação dos neutrófilos por esses agentes foram utilizados, como: explosão respiratória, clivagem da L-selectina e a mobilização da CD11b. Após essa avaliação foram comparados géis bidimensionais entre os três fenótipos (quiescentes, estimulados e ativados), o que resultou em 166 spots apresentando abundância diferencial e dentre eles 87 identificações proteicas. A análise dos termos do gene ontology para essas proteínas detectou que a maioria delas encontra-se no citoplasma e núcleo, e o processo biológico com maior número de proteínas envolvidas foi a transcrição em neutrófilos estimulados e dobramento de proteínas em neutrófilos ativados. Na comparação entre os três fenótipos, 16 spots apresentaram abundância diferencial e 11 proteínas foram identificadas, dentre elas 6 proteínas mais abundantes em neutrófilos quiescentes, envolvidas em processos como transdução de sinal, motilidade celular e modulação da resposta inflamatória. Seis outras proteínas eram mais abundantes em neutrófilos estimulados pelo PAF, relacionadas a adesão celular, transdução de sinal e atividade antimicrobiana. Dentre as proteínas identificadas neste estudo, 17 foram descritas pela primeira vez em neutrófilos e 30 foram associadas pela primeira vez ao estímulo por PAF ou à ativação por fMLP. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Innate immunity is the first system activated against the invasion of microorganisms and particles in the body. This system includes the humoral and cellular responses. Neutrophils, a participant in the cellular immune response, are found in the bloodstream and move to the tissue when they are stimulated or activated by chemoattractants, known as effector cells of the inflammatory response. The activation and/or stimulation causes changes in this cell favouring movement, phagocytosis and destruction of microorganisms. This activation may be exacerbated by causing tissue injury. The activation process can be subdivided into three distinct phenotypic states: quiescent, stimulated or activated and these states can be triggered by substances as PAF and fMLP respectively. In the present study such conditions were compared. Tests demonstrating stimulation and activation of neutrophils by these agents were used as respiratory burst, cleavage of L-selectin and CD11b mobilization. After this evaluation, were compared two-dimensional gels among the three phenotypes (quiescent, stimulated and activated), which resulted in 166 proteins presenting differential abundance and among them 87 were identified. Analysis of the gene ontology terms for such proteins localized most of them in the cytoplasm and nucleus, and associated them to the biological processes of transcription in stimulated neutrophils and protein folding in activated neutrophils. Comparing among the three phenotypes, 16 proteins showed differential abundance and 11 were identified, among them 6 were more abundant in quiescent neutrophils, involved in processes like signal transduction, cell motility and modulation of the inflammatory response. Six other proteins were more abundant in neutrophils stimulated by PAF, related to cellular adhesion, signal transduction and antimicrobial activity. Among the identified proteins, 17 were described for the first time in neutrophils and 30 were associated for the first time to the stimulation by PAF or activation by fMLP.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2007. / Submitted by mariana castro (nanacastro0107@hotmail.com) on 2009-12-14T18:09:13Z No. of bitstreams: 1 2007_KarinaCunhadosSantos.pdf: 3450951 bytes, checksum: aa8b711edd0b318c7ea8250d3da45bfb (MD5) / Approved for entry into archive by Daniel Ribeiro(daniel@bce.unb.br) on 2010-01-07T23:54:23Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2007_KarinaCunhadosSantos.pdf: 3450951 bytes, checksum: aa8b711edd0b318c7ea8250d3da45bfb (MD5) / Made available in DSpace on 2010-01-07T23:54:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2007_KarinaCunhadosSantos.pdf: 3450951 bytes, checksum: aa8b711edd0b318c7ea8250d3da45bfb (MD5) Previous issue date: 2007-07-13 / Os neutrófilos constituem o principal tipo de leucócito do sangue periférico e protegem contra infecções fúngicas e bacterianas. Devido à sua capacidade de quimiotaxia, conseguem chegar rapidamente a um sítio de infecção e destruir os patógenos invasores. Essas células podem existir em três estágios de ativação denominados, quiescente, estimulado e ativado. Neutrófilos ativados produzem espécies reativas de oxigênio (ROS), aumentam sua capacidade fagocitária; têm a apoptose retardada além de outras funções. Os polimorfonucleares podem ser ativados in vitro por várias substâncias, dentre elas o PMA, que atravessa as membranas e ativa, diretamente, várias isoformas de PKC. Neste trabalho, os neutrófilos foram purificados a partir do sangue venoso periférico, e obtidos após centrifugação do sangue total em um gradiente de percoll (pureza maior que 96% e viabilidade maior que 97%). Em seguida, 107 células foram ativadas com PMA 100 ng/mL, por 30 minutos, mantendo também um grupo controle não ativado. Análises citométricas foram executadas para se acompanhar a ativação celular através da explosão respiratória e a viabilidade e pureza da separação dos neutrófilos. Também foi realizada uma análise comparativa dos géis bidimensionais na condição Normal e ativada com PMA, verificando que 12 spots tiveram sua expressão aumentada com a ativação e 62 apresentaram expressão diminuída nesta condição. Além disso, 141 spots foram considerados como pertencentes apenas ao gel Normal e 109 spots foram exclusivos da condição PMA. Trinta e cinco spots foram sujeitos à identificação por peptide mass fingerprinting, dos quais seis foram identificados. Entre as proteínas identificadas, quatro são relacionadas ao processo inflamatório e duas foram classificadas como estruturais. RBCK1 e CRAa, foram encontradas pela primeira vez em neutrófilos. Nossa hipótese é que MEK1 e MEKK1, reduzam a atividade transcricional de RBCK1, enquanto PKA aumenta sua atividade. A lisozima, proteína microbicida de grânulos específicos e a ?-actina, classificada como a principal isoforma do citoesqueleto de neutrófilos, também foram identificadas. MRP-14, presente no citoplasma de neutrófilos, apresenta efeitos bacteriostáticos e semelhantes às citocinas. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Neutrophils are the major type of leukocytes in peripheral blood and protect against fungal and bacterial infections. Directed migration in a gradient of chemotactic stimuli enables these cells to rapidly find the site of infection and destroy the invading pathogens. PMNs can exist in three different activation states, namely, resting, primed, and activated states. Activated neutrophils produce reactive oxygen species (ROS), in what is known as respiratory burst, increase phagocytosis, delay apoptosis, among other functions. These cells can also be activated in vitro by particles and substances such as phorbol-myrystate-acetate (PMA). The PMA is a diacylglicerol (DAG) analog that bypasses membrane receptors and directly activates intracellular protein kinase C isoforms (PKC). In this study, human neutrophils were prepared from peripheral venous blood of healthy volunteers (greater than 96% purity, greater than 97% viability) and were obtained by density centrifugation on percoll gradient. 107 cells were activated with 100ng PMA for 30 minutes in 1 mL of PBS. Cytometric analysis was executed for measurement of respiratory burst, viability and purity from neutrophils. A comparative analysis of 2D-eletrophoresis gels, of normal and PMA activated neutrophils was executed, and 83 spots revealed differential expression, from which 13 spots were up regulated after PMA activation and 70 were down regulated in this condition (p≤0,05). Moreover, 141 spots were regarded as belonging only to normal gel, and 109 spots were exclusive of the PMA activated neutrophil map Thirty five conserved spots were subjected to peptide mass fingerprinting, yielding six identifications. Among the identified proteins, four are related to the inflammatory process and two are classified as structural. RBCK1 and CRAa, were found for first time in neutrophils. Our hypothesis is that MEK1 and MEK kinase 1 (MEKK1) represses the RBCK1 activity, and PKA enhances its activity. Lysozyme, a microbicidal protein of specific granules, and β-actin, the main isoform of neutrophil cytoskeleton were identified too. MRP-14, present in the neutrophil cytoplasm, provides bacteriostatic and cytokine-like effects.

Orientador: Mary Luci de Souza Queiroz / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-07-22T03:20:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Fernandes_MarciaDias_M.pdf: 2104234 bytes, checksum: f6ddb940e92ef6ade2a98d85f613bf58 (MD5) Previous issue date: 1997 / Resumo: Neste trabalho estudamos alguns dos efeitos dos inseticidas, organofosforados e carbamatos, sobre o sistema imunológico. Foram estudados 40 indivíduos expostos ocupacionalmente a estes inseticidas e 40 indivíduos-controle, sem história de exposição ocupacional a estes compostos. A atividade das colinesterases no sangue foi utilizada como indicador de exposição. Os testes imunológicos utilizados foram: . resposta imune-inespecífica avaliada através da atividade fagocitária e lítica dos neutrófilos tfente aos antígenos Candida albicans e Candida pseudotropicalis, capacidade do neutrófilo se reduzir o corante nitroblue tetrazolium (NBT) e locomoção de neutrófilos (Quimiotaxia) resposta imune-humoral avaliada através das dosagens séricas das imunoglobulinas IgG, IgA e IgM. Os resultados demonstraram uma redução significativa na atividade lítica de neutrófilos, tfente ao antígeno C. albicans nos indivíduos expostos aos inseticidas; no entanto, a atividade fagocitária estava normal. As atividades fagocitária e lítica dos neutrófilos frente ao antígeno C. pseudotropicalis, permaneceram inalteradas. Observaamos também uma diminuição significativa na produção de superóxidos, avaliada pelo teste de redução do corante NBT. Através da quimiotaxia, observamos uma diminuição significativa na locomoção de leucócitos. Em relação às dosagens séricas da imunoglobulinas, não observamos nenhuma alteração quando comparadas ao grupo controle / Abstract: In this work, some effects of the organophosphate and carbamate insecticides on the immune response were investigated. We have studied forty workers ocupationally exposed to these insecticides and forty non-exposed control individuaIs. To monitor exposure we used cholinesterase activity in red bfood cells as an indicator of exposure. Phagocytosis and killing of Candida a/bicans and Candida pseudotropicalis by neutrophils, neutrophil chemotaxis, nitroblue tetrazolium reduction and leve1s of IgG, IgM and 19A were measured. The results obtained demonstrated that the phagocytic function of neutrophi1s in exposed workers did not differ from that of the control individuals. On the other hand, lysis of C. à/bicans by neutrophi1s was significantly decreased even in those workers with normal cholinesterase activity. Conversely, the lysis of C. pseudotropicalis by neutrophils was not altered. We also observed a significant decrease of nitrqblue tetrazolium reduction and neutrophil chemotaxis in the exposed group. Regarding the levels of IgM, 19A and IgG we observed no significant alterations as compared to controls / Mestrado / Farmacologia / Mestre em Ciências

Orientadores: Mary Luci de Souza Queiroz, Giselle Zenker Justo / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-07-25T19:39:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Melo_Adrianade_M.pdf: 2789353 bytes, checksum: 87cf638a789bb737a520a262c9ac8b40 (MD5) Previous issue date: 1999 / Resumo: Neste trabalho, investigamos os efeitos imunomoduladores do composto MAPA nas atividades fagocitária, lítica e quimiotática de neutrófilos frente aos antígenos Candida albicans e Candida kefyr in vitro, bem como sobre o crescimento e diferenciação de células progenitoras hematopoiéticas da medula óssea para a série granulócito-macrófago (CFU-GM) de animais infectados com Listeria monocytogenes. A capacidade fagocitária apresentou-se aumentada com todas as concentrações de MAPA utilizadas (25, 50, 75 e 1000 j.lg/mL) frente à C. albicans. Por outro lado, em presença de C. kefyr houve um aumento com as três maiores concentrções (50, 75 e 1000 f.lg/mL). Quanto à capacidade lítica, houve um aumento nas três menores concentrações frente à C. albicans e com as três maiores concentrações frente à C. kefyr, indicando uma ação do composto na aderência dos fagócitos, bem como no processo de desgranulação de neutrófilos. A capacidade do neutrófilo de reduzir o corante nitroblue tetrazolium apresentou-se aumentada nas duas maiores concentrações testadas (50 e 75 f.lgfmL), sugerindo uma ação do composto MAPA na produção de óxido nítrico. A quimiotaxia foi utilizada para o estudo quantitativo da locomoção de leucócitos polimorfonucleares, quando incubados com as concentrações de 25, 50 e '75 j.lgfmL de MAPA. Esta atividade apresentou-se aumentada apenas quando as células polimorfonucleares foram incubadas com a concentração de 75 j.lgfmL. Para a realização dos experimentos in vivo os animais foram tratados por 7 dias, consecutivos nas doses de 0,5; 2,0; 5,0 e 7,5 mglKg de MAPA. Ao final do tratamento, os animais foram infectados com uma dose subletal de Listeria monocytogenes. Após a infecção ocorreu uma diminuição dos números de CFU-GM na medula óssea dos animais. Os animais previamente tratados com MAPA apresentaram um aumento no número de CFU-GM da medula óssea com as doses de 2,0 e 5,0 mg/Kg às 48 e 72 horas após a infecção, em relação ao controle e ao grupo infectado. Para avaliar a resistência destes animais à infecção pela L. monocytogenes realizamos uma curva de sobrevida, utilizando uma dose letal da bactéria (3 x 108 bactérias/animal). Trinta e quarenta por cento dos animais previamente tratados com as doses de 0,5 e 5,0 mgIKg de MAPA, respectivamente, sobreviveram à dose letal da L. monocytogenes, enquanto 100% dos animais do grupo controle infectado morreram em oito dias. No entanto, com 7,5 mg/Kg de MAPA todos os animais morreram em até oito dias, não havendo proteção contra a infecção. Diante dos resultados obtidos neste trabalho, podemos sugerir que o composto MAPA aumenta a resistência dos camundongos BALB/c infectados com a L. monocytogenes através do aumento dos precursores hematopoiéticos da medula óssea / Abstract: ln this work, we investigated the effeets of MAPA on the immune response. We have stlldied the neutrophils exposed to these eompound of six normal individuaIs. Phagoeytosis and killing of Candida albicans and Candida ke.fyr by neutrophils, neutrophil ehemotaxis and nitroblue tetrazolium reduetion were measured. The results obtained demonstrated - an inerease in the phagoeytie funetion of neutrophils in exposed to MAPA. On the other hand, lysis of C. albicans and C. kefyr by neutrophils was signifieantly inereased. We also observed a signifieant inerease of nitroblue tetrazolium reduetion and neutrophil ehemotaxis in these eells. e also investigated the effeets of magnesium ammonium phospholinoleatepalmitoleate anhidryde (MAPA), a roteie aggregated polymer isoleted from Aspergillus orizae, on the growth and differentiation of granuloeyte-maerophage progenitor eells (CFU-GM) in normal and Listeria monocytogenes infeeted miee. MAPA was administred subeutaneously (0.5-7.5 mg/Kg) for 7 days. ln the MAPA treated/infeeted groups L. monocytogenes was administred at the end of MAP A treatment. A signifieant reduetion in the numbers ofCFU-GM was observed at 48 h after the infection, followed by a slight restoration at 72 h. Treatment of, these animaIs previously to infection stimulated marrow myelopoiesis in a dosedependent manner. The 5.0 mg/Kg MAPA was the optimal biological aetive dose in infected mice and this dose shedule also stimulated myelopoiesis in normal mice. The 0.5 and 5. O mg/Kg doses given prior to in.fection with a lethal dose of 3 x 108 bacterialanimal led to a 30% and 40% survival, respectively. These results demonstrated that MAPA produces a significant increase in the resistanee of the animaIs infeeted with L. monocytogenes, and that this protection is due, at least in part to increased CFU-GM in the bone marrow ofinfeeted animals / Mestrado / Mestre em Farmacologia

Orientador: Edson Antunes / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-04T03:35:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Penteado_CarlaFernandaFranco_D.pdf: 6702498 bytes, checksum: f838742ae536c24bf084965358fe1412 (MD5) Previous issue date: 2004 / Resumo: O tratamento neonatal com capsaicina em ratos acarreta aumento da inflamação alérgica pulmonar, sugerindo um papel protetor para as fibras C nas vias aéreas (MEDEIROS et ai, 2001). O objetivo deste trabalho foi investigar os mecanismos responsáveis pelo aumento do influxo neutrofílico pulmonar em ratos desprovidos de neuropeptídeos pelo tratamento neonatal com capsalclna, sensibilizados e desafiados com ovalbumina (OVA) na fase adulta. Os animais receberam capsaicina (30 mg/Kg, s.c.) no segundo dia de vida, sendo os protocolos experimentais realizados nos animais na fase adulta dos mesmos (60- 70 dias de vida). A sensibilização com OVA foi realizada pela injeção subcutânea de 200 ~g de OVA adsorvida em 8 mg de AI (OHh, O desafio antigênico com OVA (1 mg) foi realizado 14 dias após a sensibilização. A contagem de células no LBA, sangue periférico e medula óssea foi realizada 6h após o desafio com OVA. Nos animais desafiados com OVA observamos um aumento no número de neutrófilos no LBA, sendo este aumento significativamente maior em animais pré-tratados com capsaicina. Em ambos os grupos, controle e capsaicina, observamos redução do número de neutrófilos no sangue periférico de ratos desafiados com OVA, sendo esta reduçao maior no grupo capsaicina. Na medula óssea, observamos aumento significativo das formas imaturas e maduras de neutrófilos em ratos desafiados com OVA, não foi observado diferenças estatísticas entre o grupo controle e capsaicina. Empregando o modelo de adesão in vitra, nossos resultados mostraram que os neutrófilos sanguíneos obtidos de ratos tratados com capsaicina têm a mesma capacidade de aderir em resposta ao fMLP (0.1 ~M) ou PMA (1 ~M) em placas recobertas com soro ou fibronectina. Além disso, neutrófilos obtidos de animais controle ou pré-tratados com capsaicina são XXV1ll capazes de migrar in vitro em resposta ao fMLP (10 flM), PAF (0.1 j.1M) e a substância P (50 j.1M) de maneira semelhante. Observamos um aumento significativo nos níveis de TNF-a, IL-5, IL-10 e LTB4 no LBA dos ratos desafiados com OVA e pré-tratados com capsaicina. Nos animais tratados com capsaicina observamos um aumento significativo na expressão do RNAm para CINC-3 e redução do RNAm para CINC-2 no pulmão após o desafio com OVA, quando comparado com o seu respectivo controle. Macrófagos alveolares obtidos de animais tratados com capsaicina foram capazes de gerar a mesma quantidade de ânion superóxido, nitrito e TNF-a (basal e estimulada) quando comparado com o grupo controle. O tratamento crônico dos ratos com o composto 48/80 preveniu o aumento do influxo de neutrófilos no grupo de animais tratados com capsaicina (desafiados com OVA) e restaurou os níveis de TNF-a aos valores encontrados no grupo controle. No conjunto, estes resultados sugerem que o tratamento neonatal com capsaicina resulta em "up-regulação" dos mastócitos, que, uma vez ativados pela exposição ao antígeno, passam a liberar grandes quantidades de mediadores inflamatórios, principalmente do TNF-a e a CINC-3, amplificando desta forma aumento do influxo de neutrófilos nas vias aéreas destes animais. Paralelamente, observamos que ratos pré-tratados com capsaicina apresentam aumento no número basal de neutrófilos imaturos e maduros na medula óssea, quando comparado aos animais controle. Este aumento está associado à elevação da expressão da PPT-I e do receptor NK1 na medula óssea, sugerindo que estas proteínas estão "upreguladas" em animais desprovidos de neuropeptídeos pelo tratamento neonatal com capsaicina / Abstract: This study was undertaken to clarify the mechanisms by which C-fiber degeneration at neonatal stages exacerbates the inflammatory responses of rat airways. Rats were treated with capsaicin at neonatal stag es and immunized with ovalbumin (OVA) at adult ages. Challenge of capsaicin pretreated rats with OVA promoted a higher influx of neutrophils in bronchoalveolar lavage (BAL) fluid compared with the vehicle group. No significant differences were found for the other cell types. The increased adhesion of fMLP (0.1 ~M) and PMA (1 ~M)-treated neutrophils to fibronectin-coated wells did not differ among vehicle- and capsaicinpretreated rats. Additionally, fMLP (1O ~M), PAF-(0.1 ~M) and substance P (50~M) induced a significant neutrophil chemotaxis, but no differences were found among vehicle and capsaicin groups. Increased levels of TNF-a, IL-5, IL-10 and LTB4 in BAL fluid as well as higher expression of CINC-3 in lung homogenates were detected in the capsaicin group compared with vehicle group. In the capsaicin group, chronic treatment with compound 48/80 restored the TNF-a levels to control values and prevented the neutrophil influx in BAL fluid. The enhanced production of TNF-a, superoxide anion and nitrite by isolated alveolar macrophages in response to LPS (3 ~g/ml), PMA (10 nM) and/or zymosan (100 particles/cell) did not differ between vehicle- and capsaicin-pretreated rats. In conclusion, chronic neuropeptide depletion promoted by neonatal capsaicin treatment upregulates airways mast cells, which upon activation by antigen at adult ages, release large amounts of cytokines such as TNF-a and CINC-3 that accounts for the massive airways neutrophil infiltration. Parallel to this, we observed that capsaicinXXX pretreated rats present higher numbers of both immature and mature neutrophils in bone marrow, compared with control rats. This was accompanied by higher expression of mRNA for PPT-I and tackynin-NK1 receptor in bone marrow, suggesting that these proteins are up-regulated in rats chronically depleted of neuropeptides by neonatal capsaicin treatment / Doutorado / Farmacologia / Doutor em Farmacologia

Memoria para optar el título de Bioquímico / La periodontitis crónica es una enfermedad periodontal, caracterizada por la inflamación de la encía, iniciada por la placa microbiana y propagada por el hospedero, con la posterior destrucción de la estructura de soporte de los dientes. Los neutrófilos son la primera línea de defensa frente a patógenos como parte de la respuesta inmune innata. En la periodontitis los neutrófilos responden a la presencia de la bacterias anaerobias Gram negativas, que colonizan el tejido subgingival, que incluye a Porphyromonas gingivalis. Los neutrófilos reconocen patrones moleculares asociados a patógenos (PAMPs), dentro de los cuales se encuentran los lipopolisacaridos (LPS), por medio de receptores de reconocimiento de patrones (PRR) de los que forman parte los TLR. Una vez que los neutrófilos han reconocido al patógeno, se producen cambios en la membrana plasmática señal de su activación. Dentro de estos cambios se encuentran la disminución de L-selectina (CD62L), seguido por el incremento en la expresión de Mac-1 de la familia β2 integrina (CD11b) en la superficie de los neutrófilos. Después de la activación de los neutrófilos comienza el proceso apoptótico asociado con algunas funciones importantes, tales como adhesión y fagocitosis, las que eventualmente llevan a la resolución de la inflamación. En la periodontitis, los neutrófilos presentarían una desregulación en la apoptosis, acumulándose y aumentando el daño tisular. De esta manera, nosotros proponemos que los pacientes con periodontitis crónica presentan activación y un retardo de la apoptosis de neutrófilos con respecto a los controles sanos. Como una forma de acercarnos a los cambios en el sistema inmune que hacen a un sujeto más susceptible a la periodontitis, se estudió la activación y apoptosis de neutrófilos en cultivo, de sangre periférica de individuos periodontalmente sanos y con periodontitis crónica. También estudiamos el efecto de LPS Escherichia coli y el extracto bacteriano de P. gingivalis sobre ambos grupos. Los neutrófilos se purificaron desde sangre periférica de 11 pacientes con periodontitis crónica sin tratamiento y 8 controles periodontalmente sanos. Los neutrófilos purificados se incubaron con LPS E. coli o extracto de P. gingivalis por periodos de 0, 4 y 8 h, para posteriormente la determinación de los nivel relativos de expresión de CD62L y CD11b y apoptosis, por citometría de flujo. Los resultados muestran una disminución de la expresión de CD62L y de CD11b en los neutrófilos de pacientes con respecto a los controles sanos en sus niveles basales. Además existe una disminución significativa de la intensidad de florescencia media (MFI) en el tiempo de los niveles basales de CD11b en el grupo control. Al ser estimulados los neutrófilos de pacientes y controles con LPS E. coli o P. gingivalis, existe una disminución de MFI de CD62L y un aumento de CD11b en ambos grupos sin llegar a ser significativos estadísticamente frente P. gingivalis. Sin embargo, LPS E. coli alcanza significación estadística con respecto a los basales en pacientes y controles. MFI de CD11b y CD62 de pacientes y controles a las 8 h de incubación se igualan. Además, los neutrófilos de pacientes presentan un retardo apoptótico en sus niveles basales, con respecto a los controles, y que no es alterada por los estímulos de LPS E. coli o P. gingivalis. Este retardo de la apoptosis ayudaría al neutrófilo a demorar su acción en el tejido liberando el contenido de sus gránulos, contribuyendo al daño tisular y a la etiopatogénesis de la enfermedad periodontal

Orientador : Jose Pedrazzoli Junior / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-07-31T16:00:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Penteado_CristianeFranco_M.pdf: 2182451 bytes, checksum: 2b90ea32184b0d98a2ce08cd4269ea7e (MD5) Previous issue date: 2001 / Resumo: A doença hepática crônica apresenta diversas causas, sendo caracterizada por diferentes graus de inflamação e necrose hepatocelular. A hepatite crônica pode ocorrer devido a vírus, reações autoimunes, drogas ou toxinas. Utilizando-se o modelo experimental de hepatopatia em coelhos induzido por CCU, o objetivo deste estudo foi investigar uma possível relação entre alguns parâmetros relacionados ao processo inflamatório (quimiotaxia de neutrófilos e análise total e diferencial dos leucócitos) e a lesão hepática. A extensão do dano hepático produzido pelo CCU foi investigada através da análise histológica dos fígados. Nossos resultados demonstraram que o tratamento com CCL4 induziu lesão hepática nos coelhos, conforme demonstrada pela análise histológica e pela elevação dos níveis séricos das enzimas ALT e AST. A análise histológica indicou a presença de hepatite após a 2a semana e de cirrose na 6a ou 8a semana de tratamento com CCL4. A resposta quimiotática in vitro dos neutrófilos verificada uma semana após a administração da droga, mostrou aumento entre a 2a e 6a semana de tratamento. Quando verificada 24 h após a droga, a quimiotaxia apresentou elevação a partir da 2ª até a 8a semana de tratamento. Neste mesmo período observou-se também aumento no número dos neutrófilos do sangue periférico. Levando-se em conta a verificação da presença de neutrófilos no fígado dos animais com cirrose, estes resultados 24 horas após a droga, sugerem que o aumento da migração in vitro dos neutrófilos e a elevação do número dos polimorfonucleares do sangue periférico podem estar relacionados à ativação e ao recrutamento destas células inflamatórias para o fígado, onde desempenham importante função no desenvolvimento do dano hepático / Abstract: The aim of this study was to investigate neutrophil chemotaxis during the induction of liver cirrhosis in rabbits. The study had three expérimentai arms: Group A (n=16) served as controls and received only normal rabbit chow. All animals were sacrificed at 16 weeks. Group B (n=19) was sacrificed 48 h after the chemotaxis assay, which was performed 24 h after CCL4 administration, at weeks 2, 4, 6 and 8. Group C (n=8) was followed by 16 weeks. The chemotaxis assay was performed 1 week after CCU administration. All animals were sacrificed at 16 weeks. The rabbits were treated with intragastric administration of CCU once weekly starting 14 days after addition of Phénobarbital to the drinking water (50mg/day). The CCU dose was adjusted weekly in order to obtain serun ALT and AST levels between 400 and 800 IU/I. Our results showed that increased ALT and AST levels were found in all of CCU-treated rabbits compared to the controls. In liver from animals sacrificed in 2, 4, 6 and 8 weeks of CCU treatment, hepatitis and fibrosis were already found at week two, and liver cirrhosis at week 6 and 8. Sixteen-week CCU treatment resulted in liver cirrhosis in 7 animals (87.5%). All animals with liver cirrhosis had an inflammatory infiltrate with neutrophils. Treatment with CCU did not interfered with total leukocyte count in blood from animals sacrificed in different periods, but a significant increase in polymorphonuclear cells between weeks 2 to 8 and a significant reduction in mononuclear leukocytes at week 4 were observed when compared with control animals. Neutrophil chemotaxis was also significantly increased from week 2 through week 8 compared with the control group. Animals that received CCU for 16 weeks present a significantly increased total leukocyte and polymorphonuclear number at week 10 when compared to controls. The mononuclear cell number was unchanged during the study period. A significant increase in neutrophil chemotaxis was observed from week 2 trough week 6. The presence of neutrophils in the liver of all animals with cirrhosis associated with an increase in polymorphonuclear cell chemotaxis during CCL4 administration in our experiment supports the view that this cell line has an important role in the development of toxic liver damage / Mestrado / Mestre em Farmacologia