Orientador: Albetiza Lobo de Araujo / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-07-31T20:11:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Arruda_VanessaAlves_M.pdf: 4146158 bytes, checksum: f0e713e7eea1481aed7e0751064dba89 (MD5) Previous issue date: 2002 / Resumo: No presente trabalho investigou-se a capacidade do veneno de Bothrops lanceolatus (VBL) em induzir a migração de neutrófilos para a cavidade peritoneal de camundongos. A injeção intraperitoneal do veneno causou um aumento na migração de neutrófilos tempo-dependente, com pico máximo 4 horas após a injeção, na dose de 750 ng/cavidade. A capacidade do veneno em induzir a migração de neutrófilos foi reduzida significativamente, quando os animais foram pré-tratados com dexametasona (inibidor indireto da fosfolipase A2; 0,5 mg/kg, s.c.,) ou AA 861 (inibidor da 5-lipoxigenase; 0.1 mg/kg, s.c.). O tratamento dos animais com indometacina (inibidor não seletivo da cic1ooxigenase; 5 mg/kg, s.c.), meloxicam (inibidor da COX-2; 5 rng/kg, s.c.) ou WEB 2086 (antagonista do PAF; 40 rng/kg, s.c.) não reduziu a migração de neutrófilos. Dexametasona e AA 861 também inibiram a migração de neutrófilos, quando administradas imediatamente após a injeção do veneno. A possibilidade da migração de neutrófilos ser causada pela contaminação com endotoxina bacteriana foi eliminada uma vez que o tratamento do veneno com polimixina B não reduziu a migração. O aquecimento do veneno (97°C, 2 min) reduziu a atividade fosfolipásica e esta foi acompanhada por uma redução na migração de neutrófilos O agente quelante EDT A reduziu parcialmente a migração de neutrófilos e a atividade fosfolipásica do veneno. Entretanto, outros componentes do veneno podem estar envolvidos na migração, visto que houve redução de apenas 30% na migração de neutrófilos com a atividade fosfolipásica do veneno totalmente abolida. Os resultados sugerem que metabólitos da lipoxigenase estão envolvidos no processo quimiotático observado, e que macrófagos residentes peritoneais são células importantes no processo, uma vez que a migração de neutrófilos foi potencializada em animais pré-tratados com tioglicolato, mas reduziu-se quando a cavidade peritoneal foi lavada com salina estéril / Abstract: The ability of Bothrops lanceolatus venom (BLV) to induce neutrophil migration into the peritoneal cavity of mice was investigated. Intraperitoneal injection of venom caused time-dependent neutrophil migration, which peaked with 750 ng of BLV/cavity 4 h after venom injection. The venom-induced neutrophil migration was significantly reduced by pretreatment with dexamethasone (0.5 mg/kg, s.c), an indirect inhibitor of phospholipase A2 (PLA2), and AA861 (0.1 mg/kg, s.c), a 5-lipoxygenase inhibitor. In contrast, the neutrophil migration was not modified by pretreatment with indomethacin (2 mg/kg, s.c), an inhibitor of the cyclooxygenase pathway, meloxicam (5 mg/kg, s.c), an inhibitor of the cyclooxygenase-2 pathway, or the PAF inhibitor WEB2086 (40 mg/kg, s.c). Dexamethasone and AA861 also inhibited the neutrophil migration by 60% and 70%, respectively when administered immediately after venom injection. BLV induced neutrophil migration was not due to contamination by endotoxin since polymyxin B-treated BLV retained its activity. Heating the venom (97°C, 2 min) reduced the PLA2 activity and this was accompanied by a corresponding reduction in neutrophil migration. The chelating agent EDTA partially reduced the neutrophil migration and the venom phospholipase activity. Thus, other components in BLV must contribute to the observed effect, since the neutrophil migration was reduced by 30% when the PLA2 activity was abolished. These results suggest that arachidonate-derived lipoxygenase metabolities are involved in the chemotaxis observed. Macrophages may be an important cell, since the migratory response to BLV was potentiated in mice pretreated with thioglycollate, but reduced when the peritoneal cavity was washed with sterile saline / Mestrado / Mestre em Farmacologia

Orientadora: Karina Alves de Toledo / Banca: Luis Octávio Regasini / Banca: Flávia Aparecida Paina Brasil / Resumo: Rutina e Quercetina são flavonoides encontrados em diversos alimentos, incluindo aqueles indicados como complemento no tratamento de doenças inflamatórias. Durante o processo inflamatório, neutrófilos são as primeiras células a serem recrutadas por estarem diretamente relacionadas à ativação e resolução destes processos. Assim, frequentemente estas células são alvos para novos compostos anti-inflamatórios. A descrição da atividade anti-inflamatória de rutina e quercetina se estende para vários ativadores das vias clássicas dos neutrófilos. O estudo quanto aos compostos forbol ésteres, como PMA (phorbol myristate acetate), que ativam de maneira específica a sinalização da proteína quinase C, ainda são escassos.O objetivo deste trabalho foi analisar a atividade anti-inflamatória de rutina e quercetina sobre neutrófilos ativados por PMA. Para tanto, foram analisadas etapas importantes do processo inflamatório mediadas pelos neutrófilos: adesão, desgranulação, e liberação das NETs (Neutrophil Extracelular Traps). Nossos resultados demonstraram que, ativação de neutrófilos por PMA: (i) rutina e quercetina não inibem a adesão dos neutrófilos, (ii) quercetina inibe a desgranulção, (iii) ambos inibem a atividade da mieloperoxidase (MPO), assim como (iv) inibem a liberação das NETs na ausência de morte celular. Análises de docking molecular sugerem que tais eventos podem estar relacionados à geração de complexos quercetina/MPO e rutina/elastase / Abstract: Rutin and Quercetin are flavonoids found in several foods, including those indicated as a supplement in the inflammatory treatment diseases. During the inflammatory process, neutrophils are the first cells to be recruited. They are directly related to the activation and resolution of these processes. Thus, these cells often target new antiinflammatory compounds. The description of the anti-inflammatory activity of rutin and quercetin extends to several activators of classical neutrophil pathways. Studies involving forbol esters compounds, as PMA ((phorbol myristate acetate), which activate in a specific manner the protein kinase signalling, it is still poor. The aim of this study was to analyze the anti-inflammatory activity of rutin and quercetin on PMAactivated neutrophils. For this, important steps of the inflammatory process mediated by neutrophils were analyzed: adhesion, degranulation, and release of NETs (Neutrophil Extracelular Traps). Our results demonstrated that neutrophil activation by PMA: (i) rutin and quercetin did not inhibit neutrophil adhesion, (ii) quercetin inhibited degranulation, (iii) both inhibited myeloperoxidase activity (MPO), as well as (iv) both Inhibit the release of NETs in the absence of cell death. Molecular docking analyzes suggest that such events may be related to the generation of quercetin/MPO and rutin/elastase complexes / Mestre

Ureases (3.5.1.5), enzimas níquel dependentes que catalisam a reação de hidrólise da uréia em amônia e dióxido de carbono, apresentam ampla distribuição em plantas, fungos e bactérias. A espiroqueta Helicobacter pylori causa úlceras pépticas e câncer gástrico por mecanismos ainda não totalmente conhecidos. H. pylori produz grande quantidade de urease, que neutraliza o meio ácido e permite sua sobrevivência no estômago. Nosso grupo demonstrou que as ureases de Canavalia ensiformis, soja e Bacillus pasteurii induzem agregação plaquetária independentemente de sua atividade ureolítica, por uma rota que requer ativação de canais de cálcio. ativação da rota do ácido araquidônico e secreção plaquetária. Estudos prévios mostraram ainda que a canatoxina, uma isoforma da urease de C.ensiformis, possui atividade pró-inflamatória, induzindo edema de pata em ratos. Neste trabalho, caracterizamos as propriedades ativadora de plaquetas e pró-inflamatória da urease recombinante de H. pylori (HPU). Em plaquetas, estudamos as vias recrutadas pela proteína na agregação plaquetária e comparamos com dados prévios para a canatoxina e a urease de Bacillus pasteurii. Em neutrófilos, demonstramos que a HPU, em doses nanomolares, induz quimiotaxia e produção de espécie reativas de oxigênio. A taxa de apoptose de neutrófilos ativados por HPU foi inibida, acompanhando alterações dos níveis de proteínas pró- e antiapoptóticas. Por último, mostramos que a resposta dos neutrófilos a HPU envolve aumento dos níveis de lipoxigenase(s), sem, contudo, haver alterações das ciclooxigenase( s). Concluímos que as propriedades não enzimáticas aqui descritas para a HPU podem potencialmente contribuir para o processo inflamatório promovido por H. pylori. / Ureases (EC 3.5.1.5), nickel-dependent enzymes that hydrolyze urea into ammonia and carbon dioxide, are widespread among plants, bacteria and fungi. The spirochete Helicobacter pylori is the etiological agent of gastric ulcers and gastric adenocarcinoma by mechanisms not yet fully understood. H. pylori produces high amounts of urease, which enables the bacterium to survive in the acidic medium of the stomach. We have previously reported that ureases from jackbean, soybean or Bacillus pasteurii induce blood platelet aggregation independently of their enzyme activity by a pathway requiring activation of calcium channels, lipoxigenase-derived eicosanoids and platelet secretion. We also showed that canatoxin, an isoform of C. ensiformis urease, presents pro-inflammatory property demonstrated by rat paw oedema. In this work we characterized the platelet aggregating and pro-inflammatory properties of the recombinant H. pylori urease (HPU). In platelets we studied the pathways recruited by the protein to induce platelet aggregation and compared the data to those previously reported for the plant urease canatoxin and for Bacillus pasteurii urease. Using neutrophils we demonstrated that nanomolar doses of HPU induce chemotaxis and production of oxygen reactive species in human neutrophils. The rate of apoptosis was decreased in HPU-treated neutrophils, accompanied by alterations in the levels of proand anti-apoptotic proteins. Moreover, we showed that the response of neutrophils to HPU requires increased levels of lipoxygenase(s) with no alterations of cyclooxygenase( s). We concluded that the non-enzymatic properties of HPU here described potentially contribute to the inflammatory process that underlies H. pylori infection.

Mieloperoxidase (MPO) é uma enzima derivada de leucócitos que catalisa a formação de numerosas espécies reativas oxidantes. Além de integrantes da resposta imune inata, evidências têm comprovado a contribuição destes oxidantes para o dano tecidual durante inflamação. A MPO participa de atividades biológicas pró-aterogênicas relacionadas à evolução da doença cardiovascular, incluindo iniciação, propagação e as fases de complicação aguda do processo aterosclerótico. Desta forma, a MPO e sua cascata inflamatória representam um alvo atrativo para investigação prognóstica e terapêutica na doença aterosclerótica cardiovascular. Vários estudos apontam para o efeito independente dos níveis de MPO na evolução da doença e ocorrência de eventos em pacientes com síndrome coronariana aguda. Entretanto, ainda não é consistente o valor preditivo adicional da dosagem de MPO na estratificação de risco cardiovascular para incorporá-la à prática clínica como sinalizadora de vulnerabilidade de placa. Estudos adicionais são necessários para avaliar os níveis de MPO como preditor de risco cardiovascular em curto e longo prazo, bem como o potencial benefício em utilizá-la para definir estratégias terapêuticas, além da padronização do ensaio, ponto fundamental para a transição desse marcador do ambiente de pesquisa para uso na rotina clínica.

LEITE, Ana Caroline Rocha de Melo. Estudo da participação do óxido nítrico na migração celular aguda na artrite e peritonite induzidas por zymosan ou lipopolissacarídeo em modelos experimentais. 2005. 70 f. Dissertação (Mestrado em farmacologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2005. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2012-03-05T14:13:07Z No. of bitstreams: 1 2005_dis_acrmleite.pdf: 373904 bytes, checksum: b4ba3e4959638053b435038e691d9ebc (MD5) / Approved for entry into archive by Eliene Nascimento(elienegvn@hotmail.com) on 2012-03-07T11:35:54Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2005_dis_acrmleite.pdf: 373904 bytes, checksum: b4ba3e4959638053b435038e691d9ebc (MD5) / Made available in DSpace on 2012-03-07T11:35:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2005_dis_acrmleite.pdf: 373904 bytes, checksum: b4ba3e4959638053b435038e691d9ebc (MD5) Previous issue date: 2005 / Cell influx (CI) to synovium participates in physiopathology of rheumatoid arthritis (RA). There are controversies about the nitric oxide (NO) action in modulation of neutrophil influx to inflammatory sites, with NO decreasing or increasing it. This study investigated the effect of nitric oxide synthase (NOS) inhibitors on acute CI in animals submitted to arthritis or peritonitis induced by zymosan (ZyA or ZyP) or lipopolysaccharide (LPSA or LPSP), and the participation of leukotriene B4 (LTB4) and intercellular adhesion molecule -1 (ICAM-1). Rats Wistar received Zy (10-1000 micrograme) or LPS (1-10 micrograme) intraarticular (i.a.). Other groups received Zy (1 mg) or LPS (10 µg) intraperitoneal (i.p.). Wild or ICAM-1-deficient (ICAM-1-/-) mice received Zy (100 µg) i.a. or i.p. Animals were pre-treated (30 minutes before arthritis or peritonitis): in ZyA, rats received L-NAME (1-30 mg/kg; i.p. or 0.3-1 micromol; i.a), 1400W (1 mg/kg; i.p.) or Aminoguanidine (Amino) (50 mg/kg; i.p.). Mice received L-NAME (3-10 mg/kg;i.p.) or NG-nitro-L-arginine (Nitro) (50 mg/kg; i.p.). In ZyP, L-NAME (10-30 mg/kg; s.c. or i.p.) or 1400W (1 mg/kg; s.c.) was administrated in rats and mice received L-NAME (30 mg/kg; s.c.) or Nitro (50 mg/kg; s.c.). In LPSA, rats received L-NAME (10-30 mg/kg; i.p) and, in LPSP, they received L-NAME (30 mg/kg; s.c.). Controls received vehicle (NT groups). After sacrifice, CI was counted and LTB4 was measured in articular and peritoneal exudates. In ZyA (10-100 µg), L-NAME (1-3 mg) reduced CI (47.4 – 76.6%) as compared to NT animals (p<0.05). In ZyA (1mg), L-NAME (30 mg), 1400W (1mg) and Amino (50 mg) reduced CI (57.4%, 74.8% and 76.6%, respectively) (p<0.05). L-NAME (0.3 µmol) i.a. also reduced CI (85.3%) (p<0.05). Similarly, L-NAME (3-10 mg) or Nitro (50 mg) pre-treated mice showed a CI reduction (67.6%, 53.8% and 39.5%) (p<0.05). In contrast, in ZyP, L-NAME (10-30 mg) and 1400W (1 mg) increased CI (566.7%, 495.1% and 470.7%, respectively) in rats and L-NAME (30 mg) in mice (155.8%) (p<0.05). In mice, Nitro increased CI, but not significantly (p>0.05). L-NAME (10 mg) i.p. also increased CI (747.6%) (p<0.05). In LPSA, L-NAME (30 mg) decreased CI in two LPS doses (50.3% and 52.3%) (p<0.05). In LPSP, L-NAME (30 mg) increased the influx (53.4%) (p<0.05). NOS inhibitors didn’t change LTB4 levels. Arthritic pre-treated or not with Nitro ICAM-1-/- animals showed a CI reduction (57.8% or 32.1%)(p<0.05). In peritonitis, pre-treated or not with Nitro ICAM-1-/- showed a CI reduction (9.5% and 22.3%), but not significantly (p>0.05). NO, especially that produced by iNOS, reduces the acute CI in articulation while increases it in the peritoneum. This effect is independent of stimulus, species, route of administration and LTB4 liberation. Beyond, it involves resident and/or migrated cells. ICAM-1 appears to participate in CI in these models, especially in arthritis. Besides, NO modulates the expression of ICAM-1 in peritonitis. / O influxo celular (IC) à sinóvia participa na fisiopatologia da artrite reumatóide (AR). Há controvérsias sobre o papel do óxido nítrico (NO) na modulação do influxo de neutrófilos para sítios inflamatórios, seja reduzindo ou estimulando-o. Esse trabalho investigou o efeito de inibidores de óxido nítrico sintase (NOS) sobre o IC agudo em animais submetidos à artrite ou peritonite induzida por zymosan (AZy ou PZy) ou lipopolissacarídeo (ALPS ou PLPS), bem como a participação de leucotrieno B4 (LTB4) e da molécula de adesão intercelular -1 (ICAM-1). Ratos Wistar receberam 10-1000 micrograma de Zy ou 1-10 micrograma de LPS intra-articular (i.a.). Outros grupos receberam 1 mg de Zy ou 10 µg de LPS intraperitoneal (i.p.). Camundongos selvagens ou geneticamente manipulados (knock out) para ICAM-1 (ICAM-1-/-) receberam 100 µg de Zy i.a. ou i.p. Esquema dos pré-tratamentos (30 minutos antes da artrite ou peritonite): na AZy, L-NAME (1-30 mg/kg; i.p. ou 0,3-1 micromol; i.a), 1400W (1 mg/kg; i.p.) ou Aminoguanidina (Amino) (50 mg/kg; i.p.) em ratos e camundongos receberam L-NAME (3-10 mg/kg;i.p.) ou NG-nitro-L-arginia (Nitro) (50 mg/kg; i.p.). Na PZy, L-NAME (10-30 mg/kg; s.c. ou i.p.) ou 1400W (1 mg/kg; s.c.) foi administrado em ratos e camundongos receberam L-NAME (30 mg/kg; s.c.) ou Nitro (50 mg/kg; s.c.). Na ALPS, ratos receberam L-NAME (10-30 mg/kg; i.p) e, na PLPS, L-NAME (30 mg/kg; s.c.). Controles receberam veículo (grupos NT). Após o sacrifício, foram quantificados o IC e LTB4 nos lavados articulares e peritoneais. Na AZy (10-100 micrograma) em ratos, L-NAME (1-3 mg) reduziu o IC (47,4 - 76,6%), quando comparado aos animais NT (p<0,05). Na AZy 1mg, L-NAME (30 mg), 1400W (1 mg) e Amino (50 mg) diminuíram o IC (57,4%, 74,8% e 76,6%) (p<0,05). L-NAME (0,3 micromol) i.a. também reduziu o IC (85,3%) (p<0,05). Semelhante aos ratos, camundongos pré-tratados com L-NAME (3-10 mg) ou Nitro (50 mg) apresentaram diminuição do IC (67,6%, 53,8% e 39,5%) (p<0,05). Contrariamente, na PZy, L-NAME (10-30 mg) e 1400W (1 mg) aumentaram o IC (566,7%, 495,1% e 470,7%) em ratos e L-NAME (30 mg), em camundongos (155,8%) (p<0,05). Nesses, Nitro aumentou o IC, mas não significativamente (p>0,05). L-NAME (10 mg) i.p. também aumentou o IC (747,6%) (p<0,05). Na ALPS, L-NAME (30 mg) diminuiu o IC nas duas doses de LPS (50,3% e 52,3%) (p<0,05). Na PLPS, L-NAME (30 mg) aumentou o IC (53,4%) (p<0,05). Os inibidores de NOS não alteraram os níveis de LTB4. Animais ICAM-1-/- artríticos pré-tratados ou não com Nitro apresentaram redução do IC (57,8% ou 32,1%)(p<0,05). Nos ICAM-1-/- com peritonite pré-tratados ou não com Nitro, houve uma redução do IC (9,5% e 22,3%), mas não significativa (p>0,05). O NO, particularmente o produzido pela NOSi, reduz o IC agudo na articulação, enquanto que o incrementa no peritôneo. Esse efeito é independente do estímulo, da espécie, da via de administração e da liberação de LTB4, além de envolver células residentes e/ou migradas. ICAM-1 parece participar do IC nesses modelos, especialmente na artrite, com o NO modulando sua expressão na peritonite.

Mieloperoxidase (MPO) é uma enzima derivada de leucócitos que catalisa a formação de numerosas espécies reativas oxidantes. Além de integrantes da resposta imune inata, evidências têm comprovado a contribuição destes oxidantes para o dano tecidual durante inflamação. A MPO participa de atividades biológicas pró-aterogênicas relacionadas à evolução da doença cardiovascular, incluindo iniciação, propagação e as fases de complicação aguda do processo aterosclerótico. Desta forma, a MPO e sua cascata inflamatória representam um alvo atrativo para investigação prognóstica e terapêutica na doença aterosclerótica cardiovascular. Vários estudos apontam para o efeito independente dos níveis de MPO na evolução da doença e ocorrência de eventos em pacientes com síndrome coronariana aguda. Entretanto, ainda não é consistente o valor preditivo adicional da dosagem de MPO na estratificação de risco cardiovascular para incorporá-la à prática clínica como sinalizadora de vulnerabilidade de placa. Estudos adicionais são necessários para avaliar os níveis de MPO como preditor de risco cardiovascular em curto e longo prazo, bem como o potencial benefício em utilizá-la para definir estratégias terapêuticas, além da padronização do ensaio, ponto fundamental para a transição desse marcador do ambiente de pesquisa para uso na rotina clínica.

Ureases (3.5.1.5), enzimas níquel dependentes que catalisam a reação de hidrólise da uréia em amônia e dióxido de carbono, apresentam ampla distribuição em plantas, fungos e bactérias. A espiroqueta Helicobacter pylori causa úlceras pépticas e câncer gástrico por mecanismos ainda não totalmente conhecidos. H. pylori produz grande quantidade de urease, que neutraliza o meio ácido e permite sua sobrevivência no estômago. Nosso grupo demonstrou que as ureases de Canavalia ensiformis, soja e Bacillus pasteurii induzem agregação plaquetária independentemente de sua atividade ureolítica, por uma rota que requer ativação de canais de cálcio. ativação da rota do ácido araquidônico e secreção plaquetária. Estudos prévios mostraram ainda que a canatoxina, uma isoforma da urease de C.ensiformis, possui atividade pró-inflamatória, induzindo edema de pata em ratos. Neste trabalho, caracterizamos as propriedades ativadora de plaquetas e pró-inflamatória da urease recombinante de H. pylori (HPU). Em plaquetas, estudamos as vias recrutadas pela proteína na agregação plaquetária e comparamos com dados prévios para a canatoxina e a urease de Bacillus pasteurii. Em neutrófilos, demonstramos que a HPU, em doses nanomolares, induz quimiotaxia e produção de espécie reativas de oxigênio. A taxa de apoptose de neutrófilos ativados por HPU foi inibida, acompanhando alterações dos níveis de proteínas pró- e antiapoptóticas. Por último, mostramos que a resposta dos neutrófilos a HPU envolve aumento dos níveis de lipoxigenase(s), sem, contudo, haver alterações das ciclooxigenase( s). Concluímos que as propriedades não enzimáticas aqui descritas para a HPU podem potencialmente contribuir para o processo inflamatório promovido por H. pylori. / Ureases (EC 3.5.1.5), nickel-dependent enzymes that hydrolyze urea into ammonia and carbon dioxide, are widespread among plants, bacteria and fungi. The spirochete Helicobacter pylori is the etiological agent of gastric ulcers and gastric adenocarcinoma by mechanisms not yet fully understood. H. pylori produces high amounts of urease, which enables the bacterium to survive in the acidic medium of the stomach. We have previously reported that ureases from jackbean, soybean or Bacillus pasteurii induce blood platelet aggregation independently of their enzyme activity by a pathway requiring activation of calcium channels, lipoxigenase-derived eicosanoids and platelet secretion. We also showed that canatoxin, an isoform of C. ensiformis urease, presents pro-inflammatory property demonstrated by rat paw oedema. In this work we characterized the platelet aggregating and pro-inflammatory properties of the recombinant H. pylori urease (HPU). In platelets we studied the pathways recruited by the protein to induce platelet aggregation and compared the data to those previously reported for the plant urease canatoxin and for Bacillus pasteurii urease. Using neutrophils we demonstrated that nanomolar doses of HPU induce chemotaxis and production of oxygen reactive species in human neutrophils. The rate of apoptosis was decreased in HPU-treated neutrophils, accompanied by alterations in the levels of proand anti-apoptotic proteins. Moreover, we showed that the response of neutrophils to HPU requires increased levels of lipoxygenase(s) with no alterations of cyclooxygenase( s). We concluded that the non-enzymatic properties of HPU here described potentially contribute to the inflammatory process that underlies H. pylori infection.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Pós-graduação em Medicina Tropical, 2015. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-06-21T16:20:41Z No. of bitstreams: 1 2015_HelaneCatarineDantasdoNascimentoRibeiro.pdf: 5640990 bytes, checksum: f577306d6c7e1c7f705450e010cf2e22 (MD5) / Approved for entry into archive by Marília Freitas(marilia@bce.unb.br) on 2016-07-26T10:55:34Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_HelaneCatarineDantasdoNascimentoRibeiro.pdf: 5640990 bytes, checksum: f577306d6c7e1c7f705450e010cf2e22 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-26T10:55:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_HelaneCatarineDantasdoNascimentoRibeiro.pdf: 5640990 bytes, checksum: f577306d6c7e1c7f705450e010cf2e22 (MD5) / As parasitoses intestinais apresentam uma alta prevalência no mundo. Estudos revelam o aumento das doenças alérgicas e da asma e concomitantemente redução das doenças infectoparasitárias em crianças. A existência de uma correlação é estudada demonstrando a ação imunossupressora dos parasitos intestinais sobre a resposta imunitária sistêmica. Os objetivos do presente trabalho foram avaliar o estado de ativação dos eosinófilos e as funções dos fagócitos comparativamente em crianças com asma, com parasitoses intestinais e na associação de ambas. Foi realizado estudo transversal com 68 crianças residentes no Riacho Fundo II e na Cidade Estrutural, em Brasília/Distrito Federal. Os pacientes foram separados nos grupos: A) crianças com parasitoses intestinais; B) crianças asmáticas sem parasitoses intestinais; C) crianças com parasitoses intestinais e asma e D) grupo controle. Após técnica de aderência em lâmina, foram avaliados: o estado de ativação dos eosinófilos do sangue periférico por parâmetros morfológicos; a fagocitose pelos monócitos (MON) e neutrófilos (NEU) por receptores para padrões moleculares de patógenos (rPMP) e para opsoninas (rOps), como também a produção de ânions superóxido (O-) pelo teste do nitroblue tetrazolium (NBT). As análises estatísticas foram realizadas pelos testes de ANOVA ou Kruskal-Wallis. Observamos, além da baixa renda familiar e reduzidas condições de escolaridade, a prática de evacuações no peridomicílio pelas crianças e a ausência de tratamento domiciliar da água de beber. Os parasitos intestinais mais prevalentes foram Ascaris lumbricoides e Giardia lamblia, seguida por Hymenolepis nana e houve associação de parasitos intestinais em 38% dos pacientes parasitados. A ativação dos eosinófilos foi menor nas crianças com enteroparasitoses, quando analisados o percentual de eosinófilos normais, espraiamento, liberação de pequenas quantidades de grânulos e emissão de pseudópode único, comparativamente às crianças asmáticas. A capacidade fagocitária pelos rPMP dos NEU das crianças parasitadas exclusivamente por protozoários foi menor do que a das crianças asmáticas. Quando a fagocitose foi avaliada pelos rOps, a capacidade fagocitária dos MON das crianças asmáticas e também parasitadas foi maior do que a das crianças controle, pela maior ingestão de leveduras pelos MON. A produção de O- pelos fagócitos foi menor nas crianças parasitadas por protozoários do que nas crianças asmáticas e parasitadas por protozoários. Contudo, a produção dos O- foi maior nas crianças parasitadas por helmintos do que nas crianças asmáticas. Em conclusão, a infecção parasitária e o quadro de asma tiveram efeitos opostos sobre as diversas funções da imunidade inata estudada. O tipo de resposta dependeu do tipo de parasito e helmintos e protozoários determinaram repostas opostas: enquanto os protozoários, particularmente a Giardia intestinalis, diminuíram a capacidade fagocitária dos NEU pelos rPMP, os helmintos estimularam a fagocitose pelos MON pelos rOps. Em adição, enquanto no quadro de asma observamos certo grau de ativação dos eosinófilos, nas crianças parasitadas, essa ativação dos eosinófilos no sangue periférico não ocorreu, possivelmente por fatores supressores produzidos pelos parasitos. Tais achados podem contribuir para o esclarecimento sobre a resposta imune inata aos parasitos e suas repercussões no indivíduo, auxiliando na abordagem das parasitoses e no desenvolvimento de novas terapêuticas para a asma e atopias. / Intestinal parasites have a high prevalence worldwide, mainly in developing countries in places showing poor sanitary and socio-economic conditions. Several studies point to an increase in allergic diseases and asthma over the years, and show a concomitant reduction in infectious and parasitic diseases in children. The existence of such a correlation or causal factor has been investigated in experimental models with animal and human beings, leading to findings that demonstrate the immunosuppressive action of the parasites on the systemic immune response. Factors depending on the host, such as genotype, immune competence and nutritional status; and factors depending on the parasite, as the parasite load and the pathogenicity and virulence of helminths or protozoans, will determine the type of immune response triggered in infected individuals. In this context, this work aimed to evaluate eosinophil activation status and phagocytes' functions comparatively in children with asthma, intestinal parasites and in combination of both. A cross-sectional study was done in 68 children living in Riacho Fundo II and Chácara Santa Luzia in Cidade Estrutural, in Brasilia/Federal District, Brazil. The socio-economic-cultural evaluation of the families, and clinical, laboratory and stool testing of each child were made. Four groups were studied: A) Helminths or/and protozooan parasitized children; B) asthmatic children; C) asthmatic and parasitized children; and D) control group. The blood eosinophil activation status was assessed by morphologic parameters after adherence to glass. The phagocytic capacity of monocytes and neutrophils was evaluated by pathogen-associated molecular pattern receptors (PAMPr) and the opsonin receptors, as well as superoxide anions production by nitroblue tetrazolium test (NBT). Statistic analyses were performed by ANOVA or Kruskal-Wallis test. Eosinophils were lower activated in children with intestinal parasites than in asmathic children, by percentage of normal eosinophils, spreading, releasing of small quantities of granules and emission of a single pseudopod. The phagocytic capacity of neutrophils of children exclusively parasitized by protozoan was lower than that of asthmatic children, by pathogen-associated molecular pattern receptors. When the phagocytosis was evaluated by opsonin receptors, phagocytic capacity of monocytes in asthmatic children concomitantly parasitized was higher than that of controls. Superoxide anions production was lower in children parasitized by protozoan than in children with asthma plus protozoan. However, superoxide anions production was higher in children who were parasitized by helminths than in asthmatic children. In conclusion, our data showed that parasitic infection and asthma had opposite effects on several immune innate functions. Furthermore, immune response depended on the type of parasite, and helminths and protozoa determined opposite responses: whereas protozoan, mainly Giardia intestinalis, decreased phagocytic capacity by neutrophils by PAMPr, helminths stimulated phagocytosis by monocytes by opsonin receptors. In addition, whereas in asthmatic children there were some eosinophil activation, in parasitized children there was no blood eosinophil activation possibly determined by suppressive factors produced by parasites. These findings may contribute to make clear the innate immune response to parasites and their impact on individual, assisting to understand parasites and in development of new therapies for treatment of asthma and atopies.

Orientador: Luiz Marcos da Fonseca / Banca: Marcelo Dias Baruffi / Banca: Paulo Inácio da Costa / Resumo: Os receptores para a porção Fc das IgG (FcgR) estão amplamente expressos nas células do sistema imune e podem estimular uma variedade de respostas efetoras. Três classes de FcgR são descritas nos humanos: FcgRI, FcgRII e FcgRIII. O neutrófilo expressa constitutivamente as isoformas FcgRIIa (CD32) e FcgRIIIb (CD16), as quais apresentam um polimorfismo funcional decorrente do polimorfismo alélico. No FcgRIIa, a substituição da histidina (H) pela arginina (R) na posição 131 resulta nas variantes polimórficas FcgRIIa- R131 e FcgRIIa-H131, que diferem quanto à capacidade de ligação à IgG2 humana. Quanto ao FcgRIIIb (CD16), o polimorfismo genético é responsável pela expressão dos antígenos de neutrófilo (NA)1, NA2 e SH e resulta em um maior número de sítios de glicosilação em NA2. O FcgRIIIb é responsável pela aproximação dos ligantes na membrana para o FcgRIIa e também interage com o receptor para complemento tipo 3 (CR3) na superfície celular. A cooperação entre os FcgRIIa/IIIb com o CR3 promove a estimulação máxima das respostas do neutrófilo, dentre elas o burst oxidativo. Uma vez que a interação FcgRIIIb/CR3 ocorre via sítio de ligação lectina-sacarídeo, o objetivo deste estudo foi avaliar se o polimorfismo alélico do FcgRIIIb poderia afetar a cooperação entre os FcgR e os CR em mediar o burst oxidativo dos neutrófilos. As freqüências dos alelos H/R-131 e NA1/NA2/SH foram analisadas por genotipagem com oligonucleotídeos alelo-específicos e reação em cadeia da polimerase e a densidade de expressão dos receptores (FcgRIIa, FcgRIIIb, CR1 e CR3) foi determinada por citometria de fluxo. A distribuição dos genótipos para o FcgRIIIb (n=169) foi NA1/NA2 (52,1%), NA2 (27,8%) e NA1 (20,1%). Dentre 174 indivíduos, apenas 6,3% apresentaram o gene SH. Quanto aos genótipos para o FcgRIIa (n=143), a distribuição... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Receptors for immunoglobulin G (FcgR) are known to be expressed on many cells of the immune system and they can trigger a variety of biological responses. Human FcgR belong to the Ig superfamily and three classes of these receptors have been recognized: FcgRI, FcgRII and FcgRIIl, with different affinities and specificities for IgG subclasses. Neutrophils express the FcgRIIa (CD32) and FcgRIIlb (CD16) isoforms, which display a functional polymorphism due to biallelic polymorphisms. In the case of FcgRIIa, an arginine (FcgRIIa-R131) or histidine (FcgRIIa-H131) at amino acid position 131 determines receptor affinity for IgG2, FcgRIIa-H131 being the isoform with highest affinity. On neutrophils, the FcgRIIIb bears the neutrophil antigen (NA) polymorphism, NA1, NA2 and SH, NA2 being the more glycosylated isoform. Cooperation of FcgRIIIb with FcgRIIa and CR3 (complement receptor type 3) is necessary for efficient neutrophil responses, including the oxidative burst. Since the FcgRIIIb/CR3 cooperation occurs via lectin-sacharide-like interaction, the aim of this study was to evaluate whether the allelic polymorphism, NA1 and NA2, could influence the cooperation of FcgRIIIb with CR3 in mediating the oxidative burst of neutrophils. FcgRIIa and FcgRIIIb genotyping analysis were performed by polymerase chain reaction with allelespecific primers and surface expressions of FcgRIIa, FcgRIIIb, CR1 and CR3 on neutrophils were determined by flow cytometry. The FcgRIIIb genotype distribution (n=169) was NA1/NA2 (52.1%), NA2 (27.8%) and NA1 (20.1%). SH gene was found in 11 (6.3%) volunteers from 174 subjects. With respect to the FcgRIIa genotype (n=143), the distribution observed was R131 (41.2%), H/R131 (38.5%) and H (20.3%). Neutrophils were stimulated with immune complexes (IC)-IgG opsonized or not with complement and the oxidative burst... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2011. / Submitted by Max Lee da Silva (bruce1415@hotmail.com) on 2011-06-28T13:30:52Z No. of bitstreams: 1 2011_LizMariaBatistaTeles.pdf: 2779966 bytes, checksum: 24f2d49d4772a40872853395bd4de504 (MD5) / Approved for entry into archive by Guilherme Lourenço Machado(gui.admin@gmail.com) on 2011-06-30T15:37:24Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_LizMariaBatistaTeles.pdf: 2779966 bytes, checksum: 24f2d49d4772a40872853395bd4de504 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-06-30T15:37:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_LizMariaBatistaTeles.pdf: 2779966 bytes, checksum: 24f2d49d4772a40872853395bd4de504 (MD5) / Os neutrófilos são os leucócitos mais abundantes no sangue periférico humano, representando a principal linha de defesa contra bactérias, vírus e protozoários. Durante o processo de ativação, essas células podem liberar ânion superóxido (O2 •-) e proteases oriundas de seus grânulos para o meio extracelular, promovendo dano tecidual. Em politraumatismo, o processo inflamatório pode tornar-se disseminado e resultar na síndrome da resposta inflamatória sistêmica (SIRS). O progresso dessa situação induz o desenvolvimento de síndrome da angústia respiratória aguda (ARDS) e falência de múltiplos órgãos (MOF). Devido à complexidade do sistema analisado, que envolve muitas e diferentes vias metabólicas de estimulação / ativação com diversos pontos de interação, a abordagem proteômica é considerada uma ferramenta apropriada para estudar as funções neutrofílicas. Este trabalho apresenta os resultados obtidos a partir da análise comparativa entre os mapas proteômicos de polimorfonucleares (PMN) humanos quiescentes e ativados por trauma grave. São pesquisados marcadores moleculares que possam estar envolvidos nos estados mórbidos observados após politraumatismo. Extratos proteicos de neutrófilos de 3 doadores hígidos e de 3 pacientes politraumatizados foram analisados, como triplicatas biológicas e experimentais, em dois intervalos de eletroforese bidimensional: pH 6-11 e 4-7. O processo comparativo da abordagem alcalina revelou 3 spots diferencialmente expressos, sendo que os três aumentaram sua expressão após ativação devido a trauma grave. Quanto ao perfil ácido, 114 spots foram diferencialmente expressos, onde 27 aumentaram e 87 diminuíram sua expressão devido à ativação por politraumatismo. Foram alcançadas identificações de algumas proteínas potencialmente relacionadas com quadros inflamatórios após trauma grave, como Zfyve19, MAOB e proteína semelhante à albumina, descritas pela primeira vez em polimorfonucleares. A partir do entendimento das funções bioquímicas dessas proteínas, espera-se que exames laboratoriais e terapias clínicas específicos possam ser desenvolvidos. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Polymorphonuclear leukocytes (PMN) or neutrophils are thought to play divergent roles in critically injured patients. In one fashion, they are the first line of defense against bacterial, viral and protozoan infections through phagocytosis and release of reactive oxygen species (ROS). However, it has become apparent that inappropriate activation of these cells and release of ROS and tissue degrading enzymes from their granules contributes to systemic inflammatory response syndrome (SIRS), acute respiratory distress syndrome (ARDS) and multiple organ failure (MOF). Neutrophil protein extracts from three volunteer normal donors and from three major torso trauma patients were submitted, as technical and biological triplicates, to two ranges of bidimensional electrophoresis: pH 6-11 and 4-7. Alkaline and acidic proteomic maps of quiescent human neutrophils were analyzed and compared to those of activated neutrophils from severe trauma patients. The alkaline proteomic comparison revealed 3 spots whose measured volumes differed between activated and quiescent neutrophils, with all of them upregulated in trauma setting. On the other hand, the acidic proteomic analysis revealed 114 spots whose measured volumes differed between activated and quiescent polymorphonuclear leukocytes, with 27 upregulated and 87 downregulated in trauma condition. This work achieved the identification of several proteins potentially involved in signaling after trauma, as exemplified by the proteins Zfyve19, MAOB and albumin-like protein, described for the first time in polymorphonuclear leukocytes. Understanding the role of some neutrophil proteins, which are involved in the leukocyte metabolical actions in inflammatory response, can contribute to the development of new therapeutic strategies to control the deleterious inflammatory process and its pathological sequelae.