Les plantes sont des organismes sessiles se développant dans un environnement hétérogène et fluctuant. La capacité d'acquisition des nutriments par le système racinaire est donc un caractère important pour leur croissance et leur développement.L'azote (N), notamment sous forme nitrate (NO3-), fait partie de ces éléments qui sont limitant pour la croissance des plantes mais aussi très mobiles dans le sol donc fréquemment distribués de façon hétérogène. Les plantes s'adaptent à cette contrainte en modulant le développement racinaire ainsi que la capacité de transport de ce nutriment dans les différentes parties du système racinaire en fonction de la disponibilité en NO3- et du besoin en azote (N) de la plante entière. Cette adaptation repose donc sur la combinaison de deux voies de signalisation, i) une signalisation locale dépendante de la disponibilité en NO3- dans le milieu extérieur ii) une signalisation longue distance (ou systémique) racines-feuilles-racines relative au besoin en N de la plante entière.Toutefois, les bases moléculaires de la signalisation longue distance comme les mécanismes de régulation qui y sont associés ne sont pas totalement connus. Ils reposent sur l'intégration au niveau des parties aériennes de signaux d'origine racinaire, provenant des racines exposées au NO3- mais aussi de celles qui en sont privées. Les parties aériennes jouent alors un rôle majeur dans la modulation de la physiologie et du développement racinaire en condition de disponibilité hétérogène en NO3-. Des études précédentes ont montré que la biosynthèse de cytokinines est essentielle pour la mise en place de cette réponse adaptative. De plus, il est connu qu'après un apport de NO3-, la biosynthèse de cette hormone dans les racines puis son accumulation dans les parties aériennes est augmentée. Dans ce contexte, nous avons émis l'hypothèse que les cytokinines pourraient correspondre à un messager racines/feuilles important pour la signalisation systémique NO3--dépendante.L'objectif de mon projet de thèse consistait à comprendre comment les parties aériennes contrôlent l'acquisition racinaire du NO3- en condition de disponibilité hétérogène en NO3-. Pour reproduire cette condition en laboratoire, le système de 'split-root', permettant de séparer le système racinaire en deux parties isolées pouvant être traitées différemment, a été utilisé pour exposer les plantes à différentes conditions de disponibilité en NO3-. Dans ces différentes conditions, les réponses moléculaires, métaboliques et physiologiques ont été caractérisées chez des plantes sauvages d'Arabidopsis et comparées à celles de mutants affectés dans la biosynthèse, le transport acropetal ou encore dans la perception des cytokinines. La combinaison de ces différentes approches m'a ainsi permis de démontrer que les cytokinines, et plus précisément les trans-zéatines, sont effectivement un messager racines-feuilles crucial pour la mise en place des réponses de la racine à une disponibilité hétérogène en NO3-. De plus, j'ai montré que l'apport hétérogène en NO3- comparé à l'apport homogène entraîne une importante reprogrammation de l'expression génique dans les parties aériennes qui est largement dépendante de ce transport de trans-zéatines vers les feuilles. Enfin, l'intégration de ces données transcriptomiques au sein de réseaux géniques a permis d'identifier des gènes candidats intéressants comme acteurs possibles de la signalisation feuilles-racines. / Plants are sessile organisms growing in a heterogeneous and fluctuating environment. Thus, foraging for nutrients is an important trait for plant growth and development. Nitrogen (N), especially as nitrate (NO3-) form, is one limiting element for plant growth but is also highly mobile in the soil leading to frequent heterogeneity distribution. Plants are managing this constraint through the regulation of root development and NO3- uptake in the different parts of the root system according to the spatial NO3- availability and the N needs of the whole plant. This adaptation relies on a dual signaling pathway involving i) a local signaling related to external NO3- supply and ii) a root-shoot-root long-distance (systemic) signaling related to the plant N needs..However, the molecular basis of the long-distance signaling as well as the regulatory mechanisms associated with, are not fully understood. They rely on the integration at the shoot level of signals originating from both NO3--supplied and N-deprived root parts. Therefore, the shoots have a key role for an efficient adaptation to heterogeneous NO3- environment through the adjustment of root physiology and development. Previously, cytokinin biosynthesis has been shown to be essential for both molecular and morphological root responses to NO3- heterogeneous environment. Moreover, it is known that upon NO3- supply, de novo biosynthesis of this hormone in the roots is increased along with its accumulation in the shoots. In this context, we hypothesized that cytokinins could correspond to an important root to shoot signal involved in NO3--dependent systemic signaling.The main objective of my PhD project was to decipher and understand how the shoots control root NO3- acquisition in response to spatial NO3- heterogeneity. To do so, we used the 'split-root' system, in which physically isolated roots of a same plant are challenged with different NO3- environments. In this framework, we characterized physiological, metabolic and molecular responses of Arabidopsis wild-type plants that we compared to responses of mutants impaired in cytokinin biosynthesis, acropetal transport or perception. The combination of these different approaches allowed me to demonstrate that cytokinins, and especially trans-zeatin species are indeed a root to shoot messenger that is crucial for root responses to spatial NO3- heterogeneity. Moreover, I have shown that NO3- heterogeneous supply compared to homogeneous supply triggers a substantial reprogramming of gene expression in aerial part, which largely depends on this trans-zeatin transport toward the shoots. Finally, the integration of these transcriptomic modifications into gene networks led to the identification of interesting candidate genes to characterize the shoot-to-root signaling.

Les composés organiques volatils d’origine biogénique (COVB) contribuent à plus de 90% des émissions des COV dans l'atmosphère. Ces composés sont éliminés de l’atmosphère par réaction avec les photo-oxydants (OH, NO3, Cl et O3) et par photolyse. Ces processus sont gouvernés par un mécanisme en chaîne dont les porteurs sont des radicaux libres tels que les radicaux peroxyles RO2 qui jouent un rôle clé dans la dégradation atmosphérique des COV. Dans ce contexte, cette thèse se concentre d’une part sur l’étude cinétique en température et mécanistique de la réaction d’ozonolyse, la détermination des spectres UV et la photolyse de six COV oxygénés insaturés (trans-2-pentènal, trans-2-hexènal, 2-méthyl-2-pentènal, 1-pentèn-3-ol, cis- 2-pentèn-1-ol et trans-3-hexèn-1-ol), et d’autre part l’étude de la réactivité de trois radicaux peroxyles (CH3OCH2O2, CH3C(O)CH2O2 et (CH3)2C(OH)CH2O2) vis-à-vis des radicaux nitrates à différentes températures. Trois dispositifs expérimentaux sont utilisés : une chambre de simulation atmosphérique couplée à une spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FTIR) et à une chromatographie en phase gazeuse associée à une spectrométrie de masse (GC/MS), un dispositif de mesure des spectres UV-Visible et la photolyse laser couplée à une spectrométrie UV-visible et diode laser. Ces dispositifs associés à des méthodes de traitement permettent d'extraire des données cinétiques en température, mécanistiques et spectroscopiques. Les paramètres cinétiques obtenus sont utilisés pour estimer les durées de vie atmosphériques des espèces étudiées. Les résultats mécanistiques sont utilisés pour élaborer les mécanismes d’ozonolyse de ces composés. Toutes ces données permettent d’enrichir les bases de données cinétiques, mécanistiques et spectroscopiques qui alimentent les modèles atmosphériques. / Biogenic volatile organic compounds (BVOC) account for 90% of VOC emissions in the atmosphere. These VOCs can be removed from the atmosphere by reaction with photo-oxidants (OH, NO3, Cl and O3) as well as by photolysis. All these processes are governed by a chain mechanism whose carriers are mainly free radicals such as peroxy radicals RO2. Hence the importance of characterizing the reactivity of these species that play a key role in the atmospheric degradation of VOCs. In this context, this thesis focuses on the determination of the temperature dependent kinetic data as well as the mechanism of the ozonolysis reaction and the UV absorption spectra along the photolysis of six unsaturated oxygenated VOCs (trans- 2-pentenal, trans-2-hexenal, 2-methyl-2-pentenal, 1-penten-3-ol, cis-2-penten-1-ol and trans-3-hexen-1-ol). Likewise, the temperature dependent kinetic parameters of the reaction of three peroxy radicals (CH3OCH2O2, CH3C(O)CH2O2 et (CH3)2C(OH)CH2O2) with nitrate radicals were also determined. Three experimental setups coupled to treatment methods were used to extract these data: an atmospheric simulation chamber coupled to both a Fourier-transform infrared spectroscopy (FTIR) and a gas chromatography connected to a mass spectrometry (GC/MS), a device for measuring UV-Visible spectra and a laser photolysis coupled with UV-visible spectrometry and laser diode spectroscopy. The kinetic parameters were used to estimate the atmospheric lifetimes of the studied species. While the mechanistic data were used to establish their ozonolysis mechanisms. All the collected data enrich kinetic, mechanistic and spectroscopic databases, improving atmospheric models specially those involving VOCs.

Cette recherche visait à aborder l’effet des caractéristiques des eaux usées (c’est-à-dire les Co-contaminants, métaux lourds et pH) sur la réduction biologique du Séléniate (SeO42-), et évaluer l'intégration des processus et des configurations pour le traitement des eaux usées chargé de sélénium et de Co-contaminants.La première partie de l’étude portait sur l’effet des accepteurs de Co-électrons et le faible pH sur la bioremédiation du SeO42-, les études expérimentales a montré que le rapport molaire NO3- et SO42- à SeO42- a un facteur de contrôle en augmentant ou en diminuant l'efficacité de l'élimination du sélénium (Se). De plus, l'étude sur les interactions biofilm-Se a révélé la présence de NO3 ou de SO42- influence la spéciation Se, les niveaux de Se (Se0) biogénique et l'activité de la biomasse. Le fonctionnement du réacteur UASB (upflow anaerobic sludge blanket) avec une diminution progressive du pH influent de 7,0 à 5,5 a montré une performance d'élimination stable de NO3-, SO42 et SeO42- ,avant une diminution de 20% de l'élimination de tous ces composants à pH 5,0 En plus, le fonctionnement à long terme du réacteur UASB à pH 5.0 a l'enrichissement des familles Geobacteraceae et Spirochaetaceae, qui n'ont pas été détectés à pH> 5,0.La deuxième partie de l'étude a exploré l'efficacité de différentes techniques d'élimination pour le traitement de SeO42- avec des Co-contaminants. La comparaison des performances d’élimination SeO42- en présence de SO4-2 dans un filtre biotrickling (BTF) et un réacteur UASB a révélé que SO42- a largement influencé la croissance du biofilm attaché et l'élimination de SeO42-a augmentée de> 200%. D'autre part, l'élimination de SeO42- était similaire dans le réacteur UASB indépendamment de la présence ou de l'absence de SO42-. La caractérisation de la biomasse a révélé la formation de Se0 sphérique et de sulfure de poly-sélénium dans la biomasse des deux bioréacteurs. L'addition de Ni dans les deux bioréacteurs a entraîné une diminution des performances de suppression de SO42- et SeO42- de ~ 20-30%. L'élimination du Ni était> 80% dans les deux bioréacteurs. Ni a été éliminé par précipitation sous la forme de sulfure de nickel. L’évaluation du flux de processus pour l'élimination de SeO42- et SO42- a été effectuée en couplant la colonne d'échange d'ions (IX) et le bioréacteur UASB en utilisant soit un prétraitement (IX  UASB), soit un post-traitement (UASB  IX) pour le bioréacteur. Le schéma du processus de prétraitement a montré une meilleure efficacité d'élimination globale de 99% de SO42- et 94% de S totale atteignant <100 mg L-1 de SO42-, <0,3 mg L-1 de Se total et <0,02 mg L-1 de Se dissous dans l'effluent pendant 42 jours de fonctionnement continu / This research aimed at addressing the effect of wastewater characteristics (i.e. co-contaminants, heavy metals and pH) on the biological reduction of selenate (SeO42-) and evaluating process integration and configurations for selenium-laden wastewater treatment with co-contaminants. The first part of the study focused on the effect of co-electron acceptors and low pH on the bioremediation of SeO42-. Experiments showed that the molar ratio of NO3- and SO42- to SeO42- has a controlling factor in either increasing or decreasing the selenium (Se) removal efficiency. Additionally, study on biofilm-Se interactions revealed the presence of either NO3- or SO42- influences the Se speciation, biogenic Se (Se0) levels and biomass activity. Upflow anaerobic sludge blanket (UASB) reactor operation with a gradual decrease in the influent pH from 7.0 to 5.5 showed a stable removal performance of NO3-, SO42- and SeO42-, before a 20% decrease in removal of all these components was observed at pH 5.0. Furthermore, long-term operation of the UASB reactor at pH 5.0 showed the enrichment of Geobacteraceae and Spirochaetaceae families, which were not detected at pH > 5.0.The second part of the study explored the effectiveness of different removal techniques for the treatment of SeO42- with co-contaminants. Comparing the SeO42- removal performance in the presence of SO42- in a biotrickling filter (BTF) and UASB reactor revealed that SO42- largely influenced the attached biofilm growth and increased SeO42- removal by > 200%. On the other hand, SeO42- removal was similar in the UASB reactor irrespective of the presence or absence of SO42-. Biomass characterization revealed the formation of spherical Se0 and poly-selenium sulfide in the biomass of both bioreactors. Addition of Ni in both bioreactors led to a decrease in SO42- and SeO42- removal performance by ~20-30%. Ni removal was > 80% in both bioreactors. Ni was removed via nickel sulfide precipitation. Evaluation of integrated process system for SeO42- and SO42- removal was conducted by coupling an ion exchange column (IX) and UASB bioreactor, using IX as either a pre-treatment (IX  UASB) or post-treatment (UASB  IX) unit for the bioreactor. The pre-treatment process scheme showed a better overall removal efficiency of 99% SO42- and 94% total Se reaching < 100 mg L-1 SO42-, < 0.3 mg Se L-1 total Se and < 0.02 mg Se L-1 dissolved Se in the effluent over 42 days of continuous operation

Les plantes prélèvent l’azote nécessaire à leur croissance essentiellement sous forme de nitrate. Pour faire face aux fluctuations spatio-temporelles de la disponibilité de cet ion dans les sols, ces organismes ont développé des mécanismes d’adaptation spécifiques à chaque situation. La réponse de la plante à l’azote met en jeu plusieurs voies de signalisations qui dépendent des scénarios de variations en azote du milieu. Deux grandes voies de signalisation sont étudiées en particulier dans cette thèse. La Primary Nitrate Response (ou PNR) qui correspond aux réponses rapides (minutes) et nitrate-spécifiques de la plante lors de la fourniture de Nitrate. La Nitrogen Starvation response (ou NSR) qui correspond à la réponse plus lente (jours) qui permet de pallier au manque d’azote dans le milieu. Bien que certains acteur moléculaires soient connus dans chacune des voies (PNR et NSR); i) la NSR est largement moins bien documentée que la PNR, ii) rien n’est connu concernant la coordination des 2 voies de signalisations. Au cours de ma thèse j’ai pu démontrer qu’un sous groupe de la famille GARP induit lors de la PNR est directement impliqué dans la régulation de la NSR (répression des gènes de transport à haute affinité de nitrate). Ceci fournit à la fois des nouveaux régulateurs de la NSR et un mécanisme de coordination entre les 2 voies de signalisation. Les phénotypes des plantes altérées dans l’expression des gènes de cette famille de facteurs de transcription ouvrent des perspectives d’améliorations biotechnologiques des plantes car ces dernières présentent des capacités de transport du nitrate bien supérieures aux plantes sauvages.Des résultats quant à la double localisation sub-cellulaire d’HRS1 et du rôle d’HRS1 dans le contrôle du statut redox des plantes sont présentés et discutés dans le contexte du modèle d’interaction entre PNR et NSR proposé précédemment. / Plants take up the nitrogen necessary for their growth mainly in the form of nitrate. To cope with spatio-temporal fluctuations in NO3- availability in soils, these organisms have developed adaptation mechanisms specific to each situation. Plant N response involves several signaling pathways that depend on the N variation scenarios of the medium. Two major signaling pathways are studied in this thesis. The Primary Nitrate Response (or PNR) which corresponds to the rapid (within minutes) and nitrate-specific responses of the plant when provided with Nitrate. The Nitrogen Starvation response (or NSR) which corresponds to the slower response (within days) which makes it possible to overcome the lack of N in the medium. Although some molecular actors are known in each of the pathways (PNR and NSR); i) the NSR is significantly less well documented than the PNR, ii) nothing is known about the coordination of the 2 signaling pathways. During my thesis I was able to demonstrate that a subgroup of the GARP transcription factor family induced during PNR is directly involved in the regulation of NSR (repression of transport genes with a very high nitrate affinity). This provides both new NSR regulators and a coordination mechanism between the 2 signaling pathways. The phenotypes recorded for plants altered in this transcription factors family open up perspectives for crop biotechnological improvements because they have nitrate transport capacities far superior to wild plants.Results regarding the subcellular dual localization of HRS1 and the role of HRS1 in controlling the redox status of plants are presented and discussed in the context of the previously proposed PNR-NSR interaction model.

Dans les cellules végétales, les canaux et les transporteurs anioniques sont essentiels pour les fonctions clés telles que la nutrition, l'homéostasie ionique et la tolérance aux stress biotiques ou abiotiques. Chez Arabidopsis thaliana, les membres de la famille CLC (pour ChLoride Channel), situés sur le tonoplaste, sont requis pour l'homéostasie du nitrate (AtCLCa et AtCLCb) ou impliqués dans la tolérance au sel (AtCLCc).Dans mon travail de thèse, j’ai identifié et caractérisé un canal chlorure, AtCLCg, chez A. thaliana. L'étude de la protéine fusion AtCLCg::GFP a révélé que cette protéine est localisée sur le tonoplaste. Deux lignés mutants indépendants d’insertion ADN-T, atclcg ont été sélectionnés. Les études physiologiques sur ces deux lignés ont démontré qu’AtCLCg joue un rôle dans le passage de chlorure mais pas dans l'homéostasie du nitrate au travers du tonoplaste. En effet, aucune différence de contenu en nitrate (NO3-) racinaire et foliaire n’a été observée entre le sauvage et les mutants dans nos conditions. Par contre, les plantes mutantes présentent un phénotype par rapport au sauvage lorsqu'elles se développent sur milieu de croissance contenant 75 mM NaCl: (i) une diminution de 20% de la masse fraîche ; (ii) une diminution de 16% de la longueur de racines primaires et une réduction de 19% du nombre de racines secondaires ; (iii) une sur-accumulation de 21% et 26% de chlorure et sulfate foliaire, respectivement. Ces phénotypes sont abolis chez les lignés complétées avec 35S::AtCLCg. De plus, les mutants atclcg présentent un phénotype similaire à la présence de 75 mM KCl, mais aucune différence n'est détectée en réponse à 140 mM mannitol. Ce résultat suggère que le phénotype d'hypersensibilité des mutants atclcg dépend du chlorure et non du l'effet osmotique du stress salin.Sachant qu’AtCLCg et AtCLCc partagent un haut degré d'homologie, environ 75% d'identité au niveau des protéines, et que les deux sont impliquées dans la réponse au stress salin de la plante, nous avons généré le double mutant atclcc/atclcg. L’analyse phénotypique a montré que le double mutant ne présente pas un phénotype additif sur milieu de stress 75 mM NaCl. En parallèle, l'analyse de l'expression des gènes a montré qu’AtCLCg est réprimé dans le fond mutant atclcc, et inversement. Par ailleurs, l'analyse de l'expression de gène rapporteur démontre que PAtCLCg::GUS est fortement exprimé dans les cellules du mésophylle alors qu’une forte expression de PAtCLCc::GUS dans les cellules de garde et le pollen est observé. Ainsi, l’ensemble de ces résultats montrent que ces deux protéines AtCLCc et AtCLCg sont impliquées dans la réponse au stress salin de la plante, mais elles n’ont pas de fonction redondante. / In plant cells, anion channels and transporters are essential for key functions such as nutrition, ion homeostasis and, resistance to biotic or abiotic stresses. In Arabidopsis thaliana, members of the ChLoride Channel (CLC) family located on the tonoplast have been shown to be required for nitrate homeostasis (AtCLCa, AtCLCb) or involved in salt tolerance (AtCLCc). In this study, we identified and characterized the chloride channel AtCLCg in A. thaliana. Use of an AtCLCg:GFP fusion revealed the localization of this protein on the tonoplast. Studies on the disruption of the AtCLCg gene by a T-DNA insertion in two independent lines demonstrated that AtCLCg is involved in response to salt stress and not in nitrate homeostasis in our conditions. Although no difference in shoot and root NO3- content is observed, mutant plants show a phenotype compared to wild-type when they are grown on 75 mM NaCl: (i) a decrease by 20% of total plant fresh weight; (ii) a diminution by 16% of primary root length and a reduction by 19% of secondary root number; (iii) an over-accumulation of chloride and sulfate in shoots by 21% and 26% respectively. These phenotypes are abolished in complemented lines with 35S::AtCLCg. atclcg mutants show a similar phenotype in the presence of 75 mM KCl, but no difference is detected in response to 140 mM mannitol. This result suggests that the hypersensitivity phenotype of atclcg mutant depends on the ionic component and not on osmotic effect of salt stress.Knowing that AtCLCg and AtCLCc share a high degree of homology, approximately 75% of identity at protein level, and both are involved in response to salt stress, we generated a clcc/clcg double mutant. Phenotypic analysis showed that the two KO mutations do not have additive effect under salt stress of 75 mM NaCl. In parallel, gene expression analysis showed that AtCLCg is repressed in the clcc mutant background, and conversely. Expression analysis of reporter gene displayed a different pattern for PAtCLCg::GUS, strongly expressed in mesophyll cells, compared with a strong expression of PAtCLCc::GUS in guard cells and pollen. Altogether these results demonstrate that both AtCLCc and AtCLCg are involved in response to salt stress but they are not functionally redundant.

Les plantes sont capables de percevoir dans leur environnement la disponibilité en nitrate (NO3-), un macro-nutriment essentiel. Chez Arabidopsis thaliana, le transporteur de NO3- NRT1.1 constitue un système de perception qui active de nombreuses réponses au NO3-, notamment la régulation de l'expression de gènes et le développement des racines latérales. Dans ce dernier cas, un mécanisme de transduction du signal a été proposé. Celui-ci met en jeu une activité de transport d'auxine par NRT1.1 qui est inhibée par le NO3-. Cependant, le(s) mécanisme(s) moléculaire(s) permettant à NRT1.1 de contrôler un large panel de réponses au NO3- reste(nt) largement inconnu(s). L'objectif de ce travail était donc d'approfondir nos connaissances sur les voies de signalisation du NO3- dépendantes de NRT1.1. Grâce à l'analyse de mutants et de lignées transgéniques exprimant des versions de NRT1.1 présentant des mutations ponctuelles, nous avons pu découpler certaines des réponses NRT1.1-dépendantes et montré que cette protéine peut percevoir/transduire le signal NO3- au travers d'au moins trois mécanismes distincts, possédant des bases structurales différentes au sein de la protéine. D'autre part, ce travail a permis de valider l'hypothèse selon laquelle NRT1.1, en intervenant comme transporteur d'auxine, contrôle directement le développement des racines latérales, et ce indépendamment des autres transporteurs d'auxine qui y sont exprimés. Enfin, nous avons montré qu'en plus de sa régulation transcriptionnelle déjà connue, NRT1.1 est soumis à une puissante et complexe régulation post-transcriptionnelle. En effet, le transcrit NRT1.1 est stabilisé en présence de NO3- dans la racine alors que l'accumulation de la protéine NRT1.1 est réprimée par le NO3- spécifiquement au niveau des primordia de racines latérales. Les résultats obtenus au cours de ce travail ont permis d'élaborer un modèle cohérent du rôle de signalisation joué par NRT1.1, et ouvrent de nombreuses perspectives pour comprendre comment, chez les plantes, un « transcepteur » (transporteur/senseur) peut contrôler une vaste gamme de réponses adaptatives aux facteurs de l'environnement. / Plants are able to sense the external availability of nitrate (NO3-), a major macro-nutrient. In Arabidopsis thaliana, the NO3- transporter NRT1.1 acts as a sensor that triggers many different adaptive responses, including the regulation of gene expression and lateral root development. In the latter case, a transduction mechanism that involves a NO3--inhibited auxin transport activity dependent of NRT1 has been proposed. However, the molecular mechanism(s) allowing NRT1.1 to control such a large palette of NO3- responses is still largely unknown. Thus the aim of this work was to better understand and characterize the NRT1.1-dependent NO3- signaling pathway(s). Using mutants and transgenic lines expressing point mutated forms of NRT1.1, we uncoupled several of the NRT1.1-dependent responses and thus demonstrated that NR1.1 can sense/transduce NO3- signal through at least three distinct mechanisms at the protein level. This work also largely confirmed the hypothesis that NRT1.1 directly controls lateral root development through its auxin transport activity regardless of the other auxin transporters expressed in lateral root primordia. Finally, we showed that, besides the already well characterized transcriptional NO3--dependent regulation of NRT1.1, this gene is also subjected to complex post-transcriptional regulations. Indeed, on the one hand, NRT1.1 mRNA is stabilized by NO3- in roots whereas, on the other hand, protein accumulation is specifically repressed by NO3- in lateral root primordia. Altogether, these results allowed us to build a comprehensive model of the complex NRT1.1 signaling and open many perspectives to understand how plant “transceptors” (transporter/sensor) can monitor a large variety of adaptive responses to environmental factors.

Os ritmos circadianos coordenam grande parte dos mecanismos fisiológicos, principalmente no metabolismo do nitrogênio, inclusive a assimilação do nitrato, que é a forma de nitrogênio mais incorporada pelos organismos fotossintéticos marinhos. Sua assimilação é feita pela enzima nitrato redutase (NR) que é regulada de forma sistêmica e em vários níveis: transcricional, pós-transcricional e pós-traducional. Tal modulação é exercida por diversos fatores como nitrato, luz, glutamato, quinases e por fatores de transcrição centrais do ritmo circadiano. A fotossíntese fornece os esqueletos de carbono e poder redutor para a incorporação do nitrogênio na síntese de glutamato. Gracilaria birdiae é uma macroalga endêmica do litoral brasileiro e ainda precisa de mais estudos em fisiologia, apesar da sua grande importância econômica. Este estudo desenvolveu um novo protocolo para o ensaio em larga escala da atividade enzimática da NR e analisou a oscilação do desempenho fotossintético ao longo do dia em G. birdiae. A alga, proveniente do Rio Grande do Norte, foi isolada a nível unialgal e apresentou uma taxa de crescimento relativo diário de 6,5% em laboratório. O novo protocolo descrito propõe as seguintes adaptações: amostragem de 20 mg de biomassa algal em vez de 100 mg, extrato bruto com 100 &#181;L em vez de 1 mL, ensaio enzimático de 50 &#181;L e parada da reação com sulfanilamida em vez de EtOH/ZnSO4. Estas modificações permitem o ensaio enzimático da NR semi-purificada de 8 testes com réplicas experimentais e biológicas e controle negativo (96 ensaios no total) em 3 horas. A caracterização enzimática demonstrou os seguintes parâmetros ótimos para atividade máxima: tampão fosfato pH 8, temperatura 25°C, 60 minutos de incubação, 1,25 mMol de nitrato e 50 &#181;Mol de NADH. A atividade máxima de 5,4 ± 0,7 nMol.min-1.mg-1 de proteínas e o KM 6 ± 2,2 &#181;Mol.L-1 para NADH e de 109 ± 11 &#181;Mol.L-1 para o nitrato. A enzima não apresentou atividade na presença de NADPH e demonstrou atividade 48 vezes maior que no protocolo inicial. Descrevemos um método preciso e reprodutível para análise em larga escala da atividade da NR que pode ser utilizado em estudos comparativos de cinética enzimática da NR de diferentes espécies ou em estudos de ritmos biológicos. A análise do desempenho fotossintético, feita em coletas de 15 mg de alga, foi caracterizada pela fluorescência da clorofila, demonstrando os seguintes parâmetros máximos: taxa de transporte de elétrons relativa (rETR) de 15,29 &#181;Mol elétrons.m-2.s-1, eficiência fotossintética (alfa) de 0,37 fótons/elétrons, irradiância de saturação (IK) foi de 41,32 &#181;E.m-2.s-1 e houve fotoinibição a partir de 300 &#181;E.m-2.s-1. Apenas o parâmetro alfa apresentou oscilação significativa em claro constante e manteve o período de 24 horas, apesar de ter diminuído sua amplitude em 50%. Isso pode ser devido a um controle pelo mecanismo central dos ritmos circadianos sobre proteínas ou pigmentos ligados ao fotossistema II, influenciando na capacidade de transformação de fótons em elétrons. Paralelamente, a aclimatação da alga à luz constante pode ter levado a uma queda na produção de pigmentos e fotoxidação, justificando a queda nos valores médios de alfa. G. birdiae é uma alga com grande importância econômica e ecológica e este estudo, ligado a outros trabalhos de fisiologia, confirma seu grande potencial para estabelecimento como organismo modelo para estudos fisiologia e fotossíntese / Circadian rhythms control most of physiological processes, including nitrate assimilation. This nutrient is the most incorporated form of nitrogen by marine plants and its assimilation is made by the nitrate reductase enzyme (NR) that is highly regulated in all levels expression, since mRNA transcription until protein degradation. Many factors coordinate this regulation, including the nitrate itself, light glutamate, kinases and by transcription factors of the central oscillator of the circadian rhythms. Photosynthesis also plays an especial role in NR regulation through carbon skeleton and NADPH synthesis that allows the last step of nitrate assimilation: glutamate synthesis. Gracilaria birdiae is an endemic marine rhodophyte from Brazil that still lacks physiological and molecular studies despite its extensively exploitation for agar-agar extraction. This study aimed the development of a large scale enzymatic assay of NR (NRA) and the analysis of daily oscillation of photosynthesis performance for G. birdiae. The algae, collected ant Rio Grande do Norte state, was isolated to a unialgal level and presented an average of relative daily growth rate of 6.5% in laboratory. The new protocol here described proposes the following adaptations for NRA: sampling of 20 mg instead of 100 mg, 100 &#181;L of crude extract rather than 1 mL, NRA in 50 &#181;L in place of 1 mL and reaction stop with sulphanilamide instead of an EtOH/ZnSO4 system. These changes allow the assay of the semi-purified NR of 24 samples all with its experimental and biological triplicates and negative control in 3 hours. Phosphate buffer at pH 8, 25°C, 60 minutes of incubation, 1.25 mMol of nitrate and 50 &#181;Mol of NADH. The maximum activity was 5.4 ± 0.7 nMol.min-1.mg-1 of protein and a KM of 6 ± 2.2 &#181;Mol.L-1 for NADH and of 109 ± 11 &#181;Mol.L-1 for nitrate. NR didn\'t show any activity in the presence of only NADPH as the electron donor and showed and 48 times greater activity in the new protocol, compared to the old one. We describe here an accurate and reproducible method for large scale NRA that can be used in comparative studies of NR kinetics or in biological rhythms of NR. The analysis of photosynthetic performance, made in 15 mg sampling of algal biomass, was characterized through chlorophyll fluorescence, revealing the maximum values of these parameters: relative electrons transfer rate (rETR) of 15,29 &#181;Mol elétrons.m-2.s-1, photosynthetic efficiency (the alpha parameter) of 0,37 photons/electrons, the saturating irradiance (IK) was 41.32 &#181;E.m-2.s-1 and there was photoinhibition below the irradiance of 300 &#181;E.m-2.s-1. The only variable that oscillated during the continuous light experiment and maintained the 24-hour period was the Alfa parameter, besides its 50% lower amplitude. This oscillation can be due to an endogenous control of the central circadian oscillator into proteins or pigments bound to the photosystem II, influencing the capacity of photon-electron transformation. At the same time, the acclimation to constant light could have driven the algae to a damping of pigment production and photoxidation, what explains the fall of alpha average values. G. birdiae is an alga with great economic and ecological relevance and this study confirms the potential for its establishment as a model organism.

La respiration est un processus fondamental qui doit être optimisé en réponse aux besoins cellulaires et aux conditions environnementales. Il a été démontré que la localisation subcellulaire dynamique du complexe nitrate réductase (NR) chez la bactérie E. coli est un moyen efficace de contrôler le flux d’électrons au cours la respiration nitrate.Pendant ma thèse, deux questions ont été posées : (i) Quels sont les facteurs moléculaires impliqués dans le mécanisme de localisation de la nitrate réductase ? (ii) Comment rendre compte de l’augmentation du flux d’électron dans la chaîne respiratoire lorsque le complexe est localisé aux pôles de la cellule ?Dans un premier temps, j’ai développé un crible génétique visant à identifier le ou les facteurs impliqués dans l’organisation spatiale de la nitrate réductase. En parallèle, j’ai mis en place une approche d’immunoprécipitation visant à identifier des protéines en interaction avec la NR lorsque celle-ci est localisée aux pôles. Cette approche associée à des expériences de microscopie à fluorescence nous ont permis de démontrer le regroupement de la formiate déshydrogénase FdnGHI avec la NR en condition de respiration nitrate expliquant l’importance de l’organisation spatiale de la NR pour l’efficacité de la chaîne respiratoire. Dans cet interactome, nous avons également identifié des acteurs impliqués dans l’homéostasie du NO qui est une molécule toxique dont la production est associée à l’optimisation de la respiration nitrate. Ainsi, le regroupement d’acteurs impliqués dans la chaîne de transfert d’électrons et dans l’homéostasie du NO semble être la clef du maintien de l’équilibre efficacité et toxicité. / Respiration is a fundamental process that must be optimized in response to metabolic demand and environmental changes. It has recently been demonstrated that dynamic subcellular localization of the respiratory complex nitrate reductase in E. coli is an efficient mean to control the electron flux during nitrate respiration, known to be crucial for gut colonization by enterobacteria when inflammation occurs.During my PhD, I focused on two key questions: (i) What are the molecular factors involved in the localization mechanism of nitrate reductase? (ii) How to account for the increase of the electron flux in the respiratory chain when the complex is localized at the cell poles? First, I designed a genetic screen aiming at identifying the underlying factor(s) involved in the spatial organization of nitrate reductase. Concomitantly, I implemented an immunoprecipitation approach to identify protein interacting with nitrate reductase when localized at the poles. Using this approach and fluorescence microscopy, we demonstrated the clustering of formate dehydrogenase FdnGHI and nitrate reductase at the poles under nitrate respiring condition. These data provide a mechanistic explanation on the importance of subcellular organization towards nitrate respiration efficiency. In this specific interactome of nitrate respiring condition, we also identified factors involved in NO homeostasis, a toxic compound resulting from the maximization of nitrate respiration. Hence, the clustering of actors involved in electron transfer and NO homeostasis seems to be the key to maintain the balance between maximizing electron flux and the resulting toxicity.

Water resources management is now recognized as a multidisciplinary task that has to be performed in an integrated way, within the natural boundaries of the hydrological basin or of the aquifers. Policy makers and water managers express a need to have tools able at this regional scale to help in the management of the water resources. Until now, few methodologies and tools were available to assess and model the fate of diffuse contaminants in groundwater at the regional scale. In this context, the objective of this research was to develop a pragmatic tool to assess and to model groundwater flow and solute transport at the regional scale. A general methodology including the acquisition and the management of data and a new flexible numerical approach was developed. This numerical approach called Hybrid Finite Element Mixing Cell (HFEMC) was implemented in the SUFT3D simulator developed by the Hydrogeology Group of the University of Liège. A first application of this methodology was performed on the Geer basin. The chalk aquifer of the Geer basin is an important resource of groundwater for the city of Liège and its suburbs. The quality of this groundwater resource is threatened by diffuse nitrate contamination mostly resulting from agricultural practices. New field investigations were performed in the basin to better understand the spatial distribution of the nitrate contamination. Samples were taken for environmental tracers (tritium, CFCs and SF6) analysis. The spatial distribution of environmental tracers concentrations is in concordance with the spatial distribution of nitrates. This allows proposing a coherent interpretative schema of the groundwater flow and solute transport at the regional scale. These new data and the results of a statistical nitrate trend analysis were used to calibrate the groundwater model developed with the HFEMC approach. This groundwater flow and solute transport model was used to forecast the evolution of nitrate concentrations in groundwater under a realistic scenario of nitrate input for the period 2008-2058. According to the modelling results, upward nitrate trends observed in the basin will not be reversed for 2015 as prescribed by the EU Water Framework Directive. The regional scale groundwater solute transport model was subsequently used to compute nitrate concentrations in groundwater under different scenarios of nitrate input to feed a socio-economic analysis performed by BRGM. These computed concentrations were used to assess the benefit, for the users, linked to the reduction of contamination resulting from the changes in nitrate input. These benefits were compared to the costs associated to the implementation of the considered agri-environmental schemes that allow reducing the nitrate input to groundwater.

Thesis (M. Sc.)--Carleton University, 2001. / Includes bibliographical references (p. 84-90). Also available in electronic format on the Internet.