Thèse (M.Sc.)--Université Laval, 2007. / Bibliogr.: f. 118-127. Publié aussi en version électronique dans la Collection Mémoires et thèses électroniques.

Thèse (Ph. D.)--Université Laval, 2007. / Titre de l'écran-titre (visionné le 9 mai 2008). Bibliogr.

Thèse (M.Sc.)--Université Laval, 2005. / Titre de l'écran-titre (visionné le 28 novembre 2005). Bibliogr.

L'oxyde nitrique (NO), un important messager biologique, est biosynthétisé par une hémoprotéine nommée Oxyde Nitrique Synthase (NOS). Il est produit par une réaction d'oxydation du groupement guanidino de la L-arginine en Nm -hydroxy-L-arginine, qui est ensuite elle-même oxydée en NO et en L-citrulline. Chez les mammifères, deux types de complexes oxygénés formés durant la catalyse par les NOS ont été identifiés: hème-oxy 1 (Bande de Soret centrée à 420 nm) et hème-oxy 2 (Bande de Soret centrée à 430 nm). On sait que hème-oxy 2 possède un caractère ferrique superoxyde (Fe -O2"), puisqu'il a déjà été caractérisé en spectroscopie de résonance Raman. Cependant, peu d'informations sont connues sur le complexe hème-oxy 1. Dans le but de caractériser la nature de complexe hème-oxy 1 ansi que certains intermédiaires impliqués dans le mécanisme de catalyse des NOS, ce dernier a été l'objet d'études en spectroscopie de résonance Raman.

L’obésité est une pathologie complexe d’origine multifactorielle qui constitue un facteur de risque indépendant de maladies métaboliques dont le diabète de type 2. L’inflammation chronique qui accompagne l’obésité semble d’ailleurs contribuer au développement de la résistance à l’insuline. Ainsi, il a été montré que l’induction de iNOS, enzyme importante lors des réponses immunitaires, dans les tissus et cellules cibles de l’insuline était impliquée dans la pathogenèse de la résistance à l’insuline associée à l’obésité. Les résultats présentés dans cet ouvrage permettent d’approfondir les connaissances concernant l’implication de cette enzyme dans les troubles métaboliques ainsi que d’identifier des cibles cellulaires potentielles pouvant servir à contrecarrer les effets délétères associés à celle-ci. Dans la première étude, nous avons observé que le resvératrol pouvait inhiber l’induction de iNOS et la production de NO dans le muscle et le tissu adipeux des souris traitées avec l’endotoxine LPS. Ces effets ont été reproduits dans des modèles in vitro. Nous avons pu également déterminer que l’inhibition de iNOS par le resvératrol impliquait l’activation de la voie de l’AMPK plutôt que celle de SIRT1 dans les cellules musculaires. Dans la deuxième étude, nous avons généré des souris MYOnos2-KO, HEPnos2-KO et ADPnos2-KO, modèles dans lesquels l’expression de iNOS est invalidée spécifiquement dans les myocytes striés, les hépatocytes et les adipocytes respectivement. Nous avons pu remarquer que l’invalidation de iNOS dans les myocytes, les hépatocytes et les adipocytes ne semble pas suffire à contrer les effets délétères d’une diète obésogène sur la sensibilité à l’insuline ou la tolérance au glucose. Par contre, l’invalidation de iNOS dans les adipocytes semble améliorer le métabolisme lipidique. Finalement, dans notre troisième étude, nous avons pu démontrer que iNOS pouvait être induite dans des cellules adipeuses d’origine humaine et que l’expression de cette enzyme, dans le tissu adipeux, corrélait négativement avec les niveaux d’adiponectine plasmatique chez les sujets de la cohorte étudiée. L’ensemble de nos études nous permet de proposer des cibles plus spécifiques visant l’inhibition de iNOS ainsi que de contribuer à la compréhension du rôle potentiel de cette protéine dans le développement des troubles métaboliques chez l’homme. / Obesity is a complex pathology, with a multifactorial origin, as well as an independent risk factor for metabolic diseases such as type 2 diabetes. It has been suggested that obesity-associated chronic inflammation contributes to the development of insulin resistance. It has been shown that iNOS, an important enzyme involved in immune responses, has been implicated in the pathogenesis of obesity-associated insulin resistance. Results presented here contribute to better understand the implication of this enzyme in metabolic disorders and thus identify potential cellular targets that might counteract deleterious effects associated with its induction. In the first study, resveratrol was shown to inhibit iNOS induction as well as NO production in muscle and adipose tissue of LPS-treated mice. These effects were recapitulated in vitro. We have also demonstrated that iNOS inhibition by resveratrol involves AMPK but not SIRT1 activation in muscle cells. In the second study, we generated MYO-nos2-KO, HEPnos2-KO and ADPnos2-KO mice, where iNOS expression was specifically invalidated in myocytes, hepatocytes and adipocytes respectively. We have observed that iNOS deletion in myocytes, hepatocytes and adipocytes was not sufficient to counteract obesogenic-diet deleterious effects on insulin sensitivity and glucose tolerance. However, iNOS specific deletion in adipocytes seems to improve lipid metabolism. In our third chapter, we have shown that iNOS could be induced in adipose cells of human origin and that its expression in adipose tissue, was negatively correlated with plasma adiponectin levels of the subjects of the study. Overall, our results allow us to propose more specific targets where iNOS inhibition might be beneficial. Likewise, the results presented here contribute to the understanding of the potential role of this protein in the development of human metabolic disorders.

La résistance à l'insuline est un désordre métabolique précoce dans le développement de l'obésité et du diabète de type 2. Plusieurs évidences suggèrent que la surproduction de monoxyde d'azote (NO) via l'induction de la synthase du monoxyde d'azote inductible (iNOS) dans les principaux organes cibles de l'insuline conduit à un état de résistance à l'insuline. De plus, des études récentes ont montré que l'invalidation génétique de iNOS chez des souris obèses prévient l'apparition de la résistance à l'insuline au niveau systémique et périphérique. Plusieurs agents thérapeutiques sont présentement disponibles en clinique pour traiter la résistance à l'insuline reliée à l'obésité et au diabète de type 2, mais aucun d'entre eux ne cible spécifiquement la voie de iNOS et du NO. Dans notre première étude, nous avons trouvé que l'inhibition pharmacologique et sélective de iNOS avec le 1400W améliore l'action de l'insuline après seulement 4 jours de traitement chez des souris db/db génétiquement obèses et diabétiques. L'effet bénéfique du 1400W était associé avec la diminution de l'hyperglycémie à jeun et du stress nitrosatif déterminé par la diminution du niveau de 3-nitrotyrosine dans le muscle. Cependant, l'effet sensibilisateur du 1400W sur l'action de l'insuline était transitoire puisque aucun effet n'a pu être observé après 10 jours de traitement. Lors de notre deuxième étude, nous avons montré que l'invalidation génétique de iNOS chez des souris obèses augmente les effets métaboliques de la rosiglitazone, un agoniste des PPARy utilisé en clinique dans le traitement de la résistance à l'insuline reliée à l'obésité et au diabète de type 2. Nous avons entre autres observé une efficacité supérieure de la rosiglitazone à améliorer la tolérance au glucose et à améliorer le défaut d'activation de la voie Akt par l'insuline dans le foie chez les souris iNOS-/- obèses. Ces effets étaient associés avec une augmentation du niveau plasmatique des gros complexes de l'adiponectine (HMW) ainsi que l'activation de la voie de l'AMPK dans les principaux tissus cibles de l'insuline. Finalement, dans notre troisième étude, nous avons démontré que le resvératrol, un composé naturel contenu dans le raisin, diminue l'induction de iNOS et du NO induite par les cytokines dans les cellules musculaires et les adipocytes en culture. Chez la souris, l'expression de iNOS induite par l'endotoxine LPS a été inhibée par le resvératrol dans le muscle et le tissu adipeux, ce qui était associé avec une diminution de l'accumulation des dérivés du NO dans ces tissus. Cependant, aucun effet du resvératrol sur l'expression de iNOS et la production de NO n'a pu être observé dans le foie des souris LPS. Ensemble, les résultats de nos études suggèrent que l'inhibition pharmacologique de iNOS représente une nouvelle stratégie prometteuse à développer dans la gestion du traitement de la résistance à l'insuline reliée à l'obésité et au diabète de type 2.

Le travail présenté dans ce manuscrit concerne le développement d’inhibiteurs sélectifs de NO Synthases, des enzymes qui catalysent la formation du monoxyde d’azote (NO) à partir de l’arginine. Trois isoformes ont été identifiées, la NOS neuronale (nNOS), la NOS endothéliale (eNOS) et la NOS inductible (iNOS). Une surproduction de NO dans l’organisme, notamment par la iNOS ou la nNOS, est impliquée dans différentes maladies, tel que le choc septique, l’arthrite, des maladies neurodégénératives ou encore certains cancers. L’inhibition des NOSs apparait donc une approche intéressante dans le traitement de ces maladies. Cependant, cette inhibition doit être sélective pour ne pas interférer avec les fonctions physiologiques des autres isoformes.Les composés synthétisés sont constitués d’une partie analogue du substrat de type S-Ethyl-Isothiocitrulline munie d’une extension sensée interagir dans le canal d’accès du substrat où la conservation entre les trois isoformes est plus faible que dans le site de liaison du substrat. Ces deux parties sont reliées par un lien qui peut être de type amide ou hétérocyclique. Ces composés sont obtenus grâce à une stratégie de synthèse en phase solide via un ancrage par la chaîne latérale, qui permet la synthèse rapide de bibliothèques de composés. Notre premier travail a été de tenter d’optimiser deux inhibiteurs sélectionnés de travaux antérieurs, l’un plutôt sélectif de la iNOS et l’autre de la nNOS. Pour cela, nous avons choisi certaines modifications selon une approche aléatoire. Mais nous avons également entamé une approche plus rationnelle en développant un protocole de docking, basé sur des structures de NOSs issues de la Protein Data Bank et destiné à prédire le mode de liaison des inhibiteurs dans le site actif des enzymes. Nous avons également développé de nouvelles séries de composés. En particulier, nous avons mis au point la synthèse sur support d’analogues où le carbone alpha de l’analogue de substrat est remplacé par un azote (composés de type aza). Nous avons aussi tenté la synthèse en solution de nouveaux analogues du substrat séléniés.Enfin, grâce au modèle de docking, un criblage virtuel de molécules issues de deux bases de données dont celle de la Chimiothèque Nationale a été effectué pour découvrir de nouvelles structures avec un potentiel pouvoir inhibiteur. Nous présentons donc dans ce document la conception et la synthèse de nouvelles séries d’inhibiteurs de NOSs, l’élaboration d’un protocole de docking pour apporter une approche plus rationnelle, et enfin l’évaluation des composés sur les trois enzymes recombinantes et, pour certains, sur deux lignées cellulaires productrices de NO. / This work is focused on the development of selective NO Synthases inhibitors, enzymes, which catalyse the production of nitric oxide (NO) from arginine. Three isoforms have been identified, the. neuronal NOS (nNOS), the endothelial NOS (eNOS) and the inducible NOS (iNOS). An overproduction of NO, in particular by iNOS or nNOS, is involved in many diseases such as septic shock, arthritis, neurodegenerative diseases or some cancers. Therefore, NOS inhibition looks very interesting to treat those diseases. However, this inhibition has to be selective of one isoform to not interfere with the physiological functions of the two others.The synthetic compounds are constituted of both an S-Ethyl-Isothiocitrulline as substrate analogue and an extension expected to interact into the substrate access channel, a less conserved region between the three isoforms compared to the substrate binding site. These two parts are joined together by a peptide bond or a heterocyclic link. These molecules have been obtained thanks to a solid-phase strategy through a side chain anchoring approach. This protocol allows the rapid synthesis of compound libraries. In a first work, we attempted to optimize two inhibitors selected from previous studies. One is rather selective of iNOS and the other to nNOS. We chose some modifications in a random fashion. But we also started a more rational approach by developing a docking protocol, based on NOS structures from the Protein Data Bank and designed to predict the binding mode of the inhibitors in the enzyme active sites.We also prepared new series of compounds. In particular, we developed the solid phase synthesis of derivatives where the alpha carbon of the substrate analogue is replaced by a nitrogen (aza-type compounds).. We also attempted the solution synthesis of new substrate analogues containing selenium.Finally, thanks to the docking model, we performed a virtual screening of molecules from two data bases including the Chimiothèque Nationale, to discover new structures with potential inhibitory activity.Therefore, we present in this manuscript the design and synthesis of new series of NOS inhibitors, the development of a docking protocol to provide a more rational approach, and finally the evaluation of compounds on the three recombinant isoforms and, for some, on two cell lines producing NO.

Thèse (M.Sc.)--Université Laval, 2006. / Titre de l'écran-titre (visionné le 28 mars 2007). Bibliogr.

Tableau d'honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2005-2006 / L'hypertension artérielle (HTA) associée à l'insuffisance rénale chronique (IRC) est une cause importante de morbidité-mortalité chez les patients dialysés. La physiopathologie de cette HTA est encore imprécise et implique un ensemble de désordres hémodynamiques incluant une expansion volémique et un changement de l'activité du système nerveux autonome et du système rénine-angiotensine. La dysfonction endothéliale constitue un facteur majeur de maintien et de progression de cette HTA. La diminution de la relâche endothéliale du monoxyde d'azote (NO) apparaît comme l'un des déterminants les plus importants de cette dysfonction endothéliale. En plus d'avoir un puissant effet vasodilatateur, le NO inhibe la production d'endothéline-1 (ET-1), module le taux de filtration glomérulaire (GFR) et est impliqué dans le processus de stress oxydatif. Cette étude vise à déterminer l'effet de la surexpression de l'enzyme NO synthase endothéliale (eNOS) sur la progression de l'HTA et de l'IRC chez le rat urémique. Un adénovirus codant pour la eNOS est administré par voie intraveineuse à des rats en urémie induite par néphrectomie sub-totale 5/6. Le transfert du gène est observé uniquement dans l'endothélium des vaisseaux. Après quatre semaines de suivi, le traitement avec l'AdeNOS/GFP a freiné l'élévation de la pression artérielle systolique (PAS), préservé la fonction rénale et prévenu l'apparition des dommages tissulaires rénaux. Ces effets protecteurs sont associés à une augmentation de la concentration circulante et urinaire de nitrites et de nitrates (NO2-/NO3-) indiquant une augmentation de la relâche de NO. Ainsi, la surexpression de la eNOS entraîne une augmentation de la biodisponibilité du NO et atténue le développement de l'HTA chez le rat urémique en plus de ralentir la progression de l'IRC, probablement en prévenant la dysfonction endothéliale.

Lors d'une infection, la principale voie d'activation du macrophage passe par l'IFNY . Par conséquent, la connaissance des événements qui surviennent préalablement à l'activation du macrophage revêt un intérêt certain. Cette thèse s'est donc intéressée à l'effet de l'infection par le parasite protozoaire intracellulaire Trypanosoma cruzi sur deux fonctions IFN-Y -dépendantes du macrophage murin: la production d'oxyde nitrique et la synthèse de la machinerie de présentation antigénique restreinte au CMH de classe I. Les résultats obtenus démontrent que l'infection préalable du parasite pré-active le macrophage à produire de l'oxyde nitrique en réponse à l'IFN-y à des niveaux nettement supérieurs de ceux atteints par le macrophage uniquement stimulé à l'IFN-Y • Cette pré-activation résulte de l'engagement par le parasite des voies NF-KB, Erkl/Erk2 et SAPK/JNK. L'activation subséquente de la voie Jak/STAT par l'IFN-y induit la translocation au noyau de STATla et à la transcription d'un ARNm stable d'iNOS. Une dégradation ralentie de l'ARNm d'iNOS mène à des niveaux élevés de protéine iNOS et d'oxyde nitrique. La stabilité de l'ARNm d'iNOS résulte de l'activation des voies Erkl/Erk2 et SAPK/JNK par le parasite, alors que le facteur de transcription NF-KB favorise probablement une expression maximale d'iNOS. Les résultats présentés dans cette thèse montrent également que l'infection préalable du macrophage par T. cruzi réduit l'expression IFN-Y -dépendante du CMH de classe I et des immuno-sous-unités du protéasome, que cette diminution est due à l'activation de c-Jun suite à l'inhibition des phosphatases murines qui, en retour, est une conséquence des radicaux libres d'oxygène générés par le macrophage en réponse au contact de T. cruzi. Bien que ces résultats soient intéressant en soi, l'ensemble des travaux présentés dans cette thèse vont quelque peu au-delà des objectifs initiaux, en faisant ressortir le rôle essentiel que semble jouer la voie de signalisation SAPK/JNK dans la modulation des fonctions IFN-y -dépendantes du macrophage.