Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Les herpèsvirus humains 6A/B (HHV-6A/B) sont deux virus ubiquitaires à l'échelle planétaire qui partagent 94% d'identité entre eux. Ces virus persistent tout au long de la vie de l'hôte en adoptant un état de latence. La latence d'HHV-6A/B est engendrée par l'intégration de leur génome entier aux télomères humains. Les télomères assurent la protection du génome cellulaire contre sa détérioration et dictent la durée de vie cellulaire. On estime que 1.1 % de la population mondiale possède la forme héritée du génome intégré d'HHV-6A/B (iciHHV-6A/B), ce qui signifie qu'environ 80 millions de personnes possèdent un génome d'HHV-6A/B dans un télomère de chaque cellule. Ceci signifie également que chez une personne iciHHV-6A/B, les virus peuvent se réactiver dans différents types de tissus cellulaires. Notamment, lors d'immunosuppression ou des traitements de chimiothérapie chez ces patients, la forme intégrée peut se réactiver et mène à de graves complications cliniques. Alors que les connaissances face à ces conséquences ont progressé, il demeure que les mécanismes fondamentaux utilisés par HHV-6A/B afin de s'intégrer aux télomères humains sont loin d'être élucidés. Les protéines précoces immédiates (IE) des herpèsvirus exercent plusieurs fonctions à des fins de réplications virales, dont celles d'être impliquées dans l'évasion du système immunitaire, dans la réponse aux dommages à l'ADN et dans le remodelage des protéines qui gouvernent les télomères. L'expression soutenue des protéines IE des herpèsvirus tout au long de leur infection afin d'établir la phase lytique et latente, font de ces protéines des protagonistes intéressantes dans la quête de la compréhension du déroulement de l'intégration d'HHV-6A/B. Les protéines IE s'associent à des corps nucléaires formés par la protéine PML (PML-NBs) et compromettent l'intégrité de ceux-ci afin de favoriser l'infection virale. Cependant, il a été documenté que lors de l'infection par HHV-6A/B, leur protéine IE, IE1 (IE1A et IE1B, respectivement), s'associe aux PML-NBs sans occasionner la dégradation ou la destruction de ceux-ci. D'un point de vue télomérique, les PML-NBs s'associent aux télomères endommagés. Notamment, les PML-NBs sont impliqués dans la recombinaison homologue des télomères. Dans le cadre de cette thèse, nous nous sommes intéressés à l'étude des mécanismes associés à l'intégration d'HHV-6A/B en portant une attention particulière à la caractérisation de la protéine IE1 d'HHV-6A/B (IE1A/B). Dans un premier temps, nous avons identifié les corps nucléaires de la protéine PML (PML-NBs) comme promoteurs de la SUMOylation d'IE1B. Ce résultat nous a conduits à identifier un motif d'interaction SUMO putatif d'IE1B, essentiel à la fois pour sa SUMOylation et pour son oligomérisation avec les PML-NB. Nous avons ensuite étudié le rôle des PML-NBs dans l'intégration d'HHV-6B et identifié que les cellules déficientes pour la protéine PML étaient moins susceptibles à l'intégration d'HHV-6B. Ces résultats corrèlent avec le résultat des PML-NBs qui influencent la localisation d'IE1B aux télomères. La deuxième étude est associée avec celle précédente dont l'objectif était de valider les résultats obtenus pour IE1B et HHV-6B avec IE1A et HHV-6A, dans un contexte de SUMOylation et d'absence de PML-NBs. Nous avons identifié des sites putatifs pour la SUMOylation d'IE1A, importants pour son oligomérisation. Par ailleurs, la localisation d'IE1A aux télomères et l'intégration d'HHV-6A furent influencées par la présence de PML-NBs. Ensemble, ces deux études ont mis en lumière l'importance de la SUMOylation pour l'oligomérisation d'IE1A/B, leur localisation aux PML-NBs et l'importance de ces derniers dans l'intégration d'HHV-6A/B. Lors de la troisième étude, nous nous sommes intéressés à étudier HHV-6A/B dans un contexte télomérique et ce, en nous penchant sur une protéine télomérique majeure, la protéine TRF2. Nous rapportons que la réplication de l'ADN d'HHV-6A/B augmente considérablement le nombre de répétitions télomériques dans les cellules infectées. En outre, nous démontrons que TRF2 se lient aux répétitions télomériques virales pendant l'infection et elle est importante pour l'intégration d'HHV-6A/B. La dernière étude de cette thèse avait l'objectif de caractériser la fonction d'IE1B dans un contexte de réparation de l'ADN. Nous avons mis en évidence qu'IE1B induit de l'instabilité génomique en inhibant la signalisation de la protéine détectrice de dommage de l'ADN, NBS1. Nous avons identifié deux régions protéiques d'IE1B responsables de l'interaction avec NBS1 et son inhibition. L'interaction/inhibition d'IE1B avec NBS1 mène à la diminution de la signalisation de dommage à l'ADN. Ces données corrèlent avec les évènements de différentes voies associées à la recombinaison homologue qui sont réduits en présence d'IE1B. Toutefois, NBS1 est importante pour l'intégration d'HHV-6B dans les cellules qui utilisent un mécanisme d'élongation des télomères basé sur la recombinaison homologue. Cette étude soulève la possibilité que d'autres protéines virales contrôlent l'action d'IE1B lors l'intégration afin de ne pas saturer l'instabilité génomique qui serait toxique à la survie cellulaire et virale. Dans l'ensemble, cette thèse identifie pour la première fois l'association de protéines cellulaires, PML, TRF2 et NBS1, dans l'intégration d'HHV-6A/B. Elle permet de mieux comprendre l'implication d'IE1B lors de l'infection d'HHV-6B et elle permet de percevoir une conséquence possible de l'iciHHV-6B. L'implication et l'importance d'IE1B dans l'instabilité génomique suggèrent qu'IE1B serait une cible thérapeutique pertinente dans le traitement des réactions d'HHV-6A/B. / Human herpesviruses 6A/B (HHV-6A/B) are two ubiquitous viruses distributed worldwide that share 94% identity between them. These viruses persist throughout the host's life through a state of latency. The latency of HHV-6A/B is generated by integrating their entire genome into human telomeres. Telomeres protect the host's genome from its deterioration and dictate the cell lifespan. It is estimated that 1.1% of the world's population has the inherited form of the integrated HHV-6A/B genome (iciHHV-6A/B), meaning that about 80 million people have an HHV-6A/B genome in one telomere of each cell. In an iciHHV-6A/B+ individual, viruses can reactivate in different types of cell tissue. Particularly, during immunosuppression or chemotherapy treatments in these patients, the integrated form can reactivate and lead to serious clinical complications. While knowledge about these consequences has grown, the fact remains that the fundamental mechanisms used by HHV-6A/B to integrate at human telomeres are far from clear. The immediate early proteins (IE) of herpesviruses perform several functions for viral replication purposes, including those involved in evading the immune system, responding to DNA damage, and remodeling the proteins that govern telomeres. The sustained expression of the IE proteins of herpesviruses throughout their infection in order to establish the lytic and latent phase make these proteins interesting protagonists in the quest to a better understanding of the process leading to the integration of HHV-6A/B. The IE proteins associate with nuclear bodies formed by the PML protein (PML-NBs) to compromise their integrity and promote viral infection. However, it has been documented that upon infection of HHV-6A/B, their IE protein, IE1 (IE1A/B), associates with PML-NBs without causing their degradation or destruction. From a telomeric perspective, PML-NBs associate at damaged telomeres. In particular, the PML-NBs are involved in the homologous recombination of telomeres. As part of this thesis, we were interested in studying the mechanisms associated with the integration of HHV-6A/B with particular interest in the characterization of the IE1 protein of HHV-6A/B. We first identified the PML NBs as promoters of IE1B SUMOylation. This result led us to identify a putative SUMO interaction motif of IE1B that is essential for both its SUMOylation and for the oligomerization of IE1B with PML-NBs. We then investigated the role of PML-NBs in the integration of HHV-6B and identified that cells deficient for PML were less susceptible to HHV-6B integration. These results correlate with the result that PML-NBs influence the localization of IE1B to telomeres. The second study is associated with the previous one whose objective was to validate the results obtained for IE1B and HHV-6B with IE1A and HHV-6A, in a context of SUMOylation and absence of PML-NBs. We have identified putative sites for IE1A SUMOylation, important for its oligomerization. Furthermore, the localization of IE1A to telomeres and the integration of HHV-6A was influenced by the presence of PML-NBs. Together, these two studies highlighted the importance of SUMOylation for the oligomerization of IE1A/B, their localization to PML-NBs and the importance of these in the integration of HHV-6A/B. In the third study, we were interested in studying HHV-6A/B in a telomeric context by studying a major telomeric protein, the TRF2 protein. We report that the replication of HHV-6A/B DNA dramatically increases the number of telomeric repeats in infected cells. In addition, we demonstrate that TRF2 binds to viral telomeric repeats during infection and is important for the integration of HHV-6A/B. The last study of this thesis aimed to characterize the function of IE1B in the context of DNA repair. We have shown that IE1B induces genomic instability by inhibiting the function of the DNA damage sensor protein, NBS1. We have identified two protein regions of IE1B responsible for the interaction with NBS1 and its inhibition. Interaction/inhibition of IE1B with NBS1 leads to decreased DNA damage signaling. These data correlate with the events of different pathways associated with homologous recombination which are reduced in the presence of IE1B. However, NBS1 is important for the integration of HHV-6B into cells that use a mechanism of telomere elongation based on homologous recombination. This study raises the possibility that other viral proteins control the action of IE1B during integration to not saturate genomic instability that would be toxic to cell and viral survival. Taken together, this thesis identifies for the first time the association of cellular proteins, PML, TRF2 and NBS1, in the integration of HHV-6A/B. It provides a better understanding of the implication of IE1B in the infection of HHV-6B and in identifying a possible consequence of iciHHV-6B. The implication and importance of IE1B in genomic instability suggests that IE1B may be an interesting therapeutic target in the treatment of HHV-6B reactivations.

L’herpèsvirus humain 6 (HHV-6) est un pathogène opportuniste dont l’infection et/ou la réactivation sont associées avec des maladies telles la roséole, des désordres du système nerveux central, et des complications suite à la transplantation d’organes. Le séquençage du génome viral a révélé l’existence de deux types de HHV-6 (A et B), se distinguant par des séquences dissemblables dans des régions spécifiques et des propriétés biologiques différentes. Nos travaux portent sur la caractérisation de la protéine précoce-immédiate (IE) 2 de HHV-6A. Son expression précoce suite à l’infection et sa capacité de transactivation suggèrent qu’elle représente une protéine clé dans l’établissement d’une infection productive, grâce à son contrôle de la cascade d’expression des gènes viraux. De plus, le transcrit codant pour IE2 se situe dans la région la plus variable entre HHV-6A et -6B, suggérant que la biologie de cette protéine pourrait contribuer à expliquer les différences cliniques entre les deux types viraux. Afin de déterminer les protéines cellulaires recrutées par IE2 durant l’établissement de l’infection, nous avons criblé une librairie de cellules T à la recherche de partenaires d’interaction. Nous avons isolé la protéine Ubc9, enzyme jouant un rôle dans la voie de conjugaison de SUMO. Cette interaction a une importance fonctionnelle pour IE2, puisqu’Ubc9 réprime significativement l’activation de promoteurs par la protéine virale. Les domaines essentiels à la fonctionnalité d’IE2 n’avaient jamais été caractérisés. Nous avons démontré que les domaines N- et C-terminaux sont tous deux requis pour une transactivation optimale, et que la délétion de la queue C-terminale d’IE2 modifie significativement la transactivation et la localisation intranucléaire de la protéine. Nous avons également établi que la région R3 du promoteur précoce-immédiat de HHV-6A est positivement régulée par IE2. Globalement, ces travaux nous procurent une vision plus précise du rôle de la protéine IE2 dans l’initiation de l’infection par HHV-6. / Human herpesvirus 6 (HHV-6) is an opportunistic pathogen whose infection or reactivation are associated with diseases such as roseola, central nervous system disorders and organ transplant anomalies. Sequencing of the viral genome has exposed the existence of two HHV-6 variants (A and B), with diverging sequences in specific regions, and different biological characteristics. Our work focused on the characterization of HHV-6A immediate-early IE2 protein. Its prompt expression following infection and its transactivating ability suggest that IE2 constitutes a key protein for the establishment of a productive infection, owing to its control over the viral gene expression cascade. Moreover, the IE2 coding transcript is located in the most variable region between HHV-6A and -6B, suggesting that the biology of this protein could help explain the clinical differences between the two viral variants. In order to identify cellular proteins recruited by IE2 during the establishment of infection, we have screened a T-cell library for interaction partners. We have isolated Ubiquitin conjugating enzyme 9 (Ubc9), a protein involved in the small ubiquitin-related modifier (SUMO) conjugation pathway. This interaction has a functional relevance for IE2, with Ubc9 significantly repressing promoter activation by the viral protein. Protein domains essential for IE2 function had never been characterized. We have determined that the N- and C-terminal domains are both required for optimal transactivation, and that the deletion of the C-terminal tail of IE2 significantly alters transactivation and the intranuclear localization of the protein. Moreover, we have determined that the R3 domain of the immediate-early HHV-6A promoter represents an IE2 responsive element. Overall, this work provides a more precise image of the role of IE2 during the initiation of HHV-6 infection and a better comprehension of the biology of this complex virus.

L’herpèsvirus humain de type 6B (HHV-6B) infecte près de 100% des humains et établit une latence pour le reste de la vie de l’hôte. L’épidémiologie d’HHV-6A est moins connue. Ces deux virus sont capables d’intégrer leur génome dans les télomères des chromosomes humains. Lorsque cette intégration a lieu dans une cellule germinale et qu’il y a fécondation, ceci mène à un individu portant une copie du génome viral dans chacune des cellules de son corps. Cette condition, appelée inherited chromosomally-integrated HHV-6 (iciHHV-6), résulte en une transmission du génome viral intégré à 50% des descendants et est retrouvée chez environ 1% des humains. Malgré cette importante fréquence dans la population, l’intégration de HHV-6, de même que son infection et son effet sur ses cellules hôtes, demeurent peu caractérisés. Dans ce travail, nous avons étudié l’effet de l’infection d’HHV-6A et HHV-6B sur la réponse de dommages à l’ADN (DDR). Nous avons observé une forte réponse DDR localisée dans les compartiments de la réplication virale (RC), colocalisant avec une grande quantité d’ADN télomérique d’origine virale. De plus, les niveaux des ARNm des gènes TRF1, TRF2 et TPP1, membres du complexe shelterin protégeant les télomères, étaient surexprimés dans les cellules infectées. Cette augmentation se traduit par une surexpression de la protéine TRF2, recrutée aux séquences télomériques virales dans les RC. Finalement, nous avons étudié l’effet de BRACO-19, un inhibiteur de la télomérase, sur l’intégration d’HHV-6A et sa persistance. En utilisant un essai d’intégration récemment mis au point dans notre laboratoire, nous avons démontré que l’inhibition de la télomérase menait à une diminution significative de la fréquence de cellules porteuses d’intégration. Ce travail apporte de nouvelles connaissances sur l’infection de HHV-6 et sur son mécanisme d’intégration potentiel, de même que la première observation d’une possible participation des protéines du complexe shelterin dans l’infection de HHV-6. / Human herpesviruse 6B (HHV-6B) is a very prevalent virus that infect nearly 100% of humans and establish a life-long latency. Much less is known regarding HHV-6A epidemiology. Both viruses can integrate their genome into the telomeres of human chromosomes. When this integration occurs in a germinal cell, it can lead to an individual carrying one copy of the viral genome in every cell of its body. This condition, called inherited chromosomally-integrated HHV-6 (iciHHV-6), will then be transmitted to 50% of offspring and is found in approximately 1% of individuals across the world. Despite being so frequent, much remains to be studied on HHV-6 infection and integration processes. In this work, we studied the effects of viral infection on DNA damage response (DDR) signaling. We observed a DDR located in viral replication compartments (RC), together with a large amount of telomeric sequences that we confirmed to be of viral origin. In addition, mRNAs coding for TRF1, TRF2 and TPP1, members of the shelterin complex protecting telomeres, were upregulated during infection. Consequently, TRF2 protein was overexpressed and relocated to viral telomeric sequences in RC. Lastly, we’ve examined the effects of BRACO-19, a compound that affects telomerase activity, on HHV-6 integration and persistence. Using an integration assay recently developed in our laboratory, we could demonstrate that in the presence of the telomerase inhibitor, the frequency of cells containing integrated HHV-6 was significantly reduced. This work brings new knowledge regarding HHV-6 infection and its potential integration mechanism, as well as the first observation of a possible participation of the shelterin complex proteins during HHV-6 infection.

La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie héréditaire liée au chromosome X. Elle est principalement causée par la délétion d’un ou plusieurs exons du gène DMD, ce qui entraine un changement du cadre de lecture et l’obtention d’une protéine dystrophine tronquée et inactive. L’édition de génome par les systèmes TALEN ou CRISPR/Cas9 est devenue dans les dernières années un grand espoir pour le développement de traitements pour ce type de maladie. Dans ce travail, nous illustrons la faisabilité d’un traitement pour la DMD en utilisant les protéines TALENs ou le complexe CRISPR/Cas9 purifiés. Ces protéines sont donc transduites afin de générer des cassures double brin dans l’ADN génomique. Ainsi, la correction de cette mutation par recombinaison non homologue pourra corriger le cadre de lecture du gène codant pour la protéine dystrophine, produisant ainsi une protéine tronquée, mais active, telle que pour les patients Becker. Bien que les protéines TALENs montrent une bonne activité in vitro, l’efficacité de coupure n’a pas pu être observée dans les cellules, ce qu’indiquerait un défaut lors de la transduction protéique. Toute fois, dans le cas du système CRISPR/Cas9, l’essai surveyor a permis d’observer les produits de coupure attendus lors de la transduction de ce système avec des lipides cationiques. Ceci indique donc que le système CRISPR/Cas9 peut être utilisé de façon efficace sous forme protéique tout en ciblant le gène DMD. Finalement, l’utilisation de ce système a été confirmée in vivo chez la souris hDMD, où il a été possible d’observer la présence des délétions ciblées. La transduction de protéines en utilisant le système CRISPR/Cas9 illustre donc une approche thérapeutique prometteuse dans le but de développer un traitement pour les maladies génétiques. / Duchenne muscular dystrophy (DMD) is an hereditary disease linked to chromosome X. It is mainly caused by the deletion of one or more exons of the DMD gene, which causes a change in the reading frame, obtaining a truncated and inactive protein. Genome editting by TALEN or CRISPR/cas9 systems has become in the recent years a powerfull tool for developing treatments for this type of disease. However, the use of plasmids encoding these systems leads to a prolonged expression, which may increase the off-target risk. Thus, it is important to note that today, viruses vectors remain the most effective delivery system for these plasmids, which always entails a risk of integration into the genome, increasing the probability of side effects for a treatment. In this work, we illustrate the development of a genome edditing treatment for DMD, but using purified protein TALENs or Cas9. These proteins are transduced in order to generate double strand breaks in the genomic DNA. Thus, the correction of this mutation by non-homologous end joining can correct the reading frame of the gene, producing a functional Dystrophin protein, as for Becker patients. Although TALEN proteins show a good activity in vitro, the cut-effectiveness has not been observed in the cells. It would indicate a defect in the protein transduction. However, in the case of CRISPR/cas9 system, we have obtained the expected cleavage products during the transduction with cationic lipids in both cell lines. These results are similar with those obteined when the plasmids coding for both systems were transfected. This indicates that the CRISPR/cas9 system can be used effectively in protein form while targeting a gene specifically. Protein therapy using the CRISPR/cas9 system can be a promising method in order to develop an alternative treatment for genetic diseases. Finally, in order to confirm that this system can be used in vivo, we will soon test it in the hDMD mouse model, containing the complete human DMD gene.

Le virus humain herpès-8 (HHV-8) est un virus oncogene associé au développement de cancers dont le sarcome de Kaposi (KS) et le lymphome primitif des séreuses (PEL). Plusieurs études mettent en évidence l'importance de différents facteurs dont les cytokines pour la survie et la prolifération des cellules tumorales infectées par HHV-8. Les médiateurs lipidiques bioactifs, provenant de l'hydrolyse des phospholipides, jouent un rôle important dans plusieurs formes de cancer en influençant le développement, la progression ainsi que le potentiel métastatique. En effet, la littérature scientifique décrit de plus en plus clairement que l'autotaxine (ATX)/acide lysophosphatidique (LPA) ainsi que la cyclooxygénase-2 (COX-2)/prostaglandine E2 (PGE2) sont intimement liés au développement du cancer. Par conséquent, l'utilisation d'inhibiteurs ciblant la synthèse ou l'action biologique de ces médiateurs lipidiques représente une avenue thérapeutique fort prometteuse. À ce jour, le rôle des médiateurs lipidiques dans la tumorigénèse associée à HHV-8 n'est pas clairement défini. Cette thèse présente donc deux projets directement reliés à la surexpression de d'ATX et de COX-2 suivant une infection par HHV-8. Nos résultats démontrent que l'ATX, une enzyme responsable de la production de LPA, est surexprimée dans les lignées cellulaires, dans l'ascite et les biopsies cutanées provenant respectivement de patients atteints du lymphome primitif des séreuses et du sarcome de Kaposi. L'augmentation de l'activité enzymatique de l'autotaxine in vitro favorise la prolifération et/ou la survie des cellules infectées. Notre étude permet aussi de confirmer l'induction de la COX-2 suivant une infection des cellules endothéliales par HHV-8. De plus, nous avons étudié les effets de la protéine Kl5 d'HHV-8 sur l'expression et la régulation du gène de la COX-2. Nos résultats ont permis de démontrer que la protéine Kl5 induit l'expression du gène de la COX-2 via les facteurs de transcription NFAT et AP-1. L'ensemble des résultats obtenus au cours de mes études de doctorat met en évidence une conséquence importante et spécifique de l'infection par HHV-8 soit l'induction des enzymes permettant la production de lipides bioactifs. Le LPA mène à une augmentation de la prolifération et/ou de la survie des cellules infectées alors que la COX-2 est essentielle à une infection efficace in vitro ainsi qu'au maintient de la latence virale.

L'herpèsvirus humain 8 (HHV-8) est un pathogène reconnu récemment dont l'infection est associée à des maladies telles que le sarcome de Kaposi, le lymphome primitif des séreuses, et la maladie de Castleman. Le génome de HHV-8 code pour de nombreuses protéines impliquées dans l'interférence avec les mécanismes de défense immunitaire de l'hôte. Nos travaux portent sur la caractérisation de la protéine K-bZIP de HHV-8. Cette protéine précoce-immédiate dans le cycle viral, est issue du gène ORFK8, et est principalement décrite comme un répresseur transcriptionnel. L'étude de son impact sur la voie de transcription de l'interféron α/β a permis d'identifier un mécanisme original par lequel K-bZIP inhibe l'activation de l'interféron (IFN). En se fixant directement aux éléments de liaison de IRF3 contenus dans le promoteur de l'IFN, K-bZIP active faiblement sa transcription. En revanche, lors d'une activation des kinases cellulaires impliquées dans la transcription de l'IFN, K-bZIP entraîne une forte inhibition de l'expression du gène de l' Ifn-β. De plus, nous avons pu déterminer que K -bZIP avait un rôle inhibiteur dans la cascade d'activation induite par la liaison de l'IFN de type 1 sur son récepteur. Cette inhibition est indépendante de la phosphorylation des STATs et de la formation du complexe ISGF3. Nous avons également identifié le fait que la sumoylation joue un rôle déterminant dans la répression liée à K-bZIP. Enfin, grâce à la génération d'un ARN interférant dirigé contre le transcrit de l'ORFK8, nous avons démontré que K-bZIP est requis pour la réplication du génome viral, pour la production de virions matures, et pour une transactivation optimale des messagers lytiques viraux. Globalement, ces travaux nous procurent une vision plus affinée du rôle de la protéine K-bZIP dans le contexte viral.

La purification par affinité couplée à l’analyse par spectrométrie de masse (AP-MS) est une méthode de choix pour l’étude des interactions protéines-protéines chez les cellules humaines. Par contre, cette technique est sensible aux perturbations causées par la surexpression ectopique des protéines cibles. Des effets anormaux, tels que la formation d’agrégats et la délocalisation des protéines cibles, peuvent mener à des conclusions erronées. Il est donc important de reproduire le plus précisément possible les niveaux physiologiques normaux des protéines à l’étude. Les travaux présentés dans ce mémoire décrivent le développement d’un système robuste et rapide couplant l’édition du génome et la protéomique permettant l’isolation de complexes protéiques natifs exprimés à des niveaux quasi physiologiques. L’approche a servie de tremplin afin d’atteindre l’objectif ultime qui est de caractériser les protéines exprimées à partir de leur contexte génomique naturel. À l’aide des outils d’édition génomique, nous avons introduit de façon ciblée au locus AAVS1 une cassette permettant l’expression de protéines d’intérêt étiquetées avec une séquence permettant la purification par affinité. Ainsi, nous avons purifié de nombreuses holoenzymes impliquées dans la réparation de l’ADN et la modification de la chromatine. Nous avons identifié de nouvelles sous-unités et interactions au sein de complexes déjà bien caractérisés et rapportons l’isolation de MCM8/9, soulignant ainsi l’efficacité et la robustesse de notre approche. La technique présentée dans ce mémoire améliore et simplifie l’exploration des interactions protéiques ainsi que l’étude de leur activité biochimique, structurelle et fonctionnelle. / Conventional affinity purification followed by mass spectrometry (AP-MS) analysis is a broadly applicable method to decipher molecular interaction networks and infer protein function. However, it is sensitive to perturbations induced by ectopically overexpressed target proteins and does not reflect multilevel physiological regulation in response to diverse stimuli. Here, we developed an interface between genome editing and proteomics to isolate native protein complexes produced from their natural genomic contexts. We used CRISPR/Cas9 and ZFNs to insert cDNA of interest in the endogenous genomic safe harbor locus AAVS1 and purified several DNA repair and chromatin modifying holoenzymes to near homogeneity. We uncovered novel subunits and interactions amongst well-characterized complexes and report the isolation of MCM8/9, highlighting the efficiency and robustness of the approach. These methods improve and simplify both small and large-scale explorations of protein interactions, as well as the study of biochemical activities and structure-function relationships.

Les technologies CRISPR-Cas9 révolutionnent la façon dont on interroge les systèmes biologiques et offrent un immense potentiel thérapeutique pour diverses maladies génétiques. Malgré les progrès fulgurants des dernières années, l'ingénierie ciblée du génome des cellules humaines demeure un défi de taille dans certains types cellulaires. La cosélection sans marqueur est une méthode qui consiste à introduire une mutation précise dans un gène endogène pour conférer de la résistance à une molécule toxique pour les cellules non modifiées, permettant l'enrichissement des cellules modifiées par CRISPR-Cas9. Comme deux différents évènements de modifications génétiques ne sont pas statistiquement indépendants au sein d'une même cellule, la sélection des cellules ayant la première modification permet l'enrichissement d'une deuxième modification d'intérêt à un locus distant par cosélection. Dans le cadre du premier chapitre de cette thèse, nous avons développé une méthode de cosélection pour permettre l'enrichissement des cellules modifiées par éditeur de type PE, de l'anglais pour « prime editing ». Nous avons identifié des mutations dominantes avec gain de fonction du gène ATP1A1 qui confèrent différents niveaux de résistance à l'ouabaïne, un inhibiteur de la pompe à sodium/potassium (ATPase Na⁺/K⁺). Ces nouvelles mutations permettent d'effectuer jusqu'à trois étapes successives de cosélection en augmentant la dose d'ouabaïne à chape étape. La cosélection facilite grandement l'enrichissement de populations de cellules hautement modifiées et l'isolement de clones dérivés d'une seule cellule homozygote pour une modification désirée. La caractérisation des clones a révélé que l'utilisation de l'éditeur PE3 génère fréquemment des modifications non voulues et plus difficiles à détecter étant donné leurs plus grandes tailles. En somme, nos méthodes devraient faciliter l'ingénierie ciblée du génome des cellules humaines pour créer des modèles cellulaires pour la recherche biomédicale. Dans le cadre du deuxième chapitre de cette thèse, nous avons développé une méthode de sélection sans marqueur pour l'ingénierie ciblée du génome des lymphocytes T pour diverses applications en thérapie cellulaire. Cette méthode permet de simultanément intégrer un transgène codant pour un récepteur antigénique chimérique (CAR) et une mutation gain de fonction dans le locus MTOR. Cette mutation permet la sélection sans marqueur avec la rapamycine, un inhibiteur de mTOR couramment utilisé en clinique comme immunosuppresseur. Notre approche permet donc d'enrichir les cellules modifiées par CRISPR-Cas9 qui expriment un transgène thérapeutique d'intérêt. À partir d'un rapporteur fluorescent de signalisation mTORC1, nous avons démontré que mTOR demeure fonctionnelle en présence de rapamycine après l'intégration du transgène d'intérêt et de la mutation dominante. Cette méthode permet l'enrichissement efficace de lymphocytes T primaires exprimant un récepteur CD19-CAR. À partir d'essais de cytotoxicité in vitro et d'un modèle murin de leucémie lymphoblastique aiguë, nous avons observé un effet combiné des lymphocytes CAR-T et de la rapamycine en ciblant des lymphocytes B cancéreux (CD19⁺). En somme, notre stratégie devrait faciliter l'ingénierie ciblée du génome des lymphocytes T pour diverses applications en thérapie cellulaire. / CRISPR-based technologies are revolutionizing the way we interrogate biological systems, and offer a diverse array of therapeutic opportunities to treat genetic diseases. Despite significant improvements, genome editing in human cells remains challenging in a variety of cell types. Marker-free co-selection is based on the installation of a specific mutation at an endogenous locus to confer cellular resistance to a molecule that is otherwise toxic for unmodified cells, allowing the enrichment of CRISPR-engineered cells. Considering that two genome editing events at distant loci are not statistically independent within the same cell, selection for the first modification allows the enrichment of a second modification of interest via co-selection. As part of the first chapter of this thesis, we developed a marker-free co-selection method to perform successive rounds of prime editing in human cells. We first identified new ATP1A1 gain-of-function mutations to confer different levels of resistance to ouabain, a plant-derived inhibitor of the essential and ubiquitous sodium-potassium pump (Na⁺/K⁺ ATPase). Introducing these mutations sequentially allowed up to three successive rounds of selection to be performed by increasing the dose of ouabain at each step. Co-selection greatly facilitates the isolation of highly-modified populations of cells and homozygous single cell-derived clones. Characterization of single cell-derived clones revealed that the use of a complementary nick sgRNA (PE3) frequently generates tandem duplications and large deletions at the target site. Overall, our co-selection toolkit should facilitate prime editing in human cells to create cellular models for biomedical research. As part of the second chapter of this thesis, we have developed a marker-free selection method to enrich CRISPR-engineered T cells for cell therapy applications. We devised a strategy to simultaneously introduce a rapamycin resistance mutation and a CAR gene cassette to the MTOR locus via intron nesting to generate rapamycin-resistant CD19-CAR-T cells. Our strategy allows the enrichment of CRISPR-engineered T cells expressing a therapeutic transgene of interest with rapamycin, a widely used immunosuppressant. Using a fluorescent mTORC1 signaling reporter, we confirmed that mTORC1 signaling remained functional in the presence of rapamycin after the installation of the dominant gain-of-function mutation and a therapeutic transgene of interest. Using luciferase-based and FACS-based in vitro cytotoxicity assays, and a mouse model of acute lymphoblastic leukemia, we confirmed that our CAR-T cells could efficiently target CD19⁺ leukemia cells in combination with rapamycin. We foresee that our strategy could both facilitate the enrichment of CRISPR-engineered CAR-T cells and improve tumor eradication.

Québec Université Laval, Bibliothèque 2014