Orientador: Marcos Hikari Toyama / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-06T00:18:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Fonseca_FabianaVieira_M.pdf: 764391 bytes, checksum: 2ea9b8ea9a806b452272ef5f3e45ba17 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: O uso de toxinas isoladas de venenos como ferramentas moleculares na compreensão de diversos eventos fisiológicos e patológicos tem sido comprovadas por vários trabalhos na literatura. A serpente Crotalus durissus cascavella é encontrada nas áreas de caatinga do nordeste do Brasil, desde o Maranhão até norte do estado de Minas Gerais, e apesar de pouco estudada sua picada constitui um importante problema da saúde pública (Martins et al, 1998). A agregação platequetária é bem caracterizada para a convulxina isolada do veneno de Crotalus durissus cascavella e Crotalus durissus terrificus. O objetivo principal do projeto foi avaliar a atividade de agregação plaquetária induzida por outras frações biológicas e farmacologicamente importantes do veneno total de Cotalus durissus cascavella, que neste projeto foram a crotoxina e giroxina. Através de uma combinação de varias metodologias em HPLC como exclusão molecular, troca iônica e de fase reversa conseguimos isolar os principais constituintes da crotoxina (PLA2, crotapotina e as proteínas ¿trombina-like¿) e a L-aminoácido oxidase a partir da giroxina. Durante o fracionamento do veneno total em coluna de HPLC de exclusão molecular foram detectados dois picos de atividade serino protease, um na fração giroxínica e outro na fração crotoxínica, sendo que na fração crotoxínica encontrou-se uma nova protease até então não caracterizada e na fração giroxínica foram monitoradas a atividade L-aminácido oxidase. Através da cromatografia em HPLC de troca iônica em DEAE 5PW obteve-se a fração Laminoácido oxidase cujo grau de homogeneidade molecular foi confirmado por HPLC de fase reversa. Da fração crotoxínica foram obtidos três grupos principais de proteínas (PLA2, crotapotinas e proteases) e da fração proteolítica foram isoladas três isoformas principais denominadas de F201, F202 e F203, sendo a fração F202, a fração majoritária. F202 foi obtida com maior homegeneidade molecular com massa molecular de 28kDa e mostrou uma alta quantidade de ácido aspártico, ácido glutâmico e outros aminoácidos importantes como histidina, cisteína e lisina. Esta proteína mostrou alta especificidade para BApNA e mostrou um comportamento Michaelis-Menten com Vmáx estimado em 5,64 µM/min e um Km de 0,58mM para este substrato. Neste trabalho foi investigada a habilidade desta proteína em degradar fibrinogênio e observou-se que F202 clivou ambas as cadeias a e ß. A atividade enzimática assim como a agregação plaquetária foi inibida fortemente com a incubação com TLCK, um inibidor específico para serinoproteases. O N-terminal da seqüência de aminoácidos de F202 mostrou alta homologia com outras proteínas ¿trombina-like¿, mas foi significantemente diferente da ¿trombina-like¿ isolada da fração giroxina. Crotalus durissus cascavella apresenta uma fração menos estudada denominada giroxina que tem sido descrita como uma proteína ¿trombina-like¿ como relatado por Raw et al. (1986) e Alexander et al. (1988). Neste trabalho foi demonstrado que a giroxina é uma fração heterogênea composta de uma ¿trombina-like¿ e proteína LAO, a qual parece estar envolvida em várias atividades / Abstract: The use of the isolated toxins from poisons as molecular tools in the understanding of diverse physiological and pathological events has been proved by some works in literature. The serpent Crotalus durissus cascavella is found in the areas of Caatinga Northeast of Brazil, since Maranhão until North of the state of Minas Gerais, and in spite of it hasn¿t been studied a lot, its bite constitutes an important problem to the public health (Martins et al, 1998). The platelet aggregation is well characterized to the isolated convulxin of the poison of Crotalus durissus cascavella and Crotalus durissus terrificus. The main objective of the project was to evaluate the activity of platelet aggregation induced by gyroxin and crotoxin that are biological and pharmacological important fractions of the total poison of Cotalus durissus cascavella. Through a combination of various methodologies in HPLC -as molecular exclusion, ionic exchange and the reverse phase- we managed to isolate the main constituent of the crotoxin (PLA2, crotapotin and the thrombin-like proteins) and the L-amino acid oxidase from the gyroxin. During the fragmentation of the total poison in column of HPLC of molecular exclusion two peaks of serine protease were found: one in the gyroxin fraction and another one in the crotoxin fraction. In the crotoxin fraction a new protease in not characterized yet and in the gyroxin fraction was found the L-amino acid activity oxidase. Through the chromatography in HPLC of ionic exchange in DEAE 5PW that allowed to the attainment of the fraction L-amino acid oxidase whose degree of molecular homogeneity was confirmed by HPLC of reverse phase. From the crotoxin fraction three main groups of proteins (PLA2, crotapotin and proteases) were isolated, and from the named proteolyitic fraction three isoforms of F201, F202 and F203, noticing that the F202 fraction is the major one. The fraction F202 showed a high quantity of aspartic acid, glutamic acid and others amino acids very important as histidine, cysteine and lysine and so more molecular homogeneity could be obtained and with molecular mass of 28kDa. This protein whose behavior Michaelis-Menten with Vmáx measured in 5,64 µM/min and one Km de 0,58 mM to this substratum showed high specificity to BapNA. In this work was investigated the ability of this protein in degrading the fibrinogen and was observed that the F202 made the cleavage into both chains a and ß. The enzymatic activity as well as the platelet aggregation were strongly inhibited with the incubation with TLCK, a specific inhibitor to serine protease. The N-terminal of the amino acid sequence of F202 showed the high homology with other proteins thrombin-like, but it was significantly different from thrombin-like isolated fro m the gyroxin fraction. Crotalus durissus cascavella presents a fraction less studied named gyroxin that has been described as a protein thrombin-like as related by Raw et al. (1986) and Alexander et al. (1988). In this work was demonstrated that the gyroxin is a composed heterogeneous fraction of one thrombin-like and protein LAO, and this seems to be involved in some activities / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Edvaldo Sabadini / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-15T19:00:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Paula_KellyRobertaFranciscoMurucide_D.pdf: 1276318 bytes, checksum: 05828c19cce0cc938017a5675f66d9d2 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: É bem conhecido que certas moléculas pequenas se agregam através de interações específicas, formando espontaneamente estruturas poliméricas supramoleculares em solução aquosa e orgânica. A formação destas macroestruturas pode alterar significativamente a viscoelasticidade da solução. Essas estruturas diferem dos polímeros por serem sistemas que estão num processo constante de quebra e recombinação numa escala finita de tempo que é dependente das propriedades físico-químicas dos sistemas. No regime semi-diluído verificamos que a adição de pequenas quantidades de álcool benzílico, benzeno, PVA parcialmente hidrolisado e PPO promovem uma perda nas propriedades viscoelásticas dos sistemas de micelas gigantes formadas por brometo de hexadeciltrimetilamônio e salicilato de sódio (CTAB/NaSal). Em solventes orgânicos, estudamos a auto-estruturação de moléculas 2,4-bis(2-etilexilureido) tolueno (EHUT). A adição de etanol e álcool benzílico aos sistemas de EHUT em octano confere a solução uma maior fluidez, que deve estar associada com a destruição parcial de algumas cadeias do polímero supramolecular, devido às interações específicas (ligações de hidrogênio, no caso do grupo OH dos álcoois e entre anéis aromáticos no caso do álcool benzílico). Apesar da significativa alteração reológica, nenhuma mudança estrutural foi observada através de medidas de SANS e Cryo-TEM para ambos os sistemas (CTAB/NaSal e EHUT). No regime diluído, fundamentados no fenômeno de redução de atrito, foi possível avaliar a estabilidade térmica dos polímeros supramoleculares sob fluxo turbulento. Para os sistemas formados por CTAB/NaSal observamos uma temperatura crítica TC onde não se observa redução no nível de turbulência dos sistemas, a qual está associada com a quebra das micelas gigantes em micelas mais curtas ou esféricas. A adição de álcool benzílico e PVA diminui os valores de TC sugerindo uma forte interação desses solutos com as micelas gigantes, diminuindo a estabilidade térmica das mesmas. Foi demonstrado pela primeira vez que uma estrutura supramolecular é capaz de reduzir o atrito hidrodinâmico em um solvente orgânico. Para os sistemas formados por EHUT em octano ou tolueno, verificamos uma perda na redução de atrito associada com a transição da forma tubo para a forma filamento com o aumento de temperatura. A adição de etanol e álcool benzílico nas soluções de EHUT provoca uma quebra nas estruturas da forma tubo e o fenômeno de redução de atrito não pode mais ser observado / Abstract: It¿s very well known that some small molecules can self-assemble spontaneously by specific interactions, forming supramolecular polymer structures in aqueous and organic phases. The formation of those macromolecules can modify expressively the viscoelasticity of the systems. These structures differ from those of polymers, because they can break and reform within a lifetime that is dependent on the physico-chemical properties of the systems. Aqueous solutions of cetyltrimethylammonium and sodium salicilate (CTAB/NaSal) can form wormlike micelles in semi-dilute regime, and we verified that the addition of minute amounts of benzylic alcohol, benzene, partially hydrolyzed PVA and PPO promote a decrease in the viscoelastic properties of the system. In organic solvents it was studied the self-assembly of bis-urea (EHUT) molecules. The addition of ethanol or benzyl alcohol in EHUT/octane systems confers a high fluidity to solutions, which can be associated to the partial destruction of some chains, due to specific interactions (OH in the case of the alcohols and between the aromatic rings in the case of benzyl alcohol). However, no structural changes were observed to CTAB/NaSal, and to EHUT systems by using SANS and Cryo-TEM techniques (in this case to the aqueous system). In dilute regime, the polymers produce hydrodynamic drag reduction under turbulent flow and based in this property, we evaluate the thermal stability of the supramolecular polymers. Systems formed by CTAB/NaSal have showed a critical temperature TC, associated to the limit in which the drag reduction phenomenon is still observed, and beyond this critical temperature, the wormlike micelles is broken into small or spherical micelles. When benzyl alcohol and PVA are added to systems, the TC values decrease, suggesting a strong interaction between those solutes and the surfactants of the wormlike micelles. This work presents the first demonstration of drag reduction in organic solvent by using a self-assembly system. We studied the thermal stability to EHUT in octane and toluene. The increase in the temperature leads a lost in the capability of EHUT to maintain the drag reduction ability, which is associated with the transition of tube to filamentform. The addition of benzyl alcohol and ethanol into EHUT solutions promote a break of the tube form and the drag reduction phenomenon cannot be observed anymore / Doutorado / Físico-Química / Doutor em Ciências

Introdução: O sangramento por queda de escara é uma complicação potencialmente letal da ligadura elástica (LE) de varizes de esôfago. Os fatores relacionados a esse evento são pouco explorados na literatura, porém a coagulopatia, principalmente a plaquetopenia, do paciente com cirrose poderia estar implicada. O número e a função plaquetária têm particular relevância na manutenção da hemostasia, uma vez que a geração de trombina depende fortemente desses parâmetros. Entretanto, dados demonstram a preservação da função plaquetária como consequência de mecanismos compensatórios representados, principalmente, pelo aumento dos níveis do fator de von Willebrand (FVW) e diminuição de ADAMTS13. Deste modo, os pontos de corte para contagem plaquetária utilizados na prática clínica não refletiriam o risco de sangramento após procedimentos. Objetivos: O objetivo desse estudo foi descrever a função plaquetária em pacientes com cirrose e a sua influência no sangramento após LE de varizes de esôfago. Pacientes e Métodos: 1) Casuística. Foram incluídos pacientes com diagnóstico de cirrose, de diferentes etiologias, encaminhados para realização de LE como profilaxia primária ou secundária de sangramento por varizes de esôfago. Os critérios de inclusão foram: a) idade acima de 18 anos; b) pacientes com cirrose e varizes de esôfago com indicação de ligadura elástica eletiva e c) concordância em participar do estudo. Os critérios de exclusão foram: a) doenças pulmonares e cardíacas graves; b) carcinoma hepatocelular; c) insuficiência renal com uremia ou dialítica; d) uso de qualquer droga que interfere na coagulação. 2) Métodos. Imediatamente antes da realização da endoscopia digestiva com LE, foi coletada amostra de sangue de cada paciente para a realização dos seguintes testes: contagem de plaquetas, testes relacionados à função plaquetária (adesão e agregação medida pela superfície coberta (SC) com valor de referência: > 7,5% e tamanho do agregado (AS) com valor de referência: > 25um² pela tecnologia Impact- R®), antigeno de FVW (referência: 40-157%), atividade de FVW (referência: 38- 176%), proteinase ADAMTS13 (referência: 40-130%), P-selectina por citometria (34,9±2,32%) e P-selectina solúvel (92-212ng/mL). Os pacientes foram estratificados de acordo com número de plaquetas. O grau de comprometimento da função hepática foi avaliado pelos estadiamentos de Child-Pugh e MELD. O desfecho primário do estudo foi a ocorrência do sangramento atribuído à queda da escara da LE. Resultados: Foram incluídos 111 pacientes, divididos em três grupos: A) plaquetas < 50x10³/mm³ (n = 38; 34,2%); B) plaquetas entre 50x10³/mm³ e 100x10³/mm³ (n = 47; 42,4%) e C) plaquetas > 100x10³/mm³ (n = 26; 23,4%). Os três grupos não diferiram significativamente em relação aos seguintes parâmetros: gênero, etiologia e grau de disfunção hepática. Na comparação entre os grupos, os parâmetros hemoglobina e bilirrubina foram significantemente maior no grupo B (p=0,04 e p=0,009, respectivamente). Nos testes relacionados à função plaquetária, encontramos no Impact-R®, SC de 7 ± 4% e AS de 52 ± 24?m2. Na avaliação do FVW o valor encontrado foi de 369 ± 157% para o antígeno e 336 ± 149% para atividade. ADAMTS13 apresentou resultado 73 ± 24%. Na comparação entre os grupos: o parâmetro Impact-R® SC foi no grupo A: 4,9 ± 3%, no grupo B: 7,7 ± 4,6% e 9,1 ± 3,6 no grupo C (p < 0,005). O AS foi de 49,9 ± 22,4% no grupo A, no grupo B foi 55,1 ± 26,6% e 51,3 ± 20 no grupo C (p=0,599). Os outros parâmetros específicos relacionados à função plaquetária não foram significantes: o antígeno do FVW com p=0,926, a atividade do FVW com p=0,870 e ADAMTS13 com p=0,080. O resultado da P-selectina por citometria de fluxo foi de 37,8 ± 23% e P-selectina solúvel foi 182,3 ± 86 ng/mL. A maioria dos pacientes (58,5%) realizaram LE como profilaxia primária. A presença de sinais vermelhos ocorreu em 74% e a gastropatia hipertensiva foi vista em 95% dos pacientes. Houve sangramento após LE em seis (5,4%) pacientes, sendo duas ocorrências no grupo A, uma no grupo B e três no grupo C (p=0,316). O valor médio do MELD foi 13 ± 3,6, sendo 12,6 ± 3,3 no grupo sem sangramento e 16 ± 5,9 no grupo sem sangramento (p=0,025). Quando comparados os pacientes sem e com sangramento não encontramos diferença estatisticamente significante em nenhum parâmetro de função plaquetária. Conclusões: Os resultados dos testes de adesão e agregação plaquetária: SC e AS; FVW e ADAMTS13 demonstraram compensação funcional a despeito da plaquetopenia e não se correlacionaram com o risco de sangramento após LE de varizes de esôfago. O MELD foi significantemente maior nos pacientes que sangraram / Introduction: Bleeding caused by ulceration after band ligation of esophageal varices is a potentially fatal complication. Contributing factors to this event are little explored in the literature, although coagulopathy, principally thrombocytopenia, in patients with cirrhosis could be implicated. The number and function of platelets has particular relevance to the maintenance of hemostasis, since thrombin generation depends heavily on these parameters. However, data show that the preservation of platelet function is a consequence of compensatory mechanisms represented principally by an increase in von Willebrand factor (VWF) levels and a reduction in ADAMTS13. Because of this, the cutoff points for platelet count used in routine clinical practice do not reflect the risk of bleeding following invasive procedures. Objective: The aim of this study was to describe platelet function in patients with cirrhosis and its influence on the bleeding following band ligation of esophageal varices. Methodology: 1) Inclusion. Patients with cirrhosis of different etiologies, referred for band ligation as primary or secondary prophylaxis of bleeding from esophageal varices were included. Inclusion criteria were: a) age > 18 years; b) patients with cirrhosis and esophageal varices elegible for elective band ligation; c) agreement to participate in the study. The exclusion criteria were: severe pulmonary or cardiovascular disease; b) hepatocellular carcinoma; c) renal dysfunction with uremia or requiring dialysis; d) use of any medication that could interfere with coagulation. 2) Methods. Immediately prior to digestive endoscopy with band ligation, a blood sample was taken from each patient to carry out the following coagulation tests: platelet count, platelet function test (adhesion and aggregation measured as surface coverage (SC) with normal range: > 7.5% and aggregate size (AS) with normal range: > 25um² by Impact-R® technology), antigen of VWF (normal range: 40- 157%), activity of VWF (normal range: 38-176%), protease ADAMTS13 (normal range: 40-130%), P-Selectin by cytometry (34.9±2.32%) and soluble P-Selectin (92- 212ng/mL). The degree of hepatic function was staged according to Child-Pugh and MELD. The principal clinical event assessed by the study was the occurrence of post-banding bleeding. Results: 111 patients were included in the study, divided into three groups: A) platelet count < 50x10³/mm³ (n=38; 34.2%); B) platelet count between 50x10³/mm³ and 100x10³/mm³ (n=47; 42.4%); and C) platelet count > 100x10³/mm³ (n=26; 23.4%). The three groups did not differ significantly in relation to the following parameters: gender, cirrhosis etiology and degree of hepatic dysfunction. The comparison among groups showed that the parameters hemoglobin and bilirubin were significantly higher in group B (p=0.04 and p=0.009, respectively). With regards to platelet function, in Impact-R® the mean SC was 7 ± 4%; in group A was 4.9 ± 3%, in group B was 7.7 ± 4.6% and 9,1 ± 3,6 in group C (p < 0.005). The AS was 52 ± 24?m2; in group A was 49.9 ± 22.4%, in group B was 55.1 ± 26.6% and 51.3 ± 20 in group C (p=0.599). The mean VWF value was 369 ± 157% for antigen and 336 ± 149% for activity. ADAMTS13 activity values were 73 ± 24%. The comparison among groups showed that the other specific parameters for platelet function were not significant: VWF antigen with p=0.926, VWF activity with p=0.870 and ADAMTS13 with p=0.080. The result of P-Selectin by flow cytometry was 37.8 ± 23% and soluble P-Selectin was 182.3 ± 86ng/mL. The majority of patients (58.5%) underwent band ligation as primary prophylaxis. Red signs appeared in 74%, and hypertensive gastropathy was seen in 95% of patients. There was bleeding following band ligation in 6 (5.4%) of patients, with 2 occurring in group A, 1 in group B, and 3 in group C (p=0.316). The mean MELD score was 13 ± 3.6, with 12.6 ± 3.3 in the group without bleeding, and 16 ± 5.9 in the group with bleeding (p=0.025). When patients with bleeding were compared with those without, there was no statistically significant difference in any parameter for platelet function. Conclusions: The results of the platelet function test SC and AS; VWF and ADAMTS13 tests showed functional compensation for thrombocytopenia, and did not correlate with the risk of bleeding following band ligation of esophageal varices. The MELD score was significantly higher in patients who suffered bleeding

Os hemoderivados têm sido utilizados com frequência cada vez maior na medicina equina, sendo caracterizados como um produto autólogo, com maior quantidade de fatores de crescimento e que melhora a capacidade de cicatrização de tecidos com pouco aporte sanguíneo, como tendões e articulações, diminuindo o tempo de recuperação do animal. Sabe-se que os fatores de crescimento são derivados das plaquetas, porém a correlação positiva entre o aumento na contagem plaquetária e a maior concentração de fatores de crescimento ainda é motivo de discussão entre os autores. Com o intuito de se obter um produto final com maior contagem plaquetária, é frequente o aumento da velocidade ou número de centrifugações na metodologia empregada, aumentando o risco de agregação plaquetária precoce. O objetivo do presente trabalho é estudar o efeito da dupla centrifugação no preparo de PRP, por meio da comparação entre contagens plaquetárias, concentrações de fator de crescimento TGF-&#946;1, e grau de ativação plaquetária por meio da porcentagem de agregação. Foram utilizados 12 equinos, machos, de 3 a 5 anos, clinicamente sadios. Para tanto foram realizados dois protocolos distintos: um com centrifugação única e o outro com dupla centrifugação. No primeiro, o sangue com anticoagulante foi centrifugado a 141G/12 minutos; enquanto no segundo a primeira centrifugação foi de 300G/5 minutos seguida de 700G/15 minutos, com repouso entre as mesmas e após. Os produtos obtidos após cada centrifugação foram submetidos à contagem plaquetária, teste de agregação e quantificação de TGF--&#946;1 por meio de kit ELISA. Os resultados obtidos demonstraram maior concentração plaquetária quando utilizado protocolo de dupla centrifugação. Agregometria evidenciou maior ativação das plaquetas durante o preparo do PRP quando submetidas a maiores velocidades de centrifugação (força gravitacional) e não ao fato das amostras serem centrifugadas duas vezes. A quantificação do TGF--&#946;1 não mostrou diferença quando realizado em amostras com apenas uma centrifugação, mas demonstrou valores maiores no produto final da segunda centrifugação. A avaliação por meio de coeficiente de determinação e coeficiente de correlação de Pearson evidenciou correlação positiva entre contagem plaquetária e de TGF--&#946;1. O protocolo com dupla centrifugação se mostrou mais eficaz em concentrar plaquetas e TGF--&#946;1, não sendo prejudicado pela ativação precoce dessas plaquetas durante o preparo. / Blood derived products have been used in equine medicine with increasing frequency, being characterized as an autologous product, with greater amount of growth factors and be capable of improvement the healing capacity in tissues with poor blood supply, such as tendons and joints, reducing the time of recovery of the animal. It is known that the growth factors are derived from platelets, but the positive correlation between the increase in platelet count and the higher concentration of growth factors is still a reason for discussion among the authors. In order to obtain a final product with a higher platelet count, it is frequent to increase the speed or number of centrifugations in the methodology employed, increasing the risk of early platelet aggregation. The aim of the present study is to verify the effect of double centrifugation in PRP preparation by comparing platelet counts, TGF-&#946;1 growth factor concentrations, and degree of platelet activation through percentage of aggregation. Twelve horses, male, aged 3 to 5 years-old, clinically healthy were subjected. Two different protocols were performed: one with single centrifugation and the other with double centrifugation. In the first one, the anticoagulated blood was centrifugated at 141G/12 minutes; while in the second one the first centrifugation was 300G/5 minutes followed by 700G/15 minutes, with rest between them and after. The products obtained after each centrifugation were submitted to platelet counting, aggregation test and measurement of TGF-&#946;1 by ELISA kit. The results showed a higher platelet concentration when double centrifugation protocol was used. The aggregometry test evidenced a greater activation of the platelets during the preparation of PRP when submitted to higher centrifugation velocities (times g), and not to double centrifugation. Quantification of TGF-&#946;1 showed no difference when performed on samples with only one centrifugation, but was higher values in the final product of the second centrifugation. The determination coefficient and Pearsons correlation coefficient showed a positive correlation between the platelet count and TGF-&#946;1 concentration. The double centrifugation protocol proved to be more effective at concentrating platelets and consequently higher amounts of TGF-&#946;1, not being impaired by early activation during obtainment.

A Na,K-ATPase é uma proteína integral que utiliza a energia derivada da hidrólise do ATP para transportar íons Na+ e K+ através da membrana contra seus gradientes eletroquímicos. É composta por três subunidades, denominadas alfa, beta e gama. Alguns autores defendem que o protômero (alfa-beta) seja a unidade estrutural e funcional da enzima, porém outros consideram que a enzima nativa da membrana funciona como um oligômero, na forma de um dímero (alfa-beta)2. Em estudos com proteínas de membrana, o uso de detergentes é bastante comum para manter a proteína de interesse em um estado funcional após ser retirada da bicamada lipídica, além disso, sabe-se que vários fatores interferem a atividade enzimática da Na,K-ATPase e existem evidências que mostram que a bicamada lipídica, na qual a enzima está inserida, também controla a interação entre os protômeros da proteína e alterações nas suas propriedades biofísicas podem modular a atividade da enzima. O objetivo do trabalho foi verificar o efeito de diferentes razões detergente/proteína na estabilidade da Na,K-ATPase solubilizada e de diferentes microambientes lipídicos na sua atividade, analisando as alterações no comportamento termotrópico da bicamada com a mudança da composição lipídica, observando as alterações da incorporação e recuperação da atividade enzimática quando a proteína foi reconstituída em sistemas miméticos de membrana. Utilizando o espalhamento dinâmico de luz (DLS) foi possível acompanhar o processo de agregação térmica da enzima, fornecendo informações da sua estrutura, bem como avaliar a sua estabilidade quando solubilizada. A desnaturação térmica da Na,K-ATPase também foi avaliada por calorimetria diferencial de varredura (DSC) e verificou-se que é um processo irreversível, e ocorreu entre 50 e 70°C, sendo a soma de três transições. Utilizando DSC, analisou-se ainda o comportamento termotrópico dos sistemas de lipossomos e proteolipossomos constituídos de DPPC, DPPE e colesterol. Para os sistemas vesiculares, na ausência da proteína, foi observado que para o sistema binário de DPPC e DPPE, o aumento da proporção do último lipídio induz uma separação de fase, assim como a presença de colesterol, tanto nos sistemas binários (DPPC:Col e DPPE:Col), quanto no ternário (DPPC:DPPE:Col). Avaliou-se ainda como o microambiente lipídico interfere na incorporação e atividade da Na,K-ATPase. Verificou que diferentes quantidades de colesterol alteram a atividade enzimática, confirmando que este possui um importante papel na modulação da atividade, alterando propriedades da membrana e influenciando na conformação da proteína. / Na,K-ATPase is an enzyme that is intrinsic to the plasma membrane, responsible for the coupled active transport of Na+ and K+ across animal cell membranes. The enzyme consists of alfa, beta and gama subunits. It has been demonstrated that the alfa-beta form of Na,K-ATPase is capable of both ATP hydrolysis and active ion transport, however accumulating evidence suggest that the enzyme normally self-associates as (alfa-beta)2 dimers. In membrane protein research, the most typical use of a detergent is to maintain a target membrane protein in a functional, folded state in the absence of a membrane. Moreover, it is known that several factors influence the enzymatic activity of Na, K-ATPase and there is evidence that the lipid bilayer, in which the enzyme is located, also controls the interaction between protomers and that changes in their biophysical properties can modulate the activity of the enzyme. The objective of this study was to investigate the effect of different detergent/protein ratios on the stability solubilized of Na, K-ATPase and different lipid microenvironments in their activity by analyzing changes in the thermotropic behavior of the bilayer, analysing the incorporation changes and the recovery of enzyme activity when the protein was reconstituted in a membrane mimetic systems. Dynamic light scattering (DLS) was used to monitor the process of thermal aggregation of the enzyme, providing information on their structure and evaluating its stability when solubized. The thermal denaturation of Na, K-ATPase was also evaluated by differential scanning calorimetry (DSC) and it was verified that it is an irreversible process, which occurred between 50 and 70 ° C, being the sum of three transitions. Using DSC, we analyzed the thermotropic behavior of proteolipossomos and liposomes consisting of DPPC, DPPE and cholesterol. For vesicular systems in the absence of the protein, it was observed that for the binary system of DPPC and DPPE, increasing the proportion of the latter induces a lipid phase separation and the presence of cholesterol in both binary systems (DPPC: Col and DPPE: Chol), and in the ternary system (DPPC: DPPE: Chol) it induces a lipid phase separation. It was also evaluated how the lipid microenvironment interferes on the incorporation and activity of Na, K-ATPase. It was found that different amounts of cholesterol alter the enzyme activity, confirming cholesterol has an important role in the modulation of the activity by altering the membrane properties and influencing the protein conformation.

Zabrotes subfasciatus é considerado um dos principais predadores de sementes da espécie Phaseolus vulgaris, causando sérios prejuízos para esta espécie em armazenagem. Este trabalho teve como objetivo conhecer alguns dados do comportamento de oviposição das fêmeas de Z. subfasciatus (Coleoptera, Bruchidae) que ainda são desconhecidos. Foi estudada a oviposição de Z. subfasciatus em P. vulgaris, ao longo de toda a vida e em situações de privação do hospedeiro, logo após a emergência dos adultos, por períodos determinados de 1 a 10 dias. Foi utilizada apenas uma variedade de P. vulgaris: rosinha. O trabalho foi dividido em 2 fases, realizadas concomitantemente. Na primeira fase, foi estudada a variação da oviposição, ao longo do tempo de vida total das fêmeas, sem e com privação do hospedeiro, por até 10 dias, bem como a variabilidade entre as fêmeas dentro de cada grupo, observando as estratégias de cada uma delas no interior de cada grupo. Foram analisados vários parâmetros, como: número de ovos colocados diariamente, a longevidade, o período de oviposição e o número de ovos colocados por cada fêmea dentro de cada grupo. O número de ovos depositados por dia variou estatisticamente, sendo que o pico de oviposição na presença do hospedeiro (Grupo Controle) ocorreu entre o 2o e 5o dia de postura. A longevidade média foi de 11,1&plusmn;1,8; o período de oviposição médio foi de 8,7&plusmn;1,1 dias e o número de ovos colocados por cada fêmea ao longo da vida foi de 37,0&plusmn;9,3. Nos Grupos em que houve privação do hospedeiro, também observou-se que o número de ovos colocados por dia foi diferente estatisticamente, sendo que o pico de oviposição ocorreu sempre no 1o. dia seguinte à privação, com exceção do nível 1, em que o pico ficou entre os dias 1 e 4 (após a presença do hospedeiro). A fecundidade máxima de cada grupo diminuiu, mas só foi diferente estatisticamente a partir do nível 6 (6 dias sem o hospedeiro), sendo que a média foi de 13,9&plusmn;9,2 ovos, quando o tempo de espera foi de 10 dias. Isso sugere que em até 5 dias de privação, Z. subfasciatus consegue manter sua capacidade de postura, graças a uma boa retenção dos seus ovos e, a partir do 6o dia, há, provavelmente, uma reabsorção. A longevidade foi maior nos Grupos de Privação do hospedeiro a partir do nível 3, em relação ao Grupo Controle, mas o período de oviposição foi menor (4,3&plusmn;4,6 dias no nível 10) a partir do nível 1, em relação ao Grupo Controle. O número de ovos colocados por todas as fêmeas, tanto no Grupo Controle como nos de Privação, não diferiu, indicando assim que não há variabilidade intraespecífica dentro de cada grupo. Na segunda fase, o objetivo foi comparar a distribuição dos ovos por grão, no Grupo em que não houve privação do hospedeiro (Controle) e nos Grupos em que houve privação por 2, 5, 8 e 10 dias, respectivamente. Foi constatado que as fêmeas privadas do hospedeiro por 5 e 8 dias apresentaram maior número de grãos com 4 ou mais ovos, no 1o dia de oviposição (1,4 grão em média), em relação ao Grupo Controle e as fêmeas que ficaram privadas do hospedeiro por 2 e 10 dias (0,8 grão em média). Quanto ao número de grãos com 1 ou nenhum ovo, observou-se que o Grupo Controle e os Grupos em que houve privação do hospedeiro por 8 e 10 dias apresentaram um maior número de grãos (3,2 grãos em média) em relação aos demais (2,1 grãos em média), no 1o dia de oviposição. E quanto ao número de ovos no grão com mais ovos, observou-se que ocorreu um maior número de ovos em todos os Grupos Privados (5,1 ovos/ grão em média), em relação ao Grupo Controle (1,9 ovo/ grão, em média). / Zabrotes subfasciatus is considered to be one of the main predators of Phaseolus vulgaris seeds, causing severe damage to this species during storage. The aim of the present study was to investigate some aspects of the oviposition behavior of Z. subfasciatus (Coleoptera, Bruchidae) females that are still unknown. The oviposition of Z. subfasciatus on P. vulgaris was studied along the entire life cycle of the parasite and in situations of host privation, right after the emergence of the adults, for periods of time ranging from one to ten days. Only one variety of P. vulgaris (&quot;rosinha&quot;) was used. The study was divided into two parts carried out concomitantly. In the first part, the variation of oviposition along the total lifetime of the females was studied, with and without host privation up to ten days, as well as the variability among the females inside each group, with individual observation of the strategies of each insect. Several parameters were analyzed: number of eggs laid daily, longevity, oviposition period and number of eggs laid per female inside each group. The number of eggs laid per day varied significantly and the peak oviposition in the presence of the host (Control Group) occurred between the second and the fifth day after deposition. The mean longevity was 11.1 &plusmn; 1.8 days, the mean oviposition period was 8.7 &plusmn; 1.1 days and the number of eggs laid by each female along their lives was 37.0 &plusmn; 9.3. In the groups submitted to host privation the number of eggs deposited per day was significantly different, with peak oviposition occurring always on the first day after privation, except for level 1 where the peak was observed between the first and fourth days (after the presence of the host). The maximum fecundity of each group has reduced, but the difference was statistically significant only when level 6 (six days without the host) and higher levels were reached, the average being 13.9 &plusmn; 9.2 eggs when the waiting time was ten days. This suggests that, for up to five days of privation, Z. subfasciatus is able to maintain its oviposition capacity thanks to the good retention of its eggs. After the sixth day, however, reabsorption is likely to occur. The longevity of the groups submitted to host privation from level 3 to higher levels was longer than the longevity of the Control Group, but the oviposition period from level 1 to higher levels (4.3 &plusmn; 4.6 days at level 10) was lower than in the Control Group. The number of eggs laid by all females in the Control and Privation Groups did not differ, thus indicating that there is no intraspecific variability inside each group. In the second part of the experiment, the aim was to compare the distribution of eggs per grain in the group where there was no host privation (Control) and in the groups where privations of 2, 5, 8 and 10 days were imposed. The females kept under host privation for 5 and 8 days presented a larger number of grains with four or more eggs on the first day of oviposition (average of 1.4 grains) compared with the Control Group and with the females that were kept under host privation for 2 and 10 days (average of 0.8 grains). As regards the number of grains with one or no egg, the Control Group and the groups submitted to host privation for 2 and 10 days presented a larger number of grains (average of 3.2 grains) in relation to the others (average of 2.1 grains) on the first day of oviposition. As regards the number of eggs on the grains with a larger content of eggs, the number of eggs was larger in all the Privation Groups (average of 5.1 eggs/grain) in relation to the Control Group (average of 1.9 eggs/grain).

Neste trabalho estudou-se o comportamento de soluções dos hidrótropos toluenossulfonato de sódio (TSS) e n-butilbenzeno sulfonato de sódio (NBBSNa) quanto a suas características de agregação/associação por Ressonância Magnética Nuclear 1H (RMN 1H), espalhamento de raios-X à baixo ângulo (SAXS), espalhamento de luz estático (SLS) e espalhamento de luz a médios ângulos (WAXS). Medidas realizadas com outros hidrótropos tais como estirenossulfonato de sódio (ESS), salicilato de sódio (SalS) e benzoato de sódio (BS) foram realizadas para comparação dos resultados. O NBBSNa foi sintetizado, purificado e caracterizado. Os experimentos de RMN revelam mudanças no deslocamento químico com a concentração, indicando mudança de ambiente a que as moléculas estão submetidas. Pela técnica de SLS pode-se avaliar o segundo coeficiente do virial das soluções de TSS com e sem a adição de um soluto. Pelas análises de SAXS determinou-se o tamanho do agregado de NBBSNa utilizando ajustes pelo programa SASfit, sendo o resultado comparado com um surfactante clássico dodecilbenzenossulfonato de sódio (DBSNa). O NBBSNa é um sistema de três densidades eletrônicas e esférico. Os demais hidrótropos estudados apresentam comportamento de líquido, sendo observado a correlação das moléculas a curta distância nos experimentos de WAXS. / In this work the behavior of solutions of the hydrotropes sodium toluene sulfonate (TSS) and sodium n-butylbenzene sulfonate (NBBSNa) was studied, concerning the aggregation/association characteristics of this molecules by the use of Nuclear Magnetic Resonance (NMR 1H), small angle x ray scattering (SAXS), static light scattering (SLS) and wide angle x ray scattering (WAXS). Measurements with other hydrotropic molecules like sodium styrene sulfonate (ESS), sodium salicylate (SalS), sodium benzoate (BS) were realized in order to discuss the results. The NBBSNa molecule was synthesized, purified and characterized. The experiments of NMR revealed changes in the chemical shift with the concentration, indicating the changes of the surround environment in what molecules are embedded. For the technique of SLS, the second virial coefficient of the solutions of TSS could be evaluated with and without the addition of a solute. By the SAXS data the size of the aggregate of NBBSNa was determined using the SASfit software. The result was compared with a classic surfactant sodium dodecylbenzene sulfonate (DBSNa). NBBSNa is a spherical system of three electronic densities. All the other hydrotropes studied shows a liquid scattering behavior. By WAXS experiments a correlation of the molecules at short distance was observed.

Dentre os principais avanços na área de ciência ou tecnologia dos materiais podemos ressaltar as atuais técnicas de produção, manipulação e análise de estruturas de tamanho muito reduzido, os quais possuem propriedades físicas (magnéticas, eletrônicas e óticas) diferentes das apresentadas pelos mesmos materiais em estruturas maiores. Nanopartículas (NPs) de metais nobres, principalmente ouro e prata, estão sendo utilizadas e incorporadas em diversas tecnologias que tiram proveito de suas características óticas ou condutivas Neste trabalho apresentamos uma metodologia de preparação de NPs de metais nobres, com a possibilidade de incorporá-las em um material dielétrico. As amostras, produzidas a partir da técnica de agregação gasosa, foram preparadas em um gerador de NPs, construído em um dos canhões de um sistema de magnetron sputtering comercial (AJA Internacional). No gerador, átomos são removidos do alvo e termalizados pelo fluxo do gás de trabalho, se condensando na forma de NPs. As NPs são extraídas do gerador aerodinamicamente e seguem em direção ao substrato. Utilizando um dos outros canhões do nosso sistema de sputtering podemos codepositar as NPs produzidas em uma matriz dielétrica ou metálica. Podemos também depositar camadas de filmes finos sobre o material produzido pelo gerador de NPs. As amostras de nanopartículas de ouro e prata produzidas foram caracterizadas a partir de técnicas de microscopia eletrônica de varredura (MEV), retroespalhamento Rutheford (RBS), espectrofotometria de UV-Visível e microscopia ótica em campo próximo (SNOM). A partir das imagens de MEV, podemos inferir a presença da matriz dielétrica a partir da separação das NPs e essa presença pode ser confirmada pela análise dos resultados de RBS. Por fim a análise do espectro de absorbância das amostras em conjunto com as imagens de SNOM demonstrou o comportamento plasmônico das amostras produzidas, sobretudo das NPs codepositadas em matriz dielétrica. / In the midst of main advances in material science and technology we can highlight the new techniques of preparation, manipulation and analyses of structures of very small size. They have physical properties (magnetic, electronic and optical) different from those presented by the same material, but in bigger dimension. Noble metal nanoparticles, mainly gold and silver, are incorporated into various technologies in order to take advantage of their optical or electric properties. In this work, we present a technique to produce noble metal nanoparticles by a physical method that also permits to imbed them in a dielectric material matrix. The samples, produced using the gas aggregation technique, were prepared in a nanoparticle gun, developed on one of the guns of a commercial magnetron sputtering system (AJA International). In the nanoparticles generator, atoms are removed from the target and thermalized by the flow of the sputtering working gas, and they are also condensed to form the nanoparticles. The nanoparticles are extracted from the generator aerodynamically and then they proceed to the substrate. Using another gun of the sputtering system we can deposit the nanoparticles produced in a dielectric or metallic matrix. We can also deposit under and capping layers of thin films on the nanoparticles layer produced. The samples of gold and silver nanoparticles produced were characterized by scanning electron microscopy (SEM), Rutherford backscattering analysis (RBS), UV-Visible spectrophotometry and near field optical microscopy (SNOM). In the SEM images, from the distribution and morphology of the nanoparticles it was possible infer the presence of the dielectric matrix, and this was also confirmed by the RBS measurements. Finally, absorbance spectrum of the samples together with the SNOM images have demonstrated the plasmonic character of the samples produced, specially for the NPs co-deposited in the dielectric matrix.

Introdução: A interação entre os anticoagulantes e a agregabilidade plaquetária é complexa. Dados laboratoriais prévios mostraram que a dabigatrana aumenta a excreção urinária de metabólito do tromboxano, indicando efeito de ativação de plaquetas. Posteriormente, dados do estudo RELY sugeriram que a dabigatrana 150mg poderia aumentar o risco de infarto do miocárdio em pacientes com fibrilação atrial. Objetivos: Comparar a influência da Dabigatrana e Enoxaparina na agregabilidade plaquetária. Métodos: Estudo prospectivo, intervencionista, realizado em pacientes com doença arterial coronariana (DAC) crônica em uso de aspirina em baixas doses. Os indivíduos foram inicialmente designados para dabigatrana 150mg, 2x/dia, por 5 dias, seguido por um período de washout de 30 dias e depois para exoxaparina 1mg/kg, 2x/dia, por um período adicional de 5 dias. Os testes de função plaquetária foram realizados no início e após cada fase de intervenção, usando agregometria de sangue total p (MEA) (objetivo primário), ELISA para determinação quantitativa de tromboxano B2 (TXB2), Verify Now Aspirin e testes de coagulação (objetivos secundários). Resultados: Em comparação com os valores basais, a dabigatrana aumentou a agregabilidade plaquetária avaliada pelo teste MEA-ASPI (+5U ± 24,1), enquanto a enoxaparina diminuiu a agregabilidade plaquetária (-6U ± 22,2), p=0,012 para a comparação entre os grupos ). O mesmo padrão foi observado usando o ensaio TXB2 (+2pg/mL para dabigatrana, -13pg/mL para enoxaparina, p = 0,011). Não houve diferenças significativas entre os dois grupos em relação aos demais testes. Individualmente, a enoxaparina diminuiu significativamente a agregabilidade plaquetária por TXB2 [33 (16,5 - 95)pg/mL vs. 20 (10-52) pg/mL, respectivamente, p = 0,026), mas não foram observadas diferenças significativas individuais com a dabigatrana em relação aos valores basais. Conclusões: Em relação à agregabilidade plaquetária, há um efeito oposto significativo da dabigatrana (aumento) em comparação com a enoxaparina (diminuição). Individualmente, foi observada uma diminuição significativa na agregabilidade plaquetária apenas com a enoxaparina, quando comparada com valores basais / Background: The interaction between anticoagulants and platelet aggregation is complex. Previous laboratory data have shown that dabigatran increases urinary thromboxane metabolite excretion, indicating platelet-activating effect. Thereafter, data from RELY trial suggested that dabigatran 150mg could enhance the risk of myocardial infarction in atrial fibrillation patients. Objectives: To compare the influence of Dabigatran and Enoxaparin on platelet aggregation. Methods: Prospective, interventional study conducted in chronic coronary artery disease (CAD) patients taking low-dose aspirin. Subjects were assigned initially to dabigatran 150mg bid for 5 days followed by a washout period of 30 days and then to exoxaparin 1mg/kg bid for an additional 5 days period. Platelet function tests were performed at baseline and after each intervention phase using multiple electrode aggregometry (MEA) (primary endpoint), ELISA for plasma quantitative determination of thromboxane B2, Verify Now Aspirin and coagulation tests as secondary endpoints. Results: In comparison with the baseline values, dabigatran increased platelet aggregation evaluated by MEAASPI test (+5U ± 24.1), whereas enoxaparin decreased platelet aggregation (- 6U± 22.2), p=0.012 for the comparison between the groups). The same pattern was observed using theTxB2 assay (+2pg/mL for dabigatran, -13pg/mL for enoxaparin, p=0.011). There were no significant differences between both groups regarding the VerifyNow Aspirin or the other platelet function and coagulation tests utilized. Individually, enoxaparin significantly decreased platelet aggregation by TXB2 [33 (16,5 - 95) pg/mL vs. 20 (10-52) pg/mL, respectivamente, p = 0.026) but no significant differences were observed with dabigatran when individually compared to baseline. Conclusions: Regarding platelet aggregation, there is a significant opposite effect of dabigatran (increase) in comparison with enoxaparin (decrease). Individually, a significant decrease in platelet aggrebability was observed with enoxaparin, but no significant differences were observed with dabigatran

Introdução: Estudos iniciais sugeriram que o risco para tromboembolismo venoso (TV) era atribuído ao componente estrogênico dos contraceptivos de forma dose-dependente. Estudos epidemiológicos têm sugerido que o risco para TV é maior com contraceptivos combinados que contêm progestagênios de terceira geração (gestodeno, desogestrel) comparados com aqueles com progestagênios de segunda geração (levonorgestrel). Esses achados inesperados têm sido alvo de muitos debates sem uma explicação definitiva. Assim, a questão das diferenças nas propriedades de cada progestagênio sobre a hemostasia tem sido levantada. Apesar dos progestagênios não serem associados a alterações marcantes nos parâmetros hemostáticos, existem poucos estudos sobre os efeitos dessas drogas, especialmente os progestagênios de terceira geração, no sistema hemostático. Objetivo: Avaliar o efeito do implante subdérmico de etonogestrel sobre a agregação plaquetária de mulheres hígidas, em seis meses de tratamento. Casuística e Métodos: Vinte e quatro mulheres saudáveis e voluntárias foram selecionadas neste estudo longitudinal e prospectivo, para usar um implante contraceptivo subdérmico de etonogestrel (metabólito biologicamente ativo do desogestrel). A agregação plaquetária foi avaliada em todas as mulheres, exceto uma, no período pré-inserção e após um, três e seis meses da inserção do implante. A agregação plaquetária foi induzida com adrenalina 50 µM, colágeno 10 µg/ml, colágeno 5 µg/ml, ADP 35 µM e ADP 17,5 µM. A análise estatística foi feita com o teste de Wilcoxon para comparar a diferença entre cada período de tratamento com os valores pré-tratamento. Resultados: Houve uma redução transitória, estatisticamente significativa, na mediana do percentual máximo de agregação plaquetária de 27%, 14% e 11%, respectivamente, com colágeno 5 µg/ml, adrenalina 50 µM e colágeno 10 µg/ml, observada um mês após a inserção do implante comparado ao valor pré-inserção (p< 0,05). A agregação plaquetária com esses agonistas retornou ao seu valor basal, após seis meses da inserção. Com outros agonistas, como o ADP 35 µM e ADP 17,5 µM, não se observou o mesmo fenômeno. Conclusão: Os resultados deste estudo mostram, pela primeira vez, que o uso do implante de etonogestrel está associado à redução transitória, mas significativa, da agregação plaquetária, observada em um mês de uso do contraceptivo, a qual retorna a seus valores normais em seis meses da inserção do implante. / Introduction: Several studies have suggested that the risk of venous thromboembolism (VTE) is attributable to the estrogen component of a contraceptive in a dose-dependent manner. Recent epidemiological studies have suggested that the risk of VTE was higher with contraceptives containing third-generation progestagens (desogestrel, gestodene) when compared with second-generation progestagens (levonorgestrel). These unexpected findings have been the subject of many debates with no definitive explanation and the question of differences in hemostatic properties of each progestagen has been raised. Although progestagens are not associated with marked changes in hemostatic variables, there are few studies on the effects of these drugs, especially third-generation progestagens, on the hemostatic system. Objective: To evaluate the acute effect of a long-term contraceptive implant of etonogestrel on platelet aggregation in healthy women. Material and Methods: Twenty-four healthy volunteer women were enrolled in this prospective longitudinal study, to use a subdermal contraceptive implant of etonogestrel (the biologically active metabolite of desogestrel). Platelet aggregation was measured in all users, except one, at baseline and after 1, 3 and 6 months of treatment. Platelet aggregation was induced with 50 µM adrenalin, 10 µg/ml collagen, 5µg/ml collagen, 35 µM ADP and 17,5 µM ADP. Statistical analysis included the Wilcoxon test to compare differences between each period of treatment from baseline. Results: Statistically significant 27%, 14% and 11% reductions of platelet aggregation with 5 µg/ml collagen, 50 µM adrenalin e 10 µg/ml collagen, respectively, were observed at 1 month of treatment (p < 0,05). Platelet aggregation returned to baseline values at 6 months of treatment with these reagents. Platelet aggregation did not show any statistic difference with ADP. Conclusions: The result of this study shows for the first time that an etonogestrel implant is associated with a transitory, but significant, reduction in platelet aggregation after the first month of treatment, which returns to normal values by 6 months of therapy.