Diss. (sammanfattning) Stockholm : Karol. inst., 2004. / Härtill 5 uppsatser.

Diss. (sammanfattning) Stockholm : Karol. inst., 2004. / Härtill 4 uppsatser.

Diss. (sammanfattning) Stockholm : Karol. inst., 2004. / Härtill 6 uppsatser.

Diss. (sammanfattning) Stockholm : Karolinska institutet, 2006. / Härtill 4 uppsatser.

Les récepteurs nucléaires de l’acide rétinoïque (AR) appelés RAR, se comportent comme des facteurs de transcription inductibles par le ligand. La transcription des gènes cibles induite par l’AR, nécessite la fixation des RAR au niveau de séquences spécifiques des promoteurs et met en jeu des changements conformationnels des récepteurs qui contrôlent l’association/dissociation de toute une panoplie de corégulateurs. Cependant, en plus de ce modèle génomique et nucléaire bien établi, l’équipe du Dr Cécile Rochette-Egly a montré récemment que l’AR a aussi des effets non-génomiques et induit rapidement la voie de signalisation p38MAPK/MSK1 qui ensuite cible les RAR pour des cascades de phosphorylations et module la transcription des gènes cibles. Pendant mon travail de thèse, j’ai mis en exergue trois nouveaux concepts originaux du mécanisme d’action du sous-type RARα. J’ai montré qu’une sous-population de RARα est présente dans des microdomaines membranaires, les radeaux lipiques ou “lipid rafts”où elle interagit avec les protéines Gαq. Cette interaction est le signal des effets non génomiques de l’AR, l’activation de la voie de la p38MAPK. Ces effets ont été corrélés à l’activité des gènes cibles de l’AR, prouvant ainsi leur nécessité. J’ai identifié un nouveau partenaire de RARα, la profiline IIA. J’ai analysé le mécanisme moléculaire de l’interaction et démontré qu’elle a lieu dans le noyau. La profiline IIA s’est révélée être un régulateur des effects génomiques de RARα et est recrutée avec RARα au niveau des promoteurs des gènes cibles. Finalement j’ai mis en évidence une nouvelle fonction de RARα dans le contrôle de l’adhésion et de l’étalement des cellules. D’où l’hypothèse de nouveaux effets génomiques de RARα avec la profiline IIA dans le contrôle de l‘expression des protéines d’adhésion. Cependant, de manière inattendue, j ‘ai identifié une nouvelle population de RARα dans le cytoplasme de ces cellules. D’où l’hypothèse de nouveaux effets non génomiques dans le cytoplasme, via l’interaction de RARα avec des protéines d’adhésion. / Nuclear retinoic acid (RA) receptors (RARs) are ligand-dependent regulators of transcription. Their transcriptional activity relies mainly on their recruitment to specific DNA response elements and on their interactions with several coregulators at the ligand-binding domain. In addition to these classical genomic effects, the team of C. Rochette-Egly demonstrated that RA also induces the rapid activation of the p38MAPK/MSK1 pathway with characteristic downstream consequences on thephosphorylation of RARs and the expression of their target genes. Here I highlighted three novel paradigms in the field of the RARα subtype. I found that a fraction of the cellular RARα pool is present in membrane lipid rafts, where it interacts with G protein alpha Q in response to RA. This interaction is the signal for nongenomic effects, i.e. the activation of p38MAPK and of the downstream kinase MSK1. These effects have been correlated to the activation of RA-target genes, highlighting its physiological relevance. I identified a new binding partner of RARα, profilin IIA. I deciphered the mechanism of the interaction and found that it occurs in nuclei. Remarkably, profilin IIA modulates positively the genomic effects of RARα and is recruited with RARα to target genes promoters. Finally, in an attempt to decipher the relevance of the RARα interaction with profilin IIA, I found that RARα controls cell adhesion and spreading. This might suggest a novel genomic functionof RARα and profiling in the control of the expression of genes involved in adhesion. However, preliminary experiments indicate that a pool of RARα is present in the cytosol, suggesting also novel nongenomic effects. Whether RARα controls adhesion via its interaction in the cytosol proteins involved in adhesion will require further investigations.

Le criblage virtuel est largement employé pour la recherche de nouveaux médicaments.La sélection de structures pour les méthodes de criblage virtuel basées sur la structure reste problématique. Nous avons montré que les propriétés physico-chimiques du site de liaison, critères simples et peu coûteux en temps de calcul, pouvaient être utilisées pour guider celle-ci.L’évaluation des méthodes de criblage virtuel, critique pour vérifier leur fiabilité, repose sur la qualité de banques d’évaluation. Nous avons construit la NRLiSt BDB, n’incluant que des données vérifiées manuellement et prenant en compte le profil pharmacologique des ligands. Une étude à l’aide du logiciel Surflex-Dock montre qu’elle devrait devenir la base de données de référence, pour l’évaluation des méthodes de criblage virtuel et pour rechercher de nouveaux ligands des récepteurs nucléaires. L’application d’un protocole hiérarchique de criblage in silico/in vitro, a permis d’identifier de nouveaux composés inhibiteurs de l’IL-6, potentiellement utilisables dans le traitement de la polyarthrite rhumatoïde. Les résultats in vitro devront être confirmés par des tests in vivo. / Virtual screening is widely used in drug discovery processes.Structure selection in structure-based virtual screening methods is still problematic. We showed that simple and “low cost” binding site physico-chemical properties could be used to guide structure selection.The evaluation of virtual screening methods, necessary to ensure their reliability, relies on benchmarking databases quality. We created the NRLiSt BDB, gathering only manually curated data and taking into account ligands pharmacological profiles. A study using Surflex-Dock showed that the NRLiSt BDB should become the reference, both for the evaluation of virtual screening methods and for the identification of new ligands of the nuclear receptors.The use of a in silico/invitro hierarchical approach screening allowed to identify new IL-6 inhibitors, that could be used in rheumatoid arthritis treatment. In vitro results should be confirmed in vivo.

Made available in DSpace on 2014-12-17T15:32:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ThamaraMMB_DISSERT.pdf: 1856423 bytes, checksum: d77238963a3bf6663f56d36a18db57b6 (MD5) Previous issue date: 2014-02-27 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior / Th17 cells have been strongly associated to the pathogenesis of inflammatory and autoimmune diseases, although their influence on the carcinogenesis is still little known, there are reports of anti-tumor and protumoral actions. The objective of this study is to research the presence of Th17 lineage in lip and tongue SCC, using the analysis of the immunoexpression of IL-17 and ROR?t, relating this immunoexpression with clinical and morphological findings in the attempt to better comprehend the role of these cells on the tumoral immunity of OSCCs. The results were submitted to non-parametric statistical tests with significance level of 5%. On the histomorphological analysis, it was observed the predominance of low level lesions on lip and high level lesions on tongue (p=0,024). It was not observed statistical significance between clinical stage and histological gradation of malignancy (p=0,644). For the immunohistochemical study, 5 random fields with greater immunoreactivity of the peritumoral inflammatory infiltrate were photomicrographed on the 400x magnification. It was done the count of lymphocytes which showed cytoplasmic and pericytoplasmic staining for the IL-17 cytokine as well as nuclear and cytoplasmic staining for ROR?t. It was observed statistical significance difference on the quantity of immunopositive lymphocytes to IL-17 between the groups of SCC of lip and tongue (p=0,028). For the ROR?t it was not observed statistical significance difference between the groups of SCC of lip and tongue (p=0,915). It was not observed statistical difference between the immunostaining of IL-17 and ROR?t with histological gradation of malignancy and clinical staging. The findings of this research suggest a possible anti-tumor role of IL-17 for cases of lip. The results of the analysis of the ROR?t are possibly due to the wide duality of the anti-tumor and protumoral role of the Th17 cells and their plasticity which, in the presence of different cytokines expressed on the tumor microenvironment, can alter its phenotype. / As c?lulas Th17 t?m sido fortemente associadas ? patogenia de doen?as autoimunes e inflamat?rias, por?m sua influ?ncia na carcinog?nese ainda ? pouco conhecida, havendo relatos de suas a??es tanto antitumorais quanto pr?-tumorais. O objetivo do presente trabalho foi pesquisar a presen?a da linhagem Th17 intratumoral em CCE de l?bio e l?ngua, atrav?s da an?lise da imunoexpress?o da IL-17 e do ROR?t, relacionando estes achados com dados cl?nicos e morfol?gicos na tentativa de melhor compreender o papel dessas c?lulas na imunidade tumoral dos CCEOs. Na an?lise histomorfol?gica, observou-se predom?nio de les?es de baixo grau em l?bio e de alto grau em l?ngua (p = 0,024). N?o foi observada signific?ncia estat?stica entre estadiamento cl?nico e grada??o histol?gica de malignidade (p = 0,644). Para o estudo imunoistoqu?mico, 5 campos aleat?rios com maior imunorreatividade do infiltrado inflamat?rio peritumoral foram fotomicrografados no aumento de 400x. Realizou-se a contagem de linf?citos que exibiram marca??o citoplasm?tica e pericitoplasm?tica para a citocina IL-17 bem como nuclear e citoplasm?tica para o ROR?t. Foi observada diferen?a estatisticamente significativa na quantidade de linf?citos imunopositivos para IL-17 entre os grupos de CCE de l?bio e l?ngua (p = 0,028). Para o ROR?t n?o foi observada diferen?a estatisticamente significativa entre os grupos de CCE de l?bio e l?ngua (p = 0,915). N?o foi observada diferen?a estat?stica entre a imunomarca??o da IL-17 e ROR?t com grada??o histol?gica de malignidade e com estadiamento cl?nico. Os achados dessa pesquisa sugerem um poss?vel papel antitumoral da IL-17 para os casos de l?bio. Os resultados da an?lise do ROR?t, possivelmente se devem ? ampla dualidade do papel pr?-tumoral e antitumoral das c?lulas Th17 e ? sua plasticidade que, na presen?a de diferentes citocinas expressas no microambiente tumoral, podem alterar seu fen?tipo

L’acide rétinoïque (AR) est le dérivé actif majeur de la vitamine A et a de multiples rôles au niveau cellulaire ainsi que pendant le développement. L’AR agit via deux familles de récepteurs nucléaires : les Récepteurs de l’Acide Rétinoïque (RAR) et les Récepteurs X des Rétinoïdes (RXR). Ces récepteurs sont des facteurs de transcription dépendants du ligand et leur activité est régulée par des phosphorylations via des kinases activées par l’AR. Durant ma thèse, je me suis intéressé à l’étude fonctionnelle et évolutive de la voie de l’AR et de la phosphorylation des RAR chez le poisson-zèbre Danio rerio. En étudiant l’activité des différents sous-types de RAR chez le poisson-zèbre, nous avons mis en avant qu’il existe une activité transcriptionnelle propre à chaque sous-type dans un embryon précoce de poisson-zèbre. De plus, mes travaux ont montré qu’au cours de l’évolution, l’acquisition d’un site de phosphorylation chez RARα permet une régulation fine de son activité chez les mammifères. Enfin, en étudiant les mécanismes moléculaires à l’origine de la diversification de la denture chez les poissons, mes travaux mettent en avant un rôle de la voie de l’AR dans la genèse de nouveaux traits phénotypiques. / Retinoic acid (RA) is the main active metabolite of vitamin A and plays multiple roles in cellular processes but also during embryonic development. RA acts through two families of nuclear receptors: Retinoic Acid Receptors (RAR) and Retinoid X Receptors (RXR). Those receptors act as ligand-dependent transcription factors and their transcriptional activity is also regulated by phosphorylation processes through kinases activated by RA. During my PhD, I focused on the functional and evolutionary study of RA pathway and of the phosphorylation of RARs using zebrafish (Danio rerio). By studying the activity of the different RAR subtypes in zebrafish, we provide evidences that they can regulate gene expression in a subtype-specific fashion in the early zebrafish embryo. Furthermore, my work showed that during evolution, the acquisition of a phosphorylated residue in RARα promotes the fine-tuned regulation of its activity in mammals. Finally, aiming at deciphering the molecular mechanisms behind dentition diversification in fish, we propose a role for RA signaling in generating morphological novel traits during evolution.

Les récepteurs nucléaires sont des facteurs de transcription régulant l’expression de gènes impliqués dans plusieurs processus physiologiques. En général, ces récepteurs sont activés par une interaction avec un ligand spécifique, mais leur activité peut également être modulée par des modifications post-traductionnelles comme la SUMOylation. Notre laboratoire a récemment trouvé que le récepteur des estrogènes ER est une cible de cette modification sur un site de SUMOylation atypique nommé pSuM. Ce site non-consensus se retrouve également sur Nor-1, un récepteur nucléaire impliqué dans une variété de processus physiologiques comme le métabolisme du glucose, la prolifération cellulaire ainsi que la survie neuronale. Pour l’instant, le rôle de ce motif atypique reste inconnu et aucune évidence n’indique que Nor-1 est SUMOylé dans la littérature. Nos objectifs étaient donc de déterminer le potentiel de SUMOylation de Nor-1 sur son pSuM dans un contexte neuronal et de caractériser l’effet de la SUMOylation sur l’activité transcriptionnelle de Nor-1 ainsi que l’expression de gènes cibles. Nos résultats ont démontré que Nor-1 peut effectivement être SUMOylé sur son pSuM, que cette SUMOylation est dépendante d’une phosphorylation de la sérine-139 et que la voie des MAPK augmente l’état global de SUMOylation de Nor-1 ainsi que son expression protéique. De plus, les résultats ont indiqués que Nor-1 peut conjuguer deux isoformes de SUMO, soit SUMO-1 et SUMO-2. Les résultats démontrent également que la SUMOylation augmente l’activité transcriptionnelle de Nor-1 et que la SUMOylation de son site pSuM est importante pour le maintien de son activité transcriptionnelle basale. Nos résultats préliminaires suggèrent que la SUMOylation du pSuM de Nor-1 affecte l’expression de gènes cibles comme l’énolase-3 ce qui propose un rôle de la SUMOylation de Nor-1 dans la régulation du métabolisme des neurones. En conclusion, les résultats de ce projet permettent d'identifier un nouveau processus de SUMOylation impliqué dans la régulation des récepteurs nucléaires et de Nor-1 suggérant un rôle de ce processus de SUMOylation atypique dans plusieurs réseaux géniques et processus physiologiques. / Nuclear hormone receptors are transcription factors that regulate the expression of many genes implicated in a wide variety of physiological functions. They are generally activated by an interaction with a specific ligand but their activity can also be modulated by post-translational modifications such as SUMOylation. Recently, our laboratory identified ER as a SUMOylation target on an atypical SUMOylation motif named pSuM. This non-consensus SUMOylation motif was also found on Nor-1, a nuclear receptor implicated in physiological processes such as glucose metabolism, cellular proliferation and neuronal survival. Until now, the function of this pSuM motif is still unknown and there are no evidence that Nor-1 is a target of SUMOylation. Therefore, the objectives of this work were to determine the SUMOylation potential of Nor-1 on his pSuM in a neuronal context and to characterize the effect of SUMOylation on Nor-1 transcriptional activity and target genes expression. Our results showed that Nor-1 can indeed be SUMOylated on his pSuM, that this SUMOylation was dependent on serine-139 phosphorylation, and that the MAPK pathway augmented the global SUMOylation state of Nor-1 and its protein expression levels. Furthermore, we demonstrated that Nor-1 can conjugate SUMO-1 and SUMO-2. Our results also indicated that SUMOylation activates the transcriptional activity of Nor-1 and that the pSuM site of Nor-1 was important in maintaining its basal transcriptional activity. Preliminary results suggests that Nor-1 SUMOylation on the pSuM has an impact on the expression of target genes such as enolase-3, suggesting a potential role for Nor-1 in the regulation of the metabolism of neurons. In conclusion, the results presented in this work identify a new SUMOylation process implicated in regulating Nor-1 and nuclear receptors activities, suggesting an extended role of this atypical SUMOylation process in many gene networks and physiological processes.

Depuis le début des années 1990, de nombreuses équipes de recherche ont consacré leurs travaux à étudier les effets des perturbateurs endocriniens (PEs) sur l'homme et les espèces animales. Plusieurs polluants libérés dans l’environnement tels que les pesticides, les herbicides, les plastifiants industriels ou les résidus de médicaments ont ainsi le potentiel de perturber les équilibres hormonaux des organismes, induisant ainsi de graves conséquences sur leur développement et leur reproduction. Pour lutter contre ces dommages, diverses réglementations spécifiques et des systèmes de criblages se mettent en place pour détecter ces molécules. Ces systèmes doivent être rapides et fiables et les poissons téléostéens comme le medaka ou le poisson zèbre constituent d'excellents modèles pour détecter la présence de ces molécules et étudier leurs effets in vivo. Durant cette thèse nous avons étudié l’impact de certains PEs sur le développement embryonnaire en utilisant le poisson zèbre et le médaka comme modèle. Nous avons pu caractériser l'action du Bisphenol A sur la formation des otholites de l’oreille interne du poisson zèbre. En alliant des approches pharmacologiques et génétiques, nous avons identifié le récepteur nucléaire orphelin ERR comme une nouvelle cible in vivo de cette molécule. En parallèle, nous avons développé des lignées transgéniques rapportrices de médaka permettant de détecter la présence de polluants à activités androgénique ou anti-androgénique ce qui accroît ainsi la gamme des outils disponibles pour évaluer la présence des PEs dans les effluents liquides. / Since the early 1990s, many research teams have devoted their work to study the effects of endocrine disruptors (EDCs) in humans and animal species. Many pollutants released into the environment such as pesticides, herbicides, industrial plasticizers or drug residues have the potential to disrupt bodies’ hormonal balances, thus inducing a severe impact on their development and reproduction. To fight against these damages, various specific regulations and screening systems are setting up to detect these molecules. These systems must be fast, reliable. Teleost fish such as medaka and zebrafish are excellent models to detect the presence of these molecules and study their effects in vivo. In this thesis, we studied the impact of certain EDCs on the embryonic development using zebrafish and medaka as models. We characterized the action of Bisphenol A on the otoliths formation in the inner ear of zebrafish. By combining genetic and pharmacological approaches, we identified the orphan nuclear receptor ERRγas a new target of this molecule in vivo. In parallel, we have developed reporter transgenic lines of medaka to detect the presence of pollutants containing androgenic or anti-androgenic activities and thereby increasing the range of tools available to assess the presence of EDCs in liquid effluents.