Movimentos coletivos prestam um papel fundamental na dinâmica e energética de biomoléculas em solução. Estes movimentos permitem o acoplamento de regiões significativamente distantes, apresentando considerável influência, por exemplo, no alosterismo para a formação de complexos macromoleculares e no funcionamento integrado de proteínas multidomínios como \"máquinas moleculares\". Neste trabalho de doutoramento, serão apresentados os resultados referentes à aplicação conjunta de técnicas experimentais biofísicas, de modelagem estrutural e de dinâmica molecular no estudo de dois sistemas para os quais estes movimentos coletivos demonstram considerável importância funcional. Para a interação do receptor nuclear do ácido 9-cis-retinóico com seu elemento responsivo específico no DNA (HRE), a comparação de estudos de dinâmica molecular com ensaios de afinidade por anisotropia de fluorescência sugere que a resistência inicial para a associação do monômero, seguida da acentuada colaboratividade na associação do dímero é regida por um impedimento da associação do domínio de ligação ao DNA (DBD) para o primeiro à sequência responsiva devido, em última análise, a uma não complementaridade dos modos coletivos mútuos. Este impedimento para a associação monomérica inicial é mais acentuado para o monômero 5\' (para o qual a menor especificidade de ligação à seqüência específica já é bem documentada), devido aos efeitos conjuntos de um \"defeito\" natural no empacotamento de bases da seqüência responsiva, que se manifesta mais significativamente na interface entre o meio-sítio 5\' e a seqüência espaçadora, e dos modos vibracionais entre os dois sítios decorrentes de seu faseamento relativo na topologia do DNA na seqüência responsiva, caracterizando um mecanismo \"chave e fechadura\" para a interação obrigatoriamente simultânea dos dois monômeros ao DNA. No segundo caso, um estudo integrado utilizando a técnica experimental de espalhamento de raios X a baixos ângulos e uma abordagem de modelagem estrutural baseada em dinâmica molecular foi realizado para a celobiohidrolase I de Trichoderma harziannum. Este estudo permitiu tanto a elaboração de um modelo estrutural de maior resolução para esta enzima de alto potencial biotecnológico como a constatação dos possíveis mecanismos moleculares a partir dos quais as glicosilações no peptídeo conector impõem restrições à orientação e modos vibracionais entre seus dois domínios de forma condizente com sua ação concertada na interação e no deslize da enzima sobre a superfície celulósica, ambos de fundamental importância para a processividade da enzima na hidrólise do substrato microcristalino. / Collective motions play a fundamental role in solution biomolecule dynamics and energetics. These movements can couple very distant regions in the protein structures affection, for instance, allosteric mechanisms, the establishment of macromolecular complexes, and on the integrated function of multidomain proteins as molecullar machines. In this thesis, we present results concerning to the joint use of experimental biophysical techniques, structural modeling and molecular dynamics simulations on the study of two systems for which these collective motions have substantial importance. First, we study the interaction of the nuclear retinoid X receptor with its specific DNA hormone response element (HRE) using a combination of molecular dynamics simulations and affinity assays performed by using fluorescence anisotropy. We find out that collective motions mediate the low binding affinity of monomers and the high cooperative binding of HRE dimers. The lower binding affinity of the monomer is more prominent for 5´ monomers. This occur due to an natural ineffective stacking of the last base pair step at the 5´-half-site and to the phasing of the two binding half-sites in the DNA topology, that impose a collective motions that tends to occlude the 5´ binding site. This behavior, in turn, is concurrent with the well known 3´ polarity and the decreased binding specificity to the 5´ half site for the hRXRα monomer. This same pattern impose a lock-and-key mechanisms dependent on the binding of the full dimer. Second, an integrated Small angle X ray scattering and molecular dynamics based structural modeling was used to comprehend the interdomain motions of cellobiohydrolase I of Trichoderma harziannum. We manage to build a refined model for this enzime, with important biotechnological potential. We also provide insights into molecular mechanisms of linker and glycosylation imposed restraints on the orientation and vibrational modes of the full-length enzyme, supporting a mechanism of sliding of on the cellulose surface. This mechanism is fundamental for the high processivity on the hydrolysis of microcrystalline cellulose.

Trois protéines de la famille TRIM (Motif TRIpartite), TIF1α, β (Transcriptional Intermediary Factor 1) et PML (ProMyelocytic Leukaemia¬), font l’objet de cette étude. TIF1α est connu comme un coactivateur des récepteurs nucléaires et TIF1β comme le corépresseur universel des protéines KRAB-multidoigt de zinc dont le prototype étudié ici est ZNF74. PML possède divers rôles dont le plus caractérisé est celui d’être l’organisateur principal et essentiel des PML-NBs (PML-Nuclear Bodies), des macrostructures nucléaires très dynamiques regroupant et coordonnant plus de 40 protéines. Il est à noter que la fonction de TIF1α, β et PML est régulée par une modification post-traductionnelle, la sumoylation, qui implique le couplage covalent de la petite protéine SUMO (Small Ubiquitin like MOdifier) à des lysines de ces trois protéines cibles. Cette thèse propose de développer des méthodes utilisant le BRET (Bioluminescence Resonance Energy Transfert) afin de détecter dans des cellules vivantes et en temps réel des interactions non-covalentes de protéines nucléaires mais aussi leur couplage covalent à SUMO. En effet, le BRET n’a jamais été exploré jusqu’alors pour étudier les interactions non-covalentes et covalentes de protéines nucléaires. L’étude de l’interaction de protéines transcriptionnellement actives est parfois difficile par des méthodes classiques du fait de leur grande propension à agréger (famille TRIM) ou de leur association à la matrice nucléaire (ZNF74). L’homo et l’hétérodimérisation de TIF1α, β ainsi que leur interaction avec ZNF74 sont ici testées sur des protéines entières dans des cellules vivantes de mammifères répondant aux résultats conflictuels de la littérature et démontrant que le BRET peut être avantageusement utilisé comme alternative aux essais plus classiques basés sur la transcription. Du fait de l’hétérodimérisation confirmée de TIF1α et β, le premier article présenté ouvre la possibilité d’une relation étroite entre les récepteurs nucléaires et les protéines KRAB- multidoigt de zinc. Des études précédentes ont démontré que la sumoylation de PML est impliquée dans sa dégradation induite par l’As2O3 et dépendante de RNF4, une E3 ubiquitine ligase ayant pour substrat des chaînes de SUMO (polySUMO). Dans le second article, grâce au développement d’une nouvelle application du BRET pour la détection d’interactions covalentes et non-covalentes avec SUMO (BRETSUMO), nous établissons un nouveau lien entre la sumoylation de PML et sa dégradation. Nous confirmons que le recrutement de RNF4 dépend de SUMO mais démontrons également l’implication du SBD (Sumo Binding Domain) de PML dans sa dégradation induite par l’As2O3 et/ou RNF4. De plus, nous démontrons que des sérines, au sein du SBD de PML, qui sont connues comme des cibles de phosphorylation par la voie de la kinase CK2, régulent les interactions non-covalentes de ce SBD mettant en évidence, pour la première fois, que les interactions avec un SBD peuvent dépendre d’un évènement de phosphorylation (“SBD phospho-switch”). Nos résultats nous amènent à proposer l’hypothèse que le recrutement de PML sumoylé au niveau des PML-NBs via son SBD, favorise le recrutement d’une autre activité E3 ubiquitine ligase, outre celle de RNF4, PML étant lui-même un potentiel candidat. Ceci suggère l’existence d’une nouvelle relation dynamique entre phosphorylation, sumoylation et ubiquitination de PML. Finalement, il est suggéré que PML est dégradé par deux voies différentes dépendantes de l’ubiquitine et du protéasome; la voie de CK2 et la voie de RNF4. Enfin une étude sur la sumoylation de TIF1β est également présentée en annexe. Cette étude caractérise les 6 lysines cibles de SUMO sur TIF1β et démontre que la sumoylation est nécessaire à l’activité répressive de TIF1β mais n’est pas impliquée dans son homodimérisation ou son interaction avec la boîte KRAB. La sumoylation est cependant nécessaire au recrutement d’histones déacétylases, dépendante de son homodimérisation et de l’intégrité du domaine PHD. Alors que l’on ne connaît pas de régulateur physiologique de la sumoylation outre les enzymes directement impliquées dans la machinerie de sumoylation, nous mettons en évidence que la sumoylation de TIF1β est positivement régulée par son interaction avec le domaine KRAB et suggérons que ces facteurs transcriptionnels recrutent TIF1β à l’ADN au niveau de promoteur et augmentent son activité répressive en favorisant sa sumoylation. / Three TRIM proteins (TRIpartite Motif), TIF1α, β (Transcriptional Intermediary Factor 1) and PML (ProMyelocytic Leukaemia¬), were studied in this thesis. TIF1α is a nuclear receptor coactivator and TIF1β is the universal corepressor of the KRAB-zinc finger repressor family of which, ZNF74 is studied here as a prototypic member. PML functions as a tumor suppressor and is the essential organiser of PML-NBs (PML-Nuclear Bodies) which are very dynamic nuclear macrostructures containing more than 40 proteins. The function of these three TRIM proteins is regulated by sumoylation, a post-translational modification involving the covalent linkage of SUMO (Small Ubiquitin like MOdifier) to specific targets lysine. In this thesis, we propose to develop new methods based on BRET (Bioluminescence Resonance Energy Transfer) to detect non-covalent nuclear protein interactions but also covalent linkage to SUMO in real time in living cells. To date, BRET was never used to assess non-covalent or covalent nuclear protein interactions. Studying transcriptionally active protein interactions represents a challenge by classical methods in particular when proteins have a tendency to aggregate (TRIM family) or when characterizing nuclear matrix proteins (ZNF74). In the first article, homo- and heterodimerisation of TIF1 α and β as well as their interaction with ZNF74 was assessed by BRET using full length proteins in living mammalian cells. We ascertained the heterodimerisation of TIF1α and β. Whereas ZNF74 interacts strongly with TIF1β, no interaction was detected with TIF1α. However, we unravelled the existence of ternary complexes involving ZNF74, TIF1α and TIF1β. This suggested that a mechanisms for cross-talk between nuclear receptors and KRAB-zinc finger proteins. Thus, we showed that BRET can be advantageously used as a non-transcription-based interaction system for studying transcriptionally active proteins, including nuclear matrix proteins, in living cells. Previous studies have shown that the sumoylation of PML (a tumour suppressor) is involved in its proteasome degradation that is As2O3-inducible and dependent on the polySUMO E3 ubiquitin ligase, RNF4. In the second article, we describe the development of a new application of the BRET method for the detection of covalent and non-covalent interactions with SUMO. Owing to this SUMO BRET assay, we established that the As2O3 / RNF4-mediated degradation of PML, not only depends on PML sumoylation as previously demonstrated, but also on the integrity of its SUMO binding domain. We also demonstrated that As2O3 which increases PML sumoylation, also enhances PML / RNF4 interaction. Our study revealed that most PML SBD non covalent interactions with sumoylated proteins required the phosphorylation of serines within PML SBD that were previously described as target sites for CK2 kinase and involved in PML degradation. Despites the involvement of PML SBD in RNF4-mediated degradation, these serines which function as an SBD phospho-switch, were not required for RNF4-mediated degradation. This suggested that CK2- and RNF4-mediated PML degradation represents two distinct pathways triggering PML ubiquitin / proteasome-dependent degradation. At last, our study led to the hypothesis that the recruitment of sumoylated PML at PML-Nuclear Bodies subnuclear structures via the PML SBD and / or possibly an E3 ubiquitin ligase activity other than RNF4 (PML itself being candidate) may favour PML degradation. Our study also stresses the dynamic involvement of three PML post-translational modifications, phosphorylation, sumoylation and ubiquitination in its degradation. A third article addressing the role of TIF1β sumoylation is presented in the Appendix. We characterized the 6 SUMO targets lysine of TIF1β and demonstrated that sumoylation is required for TIF1β transcriptional repressive activity. This is in part explained by the fact that TIF1β sumoylation is a pre-requisite for histone deacetylases recruitment since TIF1β repressive activity is partly dependent on histone deacetylases. We found that TIF1β sumoylation does not influence its homodimerisation or interaction with the KRAB box of KRAB zinc finger proteins recruiting TIF1β to promoters. TIF1β sumoylation is however relying on the integrity of TIF1β PHD finger and on its self-oligomerisation. Interestingly, we demonstrated that TIF1β sumoylation is positively regulated by its interaction with KRAB domain. It is thus suggested that KRAB-zinc finger proteins recruit TIF1β at DNA promoters where they trigger increase of TIF1β sumoylation and thus enhance its repressive activity.

L’adaptation de l’organisme à son environnement est essentielle à sa survie. L’homéostasie énergétique permet l’équilibre entre les apports, les dépenses et le stockage d’énergie. Un surplus calorique important dérègle ce processus et mène au développement du syndrome métabolique caractérisé, entre autres, par une obésité, un diabète de type II, des maladies cardiovasculaires et des dyslipidémies. La ghréline participe au maintien de l’équilibre énergétique durant le jeûne en stimulant la production de glucose par le foie et le stockage lipidique dans le tissu adipeux. Le coactivateur transcriptionnel PGC-1alpha, surexprimé en situation de jeûne, est impliqué dans l’induction de la production de glucose par le foie et l’oxydation des acides gras. Notre hypothèse est que ces deux acteurs clés du métabolisme énergétique constituent un axe de régulation commun. Dans cette étude, nous montrons que la ghréline participe à la régulation de PGC-1alpha. Son récepteur GHS-R1a, possédant une forte activité constitutive, est également impliqué de façon indépendante au ligand. GHS-R1a réduit l’activité transcriptionnelle de PGC-1alpha tandis que l’ajout du ligand inverse modérément cette action. L’effet de GHS-R1a corrèle avec l’acétylation de PGC-1alpha qui est fortement augmentée de façon dose-dépendante. La stabilité de PGC-1alpha est également augmentée par le GHS-R1a indépendamment de l’ubiquitine. La ghréline diminue la capacité de PGC-1alpha à lier PPARbeta, un récepteur nucléaire partenaire de PGC-1alpha. De plus, la ghréline réduit, de façon ligand-dépendante, la capacité de coactivation de PGC-1alpha sur PPARbeta dans les hépatocytes. L’ensemble de ces résultats identifie PGC-1alpha comme cible du signal de la ghréline et suggère un axe de régulation ghréline/PGC-1alpha/PPARbeta.Une meilleure compréhension de cet axe de régulation va permettre la mise en évidence de nouvelles cibles thérapeutiques pour faire face aux pathologies associées au syndrome métabolique. / The adaptation of an organism to its environment is essential to its survival. Energy homeostasis is defined as the balance between intakes, expenses and storage of energy. An excess of calories disrupts this process and leads to the development of the metabolic syndrome that is characterized by obesity, type II diabetes, cardiovascular diseases and dyslipidemia. During fasting, ghrelin participates in the maintenance of energy balance by stimulating hepatic production of glucose and lipid storage in adipose tissue. The transcriptional coactivator PGC-1alpha is overexpressed in the liver during fasting and is involves in the induction of the hepatic glucose production and fatty acid oxidation. Our hypothesis is that these two key performers in the energy metabolism constitute a common axis control. In this study, we show that ghrelin plays a role in the regulation of PGC-1alpha. The ghrelin receptor GHS-R1a is also involved because of its strong constitutive activity in absence of ligand. We found that GHS-R1a inhibited PGC-1alpha transcriptional activity whereas adding ghrelin to cells moderated this effect. PGC-1alpha activation by GHS-R1a correlated with a dose-dependent increase of PGC-1alpha acetylation. The stability of PGC-1alpha was also increased by ghrelin receptor in a manner involving the ubiquitin-independent proteasome pathway. Ghrelin decreased the ability of PGC-1alpha to bind to PPARbeta, one of its nuclear receptor partners. Furthermore, ghrelin decreased the ability of PGC-1alpha to coactivate PPARbeta in a ligand-dependent manner in hepatocytes. Together, these results identify PGC-1alpha as a metabolic target of GHSR-1a signaling and defines a new regulatory axis involving ghrelin/PGC-1alpha/PPARbeta in hepatocytes. A better understanding of this regulation axis will provide novel aspects in therapeutic targeting of diseases associated with the metabolic syndrome.

Thesis (Ph. D.)--University of Virginia, 2008. / Title from title page. Includes bibliographical references. Also available online through Digital Dissertations.

Movimentos coletivos prestam um papel fundamental na dinâmica e energética de biomoléculas em solução. Estes movimentos permitem o acoplamento de regiões significativamente distantes, apresentando considerável influência, por exemplo, no alosterismo para a formação de complexos macromoleculares e no funcionamento integrado de proteínas multidomínios como \"máquinas moleculares\". Neste trabalho de doutoramento, serão apresentados os resultados referentes à aplicação conjunta de técnicas experimentais biofísicas, de modelagem estrutural e de dinâmica molecular no estudo de dois sistemas para os quais estes movimentos coletivos demonstram considerável importância funcional. Para a interação do receptor nuclear do ácido 9-cis-retinóico com seu elemento responsivo específico no DNA (HRE), a comparação de estudos de dinâmica molecular com ensaios de afinidade por anisotropia de fluorescência sugere que a resistência inicial para a associação do monômero, seguida da acentuada colaboratividade na associação do dímero é regida por um impedimento da associação do domínio de ligação ao DNA (DBD) para o primeiro à sequência responsiva devido, em última análise, a uma não complementaridade dos modos coletivos mútuos. Este impedimento para a associação monomérica inicial é mais acentuado para o monômero 5\' (para o qual a menor especificidade de ligação à seqüência específica já é bem documentada), devido aos efeitos conjuntos de um \"defeito\" natural no empacotamento de bases da seqüência responsiva, que se manifesta mais significativamente na interface entre o meio-sítio 5\' e a seqüência espaçadora, e dos modos vibracionais entre os dois sítios decorrentes de seu faseamento relativo na topologia do DNA na seqüência responsiva, caracterizando um mecanismo \"chave e fechadura\" para a interação obrigatoriamente simultânea dos dois monômeros ao DNA. No segundo caso, um estudo integrado utilizando a técnica experimental de espalhamento de raios X a baixos ângulos e uma abordagem de modelagem estrutural baseada em dinâmica molecular foi realizado para a celobiohidrolase I de Trichoderma harziannum. Este estudo permitiu tanto a elaboração de um modelo estrutural de maior resolução para esta enzima de alto potencial biotecnológico como a constatação dos possíveis mecanismos moleculares a partir dos quais as glicosilações no peptídeo conector impõem restrições à orientação e modos vibracionais entre seus dois domínios de forma condizente com sua ação concertada na interação e no deslize da enzima sobre a superfície celulósica, ambos de fundamental importância para a processividade da enzima na hidrólise do substrato microcristalino. / Collective motions play a fundamental role in solution biomolecule dynamics and energetics. These movements can couple very distant regions in the protein structures affection, for instance, allosteric mechanisms, the establishment of macromolecular complexes, and on the integrated function of multidomain proteins as molecullar machines. In this thesis, we present results concerning to the joint use of experimental biophysical techniques, structural modeling and molecular dynamics simulations on the study of two systems for which these collective motions have substantial importance. First, we study the interaction of the nuclear retinoid X receptor with its specific DNA hormone response element (HRE) using a combination of molecular dynamics simulations and affinity assays performed by using fluorescence anisotropy. We find out that collective motions mediate the low binding affinity of monomers and the high cooperative binding of HRE dimers. The lower binding affinity of the monomer is more prominent for 5´ monomers. This occur due to an natural ineffective stacking of the last base pair step at the 5´-half-site and to the phasing of the two binding half-sites in the DNA topology, that impose a collective motions that tends to occlude the 5´ binding site. This behavior, in turn, is concurrent with the well known 3´ polarity and the decreased binding specificity to the 5´ half site for the hRXRα monomer. This same pattern impose a lock-and-key mechanisms dependent on the binding of the full dimer. Second, an integrated Small angle X ray scattering and molecular dynamics based structural modeling was used to comprehend the interdomain motions of cellobiohydrolase I of Trichoderma harziannum. We manage to build a refined model for this enzime, with important biotechnological potential. We also provide insights into molecular mechanisms of linker and glycosylation imposed restraints on the orientation and vibrational modes of the full-length enzyme, supporting a mechanism of sliding of on the cellulose surface. This mechanism is fundamental for the high processivity on the hydrolysis of microcrystalline cellulose.

Au cours de ma thèse, je me suis principalement intéressée aux interactions entre les systèmes angiotensine et gluco-minéralocorticoïde dans la paroi artérielle et particulièrement dans la physiopathologie du remodelage artériel. Pour cela, nous avons étudié les mécanismes moléculaires aboutissant au développement de l’athérome et qui impliqueraient ces deux systèmes. Notre hypothèse est qu’un excès local en gluco-et/ou minéralocorticoïdes dans la paroi favorise le développement de l’athérome en stimulant le système angiotensine. Nos résultats ont confirmé l’expression des éléments nécessaires à la synthèse et à l'action des gluco-minéralocorticoïdes dans la paroi carotidienne humaine et dans les CMLV, avec une prévalence de la voie des glucocorticoïdes. Cette prédominance se manifeste par l’effet stimulant du cortisol sur l’expression des marqueurs des processus fibrosants, lipogéniques et inflammatoire mis en jeu lors de la formation de l’athérome. La relation entre le taux d’expression pariétale de GRα et 11β-HSD1 d’une part et le collagène 1 d’autre part suggère une contribution majeure des glucocorticoïdes dans la rigidité artérielle. Il a également été observé que le cortisol a un effet stimulant sur l’expression du collagène dans les CMLV suggérant ainsi que le cortisol favoriserait la survenue des accidents cardiovasculaires. La relation inverse entre le taux d’expression pariétal de GRα et la mesure de la pression artérielle diastolique est en faveur de cette hypothèse. De même, l’augmentation du taux de l’ARNm de GRα chez les patients ayant fait un accident cardiovasculaire corrobore l’hypothèse d’un rôle délétère des glucocorticoïdes dans le remodelage athéromateux. Nos résultats montrent que le système glucocorticoïde est un puissant stimulateur du système angiotensine pariétal et suggère l’existence d’une régulation commune de la synthèse de l’angiotensine II, de l’aldostérone et du cortisol évoquant ainsi la possibilité d’interactions entre les systèmes angiotensine et gluco-minéralocorticoïde pariétaux. Par ailleurs, les concentrations basses du cortisol plasmatique chez les patients traités par des bloqueurs du système rénine angiotensine est en faveur de la théorie d’amplification mutuelle des systèmes angiotensine et glucocorticoïde. Notre étude souligne l’intérêt des bloqueurs du SRA comme approche thérapeutique préférentielle à utiliser afin d’atténuer les effets délétères du cortisol, améliorer le risque cardiovasculaire et le pronostic des patients / The involvement of the renin angiotensin system, cortisol and aldosterone in the increase of cardiovascular risk is well known as well as some of relationships between RAS and corticosteroids but their interactions within arterial wall and particularly during atheroma formation are not established. Considering all these data, we hypothesize that an increase in local gluco-and/or mineralocorticoid synthesis and activity within the arterial wall may favour atheroma development by stimulating tissue angiotensin system. Our results give argument in favour of an independence betweenthe parietal and endocrine corticosteroid systems. We have shown the prevailing involvement of the glucocorticoid pathway in the atherosclerotic remodelling both in terms of intra-parietal expression and regulation of fibrotic, inflammatory and lipogenic effects in VSMCs together with the further amplification of this involvement after adipocyte dedifferentiation of VSMCs. There is modulation of GR and MR effects with a change in the cell pathophysiological state. Interestingly, there is no “illicit” cortisol-dependent activation of MR-receptor. We conclude that cortisol involvement in atheroma formation could pass apart from its continuing stimulating effect on its own synthesis and action, through mutual stimulating effects of cortisol and angiotensin II on their reciprocal compounds. These processes could already take place at the initial stage of atheroma and might intensify as the atheroma development progresses. The up-regulation of parietal angiotensin system could be revealed by a low plasma renin. The lower plasma cortisol levels in patients on RAS blocker treatment corroborates the thesis of mutual amplification of effects between glucocorticoids and angiotensin system, and this treatment would be particularly beneficial in essential hypertensive patients with low plasma renin, to attenuate both angiotensin II and also cortisol up-regulation

Les infections par les nématodes gastro-intestinaux entrainent des baisses en productions animales et des pertes économiques majeures pour les éleveurs. Les lactones macrocycliques (LMs) sont parmi les antiparasitaires les plus utilisés dans la lutte contre les nématodes gastro-intestinaux en médecine vétérinaire. De part une utilisation intensive, des résistances aux LMs chez les parasites gastro-intestinaux se sont développées au sein des élevages du monde entier mettant en péril l'efficacité thérapeutique de ces molécules. Par ailleurs, le développement de nouveaux antiparasitaires est limité. Ainsi, un des enjeux pour assurer le contrôle de ces parasites est de ralentir les phénomènes de résistance aux LMs afin de prolonger leur efficacité. Le succès d'une telle stratégie repose sur les connaissances précises des mécanismes impliqués dans la résistance. Parmi eux, la modulation des systèmes de détoxification est décrite lors de phénomènes de résistance aux LMs. Au cours de ces travaux, nous avons étudiés la régulation des systèmes de détoxification, en réponse à l'ivermectine chez l'hôte. Nous avons montré, en comparaison à une administration unique, qu'une administration répétée d'ivermectine par voie orale chez la souris est responsable de l'induction de l'expression de certains gènes transporteurs ABC et cytochromes impliqués dans son métabolisme. Ceci entraîne, à la fois, une diminution de la concentration de la molécule parentale et une augmentation de la teneur de son métabolite principal dans le plasma et l'intestin. Ensuite, nous avons étudié l'implication des mécanismes de régulation des systèmes de détoxification, et notamment les récepteurs nucléaires, dans la tolérance à l'ivermectine chez le nématode C.elegans. Nous avons montré que le récepteur nucléaire nhr-a est important pour la tolérance et le développement de la résistance à l'ivermectine. Enfin, nous avons étudié l'impact d'inhibiteurs des transporteurs ABC sur l'efficacité de l'ivermectine. Nous avons mis en évidence la capacité de certains flavonoïdes et de l'ivermectine aglycone à potentialiser l'efficacité de l'ivermectine chez le nématode. Une exposition d'ivermectine induit la surexpression des systèmes de détoxification chez l'hôte. Ceci pourrait être la base des mécanismes moléculaires de la résistance chez le nématode. Cibler les systèmes de détoxification ou les mécanismes de résistance, par des inhibiteurs adaptés, représente une stratégie pertinente pour potentialiser l'efficacité de l'ivermectine. / Infections with gastrointestinal nematodes (GINs) in livestock leads to major losses in production and consequently impact economically farmers. Their intensive use has led to widespread anthelmintic resistance which is nowadays the main threat on the sustainable control of GINs in livestock. The development of new anthelmintic is limited due to the cost of such process. Then, the challenge remains in optimizing the use of existing molecules. Therefore, it is urgent to limit and control MLs resistance in order to extend their efficacy and to avoid therapeutic failure. Resistance mechanisms remain to be elucidated. In that context, we investigated regulatory mechanism of detoxification systems of ivermectin implicated in therapeutic efficacy in host and resistance development in nematode. Therapeutic combinations of ivermectin with flavonoïds have been evaluated to potentiate its efficacy in nematode. We showed that repeated oral administration of ivermectin induced gene expression encoding some ABC efflux transporters and cytochromes involved in its metabolism. Compared with single administration, repeated ivermectin administration lowered plasma, liver and intestine drug concentration, while increasing main metabolite content in plasma and intestine. We have also shown that nuclear receptor nhr-a was important for ivermectin tolerance and ivermectin development of resistance in C. elegans. Finally, we demonstrated the ability of the flavonoïd phloretin to potentiate ivermectin efficacy in the nematode C. elegans. Taken together, these data suggest that induction of detoxification systems impact on ivermectin distribution and targeting their regulation could be an appropriate strategy to potentiate ivermectin efficacy in host and to reverse resistance in nematode.

Les hormones thyroïdiennes (HTs) contrôlent plusieurs aspects du développement et de l’homéostasie intestinale. Elles agissent via des récepteurs nucléaires (TRs), facteurs de transcription modulés par la T3. Le paradigme est la métamorphose des amphibiens où elles sont responsables du remodelage du tube digestif et de l’émergence des cellules souches (Ishizuya-Oka et al, 2009). Des études précédentes ont montré que les HTs jouent un rôle fondamental en régulant la balance entre prolifération et différenciation des précurseurs épithéliaux murins. Du point de vue moléculaire, le récepteur nucléaire TRα1 contrôle plusieurs gènes du cycle cellulaire/prolifération ainsi que les voies de signalisation Wnt et Notch (rev. in Sirakov et al, 2104; Skah et al, 2017). En accord avec ces fonctions, l’expression ciblée de TRα1 dans l’épithélium intestinal (souris vil-TRα1) est suffisante pour induire des cryptes aberrantes, hyper-prolifératives et confère une sensibilité accrue au programme de tumorigénèse intestinale dépendant de la mutation dans le gène Apc (vil-TRα1/Apc+/1638N mice) (Kress et al, 2010). Le but de mon travail a été d’étudier le contrôle des cellules souches intestinales, dépendant des HTs/TRs. En effet, j’ai utilisé des souris Lgr5-EGFP-ires-CreERT2 permettant de traquer, trier et cibler les cellules souches (Barker et al, 2007) que j’ai croisées avec le modèle murin inductible au tamoxifène TRα1-LOF (Loss-of-function) (Quignodon et al, 2007). J’ai étudié les effets de l’altération de la voie HTs/TRα1 in vivo et dans des organoïdes intestinaux (ex vivo). Nos résultats indiquent que les HTs et la modulation de l’expression ou de l’activité de TRα1 affectent rapidement et fortement les cellules souches intestinales. Ce travail ouvre de nouvelles perspectives dans l’étude des signaux dépendants des HTs/ TRα1 dans la physiopathologie des cellules souches intestinales / Thyroid hormones (THs) control several aspects of gut development and homeostasis. They act through the thyroid hormone nuclear receptors (TRs) that are T3-modulated transcription factors. The paradigm is the amphibian metamorphosis, where they are responsible for gut remodeling and emergence of the stem cells (Ishizuya-Oka et al, 2009). In previous studies we showed that THs play a fundamental role in regulating the balance between cell proliferation and cell differentiation of the murine intestinal epithelial precursors. From a molecular point of view the nuclear receptor TRα1 controls several proliferation/cell-cycle genes as well as the Wnt and Notch pathways (rev. in Sirakov et al, 2104; Skah et al, 2017). In accordance with these functions, targeted expression of TRα1 in the intestinal epithelium (vil-TRα1 mice) is sufficient to induce aberrant and hyper-proliferative crypts and confers increased susceptibility to Apc-mutation dependent intestinal tumorigenic program (vil-TRα1/Apc+/1638N mice) (Kress et al, 2010). The aim of my work was to study TH- and TRα1-dependent control of intestinal stem cells. Indeed, I used the Lgr5-EGFP-ires-CreERT2 mice enable tracking, sorting and targeting the stem cells (Barker et al, 2007) crossed with tamoxifen inducible TRα1 loss-of-function (Quignodon et al, 2007) mouse model (TRα1-LOF). I studied the effect of TH/TRα1 alteration in vivo and in intestinal organoids (ex vivo). In conclusion, our results indicate that HTs and modulating TRα1 expression or activity have a rapid and strong effect on the intestinal stem cells. This work opens a new perspective in the study of TH/TRα1-dependent signal on the physiopathology of the intestinal stem cells

Le criblage virtuel est utilisé dans la recherche de médicaments et la construction de modèle de prédiction de toxicité. L’application d’un protocole de criblage est précédée par une étape d’évaluation sur une banque de données de référence. La composition des banques d’évaluation est un point critique ; celles-ci opposent généralement des molécules actives à des molécules supposées inactives, faute de publication des données d’inactivité. Les molécules inactives sont néanmoins porteuses d’information. Nous avons donc créé la banque NR-DBIND composée uniquement de molécules actives et inactives expérimentalement validées et dédiées aux récepteurs nucléaires. L’exploitation de la NR-DBIND nous a permis d’étudier l’importance des molécules inactives dans l’évaluation de modèles de docking et dans la construction de modèles de pharmacophores. L’application de protocoles de criblage a permis d’élucider des modes de liaison potentiels de petites molécules sur FXR, NRP-1 et TNF⍺. / Virtual screening is widely used in early stages of drug discovery and to build toxicity prediction models. Commonly used protocols include an evaluation of the performances of different tools on benchmarking databases before applying them for prospective studies. The content of benchmarking tools is a critical point; most benchmarking databases oppose active data to putative inactive due to the scarcity of published inactive data in the literature. Nonetheless, experimentally validated inactive data also bring information. Therefore, we constructed the NR-DBIND, a database dedicated to nuclear receptors that contains solely experimentally validated active and inactive data. The importance of the integration of inactive data in docking and pharmacophore models construction was evaluated using the NR-DBIND data. Virtual screening protocols were used to resolve the potential binding mode of small molecules on FXR, NRP-1 et TNF⍺.

Les acides biliaires sont des composants naturels du tractus gastro-intestinal. La hausse du taux d’acides biliaires dans l’intestin est associée à une carcinogenèse de l’appareil digestif. L’homéostasie des acides biliaires est maintenue par le contrôle de l’expression des gènes impliqués dans le métabolisme tels que SHP, FGF19 et CYP-7A1 par le récepteur nucléaire FXRα. FXRα agit comme facteur de transcription en réponse à l’interaction directe des acides biliaires. Par contre, plusieurs évidences tendent à démontrer le rôle central de FXRα dans la carcinogenèse hépatique. Les récepteurs de la famille EGFR/ErbB sont des récepteurs tyrosine kinase également activés par les acides biliaires, dont la surexpression est associée au développement de plusieurs cancers. Ainsi, le projet vise à déterminer l’impact de la signalisation des récepteurs EGFR/ErbB sur la réponse transcriptionnelle de FXRα. Nous avons identifié un mécanisme d’inhibition de l’activité transcriptionnelle de FXRα et de l’expression de ses gènes cibles par l’activation des récepteurs EGFR/ErbB par leur ligands HRG et EGF et par l’expression du mutant constitutivement actif ErbB2-V659E dans les cellules hépatiques. Nous avons montré que ce processus dépend de la signalisation par la voie MAPK. On observe également que l’activation de FXRα diminue la prolifération des cellules cancéreuses du foie alors que celle du récepteur ErbB2 augmente cette prolifération. Ainsi, cette étude nous a permis d’établir un nouveau mécanisme de l’impact délétère de la suractivation des récepteurs EGFR/ErbB sur la prolifération des cellules cancéreuses du foie qui implique une inhibition du potentiel transcriptionnel du récepteur aux acides biliaires FXRα. / Bile acids are natural components of the gastrointestinal tract. An increase of bile acid levels in the intestine is associated with the carcinogenesis of the digestive system. Bile acid homeostasis is maintained by the nuclear receptor FXRα which regulates the expression of specific genes involved in metabolism such as SHP, FGF19 and CYP-7A1. In this way, FXRα acts as a transcription factor following bile acids binding, allowing its transcriptional activation. On the other hand, several studies established the central role of FXRα activation in liver carcinogenesis. EGFR/ErbB receptors are a family of tyrosine kinase receptors that can be regulated by bile acids. Overexpression of EGFR/ErbB receptors is associated with several cancers. Thus, the project aims to examine the impact of EGFR/ErbB receptors signaling on FXR transcriptional potential. We identify that EGFR/ErbB activation by their ligands HRG and EGF and by the expression of the constitutively active mutant ErbB2-V659E inhibits FXR transcriptional activity and expression of its target genes in liver cells. We demonstrate that this process is dependent on the MAPK signaling pathway. We also show that FXR activation decreases proliferation of liver cancer cells while activation of ErbB2 increases this cellular response. Thus, this study identifies a new mechanism of the deleterious impact of EGFR/ErbB receptors overactivation on liver cancer cells proliferation, involving the inhibition of the transcriptional potential of the bile acid receptor FXRα.