Producing biodiesel from triacylglycerol (TAG) generates glycerol as a byproduct which could be recycled and used to grow the oleaginous yeast Rhodotorula glutinis. R. glutinis has the ability to produce up to 70% of its weight in the form of TAG. This study is designed to determine the effects of glycerol on the TAG and fatty acids produced by R. glutinis. After 24 hrs, R. glutinis cultured on medium containing dextrose, xylose, glycerol, dextrose and xylose, xylose and glycerol, or dextrose and glycerol accumulated 16, 12, 25, 10, 21, and 34% TAG on a dry weight basis, respectively. The fatty acids derived from R. glutinis were mostly saturated, however, cells cultivated on glycerol alone had the highest degree of unsaturated fatty acids (53%). Growth on dextrose may be enhanced by the addition of glycerol, but it cannot be determined if using glycerol as a secondary carbon substrate enhances lipid production.

Doctor of Philosophy / Department of Grain Science and Industry / Praveen V. Vadlani / Microbial lipids derived from oleaginous yeasts are a promising alternative source of edible oils due to the following advantages: no requirement of broad lands; availability of year-round production; and no food versus fuels controversy. Oleaginous yeast has an inherent ability to accumulate lipids inside cells and their lipids are preferable as starting materials in oleo-chemical industries because of their distinct fatty acid composition. Lignocellulosic biomass is a promising substrate to supply carbon sources for oleaginous yeast to produce lipids due to the high content of polysaccharides and their abundancy. Lignocellulosic-based sugar streams, which can be generated via pretreatment and enzymatic hydrolysis, contained diverse monosaccharides and inhibitors. The major objectives of this study were: 1) to develop a novel purification method to generate clean sugar stream using sorghum stalks after acid pretreatment; 2) to optimize fermentation conditions for Trichosporon oleaginosus to achieve high yields and productivity of microbial lipids using lignocellulosic hydrolysates; 3) to investigate the potentials of sorghum stalks and switchgrass as feedstocks for microbial lipid production using oleaginous yeast strains, such as T. oleaginosus, Lipomyces starkeyi, and Cryptococcus albidus; 4) to develop an integrated process of corn bran based-microbial lipids production using T. oleaginosus; and 5) to develop bioconversion process for high yields of lipids from switchgrass using engineered Escherichia coli. In our investigation, major inhibitory compounds of lignocellulosic hydrolysates induced by pretreatment were acetic acid, formic acid, hydroxymethyl furfural (HMF) and furfural. The activated charcoal was effective in removing hydrophobic compounds from sorghum stalk hydrolysates. Resin mixtures containing cationic exchangers and anionic exchangers in 7:3 ratio at pH 2.7 completely removed HMF, acetic acid, and formic acid from sorghum stalk hydrolysates. T. oleaginosus was a robust yeast strain for lipid production. In the nitrogen-limited synthetic media, total 22 g/L of lipid titers were achieved by T. oleaginosus with a lipid content of 76% (w/w). In addition, T. oleaginosus efficiently produced microbial lipids from lignocellulosic biomass hydrolysates. The highest lipid titers of 13 g/L lipids were achieved by T. oleaginosus using sorghum stalk hydrolysates with a lipid content of 60% (w/w). L. starkeyi and C. albidus also successfully produced microbial lipids using lignocellulosic hydrolysate with a lipid content of 40% (w/w). Furthermore, corn bran was a promising feedstock for microbial lipid production. The highest sugar yields of 0.53 g/g were achieved from corn bran at the pretreatment condition of 1% acid and 5% solid loading. Microbial lipids were successfully produced from corn bran hydrolysates by T. oleaginosus with lipid yields of 216 mg/g. Engineered E. coli also effectively produced lipids using switchgrass as feedstocks. E. coli ML103 pXZ18Z produced a total of 3.3 g/L free fatty acids with a yield of 0.23 g/g. The overall yield of free fatty acids was 0.12 g/g of raw switchgrass and it was 51 % of the maximum theoretical yield. This study provided useful strategies for the development of sustainable bioconversion processes for microbial lipids from renewable biomass and demonstrated the economic viability of a lignocellulosic based-biorefinery.

Atualmente há uma busca crescente por fontes energéticas renováveis motivada principalmente por razões ambientais e estratégicas, tais como o acúmulo de poluentes na atmosfera decorrente do uso de combustíveis fósseis e a diminuição de suas reservas. O biodiesel tem atraído atenção cada vez maior por sua capacidade em substituir o diesel do petróleo. A maior parte do biodiesel produzido utiliza como matéria-prima os óleos vegetais, os quais apresentam como principais desvantagens a sazonalidade na produção devido aos períodos de safra e a competição no uso de terras agrícolas com a produção de alimentos. Uma alternativa capaz de possibilitar a redução do uso de óleos vegetais são os óleos microbianos, como os produzidos por microalgas, fungos e leveduras. Os lipídeos produzidos por leveduras constituem uma fonte interessante de matéria-prima renovável para a produção de biocombustíveis, pois é independente das mudanças climáticas e sazonalidade, como as culturas vegetais. Desta forma, o presente trabalho tem por objetivo contribuir para o desenvolvimento de tecnologias voltadas para produção de óleos microbianos em cultivos heterotróficos. Neste sentido foram desenvolvidos estudos buscando selecionar leveduras capazes de produzir lipídeos tendo glicerol como substrato, bem como estabelecer as condições de cultivo mais favoráveis para a produção e acúmulo de lipídeos pela levedura selecionada. Para a seleção de microrganismos foram realizados ensaios visando comparar cinco diferentes leveduras (Cryptococcus curvatus Y -1511, Lipomyces starkeyi Y-27493, Rhodotorula glutinis Y- 12905, Rhodosporidium toruloides Y-1091 e Rhodotorula mucilaginosa Y-27053), neste estudo verificou-se que as cinco leveduras avaliadas foram capazes de consumir substrato, crescer e produzir lipídeos durante os cultivos. Dentre as leveduras avaliadas a Rhodotorula glutinis Y- 12905 e Cryptococcus curvatus Y -1511 foram as que apresentaram as maiores produtividades volumétricas em lipídeos, alcançando valores entre 0,20 e 0,23 g/L.dia, respectivamente. Quanto à capacidade de consumo de substrato a R. glutinis se destacou em relação as demais leveduras tendo sido capaz de consumir cerca de 59% do glicerol após 120 horas de cultivo, consumo este que representa quase duas vezes o valor alcançado pela C. curvatus, que apresentou o segundo maior consumo de substrato. Devido a sua elevada capacidade de assimilação de glicerol e apresentando uma das maiores produtividades volumétricas de lipídeos entre as leveduras avaliadas a levedura Rhodotorula glutinis foi considerada como uma das mais promissoras para a obtenção de óleos microbianos empregando glicerol como substrato. Nos ensaios realizados com diferentes agitações e razões de volume de frasco por volume de meio verificou-se que quanto maior a disponibilidade de oxigênio, maior foi o acúmulo de lipídeos, o crescimento celular e o consumo de glicerol. Quanto à avaliação da composição nutricional a presença de fontes de nitrogênio orgânico, tais como extrato de levedura e peptona mostraram-se fundamentais para o processo de produção de óleos microbianos juntamente com MgSO4.7H2O. Quando estes nutrientes estavam presentes de forma combinada foram obtidas concentrações de até 4,4 g/L de lipídeos e produtividades de 0,43 g/L.dia. Na avaliação da influência do pH inicial e da razão carbono/nitrogênio (C:N), verificou-se que o acúmulo de lipídeos pela levedura é favorecido para cultivos realizados em pH inicial entre 6 e 7, e com razão C:N entre 30:1 e 50:1. Em tais condições a levedura foi capaz de acumular até 8 g/L de lipídeos com produtividade de até 0,82 g/L.dia. A composição do óleo microbiano obtido pela levedura revelou elevados teores dos ácidos graxos palmítico (C16:0), esteárico (C18:0), oleico (C18:1) e linoleico (C18:2), os quais correspondem a 99% de sua composição. O óleo apresentou um comportamento de fluido newtoniano com viscosidade de 39,3 cP à 50ºC, tendo um índice de acidez de 5,8±0,2 mgKOH/góleo e teor de ácido graxos de 1,93±0,08 %. / Currently, there is a search for renewable energy sources motivated mainly by environmental and strategic reasons, such as the concept of solutions for the development of fossil fuel use and a decrease of its reserves. Biodiesel has attracted increasing attention for its ability to replace diesel oil. Most of the biodiesel produced uses vegetable oils as raw material, which has as main disadvantages the seasonality and a competition in the use of agricultural land with a food production. An alternative capable of reducing the use of vegetable oils is the use of microbial oils, such as those produced by microalgae, fungi and yeasts. The lipids produced by yeasts are an interesting source of renewable raw material for biofuel production, because it is independent of climatic changes and seasonality, such as vegetable crops. In this way, the present study aims to contribute to the development of technologies of microbial oils production in heterotrophic cultures. In this sense, studies were developed to select yeasts capable of producing lipids having glycerol as substrate, as well as to establish the culture conditions more favorable for the production and accumulation of lipids by the selected yeast. For a selection of microorganisms assays were carried out aiming to compare five different yeasts (Cryptococcus curvatus Y-1511, Lipomyces starkeyi Y-27493, Rhodotorula glutinis Y-12905, Rhodosporidium toruloides Y-1091 and Rhodotorula mucilaginosa Y-27053). In this step it was verified that the five yeasts evaluated were able to consume substrate, grow and produce lipids during the cultures. Among the evaluated yeasts, Rhodotorula glutinis Y-12905 and Cryptococcus curvatus Y-1511 has presented the highest volumetric lipid yields, reaching values between 0.20 and 0.23 g/L.day, respectively. Regarding the substrate consumption capacity, R. glutinis stood out in relation to other yeasts, being able to consume about 59% of glycerol after 120 hours of cultivation. Due to its high capacity for assimilation of glycerol and presenting one of the highest volumetric productivities of lipids among evaluated yeasts, Rhodotorula glutinis was considered as one of the most promising for the obtaining of microbial oils from glycerol as substrate. In the assays performed with different oxygenation levels, it was verified that higher oxygen availability higher the volume of lipids, cell growth and glycerol consumption. In the nutritional composition evaluation it was observed that the organic nitrogen source, such as yeast extract and peptone are essential for the production process of microbial oils together with MgSO4.7H2O. When these nutrients were presents in combination, concentrations of 4.4 g/L lipids and productivity of 0.43 g/L.day were obtained. In the evaluation of the influence of the initial pH and the carbon/nitrogen ratio (C:N), it was verified that the accumulation of lipids by yeast is favored for the cultures at initial pH between 6 and 7, and with C:N ratio between 30:1 and 50:1. In such conditions, it was obtained by yeast 8 g/L of lipids and volumetric productivity of 0.82 g/day. The composition of the microbial oil obtained by the yeast revealed high levels of palmitic (C16:0), stearic (C18:0), oleic (C18:1) and linoleic (C18:2) fatty acids, which correspond to 99% of composition. The oil exhibited a Newtonian fluid behavior and a viscosity of 39.3 cP at 50 °C, having an acid number of 5.8 ± 0.2 mgKOH/goil and a fatty acid content of 1.93 ± 0.08%.

Este trabalho teve como objetivos avaliar as condições de cultivo para a produção de lipase e acúmulo de lipídio pela levedura Candida viswanathii utilizando diferentes fontes de carbono e nitrogênio em condições submersas, imobilizar a lipase e avaliar o seu potencial em reação de hidrólise de gordura de frango em biorreator tipo cesto. Os cultivos submersos em condições limitantes de nitrogênio com diferentes fontes de lipídios puros ou complexos mostraram que C. viswanathii acumulou 44% de lipídio intracelular em trioleína e 39% em azeite de oliva utilizando extrato de levedura como fonte de nitrogênio. Nestas condições, a produção de lipase foi 26,78 U/ml em azeite de oliva e 23,6 U/ml em trioleína. O nitrato de amônio inibiu a produção de lipase em 48% em trioleína e 69% em azeite de oliva. Além disso, a análise dos ácidos graxos revelou predominância de ácido oleico (C18:1), em proporções de 69,31, 60,69 e 68,84%, para azeite de oliva, glicose e azeite/glicose, respectivamente. Quanto à imobilização, estudou-se a influência do diâmetro da esfera e da concentração de alginato, obtendo-se o melhor diâmetro de 2 mm e concentração de 2% de alginato, com atividade enzimática de 13,42 U/g e 28 U/g, respectivamente. Utilizou-se alginato de sódio em sua forma convencional e modificado com glutaraldeído, álcool polivinílico e carboximetilcelulose, sendo que o alginato na forma convencional foi o que apresentou melhores resultados, obtendo-se 28,6 U/g e mais de 50% de atividade após 15 ciclos de reuso. A caracterização da lipase livre e encapsulada de C. viswanathii revelou temperatura ótima de atividade de 35 ºC para a enzima encapsulada e na faixa de 40 – 45 ºC para a lipase livre sobre a hidrólise do p-NPP. Sobre a hidrólise de gordura de frango, tanto enzima livre quanto encapsulada apresentaram temperatura ótima de atividade à 40 ºC. Quanto à estabilidade térmica, a enzima livre apresentou boa estabilidade até 12h de incubação nas temperaturas de 30 e 40 ºC. Já a enzima encapsulada mostrou-se estável em até 72 horas de incubação nas mesmas temperaturas. A enzima livre apresentou aumento de atividade na presença de NH4Cl e CaCl2 (117,50% e 111,25%, respectivamente). Já a lipase encapsulada apresentou aumento na atividade com todos os íons analisados, sendo CaCl2 (152,94%), NH4Cl (145,88%), BaCl2 (144,12%) e NaCl (138,24%). Em relação à hidrólise, observou-se que tanto a enzima livre como encapsulada apresentaram maior atividade hidrolítica após 96 horas de incubação, em que a enzima encapsulada obteve 34,66% de hidrólise e a enzima livre obteve 17,91% de hidrólise. Assim, a levedura Candida viswanathii mostrou-se eficiente tanto para o acúmulo de lipídio, quanto para a produção de lipase nas condições estabelecidas. Além disso, a enzima encapsulada apresentou boa estabilidade e potencial para aplicação na hidrólise de gordura de frango. / The aim of this work was to evaluate the culture conditions for lipase production and lipid accumulation by yeast Candida viswanathii using different carbon sources and nitrogen under submerged conditions; and to immobilize the lipase produced in alginate and to evaluate its potential for poultry fat hydrolysis in basket type bioreactor. Submerged cultures under nitrogen-limiting conditions with different sources of pure or complex lipids showed that C. viswanathii accumulated 44% intracellular lipid in triolein and 39% in olive oil using yeast extract as a source of nitrogen. Under these conditions, lipase production was 26.78 U/ml using olive oil and 23,6 U/ml with triolein. Ammonium nitrate inhibited lipase production in 48% with triolein and 69% wiht olive oil. In addition, analysis of fatty acids showed a predominance of oleic acid (C18:1), in proportions of 69.31, 60.69 and 68.84%, for olive oil, glucose and olive oil/glucose, respectively. The influence of drop diameter and alginate concentration was studied, obtaining the best 2 mm diameter and 2% alginate concentration, with enzymatic activity of 13.42 U/g and 28.0 U/g , respectively. Sodium alginate was used in its conventional form and modified with glutaraldehyde, polyvinyl alcohol and carboxymethylcellulose, and the alginate in the conventional form gave the best results, obtaining 28.6 U/g and more than 50% activity after 15 cycles of reuse. The free and encapsulated lipase characterization of C. viswanathii revealed an optimal activity temperature of 35 °C for the encapsulated enzyme and in the 40-45 °C range for free lipase on the hydrolysis of p-NPP. On the hydrolysis of poultry fat, both free and encapsulated enzyme presented optimum temperature of activity at 40 ºC. As for thermal stability, the free enzyme presented good stability up to 12 h of incubation at temperatures of 30 and 40 ºC. The encapsulated enzyme was stable in up to 72 hours of incubation at the same temperatures. The free enzyme showed increased activity in the presence of NH4Cl and CaCl2 (117.50% and 111.25%, respectively). In addition, the encapsulated lipase presented increased activity with all the ions analyzed, being CaCl2 (152.94%), NH4Cl (145.88%), BaCl2 (144.12%) and NaCl (138.24%). In relation to the hydrolysis, it was observed that both the free and encapsulated enzyme presented higher hydrolytic activity after 96 hours of incubation, in which the encapsulated enzyme obtained 34.66% hydrolysis and the free enzyme obtained 17.91% hydrolysis. Thus, yeast Candida viswanathii proved to be efficient both for lipid accumulation and for lipase production under the established conditions. In addition, the encapsulated enzyme presented good stability and potential for application in poultry fat hydrolysis.

A levedura Yarrowia lipolytica tem sido muito investigada, especialmente por ser um microrganismo oleaginoso, ou seja, capaz de acumular grandes quantidades de lipídios, o que ocorre majoritariamente em organelas denominadas partículas lipídicas. Estes lipídios apresentam várias potenciais aplicações biotecnológicas, como por exemplo na produção de óleo microbiano (single cell oil) e na produção de biodiesel. Durante este projeto de mestrado, objetivou-se estudar a fisiologia de duas linhagens da levedura Y. lipolytica, sendo uma tradicionalmente estudada pela comunidade científica internacional (linhagem w29) e outra isolada da Baía da Guanabara, no Rio de Janeiro (linhagem IMUFRJ 50682). Foram realizados cultivos em frascos agitados tipo Erlenmeyer com defletores tampados com algodão (volume total 500 mL, volume de meio 100 mL, 28 oC e 200 rotações por minuto), durante os quais foi possível: 1) escolher um meio de cultivo de composição totalmente definida, com tiamina como único fator de crescimento, adequado a estudos de fisiologia quantitativa com esta levedura; 2) verificar que Y. lipolytica não é capaz de crescer com sacarose ou xilose como única fonte de carbono; 3) verificar que Y. lipolytica cresce com velocidade específica de crescimento máxima (Máx) de 0,49 h-1 num meio complexo contendo glicose, extrato de levedura e peptona (meio YPD), 0,31 h-1 em meio definido com glicose como única fonte de carbono e 0,35 h-1 no mesmo meio, mas com glicerol como única fonte de carbono, sem excreção de metabólitos para o meio de cultivo; 4) verificar que ocorreu limitação por oxigênio nos cultivos em frasco agitado, sendo este o motivo pelo qual as células deixaram de crescer exponencialmente; 5) verificar que o uso de ureia, em vez de sulfato de amônio, como fonte de nitrogênio, contribui para uma variação menor do pH durante os cultivos, sem prejuízo ao crescimento da levedura; 6) observar que, ao se restringir a oferta de nitrogênio à levedura (aumento da relação C/N inicial no meio de 12,6 para 126), as células têm sua morfologia alterada e apresentam maior quantidade de partículas lipídicas; 7) determinar uma composição elementar para a biomassa de Y. lipolytica (CH1,98O0,58N0,13), em que os átomos de carbono encontram-se em média mais reduzidos do que na biomassa de leveduras como Saccharomyces cerevisiae e Dekkera bruxellensis. Foram também realizados cultivos em biorreator em batelada (1 L de volume útil, 28 oC, aerobiose plena e pH controlado em 5,0), durante os quais foi possível: a) estabelecer um protocolo de cultivo para Y. lipolytica em biorreator (que envolvem agitação mecânica, aeração e uso de anti-espumante, entre outras diferenças em relação aos cultivos em frasco); b) confirmar os valores dos principais parâmetros fisiológicos apresentados por esta levedura, anteriormente obtidos a partir de cultivos em frasco; c) confirmar que o fator de conversão de substrato a células (Yx/s) é maior para cultivos realizados com glicerol como fonte única de carbono (0,53 g/g para a linhagem IMUFRJ 50682), do que com glicose (0,48 g/g para a mesma linhagem). Finalmente, cultivos realizados em quimiostato com glicerol como fonte de carbono e energia, limitados por amônio (fonte de nitrogênio, relação C/N 126), às vazões específicas de 0,25 h-1 e 0,15 h-1, permitiram observar que o número de partículas lipídicas por célula de Y. lipolytica permaneceu em torno de 2 em ambas as situações e houve uma diminuição no teor de nitrogênio nas células quando a velocidade específica de crescimento diminuiu de 0,25 para 0,15 h-1. / The yeast Yarrowia lipolytica has been intensively investigated, especially for being an oleaginous microorganism, thus possessing the capacity of accumulating high amounts of lipids, which mainly takes place in organeles known as lipid bodies. These lipids present several potential biotechnological appications, as in the production of single cell oil or biodiesel. During this research project, we aimed at investigating the physiology of two Y. lipolytica strains: w29, traditionally investigated by the international scientific community, and IMUFRJ 50682, isolated from the Guanabara Bay in Rio de Janeiro. Shake-flask cultivations in baffled Erlenmeyer flasks (total volume 500 mL, liquid volume 100 mL, 28 oC and 200 rotations per minute) with cotton stoppers were carried out and allowed us to: 1) choose a fully defined cultivation medium, in which tiamine is the sole growth factor, suitable for quantitative physiological studies with this yeast; 2) verify that Y. lipolytica is not capable of growing on sucrose or xylose as the sole carbon source; 3) observe that Y. lipolytica grows with a maximum specific growth rate (MAX) of 0.49 h-1 in a complex medium containing glucose, yeast extract and peptone (YPD medium), 0.31 h-1 in a defined medium with glucose as the sole carbon source, and 0.35 h-1 in the same medium, but with glycerol as the sole C-source, without excreting metabolites to the cultivation medium; 4) verify that oxygen limitation took place during our shakeflask cultivations and that this caused cells to leave the exponential growth phase; 5) verify that urea can substitute ammonium as the sole nitrogen-source for Y. lipolytica, keeping pH variations less pronounced, without compromising cell growth; 6) observe that cells presented an altered morphology and higher amounts of lipid bodies, when less nitrogen was added to the medium (C/N ratio increased from 12.6 to 126); 7) determine an elemental composition for the biomass of Y. lipolytica (CH1,98O0,58N0,13), in which the average carbon atom was more reduced with respect to the biomass of yeasts such as Dekkera bruxellensis and Saccharomyces cerevisiae. Bioreactor cultivations in batch mode (working volume 1 L, 28 oC, full aerobiosis and pH controlled at 5.0) were also carried out, which allowed us to: a) define a protocol for the cultivation of Y. lipolytica in this system (which involves mechanical agitation, aeration and the use of anti-foam, among other differences with respect to shake-flask cultivations); b) confirm the main physiological parameters presented by this yeast, previously obtained from shake-flask cultivations; c) confirm that the biomass yield on substrate (Yx/s) is higher on glycerol than on glucose (0.53 g/g and 0.48 g/g, respectively). Finally, N-limited chemostat cultivations with glycerol as the carbon and energy source and ammonium as the N-source were also performed (dilution rates of 0.25 h-1 and 0.15 h-1, C/N ratio in the medium of 126), allowing us to verify that the number of lipid particles per cell is around 2 under both conditions and that there was a decrease in the N content in the cells when the specific growth rate decreased from 0.25 to 0.15 h-1.

A exploração de resíduos agroindustriais como matérias-primas aplicadas na conversão de lipídeos por leveduras, possibilitam um destino mais sustentável a estes resíduos, visto que matéria-prima lipídica possui grande interesse comercial, tanto para suplementação alimentar como na síntese de biocombustíveis e outros produtos da indústria oleoquímica. Foram avaliadas nove linhagens de leveduras, identificadas anteriormente como boas ou ótimas produtoras de lipídeos em meio mel, para seleção da estirpe mais adequada para a produção de lipídeos em meio de soro de queijo. O crescimento celular foi quantificado pela determinação gravimétrica da biomassa seca a 60ºC por 24 h e a extração dos lipídeos totais foi determinada utilizando o método de Bligh e Dyer. A maior produção de lipídeos totais foi de 1,27 g L-1 obtida pela linhagem de Cryptococcus laurentii, apresentando diferença significativa em relação às demais linhagens avaliadas, pelo teste de Tukey a 5% de significância. Posteriormente foi realizada a comparação de dois meios de cultivos e dois métodos de extração de lipídeos de cultura de C. laurentii. Os experimentos foram realizados com planejamento fatorial completo 22, com dois fatores e dois níveis. Os lipídeos foram extraídos em dois diferentes métodos: Bligh e Dyer e Folch et al.; as leveduras cultivadas em dois meios de cultivo: soro de queijo e YEPG líquido. Obteve-se conteúdo lipídico final superior em soro de queijo nas condições avaliadas, já o método de extração de Bligh e Dyer não apresentou diferenças estatísticas em comparação ao de Folch et al., contudo apresentou maiores médias, sendo adotado como método de extração dos experimentos seguintes. Realizou-se um estudo para otimização da produção de biomassa e lipídeos totais de C. laurentii, em meio de cultivo de soro de queijo suplementado com melaço de cana de açúcar. A primeira etapa consistiu no estudo do efeito do pH, tempo de fermentação e concentração de melaço. A segunda etapa consistiu no efeito da suplementação por extrato de levedura e sais inorgânicos (KH2PO4, Na2HPO4, MgSO47H2O, CaCl22H2O, FeCl36H2O e ZnSO4H2O). A condição ótima de cultivo para linhagem de C. laurentii em meio de soro de queijo foi definida com os seguintes fatores: 360 h de fermentação, pH do meio de cultivo de 6,5 e suplementação (g L-1): 50 melaço, 0,5 extrato de levedura, 4 K2PO4, 1 Na2PO4, 0,75 MgSO47H2O e 0,002 ZnSO4H2O. Os lipídeos totais produzidos na condição de cultivo alcançaram 2,96 g L-1, que representa um aumento de 133,1% na produção de lipídeos totais por C. laurentii em relação ao meio com soro de queijo sem suplementação. Ocorrendo predomínio de lipídeos neutros 85,76%, com alto teor de ácidos graxos saturados e monosaturados, de cadeia longa com 16 e 18 átomos de carbono, o que possibilita sua aplicabilidade como fonte de triglicerídeos para biodiesel. / The exploitation of agro-industrial wastes as raw materials applied in the conversion of lipids by yeasts, allows a more sustainable destination of such waste, since lipid feedstock has great commercial interest, both for food supplementation as in the synthesis of biofuels and other products for oleochemical industry. We have evaluated nine strains of yeast, previously identified as good or excellent producers of lipids in honey medium, for selecting the most suitable strain for the production of lipids in cheese whey medium. Cell growth was quantified by gravimetric determination of dry biomass at 60°C for 24 h and the extraction of total lipids was determined using the method of Bligh and Dyer. The highest yield of total lipids was 1.27 g L-1 produced by the strain of Cryptococcus laurentii, significant difference compared to other strains assessed by Tukey test at 5% significance level. Posteriorly was carried out a comparison of two culture media and two lipid extraction methods for culture of C. laurentii. The experiments were performed with 22 full factorial design used two factors and two levels. Lipids were extracted by two different methods: Bligh and Dyer and Folch et al.; Yeasts grown in two culture media: cheese whey and liquid YEPG. Was achieved lipid content upper in cheese whey under the conditions evaluated, since the extraction method of Bligh and Dyer showed no statistical differences compared to that of Folch et al., but had higher average, used as a method of extraction in following experiments. Was conducted a study to optimize the production of biomass and lipid content of C. laurentii, in culture medium of whey supplemented with sugar cane molasses. The first step was to study the effect of pH, fermentation time and molasses concentration. The second step was the effect of supplementation by yeast extract and inorganic salts (KH2PO4, Na2HPO4, MgSO47H2O, CaCl22H2O, FeCl36H2O, and ZnSO4H2O). The optimum condition for growing strain of C. laurentii in the cheese whey medium was set to the following factors: 360 h fermentation, 6,5 pH and supplementation of (g L-1): 50 molasses, 0.5, yeast extract, 4 K2PO4,1 Na2PO4, 0.75 MgSO47H2O and 0.002 ZnSO4H2O. The total lipid produced in the culture condition reached 2.96 g L-1, which represents an increase of 133.1% total lipid in the production of C. laurentii in relation to the cheese whey medium without supplementation. Predominantly occurred neutral lipids 85.76%, with high content of saturated and monosaturated fatty acids, long chain with 16 and 18 carbon atoms, which makes its applicability as a source of triglycerides for biodiesel

Atualmente há uma busca crescente por fontes energéticas renováveis motivada principalmente por razões ambientais e estratégicas, tais como o acúmulo de poluentes na atmosfera decorrente do uso de combustíveis fósseis e a diminuição de suas reservas. O biodiesel tem atraído atenção cada vez maior por sua capacidade em substituir o diesel do petróleo. A maior parte do biodiesel produzido utiliza como matéria-prima os óleos vegetais, os quais apresentam como principais desvantagens a sazonalidade na produção devido aos períodos de safra e a competição no uso de terras agrícolas com a produção de alimentos. Uma alternativa capaz de possibilitar a redução do uso de óleos vegetais são os óleos microbianos, como os produzidos por microalgas, fungos e leveduras. Os lipídeos produzidos por leveduras constituem uma fonte interessante de matéria-prima renovável para a produção de biocombustíveis, pois é independente das mudanças climáticas e sazonalidade, como as culturas vegetais. Desta forma, o presente trabalho tem por objetivo contribuir para o desenvolvimento de tecnologias voltadas para produção de óleos microbianos em cultivos heterotróficos. Neste sentido foram desenvolvidos estudos buscando selecionar leveduras capazes de produzir lipídeos tendo glicerol como substrato, bem como estabelecer as condições de cultivo mais favoráveis para a produção e acúmulo de lipídeos pela levedura selecionada. Para a seleção de microrganismos foram realizados ensaios visando comparar cinco diferentes leveduras (Cryptococcus curvatus Y -1511, Lipomyces starkeyi Y-27493, Rhodotorula glutinis Y- 12905, Rhodosporidium toruloides Y-1091 e Rhodotorula mucilaginosa Y-27053), neste estudo verificou-se que as cinco leveduras avaliadas foram capazes de consumir substrato, crescer e produzir lipídeos durante os cultivos. Dentre as leveduras avaliadas a Rhodotorula glutinis Y- 12905 e Cryptococcus curvatus Y -1511 foram as que apresentaram as maiores produtividades volumétricas em lipídeos, alcançando valores entre 0,20 e 0,23 g/L.dia, respectivamente. Quanto à capacidade de consumo de substrato a R. glutinis se destacou em relação as demais leveduras tendo sido capaz de consumir cerca de 59% do glicerol após 120 horas de cultivo, consumo este que representa quase duas vezes o valor alcançado pela C. curvatus, que apresentou o segundo maior consumo de substrato. Devido a sua elevada capacidade de assimilação de glicerol e apresentando uma das maiores produtividades volumétricas de lipídeos entre as leveduras avaliadas a levedura Rhodotorula glutinis foi considerada como uma das mais promissoras para a obtenção de óleos microbianos empregando glicerol como substrato. Nos ensaios realizados com diferentes agitações e razões de volume de frasco por volume de meio verificou-se que quanto maior a disponibilidade de oxigênio, maior foi o acúmulo de lipídeos, o crescimento celular e o consumo de glicerol. Quanto à avaliação da composição nutricional a presença de fontes de nitrogênio orgânico, tais como extrato de levedura e peptona mostraram-se fundamentais para o processo de produção de óleos microbianos juntamente com MgSO4.7H2O. Quando estes nutrientes estavam presentes de forma combinada foram obtidas concentrações de até 4,4 g/L de lipídeos e produtividades de 0,43 g/L.dia. Na avaliação da influência do pH inicial e da razão carbono/nitrogênio (C:N), verificou-se que o acúmulo de lipídeos pela levedura é favorecido para cultivos realizados em pH inicial entre 6 e 7, e com razão C:N entre 30:1 e 50:1. Em tais condições a levedura foi capaz de acumular até 8 g/L de lipídeos com produtividade de até 0,82 g/L.dia. A composição do óleo microbiano obtido pela levedura revelou elevados teores dos ácidos graxos palmítico (C16:0), esteárico (C18:0), oleico (C18:1) e linoleico (C18:2), os quais correspondem a 99% de sua composição. O óleo apresentou um comportamento de fluido newtoniano com viscosidade de 39,3 cP à 50ºC, tendo um índice de acidez de 5,8±0,2 mgKOH/góleo e teor de ácido graxos de 1,93±0,08 %. / Currently, there is a search for renewable energy sources motivated mainly by environmental and strategic reasons, such as the concept of solutions for the development of fossil fuel use and a decrease of its reserves. Biodiesel has attracted increasing attention for its ability to replace diesel oil. Most of the biodiesel produced uses vegetable oils as raw material, which has as main disadvantages the seasonality and a competition in the use of agricultural land with a food production. An alternative capable of reducing the use of vegetable oils is the use of microbial oils, such as those produced by microalgae, fungi and yeasts. The lipids produced by yeasts are an interesting source of renewable raw material for biofuel production, because it is independent of climatic changes and seasonality, such as vegetable crops. In this way, the present study aims to contribute to the development of technologies of microbial oils production in heterotrophic cultures. In this sense, studies were developed to select yeasts capable of producing lipids having glycerol as substrate, as well as to establish the culture conditions more favorable for the production and accumulation of lipids by the selected yeast. For a selection of microorganisms assays were carried out aiming to compare five different yeasts (Cryptococcus curvatus Y-1511, Lipomyces starkeyi Y-27493, Rhodotorula glutinis Y-12905, Rhodosporidium toruloides Y-1091 and Rhodotorula mucilaginosa Y-27053). In this step it was verified that the five yeasts evaluated were able to consume substrate, grow and produce lipids during the cultures. Among the evaluated yeasts, Rhodotorula glutinis Y-12905 and Cryptococcus curvatus Y-1511 has presented the highest volumetric lipid yields, reaching values between 0.20 and 0.23 g/L.day, respectively. Regarding the substrate consumption capacity, R. glutinis stood out in relation to other yeasts, being able to consume about 59% of glycerol after 120 hours of cultivation. Due to its high capacity for assimilation of glycerol and presenting one of the highest volumetric productivities of lipids among evaluated yeasts, Rhodotorula glutinis was considered as one of the most promising for the obtaining of microbial oils from glycerol as substrate. In the assays performed with different oxygenation levels, it was verified that higher oxygen availability higher the volume of lipids, cell growth and glycerol consumption. In the nutritional composition evaluation it was observed that the organic nitrogen source, such as yeast extract and peptone are essential for the production process of microbial oils together with MgSO4.7H2O. When these nutrients were presents in combination, concentrations of 4.4 g/L lipids and productivity of 0.43 g/L.day were obtained. In the evaluation of the influence of the initial pH and the carbon/nitrogen ratio (C:N), it was verified that the accumulation of lipids by yeast is favored for the cultures at initial pH between 6 and 7, and with C:N ratio between 30:1 and 50:1. In such conditions, it was obtained by yeast 8 g/L of lipids and volumetric productivity of 0.82 g/day. The composition of the microbial oil obtained by the yeast revealed high levels of palmitic (C16:0), stearic (C18:0), oleic (C18:1) and linoleic (C18:2) fatty acids, which correspond to 99% of composition. The oil exhibited a Newtonian fluid behavior and a viscosity of 39.3 cP at 50 °C, having an acid number of 5.8 ± 0.2 mgKOH/goil and a fatty acid content of 1.93 ± 0.08%.

Made available in DSpace on 2017-07-10T15:14:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Igor Eduardo Lunelli.pdf: 432646 bytes, checksum: 860cf75177537ad62bbbd6730de6e3fd (MD5) Previous issue date: 2012-02-15 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The development of a crop is entirely connected to the soil conditions, climate, relief, water availability and nutrients. This work has as objective to evaluate the productivity of grains and the oil revenue of crambe cultivation under different nutritional arrangements with base on NPK. The experiment was carried out in the city of Cascavel PR, in the experimental area of the school farm of FAG Faculdade Assis Gurgacz, in tipical distroferric red latosoil, argillaceous to very argillaceous texture, lightly wavy relief, and average altitude of 680m. The climate of the region, according to climatic classification of koppen is humid mesothermal (Cfa). The treatment consisted of nutritional arrangements with base in NPK, being: T1: NPK; T2: N; T3: P; T4: K; T5: NP; T6: NK; T7: PK and T8: witness (without fertilizing application). The experimental delineation used was entirely randomized with 8 treatments and 3 repetitions. The cultivation in bands was used, being 3 bands of 4.8 x 68 meters long. The experimental unities consisted of 4.8 meters wide by 6.0 meters long each. The productivity of grains was performed from the harvest of an area of 1.0 square meters done in the central parts of the experimental unities. The oil revenue was made utilizing the Soxhlet method, in which the oil is extracted from the grains through successive washing with organic solvent. The statistical analysis consisted of the analysis of variance and the averages of treatment were compared by the test of Turkey to 5% of significance. Also the analysis of linear regression was made between the grain productivity data and oil revenue to verify the correlation between these variables. No isolated or associated nutrient promoted significant difference for the productivity of grains. For the oil revenue, the compost arrangement of NPK promoted significant difference from the other treatments, with exception from the NK and P treatment. The oil revenue is more associated with the quality than with the quantity of grains in the crambe cultivation. / O desenvolvimento de uma cultura está inteiramente ligado às condições de solo, clima, relevo, disponibilidade de água e nutrientes. Este trabalho tem por objetivo avaliar a produtividade de grãos e o rendimento de óleo da cultura do crambe sob diferentes arranjos nutricionais com base em NPK. O experimento foi realizado no município de Cascavel-PR, na área experimental da Fazenda escola da FAG - Faculdade Assis Gurgacz, num Latossolo Vermelho Distroférrico típico, textura argilosa a muito argilosa, relevo suave ondulado, a uma altitude média de 680 m. O clima da região, de acordo com a classificação climática de Köppen é mesotérmico superúmido (Cfa). Os tratamentos consistiram de arranjos nutricionais com base em NPK, sendo: T1: NPK; T2: N; T3: P; T4: K; T5: NP; T6: NK; T7: PK e T8: testemunha (sem aplicação fertilizante). O delineamento experimental utilizado foi o inteiramente ao acaso com 8 tratamentos e 3 repetições. Utilizou-se o cultivo em faixas, sendo 3 faixas de 4,8 x 68 m de comprimento. As unidades experimentais constaram de 4,8 m de largura por 6,0 m de comprimento cada. A produtividade de grãos foi realizada a partir da colheita de uma área de 1,0 m2 realizada na parte central das unidades experimentais. O rendimento de óleo foi realizado utilizando o método Soxhlet, em que o óleo é extraído dos grãos a partir de sucessivas lavagens com solvente orgânico. A análise estatística constou de análise de variância e as médias de tratamentos foram comparadas pelo teste de Tukey a 5 % de significância. Também foi realizada a análise de regressão linear entre os dados de produtividade de grãos e rendimento de óleo para verificar a correlação entre essas variáveis. Nenhum nutriente isolado ou em associação promoveu diferença significativa para a produtividade de grãos. Para o rendimento de óleo, o arranjo composto por NPK promoveu diferença significativa dos demais tratamentos, à exceção dos tratamentos NK e P. O rendimento de óleo está mais associado à qualidade do que na quantidade dos grãos da cultura do crambe.

The production of biofuels and oleochemicals from renewable sources offers an opportunity to reduce our dependence on fossil fuels. The work contained in this dissertation has focused on developing and improving methods for the production of biodiesel from non-traditional feedstocks and understanding biosynthetic pathways that result in the production of oleochemicals and fuels. Pure vegetable oil can account for 70-80% of the total cost of biodiesel production. Many low-cost oils contain high amounts of free fatty acids, which are unsuitable for base-catalyzed transesterification. Herein an approach is described that efficiently accomplishes the simultaneous esterification and transesterification of both free fatty acids and triglycerides found in low-cost oils. The approach utilizes an acid catalyst and longer-chain alcohols to improve biodiesel yields from oils high in free fatty acids. Microalgae are a promising biodiesel feedstock, due to its high lipid productivity and its ability to be cultivated using resources, land and water, unsuitable for agriculture. As part of this work, reaction conditions were optimized for the direct (or in situ) transesterification of algal biomass to biodiesel. This approach accomplishes the simultaneous extraction and conversion of the total lipids from microalgae and results in increased yields compared to extraction followed by conversion. The use of this process to effectively produce biodiesel from wet algal biomass is also discussed. Wax esters are a class of oleochemicals that can be used for a wide range of applications in diverse industries. The chemical composition of native wax esters from the bacterium Marinobacter aquaeolei was determined. It was found that including small alcohols in the growth medium resulted in the in vivo formation of esters similar to biodiesel. All of the proteins involved in the wax ester biosynthetic pathway are not known. The cloning, purification, and characterization of a putative fatty aldehyde reductase from M. aquaeolei, believed to be involved in the production of wax esters, is reported. Finally, the expression of a ws/dgat (wax ester synthase) gene from M. aquaeolei in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 is discussed as an approach to producing biodiesel in vivo from sunlight and CO2.

Lignin is the second most abundant biopolymer on Earth, right after cellulose, with a highly complex chemical structure that hinders its possible utilizations. Applications that utilize lignin in different manners are of great interest, due to its inexpensive nature. Present work is based on the notion of converting lignin into different biofuels that have only a few, however important, advantages over lignin as a direct energy source. The first part of current work (pyrolysis) details the analysis of lignin from a relatively new lignin isolation process called LignoBoost. It is obtained from the pulp and paper industry via CO₂ precipitation of lignin from black liquor (BL). This method is environment friendly, results lignin with minimal oxidation, eliminates the main bottleneck of the Kraft cycle (recovery boiler capacity), and yet leaves enough lignin in the process stream to recover pulping chemicals and generate energy for the pulp mill. Pyrolysis had converted this lignin into bio-oil with high aliphatic content and low oxidation level, all advantageous for application as liquid fuel. The second part of this dissertation proved the theory that lignin degradation and lipid accumulation metabolic pathways can be interconnected. Gram-positive Rhodococcus opacus species, DSM 1069 and PD630 were used to evaluate lignin to lipid bioconversion, starting with ethanol organosolv and Kraft lignin. This conversion is a first step in a multistep process towards biodiesel production, which includes transesterification, after lipids are extracted from the cells. Results clearly indicated that the lignin to lipid bioconversion pathway is viable, by cells gaining up to 4 % of their weight in lipids, while growing solely on lignin as a carbon and energy source.