Os crustáceos são originariamente marinhos; ao longo da evolução, diversas espécies invadiram ambientes de salinidades menores, chegando à água doce. A capacidade dos crustáceos colonizarem com sucesso o ambiente dulcícola depende do desenvolvimento de mecanismos eficientes de hiperosmorregulação. A osmolalidade e a composição iônica da hemolinfa de um crustáceo, em meios diluídos, refletem o equilíbrio dinâmico entre a perda de íons por difusão e pela urina e sua reabsorção do meio externo, através das brânquias. A (Na,K)-ATPase branquial desempenha um papel chave no processo de captura de Na+ a partir de ambientes diluídos e suas características cinéticas vem sendo investigadas recentemente, embora as enzimas de caranguejos dulcícolas sejam pouco conhecidas. Segundo o modelo atual, a afinidade por Na+ é o parâmetro cinético mais variável entre as enzimas de diferentes espécies, refletindo a salinidade do habitat do animal, de modo que enzimas de espécies bem adaptadas à água doce apresentam afinidades maiores por Na+. Entretanto, vários resultados conflitantes têm sido relatados nos últimos anos. Recentemente, foi proposto que uma V-ATPase também desempenha papel essencial na captação de Na+ através das brânquias dos crustáceos dulcícolas. Esta enzima ainda é praticamente desconhecida: suas características cinéticas não foram estudadas e a relação entre a magnitude da sua atividade e a salinidade do meio externo não está estabelecida. Este projeto teve por objetivo a caracterização das enzimas (Na,K)-ATPase e V-ATPase das brânquias posteriores do caranguejo hololimnético Dilocarcinus pagei, considerado um antigo invasor da água doce. A (Na,K)-ATPase foi caracterizada em animais mantidos em água doce, a fim de comparar suas propriedades cinéticas com aquelas das enzimas de outras espécies de caranguejos, habitantes de meios mais salinos, visando melhorar o entendimento das adaptações bioquímicas associadas à invasão da água doce. A V-ATPase foi caracterizada em animais mantidos em água doce ou expostos por diferentes intervalos de tempo à salinidade de 21‰ ou ainda aclimatados por 10 dias a diferentes salinidades (5-21‰), visando estabelecer uma relação entre a magnitude da atividade e a salinidade do meio, além de investigar os mecanismos de regulação da atividade da enzima. A análise da fração microsomal branquial de D. pagei mantido em água doce em gradiente contínuo de sacarose mostrou dois picos protéicos (25-35% e 35-45% de sacarose), ambos com atividades K+-fosfatase, (Na,K)-ATPase e V-ATPase. Estes resultados indicam a presença de frações de membrana com densidades distintas, apresentando, em ambos os casos, as principais bombas de íons envolvidas na captação de Na+. Estas membranas podem ser originárias de locais distintos do epitélio branquial posterior assimétrico deste caranguejo. A análise por Western blotting revelou duas bandas imunoespecíficas (Mr 116 kDa e 105 kDa) correspondentes à subunidade α da (Na,K)-ATPase, sugerindo a presença de duas isoformas nas brânquias posteriores do animal. A estimulação da atividade K+-fosfatase da (Na,K)-ATPase pelo PNFF envolveu interações sítio-sítio (nH= 1,4), com V= 43,4 ± 2,2 U mg-1 e K0,5= 1,13 ± 0,06 mmol L-1. A estimulação da atividade da enzima por K+ (V= 39,9 ± 1,9 U mg-1 e K0,5= 4,2 ± 0,2 mmol L-1), Mg2+ (V= 45,0 ± 2,2 U mg-1, K0,5= 0,82 ± 0,04 mmol L-1) e NH4+ (V= 31,7 ± 1,6 U mg-1, K0,5= 19,0 ± 0,9 mmol L-1) também ocorreu por meio de interações sítio-sítio. A afinidade aparente da enzima pelo PNFF e Mg2+ foi similar às relatadas para enzimas de outros crustáceos, incluindo caranguejos habitantes de meios mais salinos. Entretanto, a enzima de D. pagei apresentou menor afinidade aparente por íons K+ que as outras espécies já estudadas. A atividade K+-fosfatase da (Na,K)-ATPase branquial de D. pagei mantido em água doce foi estimulada sinergicamente por K+ e NH4+ sugerindo a presença de dois sítios de ligação para estes íons na molécula da enzima. Ouabaína (4 mmol L-1) inibiu a atividade PNFFase total da preparação (≈ 89%), por meio de uma curva monofásica (KI= 225,6, ± 11,3 µ mol L-1), sugerindo que, se presentes na fração microsomal, as duas isoenzimas da (Na,K)-ATPase apresentam sensibilidades próximas para o inibidor. Ortovanadato (1µmol L-1) inibiu 95% da atividade PNFFase total por meio de uma curva bifásica, reforçando a sugestão da presença de duas isoenzimas na preparação. A hidrólise do ATP pela (Na,K)-ATPase branquial de D. pagei mantido em água doce ocorreu em sítios de alta (V= 6,4 ± 0,32 U mg-1 e K0,5 = 0,34 ± 0,02 µmol L-1) e baixa afinidade (V= 127,1 ± 6,2 U mg-1e KM = 84 ± 4,1 µmol L-1). Não foi encontrada uma correlação direta entre a afinidade pelo ATP e o habitat de diferentes espécies de caranguejos. A atividade (Na,K)-ATPase específica de D. pagei mantido em água doce foi cerca de 3 vezes menor que relatada para Potamon edulis, única espécie de caranguejo dulcícola para a qual este parâmetro foi relatado. Atividades específicas muito maiores foram encontradas para caranguejos estuarinos, particularmente quando aclimatados a salinidades baixas. A baixa atividade específica determinada para D. pagei pode ser atribuída ao baixo gradiente osmoiônico que este animal mantém entre a hemolinfa e o meio externo, comparado a outros caranguejos dulcícolas, que o caracteriza como uma espécie particularmente bem adaptada ao ambiente dulcícola. A estimulação da atividade da enzima por íons Na+ (V = 133,8 ± 7,3 U mg-1e K0,5= 4,7 ± 0,3 mmol L-1), Mg2+ (V= 136,5 ± 8,0 U mg-1, K0,5= 0,62 ± 0,04 mmol L-1), K+ (V = 131,7± 7,9 U mg-1 e K0,5= 0,47 ± 0,03 mmol L-1) e NH4+ (V= 125,6 ± 6,3 U mg-1, K0,5= 1,90 ± 0,09 mmol L-1) ocorreu por meio de interações sítio-sítio. A afinidade aparente por Na+ da enzima de D. pagei é baixa, se comparada às relatadas para outros animais dulcícolas, e similar às encontradas para espécies estuarino/marinhas. Em contraste, a afinidade aparente por K+ é 2,5 a 5 vezes maior que as determinadas para espécies habitantes de meios mais salinos e aparentemente está mais relacionada ao habitat do animal que a afinidade por Na+. Esta possibilidade é coerente com o fato da (Na,K)-ATPase branquial dos crustáceos apresentar os sítios de ligação de K+ expostos para a hemolinfa, o que possibilita a modulação da atividade da enzima pela concentração de K+ na hemolinfa. Ao contrário do observado para várias outras espécies de caranguejos, a atividade (Na,K)-ATPase branquial de D. pagei não foi estimulada sinergisticamente por K+ e NH4+. Entretanto, a presença de um dos íons no meio reacional provoca o aumento da afinidade aparente da enzima pelo outro em cerca de 3 vezes. Fisiologicamente, esta característica cinética pode ser importante para garantir o transporte de ambos os íons pela enzima, mesmo em presença de concentrações relativamente elevadas do outro. Ouabaína (3 mmol L-1) inibiu a atividade ATPase total (≈ 78%) por meio de uma curva bifásica (KI= 6,21 ± 0,32 µmol L-1 e 101,2 ± 5,1 µmol L-1), reforçando os resultados anteriores no sentido de demonstrar a existência de duas isoenzimas da (Na,K)-ATPase nas brânquias posteriores de D. pagei. Observou-se também uma inibição bifásica por ortovanadato (10 µmol L-1), que inibiu a atividade ATPase total em 85%. O pH ótimo para a atividade V-ATPase branquial de D. pagei foi de 7,5. A modulação da atividade V-ATPase do animal mantido em água doce por ATP (V= 26,5 ± 1,3 U mg-1; K0,5= 3,9 ± 0,2 mmol L-1) e Mg2+ (V = 27,9 ± 1,4 U mg-1; K0,5 =0,80 ± 0,04 mmol L-1) ocorreu por meio de interações cooperativas. Já a inibição da atividade ATPase insensível ao ortovanadato por bafilomicina A1 ocorreu segundo uma curva monofásica (KI= 55,0 ± 2,8 nmol L-1). Cerca de 44 % da atividade ATPase total foi inibida, correspondendo à V-ATPase. A atividade V-ATPase branquial de D. pagei diminuiu acentuadamente em resposta à exposição à salinidade de 21‰. Após 1h de exposição, a atividade diminuiu cerca de 3 vezes, chegando a 4 vezes após 24h, o que indica a atuação de mecanismos eficientes de regulação a curto prazo. Curiosamente, a atividade V-ATPase foi cerca de 2 vezes maior para um tempo de aclimatação de 120h a 21‰, comparado a 24 h, embora 2 vezes menor que a estimada em água doce. Passadas 240 h, a atividade voltou aos baixos níveis observados entre 1h e 24h, o que indica a ação de mecanismos de regulação a longo prazo. Além da diminuição da atividade específica também foi observado aumento da afinidade da enzima por ATP (12 vezes) e Mg2+ (3 vezes) em resposta à exposição dos animais a 21‰. Similarmente, ocorreu um aumento de até 190 vezes na afinidade da enzima por bafilomicina A1. Propõe-se que, em resposta à alteração de salinidade, ocorrem mudanças conformacionais tanto em V1 (onde se encontram os sítios de ligação de ATP e Mg2+) quanto V0 (onde se localiza o sítio de ligação de bafilomicina), resultando numa maior exposição do sítio para o inibidor e no aumento da afinidade por Mg2+ e ATP. Como os aumentos de afinidade são observados já após 1h de exposição, este mecanismo parece ser independente da expressão protéica e, portanto, não estaria relacionado à expressão de isoformas diferentes de alguma das subunidades da enzima. A diminuição da atividade V-ATPase branquial de D. pagei em resposta à exposição a uma salinidade elevada é compatível com os mecanismos propostos para a atuação desta enzima no processo de captura ativa de Na+ em crustáceos dulcícolas. Após 10 dias de aclimatação ainda se tem atividade V-ATPase detectável nas frações microsomais das brânquias posteriores do animal, possivelmente envolvida nas funções de regulação ácido-base e excreção de amônia. Os resultados obtidos para a aclimatação de D. pagei por um período de 10 dias a salinidades entre 5 e 21‰ mostraram também uma diminuição acentuada da atividade V-ATPase em resposta ao aumento da salinidade. Entretanto, com exceção da salinidade mais baixa (5‰) não se observou aumento da afinidade da enzima por bafilomicina, sugerindo que esta alteração seja limitada a tempos de aclimatação mais curtos. Entretanto, também se verificou um aumento acentuado da afinidade da enzima por ATP e Mg2+. / Crustacean arose in the sea but, during evolution, several species invaded lower salinity biotopes, reaching fresh water. The ability of crustaceans to successfully colonize the freshwater biotope depends on efficient mechanisms of hyperosmoregulation. In dilute media, crustaceans\' hemolymph osmolality and ionic composition reflect a balance between diffusive and urinary ion losses, and active ion capture through the gills. The gill (Na,K)- ATPase plays a pivotal role in Na+ capture from dilute environments and its kinetic characteristics are under investigation in recent years, although freshwater crab enzymes are poorly known. According to the most recent model, the apparent affinity for Na+ is the most variable kinetic parameter among gill enzymes from different species, and reflects the salinity of the species\' habitat. Thus, enzymes from species which are well adapted to freshwater usually present higher affinities for Na+. However, several recent results are incompatible with this model. On the other hand, it has been proposed that a V-ATPase is also involved in Na+ capture through the gills of hololimnetic crustaceans. This enzyme is almost completely unknown: its kinetic characteristics have not been studied yet and the relationship between the magnitude of its activity in the gills and the external medium salinity has not been established. This work aimed to characterize the (Na,K)-ATPase and V-ATPase from the posterior gill from the holimnetic crab Dilocarcinus pagei, considered an old fresh water colonizer. The (Na,K)- ATPase was characterized in animals maintained in fresh water, in order to establish a comparison of its kinetic properties with those of enzymes from other crab species that inhabit more saline media. This comparison may enhance our understanding of the biochemical adaptations associated to fresh water invasion. V-ATPase was characterized in animals kept in fresh water or exposed for varying time intervals to a medium of 21? salinity, or else acclimated for 10 days to media of different salinities (5-21?), aiming to establish a relationship between the enzyme specific activity in the gill tissue and the external salinity, and also investigate the mechanisms involved in enzyme activity regulation. The analysis of D. pagei gill microsomes in a continuous-density sucrose gradient revealed two protein peaks (25-35% and 35-45% sucrose), both showing K+-phosphatase, (Na,K)-ATPase and V-ATPase activities. These results indicate the presence of membrane fractions of distinct densities, both presenting the main ion pumps involved in Na+ capture. These membranes may originate from different places in the asymmetric posterior gill epithelium from this crab. Western compared to those reported for other freshwater animals, but similar to those found for estuarine/marine species. In contrast, the apparent affinity for K+ is 2.5 to 5-fold higher than those estimated for species that inhabit more saline media, and is apparently more related to the animals\' habitat than Na+ affinity. This possibility is consistent with the location of the (Na,K)-ATPase in crabs gill tissue, with K+ binding sites exposed to the hemolymph, allowing the direct modulation of enzyme activity by hemolymph K+ concentration. In contrast to data reported for other crab species, D. pagei gill (Na,K)-ATPase activity was not synergistically stimulated by K+ and NH4 +. However, the presence of one of these ions in the reaction medium results in an increase of about 3-fold in the apparent affinity of the enzyme for the other. This kinetic characteristic may be physiologically relevant to assure the transport of both ions, even in the presence of elevated concentrations of the other. Ouabain (3 mmol L-1) inhibited total ATPase activity (? 78%) through a biphasic curve (KI= 6.21 ± 0.32 mol L-1 and 101.2 ± 5.1 mol L-1) reinforcing previous results suggesting the presence of two isoenzymes in the microsomal preparations. A biphasic inhibition by orthovanadate (10 mol L-1) to about 15% residual activity was also observed. Optimal pH for D. pagei gill V-ATPase activity was 7.5. The modulation of enzyme activity of the animal kept in fresh water by ATP (V= 26.5 ± 1.3 U mg-1; K0.5= 3.9 ± 0.2 mmol L-1) and Mg2+ (V = 27.9 ± 1.4 U mg-1; K0.5 =0.80 ± 0.04 mmol L-1) occurred with positive cooperativity. The inhibition of the orthovanadate insensitive ATPase activity by bafilomycin A1 followed a monophasic curve (KI= 55.0 ± 2.8 nmol L-1). About 44 % of total ATPase activity was inhibited, corresponding to the V-ATPase. Dilocarcinus pagei gill V-ATPase activity substantially decreased in response to animal\'s exposure to 21? salinity. After 1h exposure, the activity diminished about 3-fold, reaching 4- fold after 24h, indicating the action of efficient short-time regulation mechanisms. Interestingly, V-ATPase activity was about 2-fold higher after 120h exposure, compared to 24h, although 2- fold lower compared to that estimated in fresh water. After 240h, the activity returned to the low levels observed for 1 and 24 h, indicating efficient long-term regulation. Besides the decrease in specific activity, it was also observed an increase in enzyme\'s apparent affinity for ATP (12 fold) and Mg2+ (3 fold) in response to animal\'s exposure to 21? salinity. Simultaneously, the enzyme\'s affinity for bafilomycin A1 increased up to 190-fold. We propose that, in response to salinity alteration, conformational changes take place both in V1 (in which the ATP and Mg2+ binding sites are located) and V0 (which contains the bafilomycin A1 bindind site), resulting in higher exposition of the inhibitor binding site and also higher affinity for Mg2+ and ATP. As the affinity increases are observed after just 1h exposure, this regulatory mechanism seems to be independent of protein expression and, thus, should not be related to the expression of distinct isoforms of some enzyme subunit. The lowering of gill V-ATPase activity in D. pagei in response to exposure to an elevated salinity is consistent with the mechanisms proposed for the role of this enzyme in active Na+ capture in hololimnetic crustaceans. After 10 days at 21, the gill microsomal fractions still show a little V-ATPase activity, possibly related to acid-base regulation and ammonia excretion processes. The results obtained for the acclimation of D. pagei for 10 days at salinities in the range 5 to 21? also showed a substantial decrease of V-ATPase activity in response to the increase in medium salinity. However, except for 5?, it was not observed an increase of enzyme\'s affinity for bafilomycin, suggesting that this alteration is limited to shorter periods of exposure. However, a significant increase in the enzyme\'s affinity for ATP and Mg2+ was also observed.

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A caracterização bioquímica da (Na+,K+)-ATPase, uma importante enzima envolvida no controle osmo-iônico nos crustáceos osmorreguladores, foi realizada a partir de centrifugação diferencial de frações microsomais do tecido branquial do siri eurialino C. danae, coletado na Baía de Ubatuba e mantido a 33o/oo de salinidade (animais recém-capturados). A ultracentrifugação da fração microsomal em um gradiente contínuo de sacarose (10-50%) revelou a presença de um único pico de atividade (Na+, K+)-ATPase, coincidente com o pico de atividade K+-fosfatase. Ambas as atividades foram inibidas completamente pela ouabaína. O Western blotting da fração microsomal apresentou uma única banda imunoespecífica contra a subunidade alfa da (Na+, K+)-ATPase, sugerindo a presença de uma única isoforma para a cadeia alfa da enzima. A hidrólise do ATP ocorreu em sítios de alta afinidade que apresentaram interações sítio-sítio (nH=3,6) com uma atividade específica V= 35,4 ± 2,1 U/mg e K0,5= 54,0 ± 4,0 nM, bem como em sítios de baixa afinidade, que obedeceram uma cinética Michaeliana, com V= 271,5 ± 17,2 U/mg e KM = 55,0 ± 3,0 uM. A estimulação da atividade da enzima pelos íons Na+ (V= 302,1 ± 14,1 U/mg e K0,5= 5,80 ± 0,3 mM), Mg2+ (V= 309,7 ± 15,7 U/mg e K0,5= 0,48 ± 0,02 mM) e K+ (V= 294,0 ± 11,8 U/mg e K0,5= 1,61 ± 0,06 mM) ocorreu através de interações sítio-sítio, enquanto a estimulação pelos íons NH4+ obedeceu a uma cinética Michaeliana com V= 377,8 ± 22,7 U/mg e KM= 4,61 ± 0,27 mM). Interessantemente, os íons NH4+ estimularam sinergisticamente a atividade específica da enzima em cerca de 90% (V= 557,0 ± 28,3 U/mg), sugerindo que esses íons se ligam em diferentes sítios na molécula. A (Na+,K+)-ATPase do tecido branquial de C. danae hidrolisou o PNFF com V= 125,4 ± 7,5 U/mg, K0,5= 1,2 ± 0,1 mM, através de interações cooperativas (nH= 1,5). Além disso, essa atividade K+-fosfatase foi inibida competitivamente pelo ATP (KI= 57,2 ± 2,6 µM), sugerindo que os dois substratos foram hidrolisados no mesmo sítio da enzima. A estimulação da atividade K+-fosfatase da (Na+,K+)-ATPase pelos íons K+ (V= 121,0 ± 6,1 U/mg; K0,5= 2,1 ± 0,1 mM), Mg2+ (V= 125,3 ± 6,3 U/mg; K0,5= 1,0 ± 0,1 mM) e NH4+ (V= 126,1 ± 4,8 U/mg; K0,5= 13,7 ± 0,5 mM) ocorreram através de interações sítio-sítio, similarmente ao observado para o ATP. A ouabaína e o ortovanadato inibiram completamente a atividade (Na+,K+)-ATPase (KI= 147,2 ± 7,2 uM; KI= 11,2 ± 0,6 nM, respectivamente). Entretanto, para a atividade K+-fosfatase os valores determinados foram significativamente superiores (KI= 830,3 ± 42,5 uM; KI= 34,0 ± 1,4 nM, respectivamente). A inibição da atividade da (Na+,K+)-ATPase por essas duas substâncias foi afetada pela presença de íons NH4+. Entretanto, o mesmo não ocorreu com a atividade K+-fosfatase da enzima. A representação de Arrhenius revelou a ocorrência de uma transição de fase próximo a 19°C, com deltaH1= 15.939 cal/mol e outra a 38°C com deltaH2= 7.719 cal/mol. Temperaturas acima de 43°C provocaram uma rápida inativação da (Na+,K+)-ATPase. Esta é a primeira demonstração da presença de um sítio de alta afinidade para o ATP na (Na+,K+)-ATPase de crustáceo. Os resultados obtidos sugerem que as atividades (Na+,K+)-ATPase e K+-fosfatase pertencem à mesma enzima e que a preparação não apresenta contaminações por outras ATPases e/ou fosfatases. Do ponto de vista fisiológico, os resultados deste trabalho são relevantes em relação à excreção ativa dos íons NH4+ pelos crustáceos. / The modulation by Mg+2, Na+, K+, NH4+ ions and ATP of the (Na+, K+)-ATPase activity in a microsomal fraction from Callinectes danae gills was analyzed. ATP was hydrolyzed at high-affinity binding sites at a maximal rate of V= 35.4 ± 2.1 U/mg and K0.5= 54.0 ± 3.6 nM, obeying cooperative kinetics (nH= 3.6). At low-affinity sites, the enzyme hydrolyzed ATP obeying Michaelis-Menten kinetics with KM= 55.0 ± 3.0 uM and V= 271.5 ± 17.2 U/mg. This is the first demonstration of a crustacean (Na+, K+)-ATPase possessing two ATP hydrolyzing sites. Stimulation by sodium (K0.5= 5.80 ± 0.30 mM), magnesium (K0.5= 0.48 ± 0.02 mM) and potassium ions (K0.5= 1.61 ± 0.06 mM) exhibited site-site interactions, while that by ammonium ions obeyed Michaelis-Menten kinetics (KM= 4.61 ± 0.27 mM). Ouabain (KI= 147.2 ± 7.2 uM) and orthovanadate (KI= 11.2 ± 0.6 nM) completely inhibited ATPase activity, indicating the absence of contaminating ATPase and/or neutral phosphatase activities. Ammonium and potassium ions synergistically stimulated the enzyme, increasing specific activities up to 90%, suggesting that these ions bind to different sites on the molecule and that the presence of each ion modulates enzyme stimulation by the other. The kinetic properties of a microsomal gill (Na+,K+)-ATPase were also analyzed using p-nitrophenylphosphate as substrate. The (Na+,K+)-ATPase hydrolyzed the substrate obeying cooperative kinetics (n= 1.5) at rates of V= 125.4 ± 7.5 U/mg and K0.5= 1.2 ± 0.1 mM and ATP competitively inhibited K+-phosphatase activity (KI= 57.2 ± 2.6 µM). Enzyme stimulation by potassium (V= 121.0 ± 6.1 U/mg; K0.5= 2.1 ± 0.1 mM) and magnesium ions (V= 125.3 ± 6.3 U/mg; K0.5= 1.0 ± 0.1 mM) was cooperative. Ammonium ions stimulated the enzyme through site-site interactions to a rate of V= 126.1 ± 4.8 U/mg with K0.5= 13.7 ± 0.5 mM. However, the K+-phosphatase activity was not synergistically stimulated using potassium plus ammonium ions. Sodium ions (KI= 36.7 ± 1.7 mM), ouabain (KI= 830.3 ± 42.5 uM) and orthovanadate (KI= 34.0 ± 1.4 nM) completely inhibited K+-phosphatase activity. The data show that the K+-phosphatase activity corresponds strictly to the (Na+,K+)-ATPase. This is the first invertebrate (Na+,K+)-ATPase shown to exhibit both high- and low-affinity sites for ATP hydrolysis and synergistic stimulation by potassium and ammonium ions (Masui et al., 2002). Further characterization of the K+-phosphatase activity will reveal its specific kinetic characteristics and may become a useful tool in comparative osmoregulatory studies.

TRPV4 is a non-selective cation channel with a wide expression and multiple cellular and systemic functions. Described initially as an osmosensor, it can also be activated by temperature and cell swelling. Due to this variety of activating stimuli it may have a promiscuous gating behavior which is mostly unknown. This Thesis research aims to get in-depth in the understanding of the molecular determinants of TRPV4 regulation. I provide evidences that the inositol trisphosphate receptor and its modulatory function on TRPV4 relies on its binding to the C-terminal tail of TRPV4. I discuss the role of the channels’ N-terminal tail in osmotransduction and show how a mutation that results in a channel with an impaired response to osmotic environments is associated to a pathophysiological condition such as hyponatremia. I also highlight the importance of this N-terminal tail and the binding to the regulatory protein PACSIN3 for the global conformation of the channel. / El TRPV4 és un canal catiònic no selectiu d’expressió generalitzada i funcions diverses. Tot i que inicialment es va descriure com un osmosensor sistèmic, avui sabem que també es pot activar per temperatura o per augments del volum cel•lular. Degut a la diversitat d’estímuls, el canal presenta diferents vies d’activació la major part de les quals són desconegudes. Aquesta Tesi pretén estudiar en detall els mecanismes moleculars que regulen l’activitat del canal. Aportem evidències del lloc d’unió a la cua C-terminal del receptor d’inositol trifosfat així com la seva modulació sobre l’activitat del TRPV4. També discutim el rol de la cua N-terminal en la osmotransducció i presentem una mutació, generadora d’un canal amb una resposta anòmala a estímuls hipotònics, que està associada a una condició fisiopatològica com la hiponatremia. També destaquem la importància de la cua N-terminal i de la unió de la proteïna reguladora PACSIN3 en la conformació global del canal.

Thesis (Ph. D.)--Ohio State University, 2005. / Title from first page of PDF file. Document formatted into pages; contains xv, 126 p.; also includes graphics (some col.). Includes bibliographical references (p. 96-107). Available online via OhioLINK's ETD Center

Dissertação(mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande, Programa de Pós–Graduação em Aqüicultura, Instituto de Oceanografia, 2011. / Submitted by Cristiane Silva (cristiane_gomides@hotmail.com) on 2012-08-11T17:30:34Z No. of bitstreams: 1 dissertao mestrado_iuri salim abou anni.pdf: 920616 bytes, checksum: e1ed6eb173ad9593484417ec03fdce7b (MD5) / Approved for entry into archive by Bruna Vieira(bruninha_vieira@ibest.com.br) on 2012-12-19T14:26:35Z (GMT) No. of bitstreams: 1 dissertao mestrado_iuri salim abou anni.pdf: 920616 bytes, checksum: e1ed6eb173ad9593484417ec03fdce7b (MD5) / Made available in DSpace on 2012-12-19T14:26:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertao mestrado_iuri salim abou anni.pdf: 920616 bytes, checksum: e1ed6eb173ad9593484417ec03fdce7b (MD5) Previous issue date: 2011 / O objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos da salinidade sobre o comportamento iono e osmorregulatório, bem como o crescimento de juvenis de pampo Trachinotus marginatus. Um experimento foi realizado para estimar o ponto isosmótico e as concentrações iônicas plasmáticas do pampo. Os peixes (144,7 ± 28,4 g e 19,6 ± 2,0 cm) foram aclimatados durante quinze dias nas salinidades 4, 8, 12, 16 e 20 e amostras de sangue foram coletadas para análise da composição iônica e osmolalidade plasmática. O ponto isosmótico foi determinado pela regressão linear entre a osmolalidade plasmática e a osmolalidade da água. Em um segundo experimento, 320 peixes (2,14 ± 0,29 g e 5,11 ± 0,33 cm) foram aleatoriamente distribuídos em 16 tanques (50L). Cada tratamento foi mantido nas salinidades 3, 6, 12 e 32 (quatro repetições cada), equivalente a 25, 50, 100 e 267% do ponto de isosmótico. Durante o período experimental (28 dias), os peixes foram mantidos a 28 °C, pH 8,0, alcalinidade 135 mg CaCO3/L e saturação de oxigênio sempre superior a 90%. O consumo de oxigênio foi medido em cada salinidade. O segundo arco branquial de 12 peixes foi coletado para análise da atividade da enzima Na+/K+-ATPase. O ponto isosmótico do pampo foi determinado em 357,5 mOsmoles/kg H2O-1, o que equivale à salinidade 13,1. A osmolalidade plasmática, o hematócrito, a glicemia, o índice hepatossomático e atividade da Na+/K+-ATPase branquial não foram afetados pela salinidade. No segundo experimento, a maior taxa de consumo de oxigênio foi observado para os peixes criados na salinidade 3, enquanto a atividade da Na+/K+-ATPase branquial foi significativamente maior nesta salinidade em relação às salinidades 12 e 32. A concentração de glicogênio hepático da salinidade 3 foi significativamente menor em relação a salinidade 32. A atividade da tripsina no intestino e a umidade dos músculos não apresentaram variação significativa entre os tratamentos. O maior crescimento foi observado nas salinidades 3, 6 e 12. / The objective of this study was to evaluate the effect of salinity on juvenile growth of juvenile pompano Trachinotus marginatus. One experiment was done to estimate the isosmotic point of pompano, fish (144,7 ± 28,4 g e 19,6 ± 2,0 cm) were acclimated fortnightly at salinities 4, 8, 12, 16 and 20 and blood was sampled for osmolarity analysis. The isosmotic point was determined by linear regression between plasma osmolality and water osmolality. Later, 320 fish (2,1 ± 0,2 g and 5,1 ± 0,3 cm) were randomly distributed into 16 tanks (50L). Each treatment was maintained at salinities 3, 6, 12, and 32 (four replicates each), equivalent to 25, 50, 100 and 267% of the isosmotic point. During the experimental period (28 days), fish were maintained at 28°C, pH 8.0, alkalinity 135 mg/L of CaCO3, and oxygen saturation was always above 90%. Oxygen consumption was measured at each salinity. The second gill arch of 12 fish was collected for analysis of the Na+/K+-ATPase. The isosmotic point of T. marginatus was determined in 357,5 mOsmol/kg H2O-1, which is equivalent to salinity 13,1. Plasma osmolality, hematocrit, glycemia, hepatosomatic index and activity of Na+/K+-ATPase were not affected by salinity. In the second experiment, the highest rate of oxygen consumption was observed for fish reared at salinity 3, while the activity of Na+/K+-ATPase was significantly higher in salinity 3 in relation to salinity 12 and 32. The hepatic glycogen concentration of salinity 3 was significantly lower than the salinity 32. The activity of trypsin in the intestine and muscle humidity showed no significant variation between treatments. The best growth performance was observed at salinity 3, 6 and 12.

Os crustáceos são originariamente marinhos; ao longo da evolução, diversas espécies invadiram ambientes de salinidades menores, chegando à água doce. A capacidade dos crustáceos colonizarem com sucesso o ambiente dulcícola depende do desenvolvimento de mecanismos eficientes de hiperosmorregulação. A osmolalidade e a composição iônica da hemolinfa de um crustáceo, em meios diluídos, refletem o equilíbrio dinâmico entre a perda de íons por difusão e pela urina e sua reabsorção do meio externo, através das brânquias. A (Na,K)-ATPase branquial desempenha um papel chave no processo de captura de Na+ a partir de ambientes diluídos e suas características cinéticas vem sendo investigadas recentemente, embora as enzimas de caranguejos dulcícolas sejam pouco conhecidas. Segundo o modelo atual, a afinidade por Na+ é o parâmetro cinético mais variável entre as enzimas de diferentes espécies, refletindo a salinidade do habitat do animal, de modo que enzimas de espécies bem adaptadas à água doce apresentam afinidades maiores por Na+. Entretanto, vários resultados conflitantes têm sido relatados nos últimos anos. Recentemente, foi proposto que uma V-ATPase também desempenha papel essencial na captação de Na+ através das brânquias dos crustáceos dulcícolas. Esta enzima ainda é praticamente desconhecida: suas características cinéticas não foram estudadas e a relação entre a magnitude da sua atividade e a salinidade do meio externo não está estabelecida. Este projeto teve por objetivo a caracterização das enzimas (Na,K)-ATPase e V-ATPase das brânquias posteriores do caranguejo hololimnético Dilocarcinus pagei, considerado um antigo invasor da água doce. A (Na,K)-ATPase foi caracterizada em animais mantidos em água doce, a fim de comparar suas propriedades cinéticas com aquelas das enzimas de outras espécies de caranguejos, habitantes de meios mais salinos, visando melhorar o entendimento das adaptações bioquímicas associadas à invasão da água doce. A V-ATPase foi caracterizada em animais mantidos em água doce ou expostos por diferentes intervalos de tempo à salinidade de 21‰ ou ainda aclimatados por 10 dias a diferentes salinidades (5-21‰), visando estabelecer uma relação entre a magnitude da atividade e a salinidade do meio, além de investigar os mecanismos de regulação da atividade da enzima. A análise da fração microsomal branquial de D. pagei mantido em água doce em gradiente contínuo de sacarose mostrou dois picos protéicos (25-35% e 35-45% de sacarose), ambos com atividades K+-fosfatase, (Na,K)-ATPase e V-ATPase. Estes resultados indicam a presença de frações de membrana com densidades distintas, apresentando, em ambos os casos, as principais bombas de íons envolvidas na captação de Na+. Estas membranas podem ser originárias de locais distintos do epitélio branquial posterior assimétrico deste caranguejo. A análise por Western blotting revelou duas bandas imunoespecíficas (Mr 116 kDa e 105 kDa) correspondentes à subunidade α da (Na,K)-ATPase, sugerindo a presença de duas isoformas nas brânquias posteriores do animal. A estimulação da atividade K+-fosfatase da (Na,K)-ATPase pelo PNFF envolveu interações sítio-sítio (nH= 1,4), com V= 43,4 ± 2,2 U mg-1 e K0,5= 1,13 ± 0,06 mmol L-1. A estimulação da atividade da enzima por K+ (V= 39,9 ± 1,9 U mg-1 e K0,5= 4,2 ± 0,2 mmol L-1), Mg2+ (V= 45,0 ± 2,2 U mg-1, K0,5= 0,82 ± 0,04 mmol L-1) e NH4+ (V= 31,7 ± 1,6 U mg-1, K0,5= 19,0 ± 0,9 mmol L-1) também ocorreu por meio de interações sítio-sítio. A afinidade aparente da enzima pelo PNFF e Mg2+ foi similar às relatadas para enzimas de outros crustáceos, incluindo caranguejos habitantes de meios mais salinos. Entretanto, a enzima de D. pagei apresentou menor afinidade aparente por íons K+ que as outras espécies já estudadas. A atividade K+-fosfatase da (Na,K)-ATPase branquial de D. pagei mantido em água doce foi estimulada sinergicamente por K+ e NH4+ sugerindo a presença de dois sítios de ligação para estes íons na molécula da enzima. Ouabaína (4 mmol L-1) inibiu a atividade PNFFase total da preparação (≈ 89%), por meio de uma curva monofásica (KI= 225,6, ± 11,3 µ mol L-1), sugerindo que, se presentes na fração microsomal, as duas isoenzimas da (Na,K)-ATPase apresentam sensibilidades próximas para o inibidor. Ortovanadato (1µmol L-1) inibiu 95% da atividade PNFFase total por meio de uma curva bifásica, reforçando a sugestão da presença de duas isoenzimas na preparação. A hidrólise do ATP pela (Na,K)-ATPase branquial de D. pagei mantido em água doce ocorreu em sítios de alta (V= 6,4 ± 0,32 U mg-1 e K0,5 = 0,34 ± 0,02 µmol L-1) e baixa afinidade (V= 127,1 ± 6,2 U mg-1e KM = 84 ± 4,1 µmol L-1). Não foi encontrada uma correlação direta entre a afinidade pelo ATP e o habitat de diferentes espécies de caranguejos. A atividade (Na,K)-ATPase específica de D. pagei mantido em água doce foi cerca de 3 vezes menor que relatada para Potamon edulis, única espécie de caranguejo dulcícola para a qual este parâmetro foi relatado. Atividades específicas muito maiores foram encontradas para caranguejos estuarinos, particularmente quando aclimatados a salinidades baixas. A baixa atividade específica determinada para D. pagei pode ser atribuída ao baixo gradiente osmoiônico que este animal mantém entre a hemolinfa e o meio externo, comparado a outros caranguejos dulcícolas, que o caracteriza como uma espécie particularmente bem adaptada ao ambiente dulcícola. A estimulação da atividade da enzima por íons Na+ (V = 133,8 ± 7,3 U mg-1e K0,5= 4,7 ± 0,3 mmol L-1), Mg2+ (V= 136,5 ± 8,0 U mg-1, K0,5= 0,62 ± 0,04 mmol L-1), K+ (V = 131,7± 7,9 U mg-1 e K0,5= 0,47 ± 0,03 mmol L-1) e NH4+ (V= 125,6 ± 6,3 U mg-1, K0,5= 1,90 ± 0,09 mmol L-1) ocorreu por meio de interações sítio-sítio. A afinidade aparente por Na+ da enzima de D. pagei é baixa, se comparada às relatadas para outros animais dulcícolas, e similar às encontradas para espécies estuarino/marinhas. Em contraste, a afinidade aparente por K+ é 2,5 a 5 vezes maior que as determinadas para espécies habitantes de meios mais salinos e aparentemente está mais relacionada ao habitat do animal que a afinidade por Na+. Esta possibilidade é coerente com o fato da (Na,K)-ATPase branquial dos crustáceos apresentar os sítios de ligação de K+ expostos para a hemolinfa, o que possibilita a modulação da atividade da enzima pela concentração de K+ na hemolinfa. Ao contrário do observado para várias outras espécies de caranguejos, a atividade (Na,K)-ATPase branquial de D. pagei não foi estimulada sinergisticamente por K+ e NH4+. Entretanto, a presença de um dos íons no meio reacional provoca o aumento da afinidade aparente da enzima pelo outro em cerca de 3 vezes. Fisiologicamente, esta característica cinética pode ser importante para garantir o transporte de ambos os íons pela enzima, mesmo em presença de concentrações relativamente elevadas do outro. Ouabaína (3 mmol L-1) inibiu a atividade ATPase total (≈ 78%) por meio de uma curva bifásica (KI= 6,21 ± 0,32 µmol L-1 e 101,2 ± 5,1 µmol L-1), reforçando os resultados anteriores no sentido de demonstrar a existência de duas isoenzimas da (Na,K)-ATPase nas brânquias posteriores de D. pagei. Observou-se também uma inibição bifásica por ortovanadato (10 µmol L-1), que inibiu a atividade ATPase total em 85%. O pH ótimo para a atividade V-ATPase branquial de D. pagei foi de 7,5. A modulação da atividade V-ATPase do animal mantido em água doce por ATP (V= 26,5 ± 1,3 U mg-1; K0,5= 3,9 ± 0,2 mmol L-1) e Mg2+ (V = 27,9 ± 1,4 U mg-1; K0,5 =0,80 ± 0,04 mmol L-1) ocorreu por meio de interações cooperativas. Já a inibição da atividade ATPase insensível ao ortovanadato por bafilomicina A1 ocorreu segundo uma curva monofásica (KI= 55,0 ± 2,8 nmol L-1). Cerca de 44 % da atividade ATPase total foi inibida, correspondendo à V-ATPase. A atividade V-ATPase branquial de D. pagei diminuiu acentuadamente em resposta à exposição à salinidade de 21‰. Após 1h de exposição, a atividade diminuiu cerca de 3 vezes, chegando a 4 vezes após 24h, o que indica a atuação de mecanismos eficientes de regulação a curto prazo. Curiosamente, a atividade V-ATPase foi cerca de 2 vezes maior para um tempo de aclimatação de 120h a 21‰, comparado a 24 h, embora 2 vezes menor que a estimada em água doce. Passadas 240 h, a atividade voltou aos baixos níveis observados entre 1h e 24h, o que indica a ação de mecanismos de regulação a longo prazo. Além da diminuição da atividade específica também foi observado aumento da afinidade da enzima por ATP (12 vezes) e Mg2+ (3 vezes) em resposta à exposição dos animais a 21‰. Similarmente, ocorreu um aumento de até 190 vezes na afinidade da enzima por bafilomicina A1. Propõe-se que, em resposta à alteração de salinidade, ocorrem mudanças conformacionais tanto em V1 (onde se encontram os sítios de ligação de ATP e Mg2+) quanto V0 (onde se localiza o sítio de ligação de bafilomicina), resultando numa maior exposição do sítio para o inibidor e no aumento da afinidade por Mg2+ e ATP. Como os aumentos de afinidade são observados já após 1h de exposição, este mecanismo parece ser independente da expressão protéica e, portanto, não estaria relacionado à expressão de isoformas diferentes de alguma das subunidades da enzima. A diminuição da atividade V-ATPase branquial de D. pagei em resposta à exposição a uma salinidade elevada é compatível com os mecanismos propostos para a atuação desta enzima no processo de captura ativa de Na+ em crustáceos dulcícolas. Após 10 dias de aclimatação ainda se tem atividade V-ATPase detectável nas frações microsomais das brânquias posteriores do animal, possivelmente envolvida nas funções de regulação ácido-base e excreção de amônia. Os resultados obtidos para a aclimatação de D. pagei por um período de 10 dias a salinidades entre 5 e 21‰ mostraram também uma diminuição acentuada da atividade V-ATPase em resposta ao aumento da salinidade. Entretanto, com exceção da salinidade mais baixa (5‰) não se observou aumento da afinidade da enzima por bafilomicina, sugerindo que esta alteração seja limitada a tempos de aclimatação mais curtos. Entretanto, também se verificou um aumento acentuado da afinidade da enzima por ATP e Mg2+. / Crustacean arose in the sea but, during evolution, several species invaded lower salinity biotopes, reaching fresh water. The ability of crustaceans to successfully colonize the freshwater biotope depends on efficient mechanisms of hyperosmoregulation. In dilute media, crustaceans\' hemolymph osmolality and ionic composition reflect a balance between diffusive and urinary ion losses, and active ion capture through the gills. The gill (Na,K)- ATPase plays a pivotal role in Na+ capture from dilute environments and its kinetic characteristics are under investigation in recent years, although freshwater crab enzymes are poorly known. According to the most recent model, the apparent affinity for Na+ is the most variable kinetic parameter among gill enzymes from different species, and reflects the salinity of the species\' habitat. Thus, enzymes from species which are well adapted to freshwater usually present higher affinities for Na+. However, several recent results are incompatible with this model. On the other hand, it has been proposed that a V-ATPase is also involved in Na+ capture through the gills of hololimnetic crustaceans. This enzyme is almost completely unknown: its kinetic characteristics have not been studied yet and the relationship between the magnitude of its activity in the gills and the external medium salinity has not been established. This work aimed to characterize the (Na,K)-ATPase and V-ATPase from the posterior gill from the holimnetic crab Dilocarcinus pagei, considered an old fresh water colonizer. The (Na,K)- ATPase was characterized in animals maintained in fresh water, in order to establish a comparison of its kinetic properties with those of enzymes from other crab species that inhabit more saline media. This comparison may enhance our understanding of the biochemical adaptations associated to fresh water invasion. V-ATPase was characterized in animals kept in fresh water or exposed for varying time intervals to a medium of 21? salinity, or else acclimated for 10 days to media of different salinities (5-21?), aiming to establish a relationship between the enzyme specific activity in the gill tissue and the external salinity, and also investigate the mechanisms involved in enzyme activity regulation. The analysis of D. pagei gill microsomes in a continuous-density sucrose gradient revealed two protein peaks (25-35% and 35-45% sucrose), both showing K+-phosphatase, (Na,K)-ATPase and V-ATPase activities. These results indicate the presence of membrane fractions of distinct densities, both presenting the main ion pumps involved in Na+ capture. These membranes may originate from different places in the asymmetric posterior gill epithelium from this crab. Western compared to those reported for other freshwater animals, but similar to those found for estuarine/marine species. In contrast, the apparent affinity for K+ is 2.5 to 5-fold higher than those estimated for species that inhabit more saline media, and is apparently more related to the animals\' habitat than Na+ affinity. This possibility is consistent with the location of the (Na,K)-ATPase in crabs gill tissue, with K+ binding sites exposed to the hemolymph, allowing the direct modulation of enzyme activity by hemolymph K+ concentration. In contrast to data reported for other crab species, D. pagei gill (Na,K)-ATPase activity was not synergistically stimulated by K+ and NH4 +. However, the presence of one of these ions in the reaction medium results in an increase of about 3-fold in the apparent affinity of the enzyme for the other. This kinetic characteristic may be physiologically relevant to assure the transport of both ions, even in the presence of elevated concentrations of the other. Ouabain (3 mmol L-1) inhibited total ATPase activity (? 78%) through a biphasic curve (KI= 6.21 ± 0.32 mol L-1 and 101.2 ± 5.1 mol L-1) reinforcing previous results suggesting the presence of two isoenzymes in the microsomal preparations. A biphasic inhibition by orthovanadate (10 mol L-1) to about 15% residual activity was also observed. Optimal pH for D. pagei gill V-ATPase activity was 7.5. The modulation of enzyme activity of the animal kept in fresh water by ATP (V= 26.5 ± 1.3 U mg-1; K0.5= 3.9 ± 0.2 mmol L-1) and Mg2+ (V = 27.9 ± 1.4 U mg-1; K0.5 =0.80 ± 0.04 mmol L-1) occurred with positive cooperativity. The inhibition of the orthovanadate insensitive ATPase activity by bafilomycin A1 followed a monophasic curve (KI= 55.0 ± 2.8 nmol L-1). About 44 % of total ATPase activity was inhibited, corresponding to the V-ATPase. Dilocarcinus pagei gill V-ATPase activity substantially decreased in response to animal\'s exposure to 21? salinity. After 1h exposure, the activity diminished about 3-fold, reaching 4- fold after 24h, indicating the action of efficient short-time regulation mechanisms. Interestingly, V-ATPase activity was about 2-fold higher after 120h exposure, compared to 24h, although 2- fold lower compared to that estimated in fresh water. After 240h, the activity returned to the low levels observed for 1 and 24 h, indicating efficient long-term regulation. Besides the decrease in specific activity, it was also observed an increase in enzyme\'s apparent affinity for ATP (12 fold) and Mg2+ (3 fold) in response to animal\'s exposure to 21? salinity. Simultaneously, the enzyme\'s affinity for bafilomycin A1 increased up to 190-fold. We propose that, in response to salinity alteration, conformational changes take place both in V1 (in which the ATP and Mg2+ binding sites are located) and V0 (which contains the bafilomycin A1 bindind site), resulting in higher exposition of the inhibitor binding site and also higher affinity for Mg2+ and ATP. As the affinity increases are observed after just 1h exposure, this regulatory mechanism seems to be independent of protein expression and, thus, should not be related to the expression of distinct isoforms of some enzyme subunit. The lowering of gill V-ATPase activity in D. pagei in response to exposure to an elevated salinity is consistent with the mechanisms proposed for the role of this enzyme in active Na+ capture in hololimnetic crustaceans. After 10 days at 21, the gill microsomal fractions still show a little V-ATPase activity, possibly related to acid-base regulation and ammonia excretion processes. The results obtained for the acclimation of D. pagei for 10 days at salinities in the range 5 to 21? also showed a substantial decrease of V-ATPase activity in response to the increase in medium salinity. However, except for 5?, it was not observed an increase of enzyme\'s affinity for bafilomycin, suggesting that this alteration is limited to shorter periods of exposure. However, a significant increase in the enzyme\'s affinity for ATP and Mg2+ was also observed.

A caracterização bioquímica da (Na+,K+)-ATPase, uma importante enzima envolvida no controle osmo-iônico nos crustáceos osmorreguladores, foi realizada a partir de centrifugação diferencial de frações microsomais do tecido branquial do siri eurialino C. danae, coletado na Baía de Ubatuba e mantido a 33o/oo de salinidade (animais recém-capturados). A ultracentrifugação da fração microsomal em um gradiente contínuo de sacarose (10-50%) revelou a presença de um único pico de atividade (Na+, K+)-ATPase, coincidente com o pico de atividade K+-fosfatase. Ambas as atividades foram inibidas completamente pela ouabaína. O Western blotting da fração microsomal apresentou uma única banda imunoespecífica contra a subunidade alfa da (Na+, K+)-ATPase, sugerindo a presença de uma única isoforma para a cadeia alfa da enzima. A hidrólise do ATP ocorreu em sítios de alta afinidade que apresentaram interações sítio-sítio (nH=3,6) com uma atividade específica V= 35,4 ± 2,1 U/mg e K0,5= 54,0 ± 4,0 nM, bem como em sítios de baixa afinidade, que obedeceram uma cinética Michaeliana, com V= 271,5 ± 17,2 U/mg e KM = 55,0 ± 3,0 uM. A estimulação da atividade da enzima pelos íons Na+ (V= 302,1 ± 14,1 U/mg e K0,5= 5,80 ± 0,3 mM), Mg2+ (V= 309,7 ± 15,7 U/mg e K0,5= 0,48 ± 0,02 mM) e K+ (V= 294,0 ± 11,8 U/mg e K0,5= 1,61 ± 0,06 mM) ocorreu através de interações sítio-sítio, enquanto a estimulação pelos íons NH4+ obedeceu a uma cinética Michaeliana com V= 377,8 ± 22,7 U/mg e KM= 4,61 ± 0,27 mM). Interessantemente, os íons NH4+ estimularam sinergisticamente a atividade específica da enzima em cerca de 90% (V= 557,0 ± 28,3 U/mg), sugerindo que esses íons se ligam em diferentes sítios na molécula. A (Na+,K+)-ATPase do tecido branquial de C. danae hidrolisou o PNFF com V= 125,4 ± 7,5 U/mg, K0,5= 1,2 ± 0,1 mM, através de interações cooperativas (nH= 1,5). Além disso, essa atividade K+-fosfatase foi inibida competitivamente pelo ATP (KI= 57,2 ± 2,6 µM), sugerindo que os dois substratos foram hidrolisados no mesmo sítio da enzima. A estimulação da atividade K+-fosfatase da (Na+,K+)-ATPase pelos íons K+ (V= 121,0 ± 6,1 U/mg; K0,5= 2,1 ± 0,1 mM), Mg2+ (V= 125,3 ± 6,3 U/mg; K0,5= 1,0 ± 0,1 mM) e NH4+ (V= 126,1 ± 4,8 U/mg; K0,5= 13,7 ± 0,5 mM) ocorreram através de interações sítio-sítio, similarmente ao observado para o ATP. A ouabaína e o ortovanadato inibiram completamente a atividade (Na+,K+)-ATPase (KI= 147,2 ± 7,2 uM; KI= 11,2 ± 0,6 nM, respectivamente). Entretanto, para a atividade K+-fosfatase os valores determinados foram significativamente superiores (KI= 830,3 ± 42,5 uM; KI= 34,0 ± 1,4 nM, respectivamente). A inibição da atividade da (Na+,K+)-ATPase por essas duas substâncias foi afetada pela presença de íons NH4+. Entretanto, o mesmo não ocorreu com a atividade K+-fosfatase da enzima. A representação de Arrhenius revelou a ocorrência de uma transição de fase próximo a 19°C, com deltaH1= 15.939 cal/mol e outra a 38°C com deltaH2= 7.719 cal/mol. Temperaturas acima de 43°C provocaram uma rápida inativação da (Na+,K+)-ATPase. Esta é a primeira demonstração da presença de um sítio de alta afinidade para o ATP na (Na+,K+)-ATPase de crustáceo. Os resultados obtidos sugerem que as atividades (Na+,K+)-ATPase e K+-fosfatase pertencem à mesma enzima e que a preparação não apresenta contaminações por outras ATPases e/ou fosfatases. Do ponto de vista fisiológico, os resultados deste trabalho são relevantes em relação à excreção ativa dos íons NH4+ pelos crustáceos. / The modulation by Mg+2, Na+, K+, NH4+ ions and ATP of the (Na+, K+)-ATPase activity in a microsomal fraction from Callinectes danae gills was analyzed. ATP was hydrolyzed at high-affinity binding sites at a maximal rate of V= 35.4 ± 2.1 U/mg and K0.5= 54.0 ± 3.6 nM, obeying cooperative kinetics (nH= 3.6). At low-affinity sites, the enzyme hydrolyzed ATP obeying Michaelis-Menten kinetics with KM= 55.0 ± 3.0 uM and V= 271.5 ± 17.2 U/mg. This is the first demonstration of a crustacean (Na+, K+)-ATPase possessing two ATP hydrolyzing sites. Stimulation by sodium (K0.5= 5.80 ± 0.30 mM), magnesium (K0.5= 0.48 ± 0.02 mM) and potassium ions (K0.5= 1.61 ± 0.06 mM) exhibited site-site interactions, while that by ammonium ions obeyed Michaelis-Menten kinetics (KM= 4.61 ± 0.27 mM). Ouabain (KI= 147.2 ± 7.2 uM) and orthovanadate (KI= 11.2 ± 0.6 nM) completely inhibited ATPase activity, indicating the absence of contaminating ATPase and/or neutral phosphatase activities. Ammonium and potassium ions synergistically stimulated the enzyme, increasing specific activities up to 90%, suggesting that these ions bind to different sites on the molecule and that the presence of each ion modulates enzyme stimulation by the other. The kinetic properties of a microsomal gill (Na+,K+)-ATPase were also analyzed using p-nitrophenylphosphate as substrate. The (Na+,K+)-ATPase hydrolyzed the substrate obeying cooperative kinetics (n= 1.5) at rates of V= 125.4 ± 7.5 U/mg and K0.5= 1.2 ± 0.1 mM and ATP competitively inhibited K+-phosphatase activity (KI= 57.2 ± 2.6 µM). Enzyme stimulation by potassium (V= 121.0 ± 6.1 U/mg; K0.5= 2.1 ± 0.1 mM) and magnesium ions (V= 125.3 ± 6.3 U/mg; K0.5= 1.0 ± 0.1 mM) was cooperative. Ammonium ions stimulated the enzyme through site-site interactions to a rate of V= 126.1 ± 4.8 U/mg with K0.5= 13.7 ± 0.5 mM. However, the K+-phosphatase activity was not synergistically stimulated using potassium plus ammonium ions. Sodium ions (KI= 36.7 ± 1.7 mM), ouabain (KI= 830.3 ± 42.5 uM) and orthovanadate (KI= 34.0 ± 1.4 nM) completely inhibited K+-phosphatase activity. The data show that the K+-phosphatase activity corresponds strictly to the (Na+,K+)-ATPase. This is the first invertebrate (Na+,K+)-ATPase shown to exhibit both high- and low-affinity sites for ATP hydrolysis and synergistic stimulation by potassium and ammonium ions (Masui et al., 2002). Further characterization of the K+-phosphatase activity will reveal its specific kinetic characteristics and may become a useful tool in comparative osmoregulatory studies.

Les fonctions physiologiques spécifiques de la voie de N-méthylation de la phosphatidyléthanolamine (PE), une des deux voies de biosynthèse de la phosphatidylcholine (PC), restent relativement énigmatiques. Il a été démontré chez les poissons euryhalins qu’un stress hyperosmotique induisait une activation de cette voie métabolique au niveau hépatique. L’objectif de notre travail était de vérifier si ce phénomène se produit aussi chez d’autres animaux euryhalins. Les études réalisées in vivo sur deux espèces de crâbes, Eriocheir sinensis et Carcinus maenas, nous ont permis de montrer que l’acclimatation en eau de mer de ces animaux active la synthèse de PC par N-méthylation de la PE dans l’hépatopancréas. Les marquages radioisotopiques montrent aussi que cette PC est échangée avec le plasma et que ce phénomène est amplifié chez les animaux en eau de mer. Ce pool de PC est utilisé comme précurseur de la bétaïne, un osmoeffecteur organique important chez ces animaux. Nous avons ensuite caractérisé la voie de N-méthylation de la PE chez un animal osmoconformeur, la moule Mytilus galloprovincialis. Les résultats, obtenus in vivo et in vitro sur les tissus isolés, démontrent qu’une activité de N-méthylation de la PE en PC est exprimée dans la glande digestive et les hémocytes circulant de M. galloprovincialis. La PC ainsi synthétisée dans ces tissus est échangée avec l’hémolymphe de l’animal. De l’ensemble de ces observations, nous pouvons conclure que la synthèse de PC par N-méthylation est largement exprimée chez les animaux marins euryhalins et qu’une des fonctions physiologiques de cette voie métabolique est de synthétisée des osmolytes organiques comme la bétaïne / The specific physiological functions of the N-methylation of phosphatidylethanolamine (PE), one of the two biosynthetic pathways of phosphatidylcholine (PC), remain relatively mysterious. It has been demonstrated in euryhaline fish that hyperosmotic stress induced activation of this pathway in the liver. The aim of our work was to verify whether this phenomenon also occurs in other euryhaline animals. In vivo studies on two species of crabs, Eriocheir sinensis and Carcinus maenas, showed that seawater acclimation activates PC synthesis by N-methylation of PE in the hepatopancreas. Radioisotopic labelling also showed that PC is exchanged with the plasma and that this phenomenon is amplified in animals in seawater. This pool of PC is used as a precursor of betaine, an important organic osmoeffector in these animals. We then characterized the process of PE N-methylation in an osmoconforming animal, the mussel Mytilus galloprovincialis. The results, obtained in vivo and in vitro on isolated tissues, show that N-methylation of PE to PC is expressed in the digestive gland and circulating haemocytes in M. galloprovincialis. The PC synthesized in these tissues is exchanged with hemolymph of the animal. From all these observations, we conclude that the synthesis of PC by N-methylation is widely expressed in marine euryhaline animals and that a physiological function of this pathway is to provide organic osmolytes such as betaine

Le cortisol est reconnu pour être une hormone clé dans le maintien de la balance hydrominérale en eau douce et dans l'adaptation à l'eau de mer, chez de nombreux téléostéens juvéniles. Cependant, son rôle au cours du développement embryonnaire est encore mal connu, notamment son implication dans le développement des cellules spécialisées dans le transport ionique, les ionocytes. L'objectif de ma thèse a été de déterminer l'implication du cortisol lors de la mise en place du lignage des ionocytes de la peau chez l'embryon de médaka (Orysias latipes) puis d'étudier les conséquences d'une élévation du cortisol embryonnaire sur les capacités osmorégulatrices des larves lors d’un transfert dans une eau pauvre en ions ou en eau de mer. Dans un premier temps, une attention particulière a été portée à la dynamique d'apparition des ionocytes de la peau du sac vitellin des embryons. Ces derniers apparaissent en deux vagues successives avec une cinétique propre. Nous avons alors proposé un modèle de développement des ionocytes pour chacune de ces vagues. Grâce à cette première étude, nous avons ensuite montré que du cortisol exogène ne modifie pas le taux de prolifération et/ou de différenciation des ionocytes épidermiques mais accélère leur différenciation. De plus, nous avons identifié un des récepteurs aux glucocorticoïdes (GR2) comme régulateur de l’ontogenèse des ionocytes, très probablement grâce à ces transcrits maternels. Enfin, nous avons montré que les larves de médaka sont capables de réguler très rapidement leurs contenus en ions Na+ et Cl- après de chocs hypo- et hyper-osmotiques. En revanche, la capacité des larves à réguler les contenus en Ca2+ est plus limitée lors d’un choc hypo-osmotique. Un doute important sur l’efficacité du traitement cortisol lors de cette dernière partie ne nous permet pas de mettre en lien le rôle du cortisol dans l’ontogenèse des ionocytes avec la fonction d’osmorégulation de ces derniers à l’éclosion. Ces travaux ont donc permis d’établir les bases de l’ontogenèse des ionocytes embryonnaires ainsi que de l’osmorégulation des larves chez le médaka pour la caractérisation du rôle du cortisol et de ses récepteurs. De façon similaire, ce modèle pourra être utilisé comme support pour l’identification et la caractérisation de nouveaux régulateurs. / Cortisol is a key hormone regulating in teleost fish water and ionic homeostasis in freshwater and seawater and in acclimation during salinity changes. However, its role during embryonic stages is still poorly known, especially its involvement in the development of ionic transport specialized cell, namely the ionocytes. The aim of my thesis was to determine cortisol involvement in epidermal ionocyte lineage establishment in medaka (Orysias latipes) embryos and to study consequences of cortisol elevation in medaka embryos on larval osmoregulatory abilities during transfer from freshwater to ion-poor environment or to seawater transfer. In a first part, we studied the dynamic of ionocyte appearance in yolk-sac epithelium of embryos. Ionocytes appear in two distinct waves with their own kinetic. This allowed us to propose a model of ionocyte development for each wave. In the continuity of this first part, we have showed that exogenous cortisol doesn’t modify the proliferation and/or differentiation rate of epidermal ionocytes but rather accelerate their differentiation. In addition, we have identified GR2, one of glucocorticoid receptors, as the main regulator of ionocyte ontogenesis, most likely through its maternal transcripts. Finally, we have showed that medaka larvae are able to quickly regulate their Na+ and Cl- ion contents after hypo- or hyper-osmotic challenges. In contrast, larvae ability to regulate Ca2+ ion contents is more limited during hypo-osmotic challenge. A doubt on the effectiveness of the cortisol treatment, in this last part, prevent us to understand the relationship between cortisol role in ionocyte ontogenesis and its osmoregulatory functions after hatching. These studies have established in medaka the basis of embryonic ionocyte ontogenesis and larval osmoregulation in order to clarify the role of cortisol and its receptors. Similarly, this fish model could be used as a support for identification and characterization of new regulators of the osmoregulation function.