Human bone tissue has an inherent hierarchical structure, which is integral to its material properties. It is primarily composed of a collagen fiber matrix that is mineralized with hydroxyapatite. A comprehensive understanding of bone and the linkages between structural and cellular organization is imperative to developing fundamental knowledge that can be applied to better our understanding of bone disease manifestations and its interaction with implant devices. Herein, this thesis investigated non-traditional methods for evaluating bone structure across the nano- and meso-length scales. Firstly, due to the inhomogeneous organization of collagen fibrils and mineral platelets of bone ultrastructure, a suitable methodology for the investigation of both phases needed to be generated. In this work, focused ion beam (FIB) microscopy was employed to create site-specific scanning transmission electron microscopy (STEM) lift-outs of human osteonal bone that could be visualized with correlatively with STEM and small angle X-ray scattering (SAXS). Samples were successfully characterized using both techniques, and minimal visual damage was induced during data acquisition. This work is the first to demonstrate the potential for bone to be investigated correlatively using both STEM and SAXS. Secondly, this work is the first to employ a dual-beam plasma FIB (PFIB) equipped with a scanning electron microscope (SEM), to investigate bone tissue across the mesoscale. This equipment enables large volume three-dimensional (3D) imaging at nanoscale resolution across larger mesoscale volumes. This thesis aimed to reduce ion beam-based artifacts, which presents as curtain-like features by adjusting the composition of protective capping layers. Subsequently, large volume tomograms of bone tissue were acquired, demonstrating the effectiveness of the PFIB to reveal mesoscale features including the cellular network of bone tissue. Overall, this thesis has developed methods that allow for the application of advanced microscopy techniques to enhance the understanding of bone tissue across the nanoscale and mesoscale. / Thesis / Master of Applied Science (MASc) / Bone tissue has a unique structure that perplexes both biologists and materials scientists. The hierarchical structure of bone has garnered the interest of materials scientists since the body’s skeletal strength and toughness are governed by the nanoscale (millionth of centimetres) to macroscale (centimeters) organization of bone. In this work, the intricate organization of bone is investigated using advanced electron and ion beam microscopy techniques, which achieve high-resolution imaging of bone structure. Firstly, this work developed a sample preparation workflow to correlate electron and X-ray imaging of the same bone tissue. Secondly, this work was the first to apply serial-sectioning plasma focused ion beam tomography to human bone tissue to investigate its structure at high resolution across micron-sized volumes. Here, previously unexplored methodologies to image bone are demonstrated with the hopes of applying such techniques to investigate healthy and pathological bone tissue in the future.

Gesunder humaner Knochen unterliegt einem permanenten Umbau, um sich den mechanischen Anforderungen anzupassen, Mikrofrakturen zu reparieren und das Mineraliengleichgewicht zu erhalten. Dieser Umbauprozess wird durch Osteoblasten- und Osteoklastenaktivität realisiert, den knochenbildenden bzw. knochenresorbierenden Zellen. Gesteuert wird dieser Prozess durch Osteozyten, dessen Netzwerk mechanosensorische Fähigkeiten zugesprochen werden. Bisphosphonate (BP), hemmen die Osteoklastenaktivität und erhöhen somit die Knochenumsatzzeit. Im ersten Teil dieser Arbeit wurden morphologische Eigenschaften der Osteozyten-Lakunen (OL) in humanem Knochen mittels Synchrotron-µCT untersucht. Dabei wurden sowohl gesunde als auch mit BP behandelte Spender verglichen. Anschließend haben wir Synchrotron-Nano-CT in Kombination mit Phasenkontrast angewandt, um unsere Untersuchungen auf die Morphologie des lakuno-kanalikulären Netzwerkes (LKN) und die Gewebeeigenschaften in der Umgebung des LKN auszuweiten. Wir nahmen an, dass der sekundäre Mineralisierungsprozess mittels eines Diffusionsprozesses durch die Grenzfläche der extrazellulären Flüssigkeit im LKN stattfindet, was zu Gradienten der Massendichte in der Umgebung des LKN führen sollte. Unsere Untersuchungen haben gezeigt, dass sowohl in der Umgebung der OL als auch der Kanäle Massendichtegradienten existieren. Daraus schließen wir, dass der Mineralienaustausch zwischen der extrazellulären Flüssigkeit und der mineralisierten Matrix an der gesamten Oberfläche des LKN stattfindet. Wir schätzten, dass die Kapazität, unter Berücksichtigung des gesamten LKN, Mineralien auszutauschen etwa eine Größenordnung höher ist, gegenüber der Annahme, dass der Austausch lediglich an den Grenzflächen der OL stattfindet. Zukünftige Studien sollten nicht nur die peri-LKN Gewebeeigenschaften während der sekundären Mineralisierung untersuchen, sondern auch Schwankungen der Mineralienkonzentration bei hohen Kalziumanforderungen des Körpers berücksichtigen. / Under healthy conditions human bone undergoes permanent remodeling to adjust to mechanical demands, to repair micro-cracks and to maintain mineral homeostasis. This process of remodeling is performed by osteoblasts and osteoclasts: bone-forming and bone-resorbing cells. The activity of osteoclasts and osteoblasts is triggered by osteocytes, the most frequently occurring type of bone cell, via mechanosensation processes. Bisphosphonates (BP) prescribed during treatment for osteoporosis or bone metastasis inhibit osteoclast activity and thus decrease the bone turnover. In this work, the distribution and morphology of osteocyte lacunae of human cortical jaw bone was investigated in 3D, and a comparison between healthy and BP-treated donors was performed using synchrotron radiation (SR) µCT. In a second approach, we used SR nano-CT with phase contrast to investigate the morphology of the canalicular network and the bone tissue properties in the vicinity of the lacuna-canalicular network of human jaw bone, originating from both healthy subjects and patients treated with BPs. We hypothesized that secondary mineralization takes place via a diffusion process through the fluid-matrix interface at both the lacunar and the canalicular surfaces. This should result in mass density gradients with respect to the distance to the pore boundary. Such mass density gradients were indeed observed at both lacunar and canalicular interfaces. We concluded that mineral exchange between extracellular fluid and mineralized matrix occurs at all bone surfaces, including the canaliculi. Our data suggested that the capacity of the pore network to exchange mineral with the bone matrix would increase by one order of magnitude if the canalicular surface is taken into account. However, more studies should be performed, targeting not only the changes of tissue properties during secondary mineralization, but also during fluctuations of mineral concentration in periods of high mineral demand.

Das menschliche Skelett besteht aus einem dynamischen Material welches in der Lage ist zu heilen, sowie sich durch strukturellen Umbau an mechanische Beanspruchung anzupassen. In dieser Arbeit ist die mechanische Regulierung dieser Prozesse untersucht worden. Hierfür ist ein Computermodell, sowie die dreidimensionale Abbildung des Knochens und die Auswertung dieser Bilder benutzt worden. An dem Heilungsprozesses von Knochen sind verschiedene Gewebetypen beteiligt. Dabei hängt die räumliche und zeitliche Anordnung dieser Gewebe von der mechanischen Belastung ab. Ein Computermodell, welches den vollständigen Verlauf der Heilung beschreibt, wurde mit der dokumentierten Gewebeentwicklung eines Tierexperimentes verglichen. Verschiedene Hypothesen, wie die mechanische Stimulation die Bildung verschiedene Gewebe beeinflusst, wurden getestet. Zwar ließen sich durch den Vergleich mit dem Experiment keine der Hypothesen verwerfen, jedoch konnten wir Vorschläge machen, worauf bei zukünftigen Experimenten verstärkt geachtet werden soll. Es wird angenommen dass der Umbauprozesses des Knochens vom dichten Netzwerk der Osteozyten mechanisch reguliert wird. Diese Zellen sind in den Knochen eingebettet und über ein dichtes Netzwerk aus engen Kanälen, den sogenannten Canaliculi, miteinander verbunden. Dieses Netzwerk mittels konfokaler Mikrokopie dreidimensional abgebildet. Spezielle Routinen zur Auswertung der Netzwerkorientierung sowie dessen Dichte wurden entwickelt. Die Hauptorientierung des Netzwerkes entspricht der Richtung in der Knochengewebe aufgebaut wird. Die Orientierung des zu dieser Richtung senkrechten Anteils des Netzwerkes rotiert abhängig von der Position entlang der Aufbaurichtung. Dies verdeutlicht den Zusammenhang zwischen der Netzwerkorientierung und der Vorzugsrichtung des Kollagens, dem faserigen Bestandteils des Knochens. Darüber hinaus zeigt die Auswertung der Daten weitere strukturelle Unterschiede im Netzwerk. / Our skeleton is composed of a dynamic material that is capable of healing and of adapting to changing mechanical loads through structural remodeling. In this thesis the mechano-regulation of these dynamic processes are addressed using computer modeling and 3-dimensional imaging and image analysis. During bone healing an intricate pattern of different newly formed tissues around the fracture site evolves in time and is influenced by the mechanical loading. Using a computer model which is describing this temporal-spatial evolution of tissue types for the full time-course of healing, this evolution is compared to the documented evolution of an animal experiment. Different hypotheses were tested how the mechanical stimulation results in the formation of different tissues. While the comparison with the outcome of the animal experiments does not allow to falsify any of the hypotheses, it suggests a different design of future animal experiments. Bone remodeling is thought to be mechano-regulated by the dense network of osteocytes. These osteocytes are embedded in bone and are connected to each other via a network of narrow canaliculi. The 3-dimensional structure of the network was imaged using rhodamine staining and laser scanning confocal microscopy. Image analysis tools were developed to determine the network topology and to analyze its density and orientation. The analysis focused on osteons, the building blocks of cortical bone. Within an osteon we found a large variability of the network density with extensive regions without network. Most of the network is oriented radially towards the center of the osteon, i.e.\ parallel to the direction in which the bone material is deposited. The network perpendicular to this direction twists when moving along the direction of bone deposition. A correlation with the main orientation the fibrous constituent of bone, collagen, was detected. Furthermore indicates our data additional structural changes in the network alignment.