A partir de células de osteossarcoma humano (MG-63) que tem características de osteoblastos imaturos produzimos anticorpos monoclonais (Mabs) nomeados PSP 4-5, PSP 42-22 e PSP 85-9. Esses anticorpos reconhecem antígenos de 100, 26 e 20 kDa respectivamente. Avaliamos a especificidade dos mesmos, testando suas expressões em cortes congelados de tecidos oriundos da mesma célula mesenquimal, ou seja, osso, cartilagem, músculo cardíaco e tecido adiposo. Os anticorpos marcaram o periósteo, com distintos padrões de expressão, porém o PSP 42-22 foi o mais específico marcando a camada osteogênica do periósteo. Os anticorpos marcaram também células ósseas. Diante desses resultados nosso objetivo, no presente estudo, foi identificar os antígenos reconhecidos por esses anticorpos usando clonagem e sequenciamento dos genes em biblioteca de cDNA com capacidade de expressão proteica. Outro objetivo foi testar os anticorpos, pela técnica de imunohistoquímica (IHQ), em tumores ósseos primários visando estabelecer os padrões de marcação e se diferenciavam os diferentes tipos de tumores. Os antígenos reconhecidos pelos anticorpos PSP 42-22 e PSP 85-9 foram isolados, purificados e sequenciados. Devido ao elevado peso molecular do PSP 4-5 necessitaremos de outras técnicas para isolar o clone que codifica seu antígeno. O sequenciamento do clone isolado pelo PSP 42-22, mostrou uma sequência com 99% de homologia descrita no \"Homo sapiens\" como sendo \"serologically defined colon cancer antigen 3 (SDCCAG3), transcript variant 3\". A proteína SDCCAG3 foi descrita pela primeira vez em 1998 como um antígeno de câncer de cólon reconhecido por anticorpo autólogo. Vale lembrar que antígeno reconhecido pelo nosso anticorpo tem um peso molecular de aproximadamente 26 kDa, inferior ao da proteína SDCCAG3. Essa diferença poderia ocorrer devido a uma diferença no local da tradução do mRNA das células MG-63, produzindo uma proteína menor (isoforma), ou no clone isolado (3B2-3-1), poderia ocorrer uma mutação produzindo uma proteína mais curta que se expressaria na membrana celular ao contrário de uma proteína mais longa. Já o alinhamento das sequências obtidas dos clones isolados utilizando o PSP 85-9, mostrou uma sequência com 100% de concordância descrita com a porção não codante da proteína \"Homo sapiens microtubule associated protein, RP/EB family, member 1 (MAPRE1)\" portanto um falso positivo; já o clone 1A5-1-3, mostrou uma sequência de 99% de homologia com a proteína \"Homo sapiens Yip1 interacting factor homolog B (S. cerevisiae) (YIF1B), transcript variant 8\". Trata-se de uma proteína de membrana, com 6 isoformas diferentes que pode interagir com o receptor de serotonina. O resultado da IHQ nos tumores ósseos testados mostrou que o PSP 4-5 se expressou predominantemente no citoplasma de osteossarcoma, condrossarcoma e leiomiossarcoma e no núcleo de osteoblastoma. O anticorpo PSP 42-22 não reconheceu nenhum antígeno nos tumores avaliados. Quanto ao anticorpo PSP 85-9 nos condrossarcomas e leiomiossarcomas a expressão foi predominante citoplasmática e nos osteossarcomas e osteoblastoma foi nuclear. Em conclusão, identificamos os antígenos de dois dos anticorpos estudados que apresentam potencial diagnóstico diferencial em tumores ósseos primários / From human osteosarcoma cells (MG-63), which have characteristics of immature osteoblasts, we produced monoclonal antibodies (Mabs) named PSP 4-5, PSP 42-22 and PSP 85-9. These antibodies recognize antigens with 100, 26 and 20 kDa, respectively. We evaluated their specificity by testing their expression in frozen tissue sections from the same mesenchymal cells, that is, bone, cartilage, cardiac muscle and adipose tissue. The antibodies stained the periosteum, with distinct patterns of expression, but PSP 42-22 was the most specific, scoring the osteogenic layer of the periosteum. The antibodies also marked bone cells. With these results, our goal in this study was to identify the antigens recognized by these antibodies using cloning and sequencing of the genes in the cDNA library with capacity of protein expression. Another objective was to test the antibodies by immunohistochemistry (IHC) in primary bone tumors to establish standards for marking and whether they set apart different types of tumors. The antigens recognized by the PSP 42-22 and PSP 85-9 antibodies were isolated, purified and sequenced. Due to the high molecular weight of PSP 4-5 we will need other techniques to recognize its antigen. Sequencing of the clone isolated using the PSP 42-22 showed a sequence with 99% homology described in \"Homo sapiens\" as being \"serologically defined colon cancer antigen 3 (SDCCAG3), transcript variant 3\". The SDCCAG3 protein was first described in 1998 as a colon cancer antigen recognized by autologous antibody. It is worth remembering that the antigen recognized by our antibody has a molecular weight of approximately 26 kDa, lower than the SDCCAG3 protein. This difference could be due to a difference in mRNA translation site of MG-63 cells producing a lower protein; or on the isolated clone (3B2-3-1) a mutation could occur producing a shorter protein that expresses in the cell membrane instead of a longer protein. The alignment of the sequences obtained from isolated clones using the PSP 85-9 showed a sequence with 100% of homology described with the non-coding protein portion \"Homo sapiens microtubule associated protein, RP/EB family, member 1 (MAPRE1), mRNA\" therefore, a false positive; 1A5-1-3 clone showed a 99% homology sequence with the protein \"Homo sapiens Yip1 interacting factor homolog B (S. cerevisiae) (YIF1B), transcript variant 8, mRNA\". It is a membrane protein with 6 different isoforms which can interact with the serotonin receptor. The result of IHC in bone tumors tested showed that PSP 4-5 expressed predominantly in the cytoplasm of osteosarcoma, chondrosarcoma, leiomyosarcoma and osteoblastoma in was in nucleus. The PSP 42-22 antibody did not recognize any antigen in the tumors examined. As for the PSP 85-9 antibody in chondrosarcoma and leiomyosarcoma, the expression was predominantly cytoplasmic and the osteoblastoma was nuclear in osteosarcomas. In conclusion, we have identified the antigens of two of the antibodies studied which have potential differential diagnosis in primary bone tumors

Objetivo: Avaliar o desempenho diagnóstico da ressonância magnética (RM) na avaliação da presença de reação periosteal (RP) em sarcomas primários de ossos longos, utilizando a radiologia convencional (RC) como padrão de referência. Materiais e Métodos: Estudo retrospectivo com aprovação do Comitê de Ética Institucional. A partir do Sistema de Informática da Radiologia (RIS) e do Sistema de Arquivo de Imagens do HCRP identificamos retrospectivamente os casos de 42 pacientes consecutivos (idade média de 22 anos, sendo 20 homens, 22 mulheres) que realizaram tratamento de osteossarcoma ou sarcoma de Ewing no HCRP e cujos exames de RM e RC estavam disponíveis para reavaliação. Foram incluídos apenas casos de tumores de ossos longos e com confirmação histopatológica. Três radiologistas musculoesqueléticos avaliaram retrospectivamente a presença ou ausência de RP e identificaram para cada caso a ausência ou presença de cada um dos padrões de RP agressiva nas imagens da RC e da RM: Triângulo de Codman, multilamelada e espiculada. A classificação dos Radiologistas foi realizada de forma independente e às cegas em relação ao diagnóstico definitivo e em relação as demais avaliações realizadas. As leituras das imagens de RM e RC realizadas pelo mesmo observador tiveram um intervalo de pelo menos três meses entre elas. Usamos as leituras dos três observadores para avaliar a confiabilidade interobservador por meio do coeficiente Kappa. Finalmente uma análise consensual das leituras realizadas pelos três observadores tanto para a RC quanto para a RM foi utilizada para calcular o desempenho diagnóstico da ressonância magnética na detecção de RP e na classificação de cada padrão agressivo de RP. O radiologista com maior tempo de experiencia fez a classificação consensual da presença ou ausência de cada subtipo de reação periosteal nos casos em que houve discordância entre os observadores. 8 Resultados: A concordância interobservador para a detecção de RP foi quase perfeita para a RC e substancial a quase perfeita para a RM. A concordância interobservador para a classificação dos diferentes padrões de RP foi moderada a substancial para a presença do triângulo de Codman. A avaliação dos padrões de RP multilamelada e espiculada foi menos consensual entre os radiologistas tanto para RC quanto para a RM. O diagnóstico por RM e RC e a classificação de cada RP agressiva foram estatisticamente associadas com o diagnóstico por RC (p <0,05). A RM mostrou alta especificidade e valor preditivo negativo elevado, mas moderada sensibilidade na detecção de reações periosteais quando comparada com a RC. Conclusão: Nossos resultados sugerem que a detecção de RP por meio da RM e da RC apresenta alta reprodutibilidade. A RM mostrou alta especificidade e sensibilidade moderada para a identificação de RP em comparação com a RC. No entanto, a reprodutibilidade da classificação em diferentes padrões de RP agressivas foi relativamente baixo, tanto para RC quanto para RM em relação às RPs multilameladas e espiculadas. / Objective - To evaluate the diagnostic performance of magnetic resonance imaging (MR) assessing the presence of periosteal reaction (PR) in primary long bone sarcomas using conventional radiography (CR) as the reference standard. Materials and methods After institutional board approval, we retrospectively reviewed the MRI and conventional radiographies of 42 consecutive patients (mean age 22 years, 20 men, 22 women). We included only cases of osteosarcoma or Ewings sarcoma in the long bones with histopathological confirmation. Three experienced musculoskeletal radiologists retrospectively evaluated the presence or absence of periosteal reaction and each pattern of aggressive periosteal reaction in radiographs and MR imaging: Codman triangle, multi layered and spiculated. Radiologists classification was blinded and independent. The readings of the MR images and CR performed by the same observer had an interval of at least three months between them. We use the readings of three observers to assess the interobserver reliability through the Kappa coefficient. Finally a consensus analysis of readings performed by the three observers for both CR and MR was used to calculate the diagnostic performance of MR in detecting PR and classification of each PR aggressive pattern. The radiologist with greater experience made the consensus score of the presence or absence of each periosteal reaction subtype where there was disagreement among observers. 10 Results The interobserver agreement for the detection of PR was almost perfect for the CR and substantial to almost perfect for the MR. The interobserver agreement for the classification of different patterns of PR was moderate to substantial for the presence of Codman triangle. The evaluation of PR multilammelated standards and spiculated was less consensus among radiologists as well for CR as to MR. The diagnostic and the classification of each aggressive PR with MR imaging and with CR were statistically associated with the diagnosis by CR (p <0.05). MR showed high specificity and high negative predictive value, but moderate sensitivity in detecting periosteal reactions when compared to the CR. Conclusions Our results suggest that detection of PR through MR and CR has high reproducibility. MRI showed high specificity and moderate sensitivity for the identification of PR compared to CR. However, the reproducibility of the classification into different patterns of aggressive PRs was relatively low for both CR and for MR regarding the multilamellated and spiculated PRs.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:09Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-07-29 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / INTRODUÇÃO: O papel da angiogênese como indicador prognóstico em câncer é estudado frequentemente e resultados demonstram correlação entre angiogênese e prognostico em neoplasias malignas. Em osteossarcoma poucos estudos foram realizados e permanecem controversos. OBJETIVO: avaliar a densidade de microvasos (MVD) e a expressão do VEGF (vascular endothelial growth factor) como marcadores de angiogenese e a sua correlação com fatores prognósticos. MATERIAL E METODO: blocos de parafina de 50 pacientes pré-quimioterapia ( 22 deles metastáticos ao diagnostico) com osteossarcoma central de alto grau tratados na nossa instituição foram estudados pela técnica de imuno-histoquimica para VEGF e densidade de microvasos determinada por CD 34 e CD 31. A expressão de ambos foi correlacionada com aspectos clinicopatologicos e fatores relacionados ao prognostico (metástases e óbito). As neoplasias foram consideradas positivas para VEGF quando mais que 64,7% (media) das células demonstravam positividade. MVD foi obtida em cada caso pela média de contagem de microvasos em 10 campos de grande aumento (400x) em cada biopsia. Foi considerada alta e baixa usando a media como ponto de corte. RESULTADOS: apesar da alta vascularização não houve significância estatística entre MVD e fatores prognósticos para CD 31 e CD 34. Em relação ao VEGF houve correlação entre VEGF melhor sobrevida global e livre de doença para o total de pacientes. Quando separamos os pacientes metastaticos ao diagnostico os que foram VEGF negativos tiveram melhor sobrevida global e livre de doença. CONCLUSÃO: osteossarcomas são neoplasias bem vascularizadas e a imunoexpressão de VEGF dá informações prognosticas importantes principalmente em pacientes metastaticos ao diagnostico. / INTRODUCTION: The role of angiogenesis as a prognostic indicator in cancer has been extensively studied in recent times with several studies demonstrating a positive correlation for various malignant tumours. However, the role of angiogenesis in osteosarcoma remains a topic of debate. AIM: evaluate the significance of intratumoral microvessel density (MVD) and the degree of vascular endothelial growth factor (VEGF) expression as markers of angiogenesis and correlate with disease outcome. MATERIAL AND METHODS: Pretherapeutic paraffin- embedded biopsies from 50 patients diagnosed high grade central osteosarcoma at our institution with clinicopathological data were studied by immunohistochemical tecnique for VEGF and microvessel density (MVD) determined by CD 34and CD 31expression. VEGF expression and MVD were correlated with clinicopathological factors and patient outcome in terms of metastasis and death. The degree of angiogenesis was assessed, as determined by the microvessel density (MVD). Tumors were considered VEGF positive if immunoexpression was positive in greater than 64,7% ( mean) of the tumor cells. MVD was obtained by microvessels counting 10 high power fields (X400 field) in each biopsy sample. The mean MVD of the entire group was predetermined to classify patients into two groups with high and low MVD.RESULTS: Despite the moderate to high vascularity, there was no significant difference between the MVD and disease outcome factors for both CD 31and CD 34. In terms of VEGF expression, patients with metastases at diagnosis VEGF negative had better overall survival and disease-free survival .CONCLUSION: We were able to demonstrate that osteosarcoma is a relatively vascular tumor and VEGF expression provides prognostic information in osteosarcoma; however, the degree of MVD does not provide prognostic information. Angiogenesis has a potential target for anti-angiogenic therapies. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Submitted by Camila Girondi (camila.girondi@gmail.com) on 2018-07-03T20:30:17Z No. of bitstreams: 1 Dissertação 28.06 COM FICHA CATALOGRÀFICA.pdf: 1652288 bytes, checksum: 2ff0f9722f6563cc30aaacbdd2bd4b81 (MD5) / Approved for entry into archive by Silvana Alvarez null (silvana@ict.unesp.br) on 2018-07-10T19:06:46Z (GMT) No. of bitstreams: 1 girondi_cm_me_sjc.pdf: 1652288 bytes, checksum: 2ff0f9722f6563cc30aaacbdd2bd4b81 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-07-10T19:06:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 girondi_cm_me_sjc.pdf: 1652288 bytes, checksum: 2ff0f9722f6563cc30aaacbdd2bd4b81 (MD5) Previous issue date: 2018-05-02 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / As nanofibras (NF) podem ser sintetizadas por meio de eletrofiação, um método simples que permite incorporação de fármacos em biopolímeros que apresentam a vantagem de serem liberados de forma gradual. Policaprolactona (PCL) apresenta a vantagem de poder ser eletrofiada permitindo a incorporação de fármacos. Os ácidos retinoicos são fármacos empregados no tratamento de osteossarcoma, mas, apresentam efeitos colaterais. O ATRA (all-trans-retinoic-acid) é o mais comum entre os retinoides. Os objetivos deste estudo foram: sintetizar e caracterizar NF, incorporar o fármaco a elas e verificar a liberação ao meio de cultura; realizar testes de citoxicidade e genotoxicidade tais como: crescimento, integridade, viabilidade e micronúcleo de células MG63 tratadas com NF incorporada com ATRA e analisar a secreção das citocinas pró inflamatórias: IL-1β, IL-6 e TNF-α por meio do teste ELISA. As NF sintetizadas por meio da eletrofiação foram caracterizadas morfologicamente e bioquimicamente por meio de microscopia eletrônica de varredura (MEV) e estudo do espectro de infravermelho da transformada de Fourrier (FTIR): Os testes in vitro foram realizados utilizando uma linhagem de células imortalizadas de osteossarcoma, MG63. Os ensaios incluídos nesse estudo foram divididos em grupos compostos por: [C (controle puro), ATRA (controle positivo), NF (controle negativo) e NF + ATRA (grupo experimental).] Em todos os grupos foram realizados testes de viabilidade celular (MTT), micronúcleo e ELISA sob os tempos de 3, 7 e 14 dias. A liberação do fármaco através do sistema de NF+ATRA foi comprovada pelo FTIR. Os demais resultados encontrados foram avaliados através do teste ANOVA one-way, no qual o método apresentou-se eficiente, mostrando diferença estatística de p=0,00, sendo signficante para todos os períodos de tempo nos testes de MTT e MN, além de ser verificada a secreção de citocinas proinflamatórias IL-1β e IL-6, comprovando os efeitos citotóxicos e genotoxicos sob células MG63 mostrando a efetividade da técnica. Podendo ser uma alternativa para o tratamento. / Nanofibers (NF) can be synthesized by electro-spinning, a simple method that allows incorporation of drugs into biopolymers that have the advantage of being released gradually. Polycaprolactone (PCL) has the advantage that it can be electrophied allowing the incorporation of drugs. Retinoic acids are drugs used in the treatment of osteosarcoma, but have side effects. ATRA (all-trans-retinoicacid) is the most common retinoid. The objectives of this study were: to synthesize and characterize NF, to incorporate the drug to them and to verify the release to the culture medium; perform cytotoxicity and genotoxicity tests such as: growth, integrity, viability and micronucleus of N63-treated NF-treated cells with ATRA and to analyze the secretion of pro-inflammatory cytokines: IL-1β, IL-6 and TNFα by the ELISA . The NF synthesized by electrophilation were characterized morphologically and biochemically by scanning electron microscopy (SEM) and Fourrier Transform Infrared Spectrum (FTIR) study: In vitro tests were performed using an immortalized osteosarcoma cell line, MG63. The trials included in this study were divided into groups composed of: C (pure control), ATRA (positive control), NF (negative control) and NF + ATRA (experimental group). All groups were tested for cell viability (MTT), micronucleus and ELISA under the times of 3, 7 and 14 days. Release of the drug through the NF + ATRA system was confirmed by FTIR. The other results were evaluated using the oneway ANOVA test, in which the method was efficient, showing a statistical difference of p = 0.00, being significant for all time periods in the MTT and MN tests, besides the secretion of proinflammatory cytokines IL-1β and IL-6, proving the cytotoxic and genotoxic effects under MG63 cells, showing the effectiveness of the technique. It may be an alternative to treatment

O presente estudo visa comparar biomecanicamente, por meio do ensaio de flexão em quatro pontos, a resistência de segmentos de rádios de cães autoclavados e desvitalizados em nitrogênio líquido. Foram utilizados 20 cadáveres de cães de mais de dois anos de idade e massa corporal superior a 20 kg, portanto 40 rádios, que foram divididos em quatro grupos: grupo autoclave (GA), grupo controle autoclave (GCA), grupo nitrogênio (GN) e grupo controle nitrogênio (GCN). Os corpos de prova dos grupos GCA e GCN pertenciam ao lado contralateral dos grupos GA e GN, respectivamente. Os ossos foram autoclavados a 121&ordm;C, por 20 min a 2 atm. A desvitalização em nitrogênio foi realizada por meio da imersão em nitrogênio líquido, por 20 min, seguida de descongelamento à temperatura ambiente, sendo finalizada por imersão em solução de NaCL a 0,9%, por mais 15 min. A avaliação da resistência biomecânica foi realizada pelo ensaio de flexão em quatro pontos. Foi utilizado o programa de computador PMI para calcular o momento de inércia após o ensaio biomecânico destrutivo. Foram comparadas as variáveis força máxima, rigidez, altura máxima à secção transversa do corpo de prova, deslocamento do baricentro em relação ao eixo x, flecha, tensão-tração, tensão compressão e tensão máxima. Não foram encontradas diferenças estatisticamente significantes entre os grupos GN e GCN. Foram encontradas diferenças estatisticamente significantes entre os grupos GA e GCA somente na comparação da variável força máxima. A análise das variáveis tensão-tração, tensão-compressão e tensão máxima evidenciou diferenças estatisticamente significantes entre os grupos GA e GN, sendo os valores maiores para o grupo GA. Também foi realizada comparação entre os deltas (GN menos GCN e GA menos GCA) em que não foram observadas diferenças estatísticas. / The present study aim to, biomechanically compare through the four points bending test, the strenght of autoclaved and devitalized in liquid nitrogen radius segments. 20 corpses of dogs (>2 years of age and >20 kg of weight) were used. 40 radius were collected and divided into 4 groups, Autoclave Group (GA), Control Autoclave Group (GCA), Nitrogen Group (NG) and Control Nitrogen Group (GCN). Bone segments from groups GCA and GCN were contralateral to GA and NG. The segments were autoclaved at 121&ordm;C and 2 atm for 20 minutes. Nitrogen devitalization of the bone segments was obtained by 20 minutes immersion, followed by thawing at room temperature and 15 minutes immersion in 0,9% NaCL solution. The biomechanical strenght evaluation was performed in the four points bending test; afterwards, PMI computer program calculated the moment of inertia after the destructive biomechanical assay. Variables compared were maximum strength, stiffness, maximum high trough the transverse section of the bone segment, centers of mass dislocation in relation to x axe, arrow, stress-tension, stress-compression and maximum stress. No statistically significant differences between the GN and GCN groups were found. Statistically significant differences were found between groups GA and GCA only in the comparison of the maximum force variable. The analysis of variable stress-tension, stress-compression and maximum stress showed statistically significant differences between the GA and GN groups, with higher values for the GA group. Comparison of the deltas (GN least GCN and GA least GCA) that no statistical differences were observed was also performed.

Objetivo: Avaliar o desempenho diagnóstico da ressonância magnética (RM) na avaliação da presença de reação periosteal (RP) em sarcomas primários de ossos longos, utilizando a radiologia convencional (RC) como padrão de referência. Materiais e Métodos: Estudo retrospectivo com aprovação do Comitê de Ética Institucional. A partir do Sistema de Informática da Radiologia (RIS) e do Sistema de Arquivo de Imagens do HCRP identificamos retrospectivamente os casos de 42 pacientes consecutivos (idade média de 22 anos, sendo 20 homens, 22 mulheres) que realizaram tratamento de osteossarcoma ou sarcoma de Ewing no HCRP e cujos exames de RM e RC estavam disponíveis para reavaliação. Foram incluídos apenas casos de tumores de ossos longos e com confirmação histopatológica. Três radiologistas musculoesqueléticos avaliaram retrospectivamente a presença ou ausência de RP e identificaram para cada caso a ausência ou presença de cada um dos padrões de RP agressiva nas imagens da RC e da RM: Triângulo de Codman, multilamelada e espiculada. A classificação dos Radiologistas foi realizada de forma independente e às cegas em relação ao diagnóstico definitivo e em relação as demais avaliações realizadas. As leituras das imagens de RM e RC realizadas pelo mesmo observador tiveram um intervalo de pelo menos três meses entre elas. Usamos as leituras dos três observadores para avaliar a confiabilidade interobservador por meio do coeficiente Kappa. Finalmente uma análise consensual das leituras realizadas pelos três observadores tanto para a RC quanto para a RM foi utilizada para calcular o desempenho diagnóstico da ressonância magnética na detecção de RP e na classificação de cada padrão agressivo de RP. O radiologista com maior tempo de experiencia fez a classificação consensual da presença ou ausência de cada subtipo de reação periosteal nos casos em que houve discordância entre os observadores. 8 Resultados: A concordância interobservador para a detecção de RP foi quase perfeita para a RC e substancial a quase perfeita para a RM. A concordância interobservador para a classificação dos diferentes padrões de RP foi moderada a substancial para a presença do triângulo de Codman. A avaliação dos padrões de RP multilamelada e espiculada foi menos consensual entre os radiologistas tanto para RC quanto para a RM. O diagnóstico por RM e RC e a classificação de cada RP agressiva foram estatisticamente associadas com o diagnóstico por RC (p <0,05). A RM mostrou alta especificidade e valor preditivo negativo elevado, mas moderada sensibilidade na detecção de reações periosteais quando comparada com a RC. Conclusão: Nossos resultados sugerem que a detecção de RP por meio da RM e da RC apresenta alta reprodutibilidade. A RM mostrou alta especificidade e sensibilidade moderada para a identificação de RP em comparação com a RC. No entanto, a reprodutibilidade da classificação em diferentes padrões de RP agressivas foi relativamente baixo, tanto para RC quanto para RM em relação às RPs multilameladas e espiculadas. / Objective - To evaluate the diagnostic performance of magnetic resonance imaging (MR) assessing the presence of periosteal reaction (PR) in primary long bone sarcomas using conventional radiography (CR) as the reference standard. Materials and methods After institutional board approval, we retrospectively reviewed the MRI and conventional radiographies of 42 consecutive patients (mean age 22 years, 20 men, 22 women). We included only cases of osteosarcoma or Ewings sarcoma in the long bones with histopathological confirmation. Three experienced musculoskeletal radiologists retrospectively evaluated the presence or absence of periosteal reaction and each pattern of aggressive periosteal reaction in radiographs and MR imaging: Codman triangle, multi layered and spiculated. Radiologists classification was blinded and independent. The readings of the MR images and CR performed by the same observer had an interval of at least three months between them. We use the readings of three observers to assess the interobserver reliability through the Kappa coefficient. Finally a consensus analysis of readings performed by the three observers for both CR and MR was used to calculate the diagnostic performance of MR in detecting PR and classification of each PR aggressive pattern. The radiologist with greater experience made the consensus score of the presence or absence of each periosteal reaction subtype where there was disagreement among observers. 10 Results The interobserver agreement for the detection of PR was almost perfect for the CR and substantial to almost perfect for the MR. The interobserver agreement for the classification of different patterns of PR was moderate to substantial for the presence of Codman triangle. The evaluation of PR multilammelated standards and spiculated was less consensus among radiologists as well for CR as to MR. The diagnostic and the classification of each aggressive PR with MR imaging and with CR were statistically associated with the diagnosis by CR (p <0.05). MR showed high specificity and high negative predictive value, but moderate sensitivity in detecting periosteal reactions when compared to the CR. Conclusions Our results suggest that detection of PR through MR and CR has high reproducibility. MRI showed high specificity and moderate sensitivity for the identification of PR compared to CR. However, the reproducibility of the classification into different patterns of aggressive PRs was relatively low for both CR and for MR regarding the multilamellated and spiculated PRs.

A partir de células de osteossarcoma humano (MG-63) que tem características de osteoblastos imaturos produzimos anticorpos monoclonais (Mabs) nomeados PSP 4-5, PSP 42-22 e PSP 85-9. Esses anticorpos reconhecem antígenos de 100, 26 e 20 kDa respectivamente. Avaliamos a especificidade dos mesmos, testando suas expressões em cortes congelados de tecidos oriundos da mesma célula mesenquimal, ou seja, osso, cartilagem, músculo cardíaco e tecido adiposo. Os anticorpos marcaram o periósteo, com distintos padrões de expressão, porém o PSP 42-22 foi o mais específico marcando a camada osteogênica do periósteo. Os anticorpos marcaram também células ósseas. Diante desses resultados nosso objetivo, no presente estudo, foi identificar os antígenos reconhecidos por esses anticorpos usando clonagem e sequenciamento dos genes em biblioteca de cDNA com capacidade de expressão proteica. Outro objetivo foi testar os anticorpos, pela técnica de imunohistoquímica (IHQ), em tumores ósseos primários visando estabelecer os padrões de marcação e se diferenciavam os diferentes tipos de tumores. Os antígenos reconhecidos pelos anticorpos PSP 42-22 e PSP 85-9 foram isolados, purificados e sequenciados. Devido ao elevado peso molecular do PSP 4-5 necessitaremos de outras técnicas para isolar o clone que codifica seu antígeno. O sequenciamento do clone isolado pelo PSP 42-22, mostrou uma sequência com 99% de homologia descrita no \"Homo sapiens\" como sendo \"serologically defined colon cancer antigen 3 (SDCCAG3), transcript variant 3\". A proteína SDCCAG3 foi descrita pela primeira vez em 1998 como um antígeno de câncer de cólon reconhecido por anticorpo autólogo. Vale lembrar que antígeno reconhecido pelo nosso anticorpo tem um peso molecular de aproximadamente 26 kDa, inferior ao da proteína SDCCAG3. Essa diferença poderia ocorrer devido a uma diferença no local da tradução do mRNA das células MG-63, produzindo uma proteína menor (isoforma), ou no clone isolado (3B2-3-1), poderia ocorrer uma mutação produzindo uma proteína mais curta que se expressaria na membrana celular ao contrário de uma proteína mais longa. Já o alinhamento das sequências obtidas dos clones isolados utilizando o PSP 85-9, mostrou uma sequência com 100% de concordância descrita com a porção não codante da proteína \"Homo sapiens microtubule associated protein, RP/EB family, member 1 (MAPRE1)\" portanto um falso positivo; já o clone 1A5-1-3, mostrou uma sequência de 99% de homologia com a proteína \"Homo sapiens Yip1 interacting factor homolog B (S. cerevisiae) (YIF1B), transcript variant 8\". Trata-se de uma proteína de membrana, com 6 isoformas diferentes que pode interagir com o receptor de serotonina. O resultado da IHQ nos tumores ósseos testados mostrou que o PSP 4-5 se expressou predominantemente no citoplasma de osteossarcoma, condrossarcoma e leiomiossarcoma e no núcleo de osteoblastoma. O anticorpo PSP 42-22 não reconheceu nenhum antígeno nos tumores avaliados. Quanto ao anticorpo PSP 85-9 nos condrossarcomas e leiomiossarcomas a expressão foi predominante citoplasmática e nos osteossarcomas e osteoblastoma foi nuclear. Em conclusão, identificamos os antígenos de dois dos anticorpos estudados que apresentam potencial diagnóstico diferencial em tumores ósseos primários / From human osteosarcoma cells (MG-63), which have characteristics of immature osteoblasts, we produced monoclonal antibodies (Mabs) named PSP 4-5, PSP 42-22 and PSP 85-9. These antibodies recognize antigens with 100, 26 and 20 kDa, respectively. We evaluated their specificity by testing their expression in frozen tissue sections from the same mesenchymal cells, that is, bone, cartilage, cardiac muscle and adipose tissue. The antibodies stained the periosteum, with distinct patterns of expression, but PSP 42-22 was the most specific, scoring the osteogenic layer of the periosteum. The antibodies also marked bone cells. With these results, our goal in this study was to identify the antigens recognized by these antibodies using cloning and sequencing of the genes in the cDNA library with capacity of protein expression. Another objective was to test the antibodies by immunohistochemistry (IHC) in primary bone tumors to establish standards for marking and whether they set apart different types of tumors. The antigens recognized by the PSP 42-22 and PSP 85-9 antibodies were isolated, purified and sequenced. Due to the high molecular weight of PSP 4-5 we will need other techniques to recognize its antigen. Sequencing of the clone isolated using the PSP 42-22 showed a sequence with 99% homology described in \"Homo sapiens\" as being \"serologically defined colon cancer antigen 3 (SDCCAG3), transcript variant 3\". The SDCCAG3 protein was first described in 1998 as a colon cancer antigen recognized by autologous antibody. It is worth remembering that the antigen recognized by our antibody has a molecular weight of approximately 26 kDa, lower than the SDCCAG3 protein. This difference could be due to a difference in mRNA translation site of MG-63 cells producing a lower protein; or on the isolated clone (3B2-3-1) a mutation could occur producing a shorter protein that expresses in the cell membrane instead of a longer protein. The alignment of the sequences obtained from isolated clones using the PSP 85-9 showed a sequence with 100% of homology described with the non-coding protein portion \"Homo sapiens microtubule associated protein, RP/EB family, member 1 (MAPRE1), mRNA\" therefore, a false positive; 1A5-1-3 clone showed a 99% homology sequence with the protein \"Homo sapiens Yip1 interacting factor homolog B (S. cerevisiae) (YIF1B), transcript variant 8, mRNA\". It is a membrane protein with 6 different isoforms which can interact with the serotonin receptor. The result of IHC in bone tumors tested showed that PSP 4-5 expressed predominantly in the cytoplasm of osteosarcoma, chondrosarcoma, leiomyosarcoma and osteoblastoma in was in nucleus. The PSP 42-22 antibody did not recognize any antigen in the tumors examined. As for the PSP 85-9 antibody in chondrosarcoma and leiomyosarcoma, the expression was predominantly cytoplasmic and the osteoblastoma was nuclear in osteosarcomas. In conclusion, we have identified the antigens of two of the antibodies studied which have potential differential diagnosis in primary bone tumors

O osteossarcoma é um tumor ósseo maligno, de maior ocorrência em cães, possui rápido crescimento e alto potencial metastático. Assim, o cão é um modelo útil para o estudo da doença em humanos, tendo em vista as semelhanças clínicas e histopatológicas que ocorrem em ambas às espécies. Atualmente, os estudos a respeito de células-tronco são promissores considerando seu alto potencial terapêutico. Entretanto, ainda prevalecem muitas dúvidas referentes ao tratamento de tumores utilizando a terapia celular. Este tema é pouco conhecido e estudado, por isso, o objetivo deste trabalho foi avaliar a interação entre células-tronco obtidas da polpa dentária canina com as células derivadas osteossarcoma canino. Foram realizados cocultivos celulares das células derivadas de polpa dentária canina, osteossarcoma canino e derivadas de osso normal canino. Analisou-se os aspectos morfológicos das células cocultivadas e controle, assim como a atividade proliferativa, a morte celular, o potencial elétrico mitocondrial e a expressão gênica. A partir dos resultados obtidos, concluiu-se que a interação entre a célula-tronco da polpa dentária canina imatura e as células de osteosarcoma canino não apresentam alterações morfológicas. Entretanto, as células-tronco derivadas da polpa dentária canina e de osso fetal canino sadio parecem servir de suporte para o crescimento tumoral. Além disso, a cocultura celular, em todos os grupos testados, promove alterações na expressão gênica e proteica. / Osteosarcoma is a malignant bone tumor most frequent in dogs. It has fast growth and high metastatic potential. Thus, the dog is an useful model for the study of human disease, due to the clinical and histological similarities found in both species. Currently, studies about stem cells are promising considering its high therapeutic potential. However, many doubts still exist regarding the treatment of tumors using cell therapy. This theme is little known and studied. Therefore, the aim of this study was to evaluate the interaction between stem cells obtained from canine immature dental pulpstem cells with osteosarcoma cells derived from dogs. Cellular coculture were performed using cells derived from canine dental pulp, canine osteosarcoma and canine normal bone. The morphological aspects of cocultured cells and control were analyzed, as well as proliferative activity, cell death, the mitochondrial membrane electric potential and gene expression. In summary, it was concluded that the interaction between stem cells from canine immature dental pulp and canine osteosarcoma cells did not show morphological changes. However, stem cells derived from canine dental pulp and healthy canine fetal bone serve to support tumor growth. Furthermore, the cell coculture in all groups tested, causes changes in gene and protein expression.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:47:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2978289 bytes, checksum: f112ecf9ec496a2b307f3b0315fd882e (MD5) Previous issue date: 2006-12-13 / The purpose of this study was to assess the intensity of the cyclo-oxygenase 2 (Cox2), as well as the nucleolus organizing regions impregnated with silver (AgNORs) and mitosis figures in different canine oteosarcomas. The material used for the analysis was obtained from a retrospective study of approximately 10 years, of canine oteosarcomas recorded in the clinics routine at Federal University of Viçosa and at Federal University of Minas Gerais. The 78 cases of osteosarcomas recorded were histologically analysed and 6 cases of each group were classified as being osteoblastics, condroblastics, fibroblastics and combined cases. This material was submitted to both histochemistry and immunohistochemistry evaluation. Telangiectatic giant cell type and poorly differentiated osteosarcomas were not evaluated due to the small number of observed cases. The results presented statistical differences (p<0,05) for the Cox2 expressions and for the AgNORs proteins among the different osteosarcomas, however no difference was found for the mitosis figures counting. Considering all the evaluations, the osteoblastic osteosarcoma recorded in 53 % of the cases, presented the highest number of NORs and mitosis figures by field, and also it showed the highest number of positive cases with the higher immunomarked cells counting. The results suggest that the osteoblastic osteosarcoma is more aggressive than the other kinds of osteosarcoma evaluated in this study, but because of the lack of both information and standardized clinics data, it is not possible at this point, to connect these findings with the over life and tumor development, and not even to correlate the agressivity of the different kinds of canine osteosarcomas. / O propósito deste trabalho foi avaliar a intensidade da cicloxigenase 2 (Cox2), as Regiões Organizadoras de Nucléolos Impregnadas pela Prata (AgNORs) e as figuras de mitose por campo nos diferentes tipos de osteossarcomas canino, a partir de um estudo retrospectivo de pouco mais de 10 anos dos casos de osteossarcoma canino que surgiram na rotina da clínica de pequenos animais da Universidade Federal de Viçosa e da Escola de Veterinária da Universidade Federal de Minas Gerais. As 78 ocorrências encontradas foram classificadas histologicamente e 6 casos de cada grupo classificados como osteossarcomas osteoblásticos, condroblásticos, fibroblásticos e combinados (mistos) foram submetidos às avaliações histoquímicas e imunoistoquímicas do estudo. Os osteossarcomas teleangectásico, de células gigantes e pobremente diferenciados não foram avaliados em decorrência do pequeno número de casos encontrados. Os resultados mostraram diferenças estatística (p<0,05) nas expressões da Cox2 e nas proteínas AgNORs entre os diferentes osteossarcomas, no entanto, esta diferença não acorreu na contagem das figuras de mitoses. Em todas as avaliações, o osteossarcoma osteoblástico que surgiu com 53% dos casos, foi o que apresentou maior número de NORs, de figuras de mitoses por campo e de casos positivos com maior contagem de células imunomarcadas. Desta forma, pode-se sugerir que o osteossarcoma osteoblástico apresenta maior agressividade em relação aos demais tipos de osteossarcomas avaliados neste trabalho, porém, por falta de informações e padronização nos dados clínicos, não foi possível associar estes achados com a sobrevida e desenvolvimento tumoral, correlacionando-os com a agressividade dos diferentes tipos de osteossarcomas canino.

O osteossarcoma é um tumor ósseo maligno, de maior ocorrência em cães, possui rápido crescimento e alto potencial metastático. Assim, o cão é um modelo útil para o estudo da doença em humanos, tendo em vista as semelhanças clínicas e histopatológicas que ocorrem em ambas às espécies. Atualmente, os estudos a respeito de células-tronco são promissores considerando seu alto potencial terapêutico. Entretanto, ainda prevalecem muitas dúvidas referentes ao tratamento de tumores utilizando a terapia celular. Este tema é pouco conhecido e estudado, por isso, o objetivo deste trabalho foi avaliar a interação entre células-tronco obtidas da polpa dentária canina com as células derivadas osteossarcoma canino. Foram realizados cocultivos celulares das células derivadas de polpa dentária canina, osteossarcoma canino e derivadas de osso normal canino. Analisou-se os aspectos morfológicos das células cocultivadas e controle, assim como a atividade proliferativa, a morte celular, o potencial elétrico mitocondrial e a expressão gênica. A partir dos resultados obtidos, concluiu-se que a interação entre a célula-tronco da polpa dentária canina imatura e as células de osteosarcoma canino não apresentam alterações morfológicas. Entretanto, as células-tronco derivadas da polpa dentária canina e de osso fetal canino sadio parecem servir de suporte para o crescimento tumoral. Além disso, a cocultura celular, em todos os grupos testados, promove alterações na expressão gênica e proteica. / Osteosarcoma is a malignant bone tumor most frequent in dogs. It has fast growth and high metastatic potential. Thus, the dog is an useful model for the study of human disease, due to the clinical and histological similarities found in both species. Currently, studies about stem cells are promising considering its high therapeutic potential. However, many doubts still exist regarding the treatment of tumors using cell therapy. This theme is little known and studied. Therefore, the aim of this study was to evaluate the interaction between stem cells obtained from canine immature dental pulpstem cells with osteosarcoma cells derived from dogs. Cellular coculture were performed using cells derived from canine dental pulp, canine osteosarcoma and canine normal bone. The morphological aspects of cocultured cells and control were analyzed, as well as proliferative activity, cell death, the mitochondrial membrane electric potential and gene expression. In summary, it was concluded that the interaction between stem cells from canine immature dental pulp and canine osteosarcoma cells did not show morphological changes. However, stem cells derived from canine dental pulp and healthy canine fetal bone serve to support tumor growth. Furthermore, the cell coculture in all groups tested, causes changes in gene and protein expression.