Submitted by Gizele Lima (gizele.lima@inpa.gov.br) on 2017-07-18T19:14:05Z No. of bitstreams: 2 02032017 TESE GERMAN MOREY DOUTORADO-FINAL pdf.pdf: 6165895 bytes, checksum: 1cb530594771f2378f19d45aa2baafec (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-18T19:14:05Z (GMT). No. of bitstreams: 2 02032017 TESE GERMAN MOREY DOUTORADO-FINAL pdf.pdf: 6165895 bytes, checksum: 1cb530594771f2378f19d45aa2baafec (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2017-04-05 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / This work describes the parasitic fauna of Serrasalmus altispinis caught in Central Amazonia floodplain lakes and its use as a bioindicator of environmental quality. All registered parasite species are first records for this fish species. Additional information to the original descriptions of the parasite species already described were added. The studied lakes were: Baixio, Preto, São Tomé, Ananá, Araçá and Maracá, located between the cities of Manaus and Coari in Central Amazonia, in a stretch of approximately 400 km. Sixty S. altispinis were collected and examined during four field trips in the months of March, June, September, and December 2013. Fish averaged standard length was 13.3 ± 3.6 cm and 60.3 ± 35, 9 g of total weight. The relative condition factor was 1.14 ± 0.95. One thousand one hundred and twenty two (1122) parasites belonging to three phyllum and six different taxonomic groups were collected and identified: Phylum Platyhelminthes: Monogenoidea (818) and Digenea (22); Phylum Nematoda (70), and Phylum Arthropoda: Copepoda (196), Branchiura (01) and Isopoda (15). Ecological descriptors such as the Margalef and Simpson diversity indexes showed high diversity in the lakes, except for Lake Baixio, which presented values that considered it as a lake of medium diversity. However, when the calculation of diversity indices was applied only to endoparasites, they showed a different picture: the low values in the ecological descriptors considered the studied lakes as places of low diversity. All lakes had more ectoparasites than endoparasites. The species Anacanthorus jegui, A. peryphallus, A. sciponophallus, Enallothecium aegidatum, Clinostomum marginatum, Procamallanus (Spirocamallanus) inopinatus, Anisakis sp and Amplexibranchius bryconis presented IndVal significant greater than 70% (p <0.05) being considered as characteristic species in the floodplain lakes studied. The great diversity of parasite species that use S. altispinis as host indicates the important role that this fish species has for the maintenance of biodiversity in floodplain lakes of Brazilian Central Amazonia. / Neste trabalho é descrita a fauna parasitária de Serrasalmus altispinis capturados em lagos de várzea da Amazônia Central e seu uso como bioindicadora de qualidade ambiental. Todas as espécies parasitas registradas constituem os primeiros registros parasitários para este peixe. Foram adicionadas informações as descrições originais das espécies já descritas. Os lagos estudados foram: Baixio, Preto, São Tomé, Ananá, Araçá e Maracá, localizados entre as cidades de Manaus e Coari na Amazônia Central, em um trecho de aproximadamente 400 km. Foram coletados e examinados 60 S. altispinis durante quatro excursões de campo nos meses de março, junho, setembro e dezembro de 2013. Os peixes mediam em média 13,3 ± 3,6 cm de comprimento padrão e pesavam 60,3 ± 35,9 g de peso total. O fator de condição relativo foi de 1,14 ± 0,95. Foram coletados e identificados 1.122 parasitos pertencentes a três filos e seis grupos taxonômicos distintos: Filo Platyhelminthes: Monogenoidea (818) e Digenea (22); Filo Nematoda (70), e Filo Arthropoda: Copepoda (196), Branchiura (01) e Isopoda (15). Os descritores ecológicos como os índices de diversidade de Margalef e Simpson mostraram alta diversidade nos lagos de várzea estudados com exceção do Lago Baixio que apresentou valores que o consideraram como um lago de diversidade média. No entanto, o cálculo dos índices de diversidade aplicado só para os endoparasitos registrados em S. altispinis mostraram um quadro diferente. Os baixos valores nos descritores ecológicos consideraram os lagos estudados como locais de baixa diversidade. Todos os lagos apresentaram maior número de espécies ectoparasitas que endoparasitas. Das espécies analisadas, Anacanthorus jegui, A. peryphallus, A. sciponophallus, Enallothecium aegidatum, Clinostomum marginatum, Procamallanus (Spirocamallanus) inopinatus, Anisakis sp e Amplexibranchius bryconis apresentaram IndVal maior que 70% significativo (p < 0,05), sendo consideradas como espécies bioindicadoras e característica dos lagos de várzea estudados. A grande diversidade de espécies parasitas que utilizam S. altispinis como hospedeira indica o importante papel que essa espécie de peixe possui para a manutenção da biodiversidade nos lagos de várzea da Amazônia central brasileira.

Made available in DSpace on 2015-04-14T13:09:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 414796.pdf: 186239 bytes, checksum: 84d975c8024507f47eadc59f4d672996 (MD5) Previous issue date: 2007-03-30 / A angiostrongil?ase abdominal ? causada pelo Angiostrongylus costaricensis, um nemat?deo intra-arterial, que vive na regi?o ?leo-cecal de roedores silvestres. Esta parasitose tem sido registrada desde o sul dos Estados Unidos at? o norte da Argentina. O homem ? hospedeiro acidental e se infecta ingerindo as larvas de terceiro est?gio (L3) presentes no muco do hospedeiro intermedi?rio (veronicel?deos). Outra esp?cie, que tamb?m ? parasita do homem, ? Angiostrongylus cantonensis, um verme pulmonar de ratos, causador da meningite eosinof?lica, que ocorre na ?sia e ilhas do Pac?fico. Parasitas de parasitas s?o atualmente alvo de estudos n?o somente para abrir novas possibilidades terap?uticas, bem como para aprimorar t?cnicas diagn?sticas. O interesse pela Wolbachia sp, uma bact?ria gram-negativa endosimbionte, aumentou no momento em que descobriram sua caracter?stica mutual?stica em rela??o ? fil?ria. Estas considera??es levaram a novas id?ias para o tratamento destas parasitoses atrav?s da utiliza??o de drogas antibacterianas. O objetivo principal deste trabalho ? verificar a presen?a de Wolbachia em A. costaricensis e em A. cantonensis, e estudar a sua contribui??o para a resposta imune humoral do hospedeiro vertebrado. O primeiro passo foi buscar evid?ncias da presen?a de ?cidos nucl?icos de Wolbachia, atrav?s da t?cnica de PCR. Em alguns experimentos foram obtidos produtos de amplifica??o, o que poderia ser um ind?cio da presen?a da bact?ria, mas esses dados devem ser confirmados por microscopia eletr?nica e por imunohistologia. Diante das dificuldades para se obter ant?geno de Wolbachia sp alternativamente amostras de soro de indiv?duos com angiostrongil?ase foram testados contra ant?genos de Escherichia coli por ser uma bact?ria comum na microbiota de vertebrados e que eventualmente poderia colonizar o verme. Atrav?s da an?lise por imunoeletrotransfer?ncia ficou claramente demonstrada uma reatividade n?o relacionada exclusivamente aos indiv?duos infectados por A. costaricensis. Al?m disso, fragmentos de vermes foram semeados em meio de cultura a fim de estudar a microbiota do verme adulto de Angiostrongylus. O fato de s? ser encontrada um bacilo gram positivo nesse experimento parece confirmar a hip?tese de que, por ser o ambiente intravascular pouco tolerante ? presen?a de bact?rias, a microbiota do verme deve ser pouco numerosa e diversa. Permanece aberta para futuras investiga??es a contribui??o de outras bact?rias ou outros simbiontes em helmintos, para reconhecimento antig?nico pelo hospedeiro vertebrado, com poss?veis implica??es para diagn?stico, patogenia e tratamento.

Made available in DSpace on 2015-04-14T13:09:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 427622.pdf: 4680280 bytes, checksum: 75e54492eea58e6d4b33bd97da9115de (MD5) Previous issue date: 2010-08-25 / Dentre os angiostrongil?deos, h? duas esp?cies que t?m sido extensamente estudadas por constitu?rem problemas de sa?de humana: Angiostrongylus costaricensis e A. cantonensis. Enquanto existem numerosos estudos sobre a manuten??o e desenvolvimento in vitro de tremat?deos, s?o poucas as tentativas registradas na literatura do mesmo esfor?o em rela??o aos nemat?deos. Atrav?s do desenvolvimento de cultivos e co-cultivos com c?lulas embrion?rias de B. glabrata buscou-se encontrar a forma mais adequada para a produ??o de larvas nas fases intramolusco dos dois parasitos em estudo. Em um trabalho anterior foi utilizada a axeniza??o das larvas de primeiro est?gio, este m?todo foi adaptado especialmente quanto ? concentra??o de hipoclorito de s?dio que foi utilizado a 0,25% de modo eficiente. Verificou-se que nos cultivos enriquecidos com extrato prot?ico do corpo de B. glabrata, houve uma maior recupera??o de larvas de segundo est?gio. A fim de se investigar a possibilidade de uma diferen?a quanto ? express?o de prote?nas entre caramujos infectados e n?o infectados, foi realizada a eletroforese bidimensional. Uma prote?na de 37 kDa no ponto isoel?trico de 4,2 foi expressa apenas nos tecidos dos caramujos infectados. Para se ter um estoque de larvas de primeiro est?gio, testou-se formas de criopreserv?-las com diferentes concentra??es de dimetil-sulf?xido (DMSO) e de soro fetal bovino (SFB). Para ambos nemat?deos, o uso de 1% de DMSO em meio enriquecido com 5% de SFB, incuba??o pr?via de 60 minutos com o criopreservante em temperatura ambiente, seguido pelo congelamento r?pido em nitrog?nio l?quido, apresentou os melhores ?ndices de larvas ativas recuperadas.Embora os experimentos n?o tenham tido ?xito para produzir in vitro larvas de terceiro est?gio (L3), v?rios aspectos foram analisados e todo o conhecimento resultante representa o in?cio do caminho para, com esfor?o cont?nuo, se estabelecer um sistema in vitro capaz de produzir em grande quantidade e regularmente essas formas parasit?rias. Os resultados apresentados contribuem para uma melhor compreens?o da complexa tarefa de manipula??o in vitro desses nem?todeos e dos desafios para o melhor entendimento de sua biologia.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000432438-Texto+Completo-0.pdf: 2038170 bytes, checksum: 505895940d1e38c8e3925441d22f197d (MD5) Previous issue date: 2011 / Nematode worms in the genus Angiostrongylus are intra-arterial parasites of rodents. A. costaricensis lives in mesenteric system while A. cantonensis inhabits the pulmonary arteries. Man is an accidental host and the worm may cause eosinophilic gastroenteritis or meningitis due to migration of A. cantonensis’ young adult worms through central nervous system tissues. Molecular methods for diagnosis of human disease are important since parasitological diagnosis is prevented by lack of larval elimination in feces. Immunodiagnostic methods based on crude antigens lack both specificity and sensibility. Efforts where directed towards analysis of fractions for detection of antigens with better performance in immunodiagnosis for the improvement of molecular diagnosis of angiostrongyliasis. The possibility of heterologous antigens was also tested, A. cantonensis’ proteins being standardized in ELISA for the detection of anti-A. costaricensis’ antibodies. Analysis of fractions was initiated with the study of proteins extracted from the reproductive tract (RT) from female worms of A. cantonensis, several fraccionation protocols were tested and protein recognition by sera from infected humans was probed by Western blot (WB). Protein A immunoaffinity columns were loaded with sera from infected patients but recovery of antigens was unsuccessful. The RT extract was fractionated at sub-cellular level and the cellular membrane fraction (F2) was subsequently separated according to isoeletric point intervals. Proteins at several pH intervals were recognized by positive sera in WB. These antigens may be useful as antibody targets for the immunodiagnosis of angiostrongyliasis. Molecular cloning of relevant antigens is a desirable aim for future studies, leading to permanent sources of well-defined antigens and the reduction of the labor intensive in vivo production of these reagents. / Vermes do gênero Angiostrongylus são parasitos intra-arteriais em roedores. A. costaricensis vive no sistema mesentérico, enquanto A. cantonensis habita as artérias pulmonares de ratos. No homem, hospedeiro acidental destas parasitoses, elas causam a gastroenterite eosinofílica e meningite devido à migração de adultos jovens de A. cantonensis nos tecidos do sistema nervoso central. O exame parasitológico de fezes não pode ser utilizado para diagnóstico humano das angiostrongilíases porque não são encontradas larvas nas fezes, o que torna importante o desenvolvimento de técnicas moleculares. Os métodos de imunodiagnóstico empregando antígenos brutos apresentam reatividade cruzada com outras parasitoses e também resultados falso-negativos. Com o objetivo de aprimorar o diagnóstico molecular das angiostrongilíases, direcionamos os esforços na tentativa de reduzir a complexidade dos extratos de antígenos a fim de encontrar proteínas mais específicas e sensíveis para o diagnóstico. Primeiramente foi testado o uso de antígenos de A. cantonensis para o diagnóstico de A. costaricensis pela técnica de ELISA.A partir disso, antígenos de tubo reprodutor (TR) de fêmeas de A. cantonensis foram fracionados por diversas técnicas e sua reatividade a soros controle foi testada por Western blot (WB). Colunas de proteína A foram incubadas com soro de pacientes infectados, porém este fracionamento não teve sucesso. Foi realizado o fracionamento subcelular dos extratos TR e com a fração de antígenos de membrana celular (F2) foi realizado o fracionamento por ponto isoelétrico. As frações de pH apresentaram reatividade específica aos soros controle positivos quando submetidas ao WB, sugerindo que as proteínas encontradas possam ser importantes alvos para o diagnóstico das angiostrongilíases. A possibilidade de clonar as proteínas de interesse para produção em grande escala, poderá constituir fonte permanente de antígenos com redução do volume de trabalho e do emprego de animais no laboratório.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:42:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000408007-Texto+Completo-0.pdf: 7713390 bytes, checksum: bf92d92b7f1e311023e32849423ed23c (MD5) Previous issue date: 2008 / The tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus is a hematophagous ectoparasite of bovines, widely distributed in herds from America, Asia, Africa and Oceania. The use of acaricides is the main method for tick control, however it may become unfeasible due to the cost of drugs and labor required to apply the treatment, as well as the increasing appearance of resistant ticks to various acaricides. In addition, chemical residues in food and environmental pollution are major concerns nowadays. The development of an immunological control method as an alternative for the chemical control depends on finding out antigenic molecules that generate a protective immune response. As bovines develop resistance to ticks during successive infestations, the analysis of the immune responses developed by infested bovines may become of great importance in the search for protective antigens. ELISA and Western Blot were used to investigate the pattern of antibody responses of six bovines infested twelve times with R. microplus (six heavy infestations followed by six light infestations) against salivary gland, gut and larvae extracts. During heavy infestations, bovine IgG levels were shown to be higher, and a decrease in the number and weight of ticks that completed the parasitic cycle was observed. The pattern changed starting from the seventh infestation, showing a decrease in IgG levels, and an initial increase followed by a significant decrease in the proportion of ticks that completed the parasitic cycle. The number of molecules recognized by Western Blot was higher from sera collected following heavy infestations than after light infestations, although a great variation in the profiles detected could be seen when the bovines were compared. These results indicate that IgG responses to different tick antigens may not be generally associated with bovine resistance, and that infestation levels modulate the magnitude of humoral responses and possibly the immune mechanisms in the natural acquisition of tick resistance. / O carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus é um ectoparasito hematófago de bovinos, amplamente distribuído nos rebanhos da América, Ásia, África e Oceania. O uso de acaricidas é o principal método para o controle do carrapato, porém o custo das drogas e da mão-de-obra requerida para aplicar o tratamento, o aparecimento crescente de carrapatos resistentes a vários acaricidas, a permanência de resíduos químicos nos alimentos e a poluição ambiental decorrente do seu uso tornam importante o desenvolvimento de outras formas de controle. O desenvolvimento de um método de controle imunológico como uma alternativa para o controle químico depende da identificação de moléculas antigênicas que geram uma resposta imune protetora. Como bovinos desenvolvem resistência ao carrapato durante sucessivas infestações, a análise da resposta imune desenvolvida por bovinos infestados pode tornar-se de grande importância na busca por antígenos protetores. ELISA e Western Blot foram utilizados para investigar o padrão de respostas de anticorpos de seis bovinos infestados doze vezes com R. microplus (seis infestações pesadas seguidas por seis infestações leves) contra extratos de glândula salivar, intestino e larva. Durante infestações pesadas foram observados níveis maiores de IgGs reconhecendo extratos protéicos de glândula salivar, intestino e larva, e uma diminuição no número e no peso de carrapatos que completam o ciclo parasitário. O padrão mudou iniciando na sétima infestação, mostrando uma diminuição nos níveis de IgG, e um aumento inicial seguido por uma significante diminuição na proporção de carrapatos que completam o ciclo parasitário. O número de moléculas reconhecidas em Western Blot foi maior pelos soros das infestações pesadas do que das infestações leves, embora uma grande variação nos perfis detectados pode ser visto entre os bovinos. Esses resultados indicam que níveis de anticorpos contra o carrapato não estão necessariamente relacionados de forma direta com níveis de resistência. Além disso, infestações pesadas e leves parecem modular de forma diferente a magnitude da resposta humoral e possivelmente os mecanismos imunes na aquisição natural de resistência ao carrapato.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias, Programa de Pós-Graduação em Aquicultura, Florianópolis, 2011 / Made available in DSpace on 2012-10-26T06:36:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 297163.pdf: 1520647 bytes, checksum: 894bc03f3861ed7ec035c63397f43b5e (MD5) / O objetivo deste estudo foi avaliar a influência da sazonalidade nas características hematológicas e parasitológicas da garoupa verdadeira Epinephelus marginatus selvagem e cultivada em Ubatuba, SP, Brasil. Foram realizadas análises hematológicas e parasitológicas de 159 peixes, sendo 20 espécimes selvagens e 20 cultivados em cada estação do ano. Pseudorhabdosynochus beverleyburtonae foi o parasito mais abundante, com as maiores intensidades e dominância relativa média em todas as estações. Neobenedenia melleni foi observado em todas as estações, com aumento gradativo do número de parasitos das estações mais frias para as mais quentes e maiores prevalências e intensidades médias no verão. Helicometrina nimia, com exceção dos peixes selvagens no verão foi encontrado em todas as estações. Pseudempleurosoma sp. e larvas de Contracaecum sp. apresentaram prevalências baixas e ocorreram em peixes selvagens e cultivados no outono e primavera, respectivamente. Os maiores valores no percentual de hematócrito em peixes de cultivo, contagem total de eritrócitos e leucócitos nos peixes de ambas as origens, redução no número de trombócitos em peixes selvagens e de linfócitos nos peixes cultivados, além das maiores prevalências e intensidades médias de infecção por N. melleni ocorreram no verão. No outono, ocorreram as maiores intensidades médias de infecção por P. beverleyburtonae nos peixes de ambas as origens, além da maior contagem total de trombócitos em peixes selvagens, redução no número de linfócitos e aumento no número de monócitos nos peixes cultivados. Estes resultados sugerem que N. melleni possui maior influência sobre as características sanguíneas da garoupa verdadeira quando comparado a P. beverleyburtonae e que altas intensidades de parasitos potencialmente patogênicos podem favorecer surtos de doenças em condições de cultivo desta espécie.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:49:25Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006-12-31 / Com o intuito de obter informações sobre a expressão de lipídeos de formas promastigotas de Leishmania (Leishmania) amazonensis, parasitas foram analisados durante o crescimento logarítmico e estacionário quanto à composição de glicolipídeos e fosfolipídeos. Em paralelo, dois anticorpos monoclonais (mAbs), denominados LST-1 e LST-2, foram produzidos, caracterizados e utilizados neste estudo. A expressão de fosfolipídeos em promastigotas durante o crescimento logarítmico e estacionário foi analisada por cromatografia em camada delgada de alta resolução (HPTLC). O extrato lipídico total de promastigotas de L. (L.) amazonensis apresenta fosfatidilinositol (PI), fosfatidilserina (PS), fosfatidilcolina (PC), fosfatidiletanolamina (PE), Liso-PI e inositol fosforilceramida (IPC), este último caracterizado por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa, contendo esfingosina (d18:1) e ácidos graxos, principalmente ácido esteárico (C18:0) e ácido palmítico (C16:0). Enquanto as proporções molares de IPC, PS, PE, Liso-PI aumentaram com o decorrer do tempo de cultura, as proporções molares de PI e PC diminuíram. O perfil cromatográfico dos glicolipídeos se manteve constante durante o crescimento logarítmico e estacionário. Os mAbs LST-1 e LST-2 foram produzidos contra a fração enriquecida em glicolipídeos e IPC de formas promastigotas de L. (L.) amazonensis. Os dois anticorpos pertencem a classe IgM. O mAb LST-1, por imunocoloração de placas de HPTLC, reconhece um componente lipídico acídico, eluído da coluna de DEAE-Sephadex com acetato de sódio 0,2 M, que apresenta migração cromatográfica característica de IPC, o qual é resistente à hidrólise alcalina e é corado com reagente de Dittmer-Lester. Já, o mAb LST-2 foi reativo com a fração de glicolipídeos não retida na coluna de DEAE-Sephadex, e visibilizada nas placas de HPTLC com orcinol/H2SO4. Por IFI, os dois mAbs mostraram alta reatividade com formas promastigotas de L. (L.) amazonensis. O tratamento dos parasitas com isopropranol:hexano:água (IPA:Hex:água) (55:20:25; v/v/v) aboliu a reatividade, indicando que os antígenos reconhecidos pelos mAbs estão presentes somente na fração lipídica. LST-1 não foi reativo com parasitas vivos, sugerindo que o IPC está críptico na membrana, sendo talvez expresso somente no folheto interno da membrana plasmática. Já, o mAb LST-2 apresentou forte reatividade com promastigotas vivos, aglutinando-os, indicando que os glicolipídeos reconhecidos por LST-2 encontram-se na superfície do parasita. Por imunofluorescência indireta com LST-1 e LST-2 verificou-se que amastigotas isoladas de lesão não são reconhecidos pelos mAbs, e por outro lado, forte fluorescência foi detectada com amastigotas axênicos. Por cromatografia em placas de HPTLC, de extratos lipídicos purificados de amastigotas, verificou-se que os amastigotas isolados de lesão de animais infectados por L. (L.) amazonensis, apresentam diferentes perfis cromatográficos de glicolipídeos e fosfolipídeos em relação aos promastigotas e aos amastigotas axênicos. Enquanto os amastigotas isolados de lesão são ricos em glicoesfingolipídeos, os amastigotas axênicos e promastigotas apresentam glicoinositolfosfolipídeos (GIPLs) reconhecidos pelo mAb LST- 2 e IPC reconhecido pelo mAb LST-1. O mAb LST-1 apresentou reatividade com formas promastigotas de todas as espécies de Leishmania analisadas, e também com formas epimastigotas de T. cruzi. Nestes parasitas, foi observado que LST-1 reconhece especificamente IPC, sendo o resíduo de inositol e a ceramida essenciais para a reatividade do mAb LST-1. Já, o mAb LST-2, por imunofluorescência indireta, apresentou forte marcação somente com formas promastigotas ou amastigotas axênicos de L. (L.) amazonenis, reconhecendo 4 componentes glicolipídicos denominados bandas a, b, c, e d, que correspondem a GIPLs. A porção carboidrato é fundamental para a reatividade do mAb LST-2. Analisando-se macrófagos infectados com promastigotas de L. (L.) amazonensis, verificou-se por imunofluorescência indireta com o mAb LST-2, que os promastigotas durante a adesão/infecção de macrófagos, secretam ou transferem para os macrófagos os antígenos glicolipídicos, reconhecidos pelo mAb LST-2. Forte fluorescência na superfície de macrófagos infectados é observada já na primeira hora de infecção, e com o decorrer da infecção (até 4 horas) observa-se, somente nos macrófagos infectados, pequenas vesículas fluorescentes, que não correspondem a fagossomos contendo os parasitas. Assim, nesta tese, foi demonstrado que amastigotas isolados de lesão em relação a amastigotas axênicas e promastigotas de L. (L.) amazonensis apresentam padrões distintos de glico(fosfolipídeos). Enquanto amastigotas isoladas de lesão expressam GSLs, amastigotas axênicas e promastigotas expressam IPC e GIPLs, sendo que estes últimos sendo liberados pelo promastigota durante a infecção de macrófagos. / In order to obtain information about the lipid expression of promastigote forms of Leishmania (Leishmania) amazonensis, the parasites lipid composition profile was analyzed during log and stationary phase. Two monoclonal antibodies (mAb) termed LST-1 and LST-2 were produced, characterized and used in this study. Promastigote phospholipid expression on log and stationary growth phases were analyzed by high performance thin layer chromatography (HPTLC). At either phase the total lipid extract of L. (L.) amazonensis promastigotes presents phosphatidylinostol (PI), phosphatidylserine (PS), phosphatidylcholine (PC) phosphatidylethanolamine (PE), Lyso- PI and inositol phosphorylceramide (IPC). IPC was characterized by GC/MS, and it was detected sphingosine (d18:1) and fatty acids, mainly palmitic acid (C16:0), and stearic acid (C18:0). It was noted that the molar proportions of IPC, PS, PE and Lyso-PI increased during the culture time, while the percentage of PI and PC decreased. Unlikely, the glycolipid chromatographic profile did not change during the promastigotes growth at log and stationary phases. The mAbs LST-1 and LST-2 were produced against a glycolipid and IPC enriched fraction purified from promastigote forms of L. (L.) amazonensis. Both antibodies are IgM. By HPTLC immunostaining it was demonstrated that mAb LST-1 recognized an acidic lipid component, eluted with 0.2 M of sodium acetate from DEAE-Sephadex column. The LST-1 reactive component presents: i) chromatographic migration characteristic of IPC, ii) is resistant to alkaline hydrolysis; iii) is stained with Dittmer-Lester reagent. On the other hand, the mAb LST-2 was reactive with the glycolipid fraction not retained in DEAE-Sephadex column, and this fraction was visualized on HPTLC by primuline and orcinol/H2SO4 staining. By indirect immunofluorescence, both antibodies showed high reactivity with L. (L.) amazonensis promastigotes. Parasites delipidation with isopropanol:hexane:water (55:20:25; v/v/v), abolished the mAbs reactivity, indicating that the antigens recognized by LST-1 and LST-2 are present exclusively in the lipid fraction. MAb LST-1 did not react with non-fixed parasites, suggesting that IPC is cryptic in the membrane, and maybe localized only in the inner leaf of plasma membrane. Contrasting, mAb LST-2, showed a strong reactivity with live L. (L.) amazonensis promastigotes, also parasite agglutination was observed, indicating that the glycolipids recognized by LST-2 are in parasite surface. By indirect immunofluorescence with LST-1 and LST-2 no reactivity was observed with amastigotes isolated from L. (L.) amazonensis infected hamsters, conversely axenic amastigotes showed a strong fluorescence with both mAbs. By HPTLC it was verified that the lipid fractions of promastigotes, axenic amastigotes and amastigotes isolated from footpad lesions, presented distinct glycolipids and phospholipids profiles. Amastigotes isolated from lesions are rich in glycosphingolipids, whereas axenic amastigotes and promastigotes present glycoinositolphospholipids (GIPLs) recognized by LST-2, and IPC recognized by mAb LST-1. The LST-1 antibody recognized promastigotes from all species of analyzed, and also T. cruzi epimastigotes. It was determined that LST-1 recognizes specifically IPC in these parasites, and it was established that the inositol residue and the ceramide are essential for LST-1 reactivity. By indirect immunofluorescence with mAb LST-2 a strong labeling of only L. (L.) amazonensis promastigotes and axenic amastigotes was observed. LST-2 recognizes 4 glycolipid components termed a, b, c and d, which correspond to GIPLs. It was demonstrated that the carbohydrate moiety is fundamental for LST-2 reactivity. L. (L.) amazonensis promastigotes infected macrophages showed by indirect immunofluorescence, that promastigotes during the macrophage adhesion/infection, secrete or transfer GIPLs recognized by mAb LST-2 to the macrophage. Strong fluorescence in infected macrophage was observed in the first hours of infection. During the next hours of infection (up to 4 hours) also small fluorescent vesicles were observed in the infected macrophages, which did not correspond to phagossomes containing parasites. Thus, these studies describe distinct (glyco)phospholipid profile in lesion amastigotes, axenic amastigotes and promastigotes, and GIPLs vesicles formation during macrophage infection by promastigotes. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

A criação de ovinos para produção de leite no Brasil tem crescido nos últimos anos. Este trabalho teve como objetivo avaliar a sanidade de ovinos leiteiros. Para tanto, utilizou-se como metodologia o estudo de caso exploratório e selecionou-se como população o maior rebanho ovino com produção leiteira do país, no município de Chapecó, SC. Avaliaram-se aspectos sanitários relacionados à produção leiteira determinando-se a ocorrência de mastites e a composição do leite; determinou-se a prevalência de resposta imune para Toxoplasma gondii e Neospora caninum utilizando RIFI, em ovelhas em idade reprodutiva e cordeiras; avaliou-se o status parasitológico de parasitoses gastrintestinais em fêmeas lactantes e não lactantes pelo teste de Gordon & Whitlock (OPG) e, pela técnica de Robert & O'Sullivan (Coprocultura), identificaram-se os principais parasitos de ocorrência para o rebanho em estudo. Das 24 ovelhas analisadas, 3 (12,5%) apresentaram resposta (3 cruzes) ao California Mastitis Test em um dos tetos, pelo menos uma vez, durante a lactação. Embora nenhum animal tenha apresentado quadro clínico, verificou-se crescimento bacteriano em (22) 12,3% amostras de leite, com predomínio de Staphylococcus coagulase negativa. Verificou-se variabilidade na CCS (2,3x104 a 9,5x106 células.mL-1) entre os animais e entre os meses de lactação. No leite de mistura determinou-se acidez de 25 e 26 ⁰D, estabilidade ao álcool entre 52 a 56⁰GL, CCS de 9,7x105 a 1,7x106 cél.mL-1 e contagem bacteriana de 2x103 a 3x103 ufc.mL-1. Verificou-se resposta imune para T. gondii nas diluições de 1:64 (24,58%), 1:128 (12,29%), 1:256 (6.64%), 1:512 (3,32%) e 1:1024 (2,32%). As ovelhas foram sororreagentes, também, para N. caninum (10,63%) na diluição de 1:50. Determinou-se que a parasitemia foi significativamente (p=0,0018) maior nas fêmeas lactantes e Haemonchus spp. foi o parasito de maior ocorrência, sendo observado em 100% dos animais parasitados. Os resultados observados permitem concluir que as infecções da glândula mamária devem ser melhor estudadas para o estabelecimento, inclusive, de parâmetros de normalidade do leite para espécie ovina. Entretanto, as enfermidades de origem parasitária destacam-se como problema sanitário na produção de ovinos leiteiros. Estudos sobre enfermidades de repercussão na produtividade de ovinos leiteiros ainda são escassos no Brasil e necessitam cada vez mais de atenção, tendo em vista o crescimento desta cadeia produtiva no país. / Sheep raising for milk production in Brazil has grown in recent years. This study aimed to evaluate the dairy sheep sanity. For this purpose, the methodology used was exploratory case study and the population selected was the largest sheep herd in milk production of the country, in the municipality of Chapecó, SC. Sanitary aspects related to milk production were evaluated by determining the occurrence of mastites and milk composition; the imunne response prevalence to Toxoplasma gondii and Neospora caninum was determined with RIFI technique, in sheep reproductive age and female lamb parasitological status of gastrointestinal parasitosis in lactating and non-lactating females was evaluated using Gordon & Whitlock test (OPG) and, using Robert & O'Sullivan technique (Coproculture). And the main parasites of occurence to the herd studied were identified. In the 24 sheep analyzed, 3 of them (12.5%) had response (3 crosses) to the California Mastitis Test in one of the teats at least once during the lactation. Although no animal has shown clinical feature, bacterial growth was detected in 24 milk samples, with predominance of coagulase negative Staphylococci. SCC from each animal was evaluated during the lactation months, which varied from 2.3x104 a 9.5x106 cells.mL-1. Acidity of 25 and 26 ⁰D, alcohol stability between 52 and 56⁰GL, SCC of 9.7x105 to 1.7x106 cél.mL-1 and bacterial counting of 2x103 to 3x103 ufc.mL-1 were determined in the mixture milk. Imunne response to T. gondii in dilutions of 1:64 (24.58%), 1:128 (12.29%), 1:256 (6,64%), 1:512 (3.32%) and 1:1024 (2.32%) was verified. The sheep were positive for N. caninum (10.63%) in dilution 1:50 too. It was determined that the parasitemia was significantly (p=0,0018) higher in lactating females and Haemonchus was the most frequent parasite being observed in 100% of infected animals. The results observed allow to conclude that mammary gland infections should be more studied to establish the normal parameters for milk sheep. However, the diseases caused by parasites stand out as a sanitary problem in the dairy sheep production. Studies about diseases with implications on dairy sheep productivity are still scarce in Brazil and increasingly need more attention, in view of the growth of this productive chain in the country.

Os antimoniais pentavalentes, tais como o Glucantime, são geralmente usados como fármacos de primeira escolha para o tratamento das leishmanioses, no entanto seu mecanismo de ação não é completamente esclarecido. Atua contra formas amastigotas intracelulares de Leishmania sp, comprometendo o potencial redox levando danos ao DNA do parasito. Alguns trabalhos sugerem que o Glucantime aumenta a capacidade fagocítica e a produção de TNF-alfa por fagócitos. O objetivo deste estudo foi avaliar a capacidade do Glucantime modular a atividade do macrófago, a principal célula hospedeira da Leishmania. Inicialmente, a toxicidade do Glucantime foi testada sobre macrófagos peritoneais de camundongos BALB/c, tratando as monocamadas in vitro por 48 horas. A viabilidade celular foi avaliada pelo método do MTT. A capacidade do Glucantime (0,1, 1 e 10 mg/ml) modular os macrófagos foi avaliada tratando as monocamadas de macrófagos peritoneais por 24 horas antes da infecção com Leishmania braziliensis. Após 48 horas de incubação com meio de cultura foi avaliado o índice de infecção por contagem. Antes e após a infecção foram analisados a produção de óxido nítrico (NO) pelo método de Griess, espécies reativas de oxigênio (EROS) por fluorimetria usando a sonda H2DCFDA e a produção de citocinas por ELISA. Para avaliar se o Glucantime seria capaz de modular macrófagos in vivo, camundongos suíços foram tratados por 5 dias consecutivos com 8 mg de Glucantime pela via intraperitoneal. Macrófagos peritôneais foram avaliados quanto a sua capacidade de controlar a infecção in vitro com L. braziliensis. Os resultados mostraram que nas concentrações até 10 mg/ml, o Glucantime não alterou a viabilidade dos macrófagos in vitro. O pré-tratamento dos macrófagos com Glucantime nas concentrações de 0.1mg/mL, 1mg/mL e 10mg/mL, foi capaz de reduzir o índice de infecção em 49%, 74% e 85%, respectivamente. Em macrófagos não infectados a produção de NO foi aumentada na concentração de 10mg/ml de Glucantime. O tratamento com 1 e 10 mg/ml de Glucantime foi capaz de aumentar significativamente a produção de EROs (p<0,05 e p<0.01, respectivamente) e a produção IL-12 (p<0,05), mas a IL-10 não foi alterada. Não houve alterações significativas desses parâmetros em relação ao controle após a infecção com L. braziliensis. Os macrófagos oriundos dos animais tratados com Glucantime foram capazes de reduzir o índice de infecção por L. braziliensis (p<0,05). Esses resultados sugerem que o Glucantime é capaz de ativar os macrófagos e esse efeito pode contribuir para o mecanismo de ação desse fármaco. / The pentavalent antimonial drugs, such as Glucantime, are generally used as first choice for the treatment of leishmaniasis, however its mechanism is not fully understood. It has activity against intracellular amastigotes of Leishmania sp, compromising the redox potential and causing damage to the DNA of the parasite. Some studies suggesting that Glucantime enhances phagocytosis and TNF-&#945; production by phagocytes. The aim of this study is to evaluate the modulation of Glucantime on macrophages, the major host cell of Leishmania. Initially, Glucantimes toxicity was tested on peritoneal macrophages from BALB/c mice, by treating the monolayers in vitro for 48 hours. Cell viability was evaluated by MTT method. The capacity of Glucantime (0,1, 1 and 10 mg/ml) of modulate macrophages was evaluated by treating the monolayers of peritoneal macrophages for 24 hours before the infection with Leishmania braziliensis. After 48 hours of incubation with culture medium the infection index was evaluated by counting. Before and after the infection were analyzed the production of nitric oxide (NO) by Griess method, reactive oxygen species (ROS) by fluorimetry using the H2DCFDA dye and cytokines by ELISA. To evaluate if Glucantime could modulate macrophages in vivo, Swiss Webster mice were treated for 5 consecutive days with 8 mg Glucantime by intraperitoneal route. Peritoneal macrophages were evaluated about its capacity of control the in vitro infection with L. braziliensis. Results showed that until the concentration of 10 mg/ml, Glucantime did not alter the macrophages viability in vitro. The pre-treatment of macrophages with Glucantime at 0.1mg/mL, 1mg/mL and 10mg/mL was able to reduce the infection index in 49%, 74% and 85%, respectively. On non-infected macrophages the NO production was increased at 10mg/ml of Glucantime. The treatment with 1 and 10 mg/ml de Glucantime was able to significantly increase the ROS production (p<0,05 and p<0.01, respectively) and IL-12 production (p<0,05), however the IL-10 production was not altered. There were no significant changes of these parameters comparing to control after the L. braziliensis infection. The macrophages from the treated mice were capable of reduce the infection index by L. braziliensis (p<0,05). These results suggest that Glucantime is capable of activate macrophages and this effect could contribute to the mechanism of action of this drug.

Orientadora: Fabiana Pilarski / Banca: Dalton José Carneiro / Banca: Maurício Laterça Martins / Resumo: Há inúmeras razões para a exploração da aquicultura mundial, principalmente no Brasil, país apontado pela FAO, como um dos poucos capazes de produzir alimentos suficientes para atender a demanda mundial nos próximos 30 anos. A piscicultura brasileira destaca-se pela produção de tilápias em tanques-rede, e este sistema foi alavancado graças ao desenvolvimento das técnicas de incubação artificial de ovos e masculinização de pós-larvas. Todavia, a masculinização pode sobrecarregar o metabolismo dos indivíduos, uma vez que, durante a fase de pós-larva, o sistema digestório destes animais ainda é imaturo. A utilização de hormônios esteroides aliado a níveis elevados de proteína, tem como consequência alterações fisiopatológicas, como o comprometimento hepático, que poderão perdurar por todo o ciclo de produção, com isso, os peixes podem tornar-se mais susceptíveis a patógenos oportunistas ou serem submetidos a tratamentos equivocados. Este trabalho propõe a utilização da homeopatia na ausência de produtos específicos e registrados para uso na aquicultura no Brasil. O medicamento foi avaliado em duas apresentações: complexo homeopático Fator Pró-digestão Inicial ® administrado na dieta de pós-larvas de tilápias-do-Nilo e o medicamento homeopático Isoterápico, gotejado na água dos peixes (2,5 gotas/minuto-1), ambos durante o ciclo inicial de produção (incluindo o período de masculinização) até 70 dias. O estudo foi realizado em uma piscicultura comercial do estado de São Paulo sendo avaliado: desempenho produtivo, sobrevivência, prevalência parasitária e realizados exames histopatológicos do fígado e brânquias das pós-larvas. A homeopatia, nas duas apresentações, melhorou a sobrevivência dos peixes, o complexo homeopático Fator Pró-digestão Inicial® e o seu veículo (sacarose) melhoraram o desempenho produtivo em relação aos grupos controle ... / Abstract: There are innumerous reasons to explore the worldwide aquaculture. Brazil has been pointed by FAO, as one of the few countries able to produce food to handle worldwide demand for the next 30 years., The aquaculture, as farming activity, is unique, and demands a vast knowledge in limnology, ictiology and ecology. Tilapia production in net-cages made a huge advance after the discovery of artificial incubation of eggs and masculinization of fingerlings. During this phase, the digestory system of fish is still immature and with the utilization of steroid hormones and high protein diets, it can overload the system, causing physiopathological alterations that will endure all the production cycle. With that, fish could be more susceptible to opportunistic agents. This way, it is desired to use products that can make fish with a higher ability to answer the challenges of farming. As a regulation therapy, homeopathy uses the natural force of the organism to reestablish the homeostasis. One of the unique application of population homeopathy is the easier to administrate, like in fish, wich is made by feed or dripping in the water. The knowledge of homeopathy is wide, and involves: physics concepts, like the ultradilution concept, drug action in non-existing molecular of the drug itself; biology concepts, approaching the dynamic of the function in organisms, as like as the interaction of life with physic-chemical environment; and medicine concept, applying the physical, mental, psychological and social welfare / Mestre