INTRODUÇÃO: Onicomicose, infecção das unhas por fungo é a mais freqüente das doenças ungueais, constituindo aproximadamente metade de todas as alterações ungueais. Pode ser causada por dermatófitos, leveduras ou fungos filamentosos não dermatófitos. OBJETIVO: Caracterizar as onicomicoses causadas por fungos filamentosos não dermatófitos. (1) Verificar, dentre as suspeitas clínicas de onicomicose, qual a freqüência da recuperação de fungos,(2) Verificar, dentre as suspeitas clínicas de onicomicose, quais as espécies de fungos recuperadas, (3) Verificar, dentre o total das espécies identificadas, qual a freqüência das espécies de fungos filamentosos não dermatófitos. MÉTODOS: Duzentos e cinco indivíduos com suspeita clínica de onicomicose foram estudados no período de dezembro de 2003 a novembro de 2004, por meio de exames micológicos diretos e cultura para fungos. RESULTADOS: O diagnóstico de onicomicose foi estabelecido, pelo exame micológico direto, em 170 indivíduos. O diagnóstico etiológico foi estabelecido pela cultura para fungos. Dentre os 107 agentes identificados, os dermatófitos foram identificados em 78,52% (N=84), as leveduras em 13,08% (N=14) e os FFND em 8,40% (N=9) das vezes. CONCLUSÃO: É necessário que se estabeleça o diagnóstico etiológico dos casos de onicomicoses, já que os fungos filamentosos não dermatófitos ocorrem com freqüência considerável e são indistinguíveis daquelas por dermatófitos. / INTRODUCTION: Onychomycosis, a nail fungus infection is the most frequent nail disease, constituting about half of all nail disorder. It can be caused by dermatophytes, yeasts and non- dermatophytes filamentous fungi. OBJECTIVE: Characterize the onychomycosis caused by filamentous fungi non- dermatophytes. (1) Verify after a clinical suspicion of onychomycosis, which are the frequency of fungi recovery, (2) examine, after a clinical suspicion of onychomycosis, which species of fungi are recovered, (3) Checking, among the total of identified species , which are the frequency of the species of filamentous fungi not dermatophytes. METHODS: Two hundred and five patients with clinical suspicion of onychomycosis were studied in the period from December 2003 to November 2004, through direct mycological examination and culture for fungus. RESULTS: The diagnosis of onychomycosis has been established by direct mycological examination, in 170 individuals. The etiological diagnosis was established by the culture for fungus. Among the 107 persons identified, the dermatophytes were recovered in 78.52% (N = 84), the yeast in 13.08% (N = 14) and filamentous fungi non- dermatophytes in 8,40% (N = 9). CONCLUSION: It is necessary to establish the etiological diagnosis of the cases of onychomycosis, as filamentous fungi non- dermatophytes occur often than ever considered and are its clinic features are indistinguishable from those of the dermatophytes.

Foram estudadas as características morfológicas, fisiológicas e patogênicas de frutos de abacate, banana, mamão, manga e morango. Com base nas dimensões apresentadas pelos conídios, pode-se estabelecer que apesar das variações exibidas pelo diferentes isolados do fungo, o comprimento e a largura dos mesmos esteve dentro dos limites fixados por ARX (1957), para a espécie Colletotrichum gloeosporioides . Quanto aos apressórios, estes também apresentaram variações de tamanho e formato, sendo que isolados de abacate, banana, mamão e manga tiveram apressórios de formatos diferentes dos de morango os que foram notadamente esféricos. Quanto às características fisiológicas , todos os isolados do fungo demonstraram ser auxoautotróficos. Por outro lado, isolados provenientes de frutos de morango e manga foram os 6nicos insensíveis in vitro a concentrações de 100ppm de Benomyl. Através dos testes de patogenicidade realizados tanto em discos de folhas, como em frutos verdes, ficou comprovado que nas inoculações cruzadas todos os isolados testados foram mais patogênicos, quando inoculados em seus hospedeiros congeniais / Morphological, physiological and pathogenic characteristics of fifteen isolates of Colletotrichum from fruits of avocado, banana, papaya, mango and strawberry were studied. Based on the dimensions presented by the conidia it was possible to establish that in spite of the variations exhibit by the differents isolates of fungi, the length and width were within the limits fixed by ARX (1957) for Colletotrichum gloeosporioides species. As to the appressoria, these also presented variations of size and shape, being the avocado, banana, papaya and mango different in shape in relation to strawberry isolates which had notoriously spherical shape. Practically all conidia of the different isolates of Colletotrichum spp. observed had one nucleus. Concerning the physiological characteristics all the isolates demonstrated to be auxoautotrophics. On the other hand, isolates from mango and strawberry fruits, were the only insensible ones in vitro at concentrations of 100 ppm of Benomyl. Through the pathogenicity tests done in disk of leaves and also in green fruits, it was proved that in the cross inoculations, all isolates tested were more pathogenic when inoculated in their congenial hosts

Foram feitas comparações morfológicas, patogénicas, serológicas e eletroforéticas, de isolados de Exserohilum turcicum (Pass.) Leonard & Suggs. de diferentes hospedeiros (milho, sorgo e capim). Morfologicamente, os conídios dos isolados de capim apresentaram-se significativamente maiores do que os dos isolados de milho e sorgo em relação aos diâmetros. Testes de patogenicidade em milho, sorgo e capim massambará, mostraram que: isolado de milho dos Estados Unidos com lesão somente no milho, pode ser classificado como Exserohilum turcicum f.sp. zeae; e que isolados de sorgo, virulentos ao milho, sorgo e capim massambará podem ser classificados como Exserohilum turcicum f.sp. complexa; entretanto isolados de milho do Brasil, patogênicos ao milho e ao sorgo; e isolados de capim virulentos ao capim, fracamente virulentos ao milho e avirulentos ao sorgo não podem ser enquadrados em nenhuma formae speciales descritas. Os testes de dupla-difusão em ágar de antígenos extraídos de conídios e\ou micélios não conseguiram detectar qualquer distinção serológica entre os isolados. No teste de ELISA o antissoro do isolado de milho distinguiu os isolados de milho e sorgo dos isolados de capim. O antissoro do isolado de capim distinguiu isolados de capim dos de milho e sorgo, sendo que aparentemente os de sorgo apresentaram-se como intermediários. Análises eletroforéticas isoenzimáticas envolvendo esterase e peroxidase permitiram diferenciar os isolados entretanto, somente foi possível associar os resultados de serologia com a eletroforese-esterase. Através da extração do DNA, digestão com enzima de restrição HpaI e análise eletroforética com coloração por prata, foi possível observar que o tamanho dos DNAs de todos os isolados foram iguais. Os resultados sugerem que testes serológicos e eletroforéticos podem auxiliar no estudo taxonômico para análise de variação inter-específica (ou inter-forma especial). / Morphological, pathogenic, serological and electrophoretic comparisons were made among isolates of Exserohilum turcicum (Pass.) Leonard & Suggs. from maize, sorghum and Johnson grass. Concerning morphology, it was observed that diameters of conidia of Johnson grass isolates were significantly larger than those of maize and sorghum. In laboratory and greenhouse conditions, plants from maize, sorghum and Johnson grass inoculated with isolates of Exserohilum turcicum showed: isolate of maize from the United States produced lesions only in maize stating that this isolate can be considered as Exserohilum turcicum f. sp. zeae; isolates of sorghum were virulent to sorghum, maize and Johnson grass stating that these isolates can be considered as Exserohilum turcicum f. sp. complexa; iso1ates of maize from Brazil were pathogenic to maize and sorghum; isolates of Johnson grass were virulent only to Johnson grass, inducing flecks to maize and a virulent to sorghum. These observations concerning isolates of maize from Brazil and of Johnson grass suggest that they can not be treated of formae speciales. Serological reactions in agar double diffusion tests with antigens extracted from conidia and mycelium did not distinguish any isolate from the others. In the DAS-ELISA test it was observed that antiserum produced against isolates of maize distinguished isolates of maize and of sorghum from isolates of grass. The antiserum produced against isolates of Johnson grass distinguished isolates of Johnson grass from isolates of maize and sorghum, and revealed that apparentely isolates of sorghum are intermediaries. Electrophoretic analysis with the isoenzimatic variation (peroxidase and esterase) differentiated the isolates however only the results from electrophoretic-esterase could an be associated with serological results. DNA extraction, digestion with HpaI enzyme, electrophoretic analyses and silver coloration demonstrated that the sizes of DNA from all isolates are the same. The results suggest that serological and electrophoretic tests can help the taxonomic studies in the analyse of inter-specific (or inter-formae speciales> variations.

A leptospirose é uma doença sistêmica, causada por bactérias patogênicas do gênero Leptospira. O desenvolvimento de novas estratégias para prevenir a doença é necessário. Vacinas surgem como fortes candidatas para contornar o problema. As pesquisas atuais têm interesse em identificar antígenos conservados que estão envolvidos nas interações patógeno-hospedeiro.O presente projeto selecionou três proteínas hipotéticas de L. interrogans para serem caracterizadas quanto ao seu papel na patogênese e avaliadas quanto ao seu potencial protetor. Os genes foram amplificados por PCR e clonados no vetor de expressão PAE. As proteínas recombinantes foram purificadas por cromatografia de afinidade e foram reconhecidas por soro de indivíduos infectados. As proteínas LIC13479 e LIC10050 foram capazes de se ligar a laminina, plasminogênio e fibronectina plasmática. Em relação à LIC10537, dois fragmentos recombinantes foram gerados. Apenas o fragmento 2 foi capaz de interagir com PLG. As proteínas que interagiram com o PLG foram capazes de gerar plasmina As proteínas foram capazes de estimular uma resposta imune e LIC13479 e LIC10050 exerceram proteção parcial no modelo de leptospirose em hamsters. / Leptospirosis is a systemic disease caused by pathogenic bacteria of genus Leptospira. The development of new strategies to prevent the disease is needed. Vaccines emerge as strong candidates to fight the problem.Currently research has focused to identify conserved antigens This project selected three hypothetical proteins of L. interrogans. Thesecoding sequences were characterized for their possible role in pathogenesis and their potential to protect animals against challenge with virulent leptospires. Genes were amplified by PCR and cloned into the expression vector pAE. The recombinant proteins were purified by metal affinity chromatography and were recognized by confirmed human leptospirosis serum samples.LIC13479 and LIC10050 proteins were able to bind with laminin, plasminogen and plasma fibronectin. The coding sequence LIC10537 was cloned in two fragments. Fragment 2was able to interact with plasminogen. All proteins were able to generate active plasmin. The recombinant proteins were able of inducing an immune response. Evaluation of immunoprotection in leptospirosis hamster model followed by challenge with virulent bacteria showed that the recombinant proteins conferred partial protection.

Cryptococcus neoformans e C. gattii são as principais espécies do gênero que causam infecção no homem, C. albidus e C. laurentii são espécies menos envolvidas. O presente trabalho teve por objetivos avaliar a patogenicidade in vivo, os fatores e os genes relacionados à virulência, e verificar o perfil de suscetibilidade ao fluconazol de 10 isolados ambientais de cada uma das espécies: C. neoformans, C. albidus e C. laurentii, antes e após a inoculação em camundongos BALB/c imunocompetentes; pesquisar os sorotipos, mating types e realizar a tipagem molecular. Proteinase, fosfolipase, urease, produção de melanina e crescimento à 37ºC foram pesquisados utilizando metodologias clássicas, e a pesquisa dos genes e determinação dos sorotipos e mating types foram feitas por PCR. A tipagem molecular foi realizada por PCR-fingerprinting, com os iniciadores (GACA)4 e M13. A determinação da CIM do fluconazol foi realizada pelo método da microdiluição em caldo. Todos os isolados de C. neoformans foram sorotipos A e MAT-alfa. A inoculação em animais mostrou que 9 isolados de C. neoformans mataram 100% deles em até 33 dias, e 1 levou os animais à morte num período entre 40 e 82 dias; 9 isolados foram recuperados dos pulmões e cérebro dos animais em 7 e 14 dias, e um deles levou todos os animais à morte em 12 dias, sendo possível recuperá-lo somente no 7º dia. Os animais inoculados com C. albidus e C. laurentii permaneceram vivos até negativação das culturas dos órgãos avaliados. C. albidus foi isolado principalmente do fígado e dos pulmões até 10 dias após a inoculação, C. laurentii dos pulmões e do cérebro até 120 dias. Todos os isolados das 3 espécies produziram cápsula antes e após a inoculação. Todos C. neoformans, 6 C. albidus e 6 C. laurentii cresceram à 37ºC antes e depois da inoculação. Melanina foi produzida por todos os isolados de C. neoformans e nenhum C. albidus nas duas ocasiões; e por 6 e 9 isolados de C. laurentii, antes e depois da inoculação, respectivamente. Seis isolados de C. neoformans e 1 de C. laurentii produziram proteinase nas duas ocasiões. Sete isolados de C. albidus produziram proteinase antes e todos depois da inoculação. Fosfolipase foi produzida por todos C. neoformans e C. albidus, e por 6 C. laurentii nas duas ocasiões. A avaliação da atividade da urease realizada em meio líquido foi positiva em 24 a 48 horas pelos isolados de C. neoformans e C. laurentii, e em 24 a 96 horas por C. albidus. A CIM de fluconazol variou de 2 a 8 ug/mL para C. neoformans, de 8 a >= 64 ug/mL para C. albidus, e de 1 a 64 ug/mL para C. laurentii, nas duas ocasiões. Todos os isolados de C. neoformans apresentaram os genes lacase (Lac1), fosfolipase (PLB1), proteinase (cnap1), calcineurina (CNA1), urease (URE1), e ERG11, com os oligonucleotídeos utilizados. A PCR com ERG11 mostrou uma banda no gel de agarose para todos C. albidus, porém nenhum dos outros genes pesquisados foram amplificados em C. albidus e C. laurentii. A tipagem molecular por PCR-fingerprinting dos isolados de C. neoformans revelou 2 tipos moleculares: VNI (7 isolados) e VNII (3 isolados). A maioria dos isolados de C. albidus apresentou homogeneidade nos padrões de bandas gerados, e C. laurentii foi a espécie que demonstrou maior diversidade genética por esta metodologia. Concluímos que a passagem dos isolados pelos animais não alterou os fenótipos estudados e nenhuma alteração foi detectada pela análise molecular. No entanto, verificamos a grande heterogeneidade molecular dos isolados de C. laurentii estudados. / Species of Cryptococcus neoformans and C. gattii are the main ones in the genus causing infection in man while C. albidus and C. laurentii are less involved. This study evaluated the in vivo pathogenicity, factors and genes related to virulence and the susceptibility to fluconazole before and after inoculation in immunocompetent BALB/c mice of ten environmental isolates of C. neoformans, C. albidus and C. laurentii. Serotypes, mating types and molecular typing were also determined to complete the evaluation. Enzymes like proteinases, phospholipase, urease, production of melanin and growth at 37oC were investigated by classical methods, but gene characterization and determination of serotypes and mating types were investigated by PCR. Molecular typing was done by PCR-fingerprinting with primers (GACA)4 and M13. The microdilution method was used to determine the minimum inhibitory concentration (MIC) of flucozanole. All C. neoformans isolates were serotype A and MAT-alfa and 9 of them when inoculated in animals killed 100% in up to 33 days. One isolate inoculated killed the animals in 40 to 82 days. Nine isolates were recovered from the animal lungs and brain in 7 and 14 days and the one which killed all animals in 12 days was only recovered on the 7th day. Animals inoculated with C. albidus and C. laurentii were alive until the tissue cultures of evaluated organs were negative. C. albidus was isolated mainly from the liver and lungs in up to 10 days after inoculation and strains of C. laurentii from the lungs and brain in up to 120 days. All isolates in the 3 species were capsule producers before and after inoculation. All strains of C. neoformans, 6 C. albidus and 6 C. laurentii grew at 37oC both before and after inoculation. All C. neoformans produced melanin and 6 C. laurentii produced it before inoculation and nine after. None was produced by C. albidus. Six isolates of C. neoformans and one of C. laurentii produced proteinases in both situations, before and after inoculation. Seven C. albidus isolates produced the protein hydrolyzing enzyme before inoculation and all after. Phospholipase enzyme was produced by all C. neoformans, and C. albidus and by 6 C. laurentii in both conditions, before and after inoculation. Urease activity was detected between 24 and 48 hours after incubation in a liquid medium for C. neoformans and C. laurentii cultures and after 24 to 96 hours for C. albidus. Fluconazole MICs ranged from 2 to 8 ug/ mL for C. neoformans isolates, from 8 to >= 64 ug/mL for C. albidus and from 1 to 64 ug/mL for C. laurentii in both conditions. Genes laccase (Lac1), phopholipase (PLB1) proteinase (cnap1), calcineurine (CNA1), urease (URE1) and ERG11, detected with the primers used were present in all C. neoformans. With exception of ERG11, which showed a band in agarose electrophoresis by all C. albidus, the other genes were not amplified in C. albidus and C. laurentii. Molecular typing by PCR-fingerprinting showed two molecular types in C. neoformans: VNI in 7 isolates and VNII in 3 isolates. Most C. albidus showed homogenous patterns in the bands generated and C. laurentii was the species with the higher genetic diversity by this methodology. It is concluded that isolate inoculations in animals does not alter phenotypes and no alteration is detected by molecular analysis. However, the high molecular heterogeneity of C. laurentii was detected.

O isolamento do vírus da raiva (genótipo 1) a partir de morcegos não hematófagos está se tornando cada vez mais freqüente nas grandes cidades do Brasil. Este trabalho foi delineado para investigar a patogenicidade de um isolado do vírus da raiva, do morcego insetívoro Lassiurus ega, procedente do município de Presidente Prudente SP, em comparação ao vírus fixo da raiva, amostra CVS/32 (Challenge Vírus Standard). Os vírus foram reativados por meio de inoculação intracerebral em camundongos e os experimentos de patogenicidade foram realizados em camundongos e hamsters, desafiando-os pelas vias intramuscular (IM), intradérmica (ID), intranasal (IN) e abrasão superficial da pele (AP). A presença do vírus nos cérebros de animais que haviam manifestado sinais compatíveis à raiva, foi confirmada mediante a prova de imunofluorescência direta. Foram considerados para a avaliação da patogenicidade o quadro clínico, proporção de mortos, e a duração dos períodos de incubação (PI) e clínicos (PC) em dias. Em hamsters, o isolado de L. ega exibiu um quadro furioso, com proporção total de mortos de 2.60%; assim discriminada: 2.08% IM (PI: 11 dias; PC: 6 dias) e 8.33% IN (PI:10.66 ± 1.15 e PC: 7.33 ± 1.54). A presença do vírus no SNC foi detectada apenas em animais inoculados por essas vias. Por outro lado, o vírus CVS produziu um quadro paralítico com mortalidade total de 39.84%, com a seguinte distribuição: 62.50% IM (PI 7.50 ± 2.33; PC: 5.13 ± 1.89) 78.12% ID (PI 9.13 ± 2.23; PC 3.88 ± 2.23) 18.75% IN (PI 12.00 ± 2.77; PC 7.14 ± 2.54). Em camundongos, o isolado do L. ega manifestou sinais de agressividade e a raiva foi confirmada em animais inoculados IM e IN. A proporção de mortos observados em camundongos foi de 50.00% (PI 16.80 ± 2.20; PC 1.4 ± 0.54) e 30% (PI 14 ± 4.35; PC: 2.66 ± 0.57) respectivamente e o vírus CVS produziu mortalidade de 45.00% (PI: 6.30 ± 0.67; PC: 1.5 ± 0.70), 70% (PI: 7.14 ± 1.34; PC 2.28 ± 1.25) e 30% (PI:10.00; PC:1) pelas vias mencionadas acima, com quadro clínico de paralisia. O isolado de L. ega mostrou diferenças na proporção de mortos e quadro clínico furioso quando comparado com o CVS nos dois modelos animais. Os resultados sugerem que o contato com os morcegos insetívoros infectados pelo vírus da raiva representa um risco de transmissão da doença, por meio de ferimentos superficiais da pele provocadas pelas mordeduras ou ainda pela via respiratória, supostamente por meio de aerossóis. Pelo sequenciamento completo da proteína G viral do isolado do L. ega, foram observadas substituições na seqüência de aminoácidos nos sítios antigênicos AI, AII, assim como no domínio de fusão dependente de baixo pH. Os resultados obtidos, sugerem que as diferenças no comportamento biológico podem estar associadas às substituições encontradas na sequencia de aminoácidos da proteína G. / The isolation of rabies virus (genotype 1) from the non-hematophagous bats is becoming frequent in heavy urbanized areas in Brazil. This work intended to investigate the pathogenicity of a Brazilian rabies virus isolate from the insectivorous bat Lassiurus ega, from PresidentePrudente-SP, comparing with the CVS/32 (Challenge Virus Standard) fixed rabies virus strain. The viruses were reactivated through intracerebral inoculation into mice and the pathogenicity experiments were made in hamsters and mice, challenged by intramuscular (IM), intradermal (ID) and intranasal (IN) routes and by superficial abrasion of skin. The presence of virus in the brain of animals manifesting the signs compatible with rabies was confirmed by the direct immunofluorescence test. For the evaluation of the pathogenicity, the clinical manifestations, incubation (IP) and clinical (CP) periods in days and the mortality were considered. In hamsters, the isolate of L. ega exhibited a furious form of rabies with total mortality rate of 2.60%, with following distribution: 2.08% IM (IP: 11 days; CP: 6 days) and 8.33% IN (IP: 10.66 ± 1.15 and PC: 7.33 ± 1.54). The presence of rabies virus in the CNS was detected only in animals inoculated through IM and IN routes. The CVS strain has provoked paralytic disease with a total mortality rate of 39.84% as the follow: 62.50% IM (IP 7.50 ± 2.33; CP: 5.13 ± 1.89), 78.12% ID (IP 9.13 ± 2.23; CP 3.88 ± 2.23) and 18.75% IN (IP 12.00 ± 2.77; CP 7.14 ± 2.54). In mice, the isolate of L. ega manifested signs of aggressiveness and rabies was confirmed in animals that were inoculated intramuscularly and intranasally. The total mortality rate observed in mice was 20%, by the IM route was 50% (IP 16.80 ± 2.20; CP 1.4 ± 0.54) and 30% by the intranasal route (IP 14.00 ± 4.35; CP: 2.66 ± 0.57) respectively. The CVS strain showed a total mortality rate of 45.00% and by the IM route, 100% (PI: 6.30 ± 0.67; CP: 1.5 ± 0.70), by the ID route, 70% (IP: 7.14 ± 1.34; CP 2.28 ± 1.25) and by IN, 30% (IP: 10, 00; C: 1.00) showing signs of paralysis. Compared to the CVS strain, the isolate of L. ega showed difference in mortality rate and signs of aggressiveness were found both in hamster and mouse model. The results suggest that the contact with the insectivorous bats infected with rabies virus would represent a risk of disease transmission, by means of superficial wounds of the skin inflicted by bites or by inhalation of aerosols. By the complete sequencing of the viral G protein of the isolate of L. ega, sequencings of amino acids substitutions were observed at antigenic sites AI, AII, as well as the in domain of fusion dependent on low pH. According to the results, differences in the biological behavior may be associated to the substitutions found in the amino acids sequence of the G protein.

Xylella fastidiosa é o agente etiológico de diversas doenças em plantas, incluindo a Clorose Variegada dos Citros (CVC), uma séria ameaça à indústria citrícola. Os níveis de transcritos sob diferentes disponibilidades de ferro foram medidos com microarranjos de DNA representando 2608 (91,6%) sequências codificadoras (CDS) da cepa 9a5c de X. fastidiosa. Na presença de 100 uM pirofosfato férrico, 218 e 256 CDS foram consideradas como reguladas positiva e negativamente, respectivamente. Quando tratada com o quelante de ferro 2,2\'-dipiridil, 193 CDS foram consideradas como reguladas positivamente e 216 negativamente. A expressão diferencial de um subconjunto de 44 CDS foi também avaliada por RT-qPCR, que mostrou uma correlação de Pearson de 0,77 com os resultados dos microarranjos. As CDS diferencialmente expressas nas variações de concentração de ferro participam em diversas funções celulares. Muitas CDS envolvidas com funções regulatórias, patogenicidade e estrutura celular foram moduladas em ambas as condições testadas, sugerindo que grandes mudanças na arquitetura celular e metabolismo ocorrem quando células de X. fastidiosa são expostas a variações extremas na concentração de ferro. Interessantemente, as CDS moduladas incluem as de síntese e secreção de bacteriocinas similares à colicina tipo V e funções ligadas a formação de pilus e fímbria. Nós também investigamos a contribuição do regulador transcricional Fur no stimulon do ferro em X. fastidiosa. Para tal, as regiões promotoras do genoma da cepa 9a5c foram varridas em busca de Fur boxes putativas. Nossas análises identificaram que regiões promotoras de 49 CDS contem elementos com características de Fur boxes. A funcionalidade de pelo menos uma das Fur boxes identificadas foi confirmada através de ensaios de alteração de mobilidade eletroforética que demonstraram sua interação específica com a proteína recombinante Fur de X. fastidiosa. Entretanto, nem todos os genes cuja expressão é modulada por alterações na concentração de ferro, são diretamente regulados por Fur, apoiando a hipótese de que Fur não é o único responsável pela modulação do stimulon de ferro em X. fastidiosa. Em conjunto, nossos dados apresentam novas evidências da relação entre a disponibilidade de ferro e a regulação de determinantes de patogenicidade e virulência em X. fastidiosa. / Xylella fastidiosa is the etiologic agent of a wide range of plant diseases including citrus variegated chlorosis (CVC), a major threat to citrus industry. Transcript levels in different iron availabilities were assessed with DNA microarrays representing 2608 (91.6%) coding sequences (CDS) of X. fastidiosa CVC strain 9a5c. In the presence of 100 uM of ferric pyrophosphate, 218 and 256 CDS were considered as up- and down-regulated, respectively. When treated with the iron chelator 2,2\'-dipyridyl, 193 CDS were considered as up-regulated and 216 as down-regulated. Differential expression for a subset of 44 CDS was further evaluated by RT-qPCR that showed a Pearson correlation of 0.77 with array results. The CDS differentially expressed upon the iron concentration shift participate in diverse cellular functions. Many CDS involved with regulatory functions, pathogenicity and cell structure, were modulated in both conditions tested suggesting that major changes in cell architecture and metabolism occur when X. fastidiosa cells are exposed to extreme variations in iron concentration. Interestingly, the modulated CDS include those related to colicin V-like bacteriocin synthesis and secretion and to pili/fimbriae functions. We also investigated the contribution of the ferric uptake regulator Fur to the iron stimulon of X. fastidiosa. Thus, the promoter regions of strain 9a5c genome were screened for putative Fur boxes. Our analyses identified Fur boxes-like elements in promoter regions of 49 CDS. The functionality of at least one Fur box was confirmed by electrophoretic mobility shift assays which demonstrated its interaction with X. fastidiosa recombinant Fur. However, not all genes that appeared to be modulated by iron concentration shift are directly regulated by Fur. This supports the hypothesis that Fur is not solely responsible for the modulation of the iron stimulon of X. fastidiosa. Taken together, our data present novel evidence for iron regulation of pathogenicity and virulence determinants in X. fastidiosa.

As bactérias patogênicas do gênero Leptospira são o agente causador da leptospirose, uma doença de importância global. As leptospiras patogênicas causam infecção em um amplo espectro de animais e no homem. As leptospiras podem invadir o corpo humano através de abrasões na pele e mucosa. A invasividade bacteriana depende de várias etapas, tais como: aderência, invasão e disseminação através dos tecidos do hospedeiro. Recentemente, nosso grupo identificou proteínas de membrana externa que atuam como adesinas de leptospira e/ou receptores de componentes do plasma hospedeiro, o que poderia contribuir para a patogenicidade bacteriana. Assim, o presente projeto tem como objetivo avaliar as propriedades funcionais do gene LIC10920, identificado na sequência genômica de Leptospira interrogans sorovar Copenhageni, como uma proteína hipotética, predita de membrana externa. A sequência LIC10920 foi amplificada por PCR e clonada no vetor de expressão pAE. O plasmídeo pAE contendo o inserto foi introduzido em estirpes de E. coli para a expressão da proteína. A proteína recombinante rLIC10920 foi purificada por cromatografia de afinidade a níquel e sua integridade estrutural foi avaliada pela técnica de dicroísmo circular. Camundongos foram imunizados com a LIC10920 para a avaliação da sua imunogenicidade. A presença de IgG humano contra LIC10920, foi avaliada por ELISA, em amostras de soro de pacientes com leptospirose. Assim, como a sua ligação com componentes da matriz extracelular e plasma do hospedeiro. Animais imunizados apresentaram alto título de anticorpos contra LIC10920. Além disso, a proteína foi reconhecida por anticorpos presente em amostras de soro humano infectado. A proteína foi capaz de interagir com plasminogênio e laminina de maneira dose-dependente e saturável. Em ambas as interações, a participação das regiões imunogênicas se mostrou importante. rLIC10920 foi capaz de capturar o plasminogênio direto do soro humano também de maneira dose-dependente. Por fim, foi observado que o plasminogênio ligado a rLIC10920 pode ser convertido em plasmina. A proteína em estudo é expressa durante a infecção e podemos atribuir a função de adesina, com papel na patogênese da bactéria. / Pathogenic bacteria of genus Leptospira are the causative agent of leptospirosis, a disease of global importance. Pathogenic leptospires cause infection in a broad spectrum of animals and humans. Pathogenic leptospires can efficiently invade the human body through skin and mucosa and promptly spread into blood vessels, reaching target organs. Bacterial invasiveness depends on several steps, such as adherence, invasion and throughout host tissues. Recently, our group has identified outer membrane proteins that act as leptospiral adhesins and/or receptors of host plasma components, which could contribute for bacterial pathogenesis. This project aims to evaluate the functional properties of the gene LIC10920, identified in the genome sequence of Leptospira interrogans serovar Copenhageni, as a predicted outer membrane protein of unknown function. The LIC10920 sequence was amplified by PCR, cloned into the expression vector pAE. Plasmids containing cloned DNA were introduced in E. coli strains for protein expression. The recombinant protein was purified by the metal affinity chromatography and its structural integrity was assessed by circular dichroism spectroscopy. Mice were subcutaneously immunized with LIC10920 for immunogenicity evaluation. The presence of IgG against LIC10920 in confirmed leptospirosis human serum samples was evaluated by ELISA. Binding of protein with extracellular matrix or plasma components was also assessed. Sera from immunized animals show that the rLIC10920 protein is capable to stimulate antibody immune response in mice. In addition, the protein is recognized by antibodies in leptospirosis human serum samples. The recombinant protein was capable of binding plasminogen and laminin. Dose-dependent and saturable binding was observed when increasing concentrations of the rLIC10920 were allowed adhere to a fixed concentration of plasminogen or of laminin, fulfilling the receptor-ligand interactions. In both cases, the participation of the immunogenic regions occurs, but in the case of laminin, the dependence is greater with structured epitopes. It has been shown that plasminogen linked to rLIC10920 can be converted to plasmin in the presence of activator. The recombinant protein was able to capture the plasminogen directly from normal human serum in a dose-dependent manner, suggesting the involvement of native protein in host-pathogen interactions. The protein under study is expressed during the infection and due to its capacity of interaction with host components, we may anticipate its role in leptospiral pathogenesis.

Escherichia coli enteropatogênica atípica (aEPEC) é considerada um dos principais agentes etiológicos da diarreia em várias regiões do mundo. O mecanismo central da patogenicidade de aEPEC é a capacidade de causar lesões attaching-effacing (A/E) no epitélio intestinal, uma propriedade desencadeada por proteínas codificadas pelo locus of enterocyte effacement (LEE). Enquanto algumas aEPEC utilizam a via de fosforilação de Tir (Y-P) para induzir a formação de pedestais, outras cepas podem empregar a proteína efetora EspFU (TccP/TccP2) para uma eficiente polimerização de actina. Neste estudo foi avaliada a prevalência e produção de EspFU, como também o papel desempenhado por esta proteína na interação com células epiteliais e colonização intestinal, aspectos essenciais da patogênese de aEPEC. O gene espFU foi detectado em 46% das cepas de aEPEC, com uma predominância do alelo tccP2. A maioria das cepas apresentou o tir fosforilado (Y-P), sugerindo que possam utilizar diferentes mecanismos redundantes para a polimerização de actina. As cepas positivas para tccP e tccP2 foram significativamente associadas com os filogrupos E, e B1, respectivamente. A produção de EspFU (TccP/TccP2) variou de cepa-a-cepa, independentemente dos genótipos e filogrupos. A deleção do gene espFU em uma cepa de aEPEC O55:H7 (BA320) resultou em menor aderência bacteriana e comprometeu a capacidade de induzir polimerização de actina em células HeLa após 6 h de infecção. Adicionalmente, o mutante em espFU apresentou uma menor eficiência na colonização intestinal em um modelo murino de infecção. A análise da cinética da formação de pedestais por aEPEC mostrou que, de modo geral, cepas expressando EspFU foram mais aderentes e induziram polimerização de actina mais rapidamente em comparação à via de TirY-P. A adesão bacteriana e formação de pedestais mediada por EspFU regulou negativamente a expressão de LEE, além de modular a resposta transcricional epitelial por meio da ativação de genes pró-inflamatórios, como NF-kB, IL-6, IL-8, entre outros. Em suma, a proteína EspFU é ampla e filogeneticamente distribuída em cepas de aEPEC, desempenha um importante papel na adesão bacteriana e colonização intestinal, e pode contribuir direta ou indiretamente para a indução de resposta inflamatória. / Atypical enteropathogenic Escherichia coli (aEPEC) is one of the most important pathogen causing diarrhea disease worldwide. The hallmark of aEPEC pathogenesis is the ability to cause attaching and effacing (A/E) lesions on intestinal epithelium, a property triggered by proteins encoded on a pathogenicity island called locus of enterocyte effacement (LEE). While some aEPEC require tyrosine phosphorylation (Y-P) of Tir to trigger actin assembling, certain strains whose Tir is not tyrosine phosphorylated utilize the T3SS effector Tir-cytoskeleton coupling protein (TccP/TccP2) for efficient actin polymerization. In the present study, we evaluated the prevalence, production, and functions played by the EspFU protein on important aspects of aEPEC pathogenesis, such as interaction with epithelial cells and intestinal colonization. The tccP and/or tccP2 genes were detected in 45.8% of the aEPEC strains, with a predominance of tccP2 allele. Most of these strains carried tirY-P, suggesting that can trigger actin polymerization using both Tir tyrosine phosphorylation and TccP/TccP2 pathways. aEPEC strains carrying tccP or tccP2 were significantly associated to phylogroups E and B1, respectively. We also observed a differential production of TccP/TccP2 among the strains, regardless genotypes and phylogeny. Deletion of espFU from aEPEC BA320 (serotype O55:H7) significantly decreased bacterial adherence and impaired the ability to induce actin rearrangement in HeLa cells after 6 h of infection. Also, the espFU mutant showed lower colonization levels compared to the wild-type strain in a murine infection model. Analysis of the kinetics of pedestal formation showed EspFU-expressing strains were more adherent and induced actin rearrangement more rapidly than Tir-phosphorylated (TirY-P) producing aEPEC. Importantly, bacterial adherence and pedestal formation driven by EspFU downregulated the LEE expression, and also induced changes in the epithelial transcriptional response, specifically by activating pro-inflammatory genes such as NKFB, IL6 and IL8. In summary, our data suggest that EspFU protein is widely and phylogenetically distributed among aEPEC strains, and play an important role on bacterial attachment and intestinal colonization. Moreover, aEPEC could induce inflammation in a EspFU-dependent manner.

Leptospirose é uma zoonose mundial que causa grandes prejuízos econômicos e sociais. Os mecanismos de patogenicidade da leptospira ainda não estão totalmente elucidados. Nesse trabalho foi avaliado o papel de três proteínas hipotéticas de superfície na patogenia da leptospirose: LIC11009, LIC11360 e LIC11975. Os genes foram clonados a partir do DNA da L. interrogans sorovar Copenhageni e as proteínas recombinantes foram purificadas por cromatografia de afinidade. RT-qPCR mostrou a transcrição dos genes em leptospiras. As proteínas recombinantes reagiram com soro de humanos diagnosticados com leptospirose. rLIC11009 induziu somente resposta imune Th1 em camundongos, enquanto que rLIC11360 e rLIC11975 induziram resposta Th1 e Th2. As três proteínas recombinantes se ligaram à laminina e plasminogênio, enquanto rLIC11360 e rLIC11975 também se ligaram à fibronectina plasmática e fibrinogênio. Em adição, rLIC11360 se ligou ainda aos reguladores do sistema complemento fator H e C4BP. Os resultados sugerem que as proteínas estudadas podem auxiliar a leptospira a evadir e invadir o hospedeiro. / Leptospirosis is a worldwide zoonosis that causes great economic and social losses. The pathogenic mechanisms of leptospira are not yet fully elucidated. In this study we evaluated the role of three hypothetical surface proteins in the leptospiral pathogenesis: LIC11009, LIC11360 and LIC11975. Genes were cloned from DNA of L. interrogans serovar Copenhageni and the recombinant proteins were purified by affinity chromatography. RT - qPCR data have shown that the genes are fully transcribed in leptospires. Recombinant proteins reacted with sera from humans diagnosed with leptospirosis. rLIC11009 induced Th1 immune response in mice, whereas rLIC11360 and rLIC11975 promoted both Th1 and Th2. The three recombinant proteins interacted with laminin and plasminogen while, rLIC11360 and rLIC11975, also interacted with plasma fibronectin and fibrinogen. In addition, rLIC11360 interacted with the complement regulators factor H and C4BP. These results suggest that the proteins tested can help leptospires to evade and invade the host.