Orientador: Cristiano Gallina Moreira / Banca: Waldir Pereira Elias Nunes / Banca: Carla Raquel Fontana Mendonça / Resumo: A sinalização química é o mecanismo através do qual bactérias patogênicas interagem com o hospedeiro e sua microbiota, de modo a promover a regulação dos seus mecanismos de virulência. O estudo da sinalização química, em bactérias entéricas, do sistema de 2-componentes QseBC via autoindutor-3 (AI-3), epinefrina (Epi) e norepinefrina (NE), tem aberto perspectivas para desvendar novos mecanismos. Escherichia coli O104:H4 possui características fenotípicas clássicas de E. coli enteroagregativa (EAEC) e se apresenta positiva para toxina de Shiga, encontrada em cepas de E. coli enterohemorrágica (EHEC). A presença dessa toxina pode levar o hospedeiro ao desenvolvimento de complicações mais graves, como a síndrome hemolítica urêmica (SHU). Dessa forma, essa combinação se torna altamente perigosa e patogênica a humanos, conforme observado no surto epidêmico em 2011 na Europa. O presente estudo teve como objetivo investigar a sinalização química e os mecanismos de patogenicidade em EAEC O104:H4 C227-11, já descritos em EAEC e EHEC, bem como buscar mecanismos ainda não elucidados na literatura. Comparada com cepas protótipos de E. coli diarreiogênicas, os resultados demonstraram que a cepa C227-11 possui um fenótipo de adesão e formação de biofilme acentuados. Em meio ácido, apresentou mais robustez na sobrevivência e maior motilidade em relação à EAEC 042. Também foi possível observar que o nível de expressão gênica para qseC apresentou-se semelhante ao de EHEC e exerce um importante... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Chemical signalling is the mechanism through which pathogenic bacteria interact with the host microbiota, in order to promote regulation of virulence mechanisms. The study of chemical signalling in two-component system QseBC in enteric bacteria, by autoinducer3 (AI-3), epinephrine (Epi) e norepinephrine (NE), has opened perspectives to discover new mechanisms. Escherichia coli O104:H4 has classic phenotypic characteristics of enteroaggregative E. coli (EAEC) and presents itself positive for Shiga toxin, which is found in enterohemorrhagic E. coli strains (EHEC). This toxin may lead the host to the development of more serious diseases, such as the Hemolytic Uremic Syndrome (HUS). Therefore, this combination is highly dangerous and pathogenic to humans, as observed during the epidemic outbreak in Europe in 2011. This study aimed to investigate chemical signalling and mechanisms of pathogenicity in EAEC O104:H4 C227-11, already described in EAEC and EHEC, as well as mechanisms still not elucidated in literature. Compared to prototype strains of diarrheagenic E. coli, the results have shown that C227- 11 has accentuated phenotype of adhesion and biofilm formation. In acid medium, it presented more strength of survival and more motility than EAEC 042. In addition, gene expression level in qseC was found similar to EHEC and it holds an important participation in activation of virulence factors expression, highlighting, thereby, the possibility of its participation in related mechanisms. Through in vivo tests, it was noticed considerable variation of microbiota, compared to C227-11, just as significant differences among other EAEC that mostly did not present great alterations during analysed days, with predominance of Bacteroidetes over Firmicutes Phylum. The conclusion was that its large profile of adhesion and its elevated tolerance... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Angelo Berchieri Junior / Coorientador: Oliveiro Caetano de Freitas Neto / Banca: Wanderley Dias da Silveira / Banca: Gerson Nakazato / Banca: Manoel Victor Franco Lemos / banca: Marcos tulio de Oliveira / Resumo: O tifo aviário, causado por Salmonella Gallinarum biotipo Gallinarum, é uma infecção caracterizada pela alta mortalidade nos lotes de aves suscetíveis acometidos, enquanto S. Gallinarum biotipo Pullorum, o agente da pulorose, infecta as aves de produção industrial com as quais desenvolve relação mais branda. Ainda é escasso o conhecimento sobre os mecanismos moleculares que sustentam essas diferentes interações patógeno-hospedeiro. Nesse estudo, objetivou-se investigar o efeito de deleção parcial das sequências codificantes dos genes idnT (transportador de L-idonato ou D-gluconato), idnO (5-cetogluconato redutase) e ccmH (heme liase necessária na montagem de citocromos do tipo C) sobre a patogenicidade de S. Gallinarum 287/91 (SG287/91), uma vez que seus ortólogos são pseudogenes conservados em S. Pullorum. Os clones mutantes SG∆idnTO, SG∆ccmH e SG∆ccmHidnTO foram obtidos por meio da técnica de mutação sítio-dirigida, denominada de recombinação Lambda-Red e testados em dois experimentos independentes com aves comerciais semipesadas de postura suscetíveis ao tifo aviário. No 1º experimento não se observou alteração da patogenicidade dos clones mutantes após inoculação oral, pois todos os animais infectados desenvolveram sinais clínicos típicos do tifo aviário e vieram a óbito ao longo de 12 dias pós-infecção (dpi). Apesar dos 100% de mortalidade, as infecções desenvolvidas pelos clones SG∆idnTO e SG∆ccmHidnTO levaram os animais a óbito dentro de 48 horas desde o aparecimento d... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Fowl typhoid, caused by Salmonella Gallinarum biovar Gallinarum, is an infectious disease which elicits high mortality into a flock of susceptible birds whereas S. Gallinarum biovar Pullorum, the aetiological agent of pullorum disease, infects poultry of commercial importance with which such a bacterium sets off a more permissive host-pathogen interaction. Little is known about the molecular mechanisms driving these distinct interplays with the host. Herein, we aimed at investigating the effect of partial deletions in the idnT (L-idonate / D-gluconate transporter), idnO (5-ketogluconase reductase) and ccmH (heme liase involved in the c-type cytochrome maturation) coding sequences on S. Gallinarum 287/91 (SG287/91) pathogenicity since they are conserved pseudogenes in S. Pullorum genomes. SG∆idnTO, SG∆ccmH and SG∆ccmHidnTO mutant strains were constructed through a one-step inactivation technique, known as Lambda-Red-mediated recombination, and tested on two independent experiments by using a commercial brown egg-producing layer line susceptible to fowl typhoid. On the experiment 1, no changing was observed in the pathogenicity of the mutant strains upon oral inoculation as the infected animals developed typical fowl typhoid clinical signs and died along 12 days post-infection (dpi). In spite of causing 100% mortality, SG∆idnTO and SG∆ccmHidnTO killed all the animals within 48 hours since the clinical signs appearance while SG287/91 did so in 6 days, indicating an increased virulence by these mutant strains. On the experiment 2 every mutant strain were able to invade the host system from the intestine albeit SG∆idnTO and SG∆ccmHidnTO were recovered from livers and SG∆idnTO alone from spleens at higher numbers than was SG287/91, supporting the hypothesis of increased virulence for those clones ha... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The cultivation of Yerba-mate (Ilex paraguariensis) has intensified in the state of Rio Grande do Sul, due to the valorization of the price paid to the producer. However, the demand for studies related to the pathosystem Fusarium x yerba-mate is still insufficient, so that many producers have faced significant losses in the production of the plantations. Given the above, the aim of this study was to characterize the causal agent of rot-of-roots in Yerba-mate (I. paraguariensis). The following specific objectives were established: a) to select efficient morphological characters in the separation of the pathogenic isolates by groups of similarity b) to evaluate the sequencing of different regions of the genome in the identification of the pathogenic isolates at a species level c) to identify the formation of vegetative compatibility groups (VCG) among the pathogenic isolates d) to investigate the enzymatic arsenal of the pathogenic isolates. Therefore, samples were taken in five municipalities of the state, for the pathogen isolation. In addition, soil samples were collected for the area characterization and also for the geo-referencing of collection points. Fusarium spp. isolates were tested for their pathogenicity through substrate inoculation. It was not possible to associate the chemical properties of the soil of the collected areas with the pathogenicity of the isolates in commercial substrates. The 39 isolates were morphologically characterized through the variables of mycelial growth, sporulation, length and width of macroconidia, shape of microconidia, pigmentation of the colonies and formation of chlamydospores. The variables used in the morphological characterization were efficient in the discrimination for seven groups of isolates, especially length of macroconidia associated with sporulation. There were identified seven pathogenic isolates of Fusarium spp. The pathogenic isolates were also identified molecularly by sequencing the ITS, TEF-1 and β-tubulin regions. The sequencing of the ITS, TEF-1α and β-tubulin regions, consolidated the separation between the pathogenic isolates in F. solani and F. oxysporum. For the same isolates, the technique to obtain nit mutants is suitable for henotypic classification, which is fundamental in the VCG tests for Fusarium species. Five VCGs were obtained. The pathogenic isolates of Fusarium spp. produced extracellular enzymes catalase, laccase, cellulase, caseinase, amylase, protease, lipase, polygalacturonase and pectate lyase. / O cultivo da erva-mate (Ilex paraguariensis) tem se intensificado no estado do Rio Grande do Sul, fruto da valorização do preço pago ao produtor. Conduto, a demanda de estudos relacionados ao patossistema Fusarium x erva-mate ainda são insuficientes, de modo que muitos produtores têm enfrentado perdas significativas na produção dos ervais. Diante do exposto, o objetivo geral deste trabalho foi caracterizar o agente causal da podridão-de-raízes da erva-mate (I. paraguariensis). Como objetivos específicos estabeleceram-se os seguintes: a) selecionar caracteres morfofisiológicos eficientes na separação dos isolados em grupos de similaridade; b) avaliar o sequenciamento de diferentes regiões do genoma na identificação dos isolados patogênicos em nível de espécie; c) identificar a formação de grupos de compatibilidade vegetativa (VCG) entre os isolados patogênicos; d) investigar o arsenal enzimático dos isolados patogênicos. Para tanto, foram realizadas coletas em cinco municípios do estado, para isolamento do patógeno. Além disso, foram coletadas amostras de solo para a caracterização da área e também o georreferenciamento dos pontos de coleta. Os isolados de Fusarium spp., foram testados quanto a sua patogenicidade através da inoculação em substrato. Não foi possível associar as propriedades químicas do solo das áreas de coleta com a patogenicidade dos isolados em substrato comercial. Os 39 isolados foram caracterizados morfologicamente através das variáveis crescimento micelial, esporulação, comprimento e largura dos macroconídios, formato dos microconídios, pigmentação das colônias e formação de clamidósporos. As variáveis utilizadas na caracterização morfológica foram eficientes na discriminação em sete grupos de isolados, especialmente comprimento dos macroconídios associado a esporulação. Foram identificados sete isolados patogênicos de Fusarium spp. Os isolados patogênicos também foram identificados molecularmente através de sequenciamento das regiões do gene ITS, TEF-1 e β-tubulina. O sequenciamento das regiões ITS, TEF-1α e β-tubulina, consolidou a separação entre os isolados patogênicos em F. solani e F. oxysporum. Para os mesmos isolados a técnica para obtenção de mutantes nit é adequada para a classificação fenótipica, fundamentais nos testes de VCG para espécies de Fusarium. Foram obtidos cinco VCG‟s. Os isolado patogênicos de Fusarium spp. produziram as enzimas extracelulares catalase, lacase, celulase, caseinase, amilase, protease, lipase, poligalacturonase e pectato liase.

A raiva é uma zoonose causada pelo vírus da raiva (VR), um membro do gênero Lyssavirus da família Rhabdoviridae. Apesar do VR ser considerado antigenicamente estável, amostras com variações antigênicas têm sido detectadas. Na busca de identificar possíveis variantes circulantes no Brasil, um dos objetivos do presente estudo foi identificar as características antigênicas de amostras de vírus rábico circulantes nas regiões Centro-Oeste e Norte do Brasil. Para tanto, amostras do VR coletadas naquelas regiões, isoladas de diferentes hospedeiros, tiveram seu perfil antigênico avaliado por imunofluorescência indireta frente a um painel de anticorpos monoclonais preparados contra antígenos de lissavírus. Foram identificados três perfís antigenicamente distintos: um característico de amostras de origem de cães domésticos, outro de amostras de morcegos hematófagos e outro de amostras de morcegos não hematófagos. O segundo objetivo deste estudo consistiu em avaliar a estabilidade antigênica e a patogenia de amostras com tais perfís antigênicos distintos. Para atingir este objetivo, três amostras de VR com diferentes perfís antigênicos foram submetidas a vinte inoculações sucessivas em camundongos. Á medida em que as passagens eram realizadas, o perfil antigênico das mesmas era monitorado. Os resultados obtidos revelaram que todas as amostras mantiveram-se relativamente estáveis e todas as amostras ao longo as 20 inoculações mantiveram altamente patogenicas. Duas delas (a amostra com perfil antigênico de cães e a amostra com perfil antigênico de morcegos hematófagos) mantiveram-se antigenicamente estáveis ao longo de todas as 20 inoculações. Por outro lado a amostra com perfil antigênico usualmente detectado em morcegos não hematófagos apresentou uma modificação antigênica após a sétima passagem sucessiva. Isto pode indicar diferenças no grau de adaptação do vírus à espécie hospedeira natural. Sumarizando os resultados desses estudos, conclui-se que as variantes do VR circulantes nas regiões Norte e Centro-Oeste do Brasil possuem características antigênicas comuns a amostras cujos hospedeiros naturais são cães domésticos, morcegos hematófagos e morcegos não hematófagos. As variantes detectadas apresentam um elevado grau de estabilidade antigênica; a variante cujo hospedeiro natural são morcegos não hematófagos parece menos estável antigenicamente. Essa menor estabilidade antigênica poderia ter relação com o grau de adaptação à espécie hospedeira natural, hipótese que será examinada mais profundamente em estudos futuros. / Rabies is caused by rabies virus (RV), a member of the genus Lyssavirus within the family Rhabdoviridae. Despite the acknowledged antigenic stability of RV, variants have been identified. In search for RV variants circulating in Brazil, one of the objectives of the present study was to identify the antigenic profile of RV isolates from different natural host species in North and Central West regions of Brazil. The isolates had its antigenic profiles determined by indirect immunofluorescence with a panel of monoclonal antibodies prepared to lyssavirus antigens. Three distinct antigenic profiles were detected: one characteristic of isolates from domestic dogs, another in isolates from vampire bats and another in non haematophagous bats. A second aim of the present study was to evaluate the degree of antigenic stability and patogeny of RV isolates with such distinct antigenic profiles. For that, three RV isolates were submitted to twenty successive inoculations in mice and periodically monitored in search for antigenic alterations. The results obtained revealed that in fact the three isolates were quite stable antigenically and all strains after 20 consecutive inoculations maintained higly patogenics. Two of the viruses (dog and vampire bat profiles) remained antigenically stable throughout the twenty successive passages in mice. On the other hand, the isolate with an antigenic profile commonly found in non haematophagous bat viruses revealed an antigenic modification after the seventh passage in mice. This could be indicative of differences in the degree of adaptation of the isolate to its natural host species. Summarizing the results of theses studies, it was concluded that RV variants circulating in the Centre-West and North regions of Brazil display antigenic profiles common to those usually detected in isolates whose natural hosts are domestic dogs, haematophagous and non hematophagous bats. Such variants display a relatively high degree of antigenic stability; however, the variant whose natural hosts are non haematophagous bats seem less antigenically stable. Such lesser degree of antigenic stability might be related to the degree of adaptation of the virus to its natural host species. Such hypothesis shall be examined more deeply in future studies.

Amebas de vida livre (AVL) do gênero Acanthamoeba estão amplamente distribuídas no ambiente e podem tornar-se amebas patogênicas ao homem. O objetivo deste trabalho foi isolar em de água de torneira amebas de vida livre do gênero Acanthamoeba, identificá-las e classificá-las. Um total de 132 amostras de água de torneira foi coletado de escolas estaduais e municipais entre os meses de março a novembro de 2009. As amostras passaram pelo processo de filtração e as membranas foram semeadas em ágar não-nutriente 1,5% coberto por uma suspensão de E. coli inativadas pelo calor. Todas as amostras positivas para AVL foram submetidas à clonagem celular e identificadas como pertencentes ao gênero Acanthamoeba, através da morfologia dos cistos e trofozoitos e pela PCR utilizando oligonucleotídeos gênero-específicos que amplificam a região ASA.S1 do gene 18S rDNA. Ensaios fisiológicos de termo e osmotolerância foram utilizados para avaliar a patogenicidade dos isolados. Vinte sete isolados foram positivos para AVL e 10 foram identificados como pertencentes ao gênero Acanthamoeba tanto pelas características morfológicas quanto pela análise molecular. Destes, nove isolados apresentaram características do grupo II e um do grupo III, segundo Pussard e Pons (1977). A análise do sequenciamento através da comparação das sequências dispostas no GenBank, demonstrou a distribuição no grupo genotípicos T2 (40%), T2/T6 (40%), T6 (10%) e T4 (10%). Nos ensaios de termotolerância e osmotolerância 50% dos isolados obtiveram um baixo potencial patogênico. Os resultados indicaram a presença do gênero Acanthamoeba em água tratada no estado do RS, revelando sua importância epidemiológica e a necessidade de mais estudos para determinar sua distribuição no ambiente e seu potencial patogênico. / Free-living amoebae (FLA) of Acanthamoeba genus are widely distributed in the environment and can become human pathogenic amoebae. The aim of this study was to isolate from tap water in free-living amoebae of Acanthamoeba, identify them and then classify them. A total of 132 samples of tap water was collected from state and municipal schools between march and november 2009. The samples passed through the filtration process and the membranes were seeded in non-nutrient 1.5% covered by a suspension of E. coli heatinactivated. All samples of AVL were cloned and identified as belonging to the genus Acanthamoeba by the morphology of cysts and trophozoites by PCR using primers and genus-specific primers that amplify the ASA.S1 region of 18S rDNA gene. Tests of physiological thermotolerance and osmotolerance were used to evaluate the pathogenicity of the isolates. Twenty seven isolates of AVL and 10 were identified as belonging to the genus Acanthamoeba through the morphological and molecular analysis. Nine of the isolates showed characteristics of group II and one isolate showed characteristics of group III, according Pussard and Pons (1977). The sequencing analysis by comparing the sequences submitted to GenBank, showed that genotype distribution in group T2 (40%), T2/T6 (40%), T6 (10%) and T4 (10%). In tests of thermotolerance and osmotolerance 50% of isolates had a low pathogenic potential. The results indicated the presence of Acanthamoeba in tap water in the RS, revealing its importance and the need for more epidemiological studies to determine their distribution in the environment and its pathogenic potential.

Foram coletadas amostras de água de piscinas térmicas e não térmicas na cidade de Porto Alegre, RS, Brasil entre os meses de maio de 2006 e março de 2007, com o objetivo de determinar a presença do gênero Acanthamoeba, bem como realizar a caracterização fenotípica e genotípica dos isolados. Amebas foram isoladas em cultivo monoxênico com Escherichia coli. A identificação dos isolados foi baseada na morfologia dos cistos e trofozoítos e na amplificação por PCR com oligonucleotídeos gênero-específico. O potencial patogênico foi avaliado usando testes de osmotolerância e termotolerância. Das 65 amostras analisadas, 13 (20%) foram positivas para amebas de vida livre e identificados morfologicamente como pertencentes ao gênero Acanthamoeba. Destas, 9 possuíam características compatíveis com o grupo morfológico II e 4 com o grupo III. Todos os isolados identificados morfologicamente quando submetidos à Reação de PCR, confirmaram pertencer ao gênero Acanthamoeba e 38% (5/13) dos isolados foram considerados potencialmente patogênicos a partir dos testes de osmotolerância e termotolerância. Neste estudo, o método molecular de RAPD ("Random Amplified Polymorphic-DNA") foi utilizado para investigar a relação genética entre os 13 isolados de piscinas e dois isolados de referência da ATCC. De 10 oligonucleotídeos decaméricos testados, quatro foram selecionados por gerarem produtos de amplificação passíveis de análise. A similaridade entre os isolados foi calculada utilizando-se o coeficiente de Jaccard e o dendrograma construído pelo método da média das distâncias entre grupos ("Average Linkage"). Quatro grupos distintos (G1-G4) de isolados foram formados de acordo com a similaridade genética entre eles. Sugeriu-se que os isolados do G1 por agruparem-se aos isolados de referência de A. castellanii (ATCC 30010 e 50492) possam pertencer a esta espécie. Os dados fenotípicos, tais como, morfologia e testes de tolerância foram relacionados aos dados genotípicos de RAPD e permitiram a caracterização dos isolados. Os resultados deste primeiro estudo de isolamento e caracterização de Acanthamoeba de água de piscinas na cidade de Porto Alegre-RS, Brasil confirmam a presença de isolados potencialmente patogênicos que podem representar um risco à saúde humana. / Water samples were collected from both heated and unheated swimming pools in the city of Porto Alegre, RS, Brazil between May 2006 and March 2007, to determine the presence of Acanthamoeba in the water of swimming pools as well as perform the phenotypic and genotypic characterization of the isolates. Amoebae were isolated in monoxenic culture with Escherichia coli. The identification of the isolates was based on the trophozoites and cysts morphology and on the amplification through PCR with genus-specific oligonucleotides. The potential pathogenic was assessed by osmotolerance and temperature tolerance assays. From the 65 samples analyzed, 13 (20%) were positive for free-living amoebae, and the isolates morphologically identified as belonging to the genus Acanthamoeba. Out of these, 9 presented characteristics compatible with morphological group II, and 4 with group III. All the morphologically identified isolates, when submitted to PCR, were confirmed as belonging to the genus Acanthamoeba, and 38% (5/13) of the isolates were considered potentially pathogenic according to osmotolerance and temperature tolerance assays. In this study, the molecular RAPD method (Random Amplified Polymorphic-DNA) was used to investigate the genetic relationship among 13 isolates from swimming pools and two strains from the ATCC reference. From the ten decameric oligonucleotides tested, four were selected for generating products of amplification possible to be analyzed. The similarity between isolates was calculated using the Jaccard coefficient and the dendrogram constructed by using the method of the average distances between groups ("Average Linkage"). Four distinct groups (G1-G4) of isolates were separated according to genetic similarity between them. It was suggested that the isolates from G1 once group up with the reference isolates of A. castellanii may belong to this species. The phenotypic data such as morphology and tolerance tests were related to RAPD genotypic data and led to the characterization of isolates. The results of this study about isolation and characterization of Acanthamoeba in swimming pools water at Porto Alegre, RS, Brazil confirm the presence of potentially pathogenic isolates which can present risks to human health.

Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2013-05-28T13:18:55Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao_ChristianeCostaPereira.pdf: 812471 bytes, checksum: a060b7309392afdca00cecb47969c8a5 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-05-28T13:18:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao_ChristianeCostaPereira.pdf: 812471 bytes, checksum: a060b7309392afdca00cecb47969c8a5 (MD5) Previous issue date: 2013 / A leishmaniose visceral é endêmica em muitas regiões do Brasil e é uma importante doença infecto-parasitária causada por protozoários. Além dos seres humanos, os cães também são seriamente acometidos e, no meio urbano, são considerados os principais reservatórios da doença. Esta espécie animal caracteriza-se como fonte de transmissão eficaz por coabitar com as pessoas e, muitas vezes, apresentar altas taxas de infecção sem ter um quadro clínico aparente. A atual estratégia para o controle desta doença é baseada na eliminação de cães soropositivos, tratamento sistemático dos casos humanos e o controle vetorial. Embora a eutanásia do cão seja a principal estratégia de controle da doença, não é amplamente aceita, especialmente por parte dos proprietários. Contudo, as estratégias terapêuticas mais estudadas em cães não conseguiram alcançar a cura parasitológica consistente em CVL. Neste contexto, o desenvolvimento de uma vacina protetora contra CVL poderia ser uma ferramenta promissora para o controle de CVL e consequentemente para Leishmaniose visceral humana. Normalmente, há um consenso de que o microambiente citocina desempenha um papel central no resultado da patogênese da leishmaniose. O principal mecanismo efetor envolvido na resposta imunoprotetora em cães infectados com Leishmania é a ativação dos macrófagos pelo IFN-γ, levando-o a eliminar a forma amastigota intracelular mediada pela produção de óxido nítrico. O objetivo do nosso estudo foi avaliar o perfil de citocinas em cães, e m diferentes tempos pós vacinação com Leishmune ®, após estímulo in vitro com antígeno solúvel de Leishmania chagasi. Empregamos citometria de fluxo e ELISA para análise da produção de citocinas intracelular e secretadas, respectivamente. Os nossos resultados mostraram que a Leishmune ® foi capaz de induzir um aumento do nível de produção de IL-8 e IFN−γ, IL-17a e TNF- α e redução de IL-10 no primeiro e sexto mês após a vacinação, e também redução de IL-4 seis meses após vacinação. No grupo de cães com um ano a pós vacinação, não foi encontrada nenhuma alteração significativa em relação ao perfil de citocinas do grupo de cães não vacinados. As alterações imunológicas acima citadas , levam-nos a acreditar que o processo vacinal promove o desenvolvimento de um perfil de resposta imune celular capaz de induzir imunoproteção aos cães vacinados, ou seja, o animal desenvolve mecanismos imunobiológicos supostamente efetivos contra infecção. Portanto, fica claro que estas alterações permanecem até 6 meses, sendo que após 1 ano da vacinação os animais retornam à um perfil de biomarcadores basal, o que sugere a necessidade do reforço vacinal neste período ou até mesmo anterior a ele / Visceral leishmaniasis is endemic in many regions of Brazil, and it is an important infectious disease caused by protozoan. Apart from humans, dog s are also seriously affected and, in urban areas, are considered the main reservoir of the disease. This species is characterized as a source of transmission for effective cohabit with people and often exhibit high rates of infection without having a seeming clinical condition. The current strategy for the control of this disease is based on the elimination of seropositive dogs, systematic human cases treatment and vector control. Although dog euthanas ia is the main strategy to control the disease, it is not widely accepted, especially by the owners. However, the most often therapeutic strategies studied in dogs had failed t o achieve a consistent parasitological cure in CVL. In this context, the development of a protective vaccine against CVL could be a promising tool for the control of CVL and consequently for human visceral leishmaniasis. Typically, there is a consensus that the cytokine microenvironment performs a central role in the outcome of the pathogenesis of leishmaniasis. The major effector mechanism involved inLeishmania immunoprotective response on infected do gs is the activation of macrophages by IFN-y, leading to destroy the intracellular amastigote form mediated by the production of nitric oxide. The aim of our study was to evaluate the cytokine profile in dogs at different Leishmune ® vaccination times, after in vitro stimulation with soluble antigen of Leishmania chagasi. We had used flow cytometry and ELISA method to an alysis the cytokine production. Our results showed that Leishmune® was capable of the induction of increasing IL-8, IFN-γ,IL-17a and TNF-α production levels in the first and sixth months after vaccination, also IL-10 reduction rates in first and sixth month after vaccination and decreased IL-4 rates only six months after the vaccination. In the “T12 time” group of dogs, one year after vaccination, we did not find any significant difference in the cyto kine profile for the group of non-vaccinated dogs group. The immunobiological changes aforementioned lead us to believe the immunization process promotes the development of a cellular immune response profile capable of inducing immunoprotection on vaccinated dogs. Therefore, it is clear that those changes remain up to 6 months whereas after 1 year after the vaccination the animal returns to a baseline profile of biomarkers, which suggests the necessity of the strengthen the vaccine either at this time or even before

Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2014-01-21T12:33:06Z No. of bitstreams: 1 T_54.pdf: 3536931 bytes, checksum: 59552db3345f3f24dce1136cf6f46d7c (MD5) / Made available in DSpace on 2014-01-21T12:33:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 T_54.pdf: 3536931 bytes, checksum: 59552db3345f3f24dce1136cf6f46d7c (MD5) Previous issue date: 2012 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas René Rachou / Apesar do grande esforço na tentativa de controlar a esquistossomose, esta doença continua sendo uma das mais prevalentes no mundo. Novas intervenções são uma prioridade importante para a eliminação da esquistossomose, uma vez que o controle da doença tem sido baseado essencialmente na quimioterapia, a qual não previne a reinfecção. O desenvolvimento de uma vacina para a esquistossomose para proteção a longo prazo, bem como de um novo teste de diagnóstico, constituirá um grande avanço para o controle da doença. A compreensão da resposta imunológica associada com os estados de infecção/proteção pode constituir a base da descoberta de novos antígenos biomarcadores para vacina e diagnóstico para a esquistossomose. Recentes avanços na área pós-genômica têm permitido uma busca mais racional por biomarcadores. Inicialmente, eletroforese bidimensional (2-DE) de extrato proteico total de diferentes fases de desenvolvimento do Schistosoma mansoni foi realizada, obtendo-se um perfil de separação de spots proteicos com boa resolução com os extratos de todas as fases, mas com um perfil distinto entre eles. Posteriormente, proteínas do extrato proteico de verme adulto, total e de tegumento, foram separaradas por 2-DE e, então, incubadas com amostras de soro de indivíduos infectados (INF) e não infectados de área endêmica (NE) e de indivíduos não infectados de área não endêmica (NI) para esquistossomose em experimento de Western-blotting bidimensional (2D-WB). No total, 47 proteínas imunogênicas foram identificadas por espectrometria de massas. Embora a maioria dos spots proteicos sejam imunogênicos aos diferentes pools de soro, nove spots proteicos reagiram exclusivamente com o pool de soro INF e um com o pool de soro NE. Algumas glicoproteínas foram identificadas no extrato proteico total de verme adulto de S. mansoni usando o método Periodic Acid-Schiff e lectina-blotting. No entanto, o tratamento com periodato/borohidreto indicou que a porção glicídica não tem influência sobre a reatividade das proteínas aos diferentes pools de soro utilizados nos experimentos de 2D-WB. Western-blotting de duas proteínas recombinantes, selecionadas dos experimentos de 2D-WB, mostrou um perfil de reconhecimento pelos diferentes pools de soro semelhante ao das proteínas nativas. Dentre as proteínas imunogênicas identificadas nos experimentos de 2D-WB, 27 foram expressas in vitro com sucesso, as quais serão utilizadas em experimentos futuros em um microarranjo de proteínas. A associação de eletroforese bidimensional e Western-blotting permitiu a seleção de um painel de antígenos proteicos capazes de distinguir os estados de suscetibilidade e resistência à esquistossomose mansônica. Estes antígenos poderão ser utilizados como biomarcadores no desenvolvimento de uma vacina e/ou de um novo teste diagnóstico para a doença. / Despite intensive efforts towards schistosomiasis control, the disease is still one of the most prevalent in the world. New interventions are a high priority for the elimination of schistosomiasis, since the disease control has been essentially based on the use of chemotherapy, which does not prevent re-infection. The development of a long term protection and an effective diagnostic assay would be a major breakthrough for schistosomiasis control. Understanding which aspects of the immune responses are associated with infection/protection status may constitute the basis for the understanding of a successful vaccine and could also indicate new diagnostic candidates. Progress on post-genomic technologies resulted in the development of rational and global approaches for the discovery of new biomarkers. Initially, two-dimensional electrophoresis (2-DE) of different developmental stages protein extracts of Schistosoma mansoni were conducted. It was obtained a good separation pattern of the spots that was distinguishable in all the stages evaluated. Subsequently, two-dimensional electrophoresed S. mansoni adult worm protein extracts, total and tegumental, were probed with pooled sera of infected (INF), non-infected individuals from endemic area (NE) and non-infected individuals from non-endemic schistosomiasis area (NI) in a two-dimensional Western-blotting experiment (2D-WB). A total of 47 immunoreactive proteins were identified by mass spectrometry. Although most of the protein spots were immunoreactive to all of the serum pools, nine reacted exclu sively with the INF serum pool, and one with the NE serum pool. Glycoproteins were identified in the S. mansoni adult worm total protein extract using Periodic Acid–Schiff base method and lectin-blotting. However, periodate/borohydride treatment indicated that the glycoprotein glycan portion had no influence on the immunoreaction obtained in the 2D-WB experiments using different serum pools. Western-blotting of two 2D-WB selected recombinant proteins showed a similar serum recognition profile of the native protein. A total of 27 immunoreactive proteins identified by 2D-WB approach were successfully in vitro expressed and will be used in future experiments of protein microarray. The association of two-dimensional electrophoresis and Western-blotting assays allowed the selection of a protein antigens panel capable to diagnose the schistosomiasis mansoni susceptibility/resistance status. These antigens may be used as biomarkers for the development of a vaccine and/or a new diagnostic test for the disease

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-04-20T18:33:23Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 20005358 bytes, checksum: 1121af69167ca6262a2059e1892c3134 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-20T18:33:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 20005358 bytes, checksum: 1121af69167ca6262a2059e1892c3134 (MD5) Previous issue date: 2003-12-12 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Em Magnaporthe grisea, agente causal da brusone, mutagênese insercional mediada por transformação tem constituído estratégia para a identificação de genes essenciais para a patogenicidade em arroz. A técnica REMI, integração mediada por enzima de restrição, merece destaque em virtude da eficiência de transformação e da predominância de integrações simples. Visando a implantação de programa de mutagênese insercional em M. grisea, os objetivos deste trabalho incluíram: (1) adequar as condições para a obtenção e regeneração de protoplastos do ascomiceto, (2) estabelecer sistema de transformação REMI em M. grisea, avaliando o potencial dos protoplastos e do vetor pAN7-1 e (3) selecionar e caracterizar mutantes com patogenicidade alterada em plantas de arroz. Produção eficiente de protoplastos foi alcançada com o uso simultâneo de 10 mg de Lysing Enzymes e 10 mg de Cellulase Onozuka R10 em 3 mL de MgSO 4 a 1,2 M / NaH 2 PO 4 a 0,01 M (pH = 5,8). Protoplastos de M. grisea I-22 liberados com 3 horas de hidrólise enzimática apresentaram maior capacidade de regeneração da parede celular. Quando expostos ao vetor pAN7-1, os protoplastos foram prontamente transformados para a resistência à higromicina. Quando pAN7-1- HindIII foi usado para transformar I-22 na presença de HindIII, a freqüência de transformantes foi 1,1 a 8,1 vezes superior ao tratamento sem a adição da endonuclease de restrição. No geral, a melhor concentração de HindIII foi 5 unidades/reação de transformação. A partir de testes de patogenicidade envolvendo 125 transformantes, principalmente gerados por REMI, foi possível selecionar cinco mutantes com alterações consistentes na patogênese. Dois desses mutantes, T108 e T93, causaram poucas lesões em folhas de arroz, enquanto o mutante T251 não foi patogênico. A alteração na patogenicidade de T108 foi acompanhada pela menor capacidade de desenvolvimento in vitro. Quando inoculado em plantas de arroz, o mutante T41 apresentou agressividade reduzida, caracterizada por lesões arredondadas de tamanho limitado. Por sua vez, o período de incubação para o mutante T72 foi mais longo do que o do isolado selvagem. Além disso, atrasos consideráveis na germinação de conídios e na formação de apressórios foram detectados em T72. Os mutantes T93 e T251 apresentaram fenótipos semelhantes quando em cultura, caracterizados pela pigmentação marrom. Análises Southern blots de quatro mutantes indicaram que em 50 % dos casos, T108 e T251, apenas uma cópia de pAN7-1 se integrou em um único sítio no genoma. No mutante T251 ocorreu evento REMI propriamente dito. Os mutantes T41 e T93 apresentaram padrões de integração mais complexos. / Transformation mediated-insertional mutagenesis of phytopathogenic fungi is an important tool to identify genes involved in pathogenicity. An improved version of this method is the restriction enzyme mediated integration, or REMI. We chose REMI to begin an insertional mutagenesis project in M. grisea. In this work, were reported the: (1) protoplasts production and regeneration of M. grisea, (2) transformation of protoplasts with pAN7-1 mediated by restriction enzyme and (3) identification and characterization of five transformants with pathogenicity defects in rice, at the phenotypic and molecular levels. The highest protoplasts production was obtained with Lysing Enzymes plus Cellulase Onozuka R-10 and the osmotic buffer MgSO 4 at 1.2 M / NaH 2 PO 4 at 0.01 M (pH = 5.8). The highest regeneration frequency was obtained with protoplasts produced after 3 hours of incubation. The I-22 protoplasts were readily transformed for hygromycin resistance. When pAN7-1-HindIII was used to transform fungal protoplasts in the presence of the HindIII, the transformation efficiency was increased 1.1 to 8.1-fold. The optimal HindIII concentration for enhanced transformation corresponded to 5 unit/transformation mix. Out of 125 transformants screened for the ability to infect rice plants, five showed changes in pathogenicity. The T108 and T93 mutants caused few lesions in rice leaves, while the T251 mutant was non-pathogenic. The alteration in pathogenicity of T108 was accompanied by reduced development in culture. The T41 mutant caused small and limited round lesions. The incubation period of the T72 mutant was longer than of wild type. Furthermore, late germination and appresorium formation was detected in the T72 mutant. The T93 and T251 mutants had similar phenotypes, characterized by a brown-pigmented colony. Four mutants (T41, T93, T108 and T251) were examined by Southern blots. The T108 and T251 mutants contained one copy of the vector integrated at a single site in the genome. REMI event occurred in the T251 mutant. More complex integration events were observed in the T41 and T93 mutants. / Tese importada do Alexandria

Escherichia coli patogênicas aviárias (APEC) causam infecções extraintestinais em aves, que podem ser localizadas ou sistêmicas, denominadas colibacilose. O patotipo de APEC não está definido, mas vários genes de virulência são associados a essas cepas, como os genes plasmidiais iroN, ompT, hlyF, iss e iutA, propostos, em 2008, como preditores da virulência de APEC. Além dos genes de virulência conhecidos, outros fatores podem estar associados à patogenicidade bacteriana, como as maquinarias de secreção protéica denominadas Sistemas de Secreção. O Sistema de Secreção do Tipo 6 (T6SS), descrito em 2006, tem sido associado à virulência de cepas APEC. Este trabalho divide-se em duas partes: a primeira teve como objetivo avaliar a frequência dos genes iroN, ompT, hlyF, iss e iutA em 401 cepas aviárias de E. coli e sua relação com a patogenicidade in vivo dessas cepas. A segunda parte teve como objetivos verificar a frequência de genes componentes do T6SS (clpV, vgrG, icmF e dotU), em uma coleção de 187 cepas APEC; e, em algumas cepas positivas para os genes, verificar a expressão de um fenótipo relacionado ao sistema, bem como a expressão do efetor vgrG e da ATPase do sistema clpV2, além da secreção de proteínas, no meio de cultura e durante contato com células eucarióticas. Os resultados da primeira parte indicam que cepas com dois ou mais dos genes analisados tem maior probabilidade de serem patogênicas do que cepas com apenas um ou nenhum dos genes. Já os da segunda parte mostram que várias cepas apresentaram duas cópias de pelo menos um dos genes testados, e algumas delas apresentaram resistência à predação por D. discoideum. Não foram encontradas diferenças entre a expressão dos genes vgrG (1 e 2) e clpV2 em cultura pura ou em contato com células eucarióticas. Este trabalho apresenta a triagem de genes plasmidiais em uma grande coleção de amostras de Escherichia coli, e a primeira triagem de genes do T6SS em uma coleção de isolados APEC. / Avian pathogenic Escherichia coli (APEC) causes extraintestinal infections in birds, which can be localized or systemic, known as colibacillosis. The APEC pathotype is still undefined, but several virulence genes are associated with these strains, as the plasmid-linked genes iroN, ompT, hlyF, iss and iutA, proposed in 2008 as APEC virulence predictors. Besides the known virulence genes, other factors may be associated with bacterial pathogenicity, such as the protein secretion machineries called Secretion Systems. Described in 2006, Type 6 Secretion System (T6SS) has been associated with virulence of APEC strains. This work is divided in two parts: the first aimed to evaluate the frequency of iroN, ompT, hlyF, iss and iutA genes in 401 avian strains of E. coli and its relationship with in vivo pathogenicity of these strains. The second part aimed to verify the frequency of T6SS genes (clpV, vgrG, icmF and dotU) in a collection of 187 APEC strains; and verify, in some positive strains, the expression of a phenotype related to the system, as well as the gene expression of effector vgrG and ATPase clpV2, besides the secretion of proteins into the culture medium and during contact with eukaryotic cells. The results of the first part of this study indicate that isolates harboring two or more of the genes analyzed were most likely to be pathogenic than strains harboring only one or none of the genes. The results of the second part show that several strains harbored two copies of at least one of the genes tested, and some of them were resistant to predation by D. discoideum. No differences were found between the expression of genes vgrG (1 and 2) and clpV2 in pure culture or in contact with eukaryotic cells. This work presents the screening of plasmidial genes in a large collection of Escherichia coli isolates, and the first screening of T6SS genes in a collection of APEC isolates.