A raiva é uma zoonose causada pelo vírus da raiva (VR), um membro do gênero Lyssavirus da família Rhabdoviridae. Apesar do VR ser considerado antigenicamente estável, amostras com variações antigênicas têm sido detectadas. Na busca de identificar possíveis variantes circulantes no Brasil, um dos objetivos do presente estudo foi identificar as características antigênicas de amostras de vírus rábico circulantes nas regiões Centro-Oeste e Norte do Brasil. Para tanto, amostras do VR coletadas naquelas regiões, isoladas de diferentes hospedeiros, tiveram seu perfil antigênico avaliado por imunofluorescência indireta frente a um painel de anticorpos monoclonais preparados contra antígenos de lissavírus. Foram identificados três perfís antigenicamente distintos: um característico de amostras de origem de cães domésticos, outro de amostras de morcegos hematófagos e outro de amostras de morcegos não hematófagos. O segundo objetivo deste estudo consistiu em avaliar a estabilidade antigênica e a patogenia de amostras com tais perfís antigênicos distintos. Para atingir este objetivo, três amostras de VR com diferentes perfís antigênicos foram submetidas a vinte inoculações sucessivas em camundongos. Á medida em que as passagens eram realizadas, o perfil antigênico das mesmas era monitorado. Os resultados obtidos revelaram que todas as amostras mantiveram-se relativamente estáveis e todas as amostras ao longo as 20 inoculações mantiveram altamente patogenicas. Duas delas (a amostra com perfil antigênico de cães e a amostra com perfil antigênico de morcegos hematófagos) mantiveram-se antigenicamente estáveis ao longo de todas as 20 inoculações. Por outro lado a amostra com perfil antigênico usualmente detectado em morcegos não hematófagos apresentou uma modificação antigênica após a sétima passagem sucessiva. Isto pode indicar diferenças no grau de adaptação do vírus à espécie hospedeira natural. Sumarizando os resultados desses estudos, conclui-se que as variantes do VR circulantes nas regiões Norte e Centro-Oeste do Brasil possuem características antigênicas comuns a amostras cujos hospedeiros naturais são cães domésticos, morcegos hematófagos e morcegos não hematófagos. As variantes detectadas apresentam um elevado grau de estabilidade antigênica; a variante cujo hospedeiro natural são morcegos não hematófagos parece menos estável antigenicamente. Essa menor estabilidade antigênica poderia ter relação com o grau de adaptação à espécie hospedeira natural, hipótese que será examinada mais profundamente em estudos futuros. / Rabies is caused by rabies virus (RV), a member of the genus Lyssavirus within the family Rhabdoviridae. Despite the acknowledged antigenic stability of RV, variants have been identified. In search for RV variants circulating in Brazil, one of the objectives of the present study was to identify the antigenic profile of RV isolates from different natural host species in North and Central West regions of Brazil. The isolates had its antigenic profiles determined by indirect immunofluorescence with a panel of monoclonal antibodies prepared to lyssavirus antigens. Three distinct antigenic profiles were detected: one characteristic of isolates from domestic dogs, another in isolates from vampire bats and another in non haematophagous bats. A second aim of the present study was to evaluate the degree of antigenic stability and patogeny of RV isolates with such distinct antigenic profiles. For that, three RV isolates were submitted to twenty successive inoculations in mice and periodically monitored in search for antigenic alterations. The results obtained revealed that in fact the three isolates were quite stable antigenically and all strains after 20 consecutive inoculations maintained higly patogenics. Two of the viruses (dog and vampire bat profiles) remained antigenically stable throughout the twenty successive passages in mice. On the other hand, the isolate with an antigenic profile commonly found in non haematophagous bat viruses revealed an antigenic modification after the seventh passage in mice. This could be indicative of differences in the degree of adaptation of the isolate to its natural host species. Summarizing the results of theses studies, it was concluded that RV variants circulating in the Centre-West and North regions of Brazil display antigenic profiles common to those usually detected in isolates whose natural hosts are domestic dogs, haematophagous and non hematophagous bats. Such variants display a relatively high degree of antigenic stability; however, the variant whose natural hosts are non haematophagous bats seem less antigenically stable. Such lesser degree of antigenic stability might be related to the degree of adaptation of the virus to its natural host species. Such hypothesis shall be examined more deeply in future studies.

O controle biológico de cigarrinha com Metarhizium (Hypocreales: Clavicipitaceae) na cana-de-açúcar é um exemplo de sucesso da aplicação do manejo sustentável de pragas no Brasil. No entanto, pouco se sabe sobre a riqueza, distribuição e ecologia das espécies de Metarhizium nos agroecossistemas e ambientes naturais no Brasil. Neste trabalho, avaliou-se a diversidade genotípica e realizou-se a identificação específica de 96 isolados depositados na Coleção de Entomopatógenos \"Prof. Sérgio Batista Alves\" da ESALQ-USP pelo sequenciamento da região 5\' do fator de alongamento da tradução 1 alfa (5\'-TEF) e das regiões espaçadoras intergênicas do DNA nuclear MzIGS3 e MzFG543igs. Observou-se a existência de 10, 11 e 17 haplótipos pelas sequências destes genes, respectivamente. Foram ainda obtidos 41 isolados de dois talhões de canavial em Araras-SP que consistiram em 9 haplótipos pela região MzIGS3. Foi observada a existência de cinco espécies de Metarhizium, duas atualmente reconhecidas, M. anisopliae s.l. e M. robertsii s.l., sendo estes os dois clados mais abundantes e três novas linhagens não caracterizadas taxonomicamente, referidas aqui como Metarhizium sp. indet. 1, Metarhizium sp. indet. 2 e Metarhizium sp. indet. 3. Com exceção de um único isolado todos os outros provenientes de insetos, incluindo os isolados de cigarrinha, pertencem a um único clado de M. anisopliae s.l. M. robertsii foi obtido exclusivamente a partir de amostras de solo ou rizosfera. Apesar de proporcionar um maior grau de resolução genética entre os isolados a região MzIGS3 se mostrou incapaz de reconstruir a filogenia consenso para o clado PARB, dificultando a sua utilização como sequência diagnóstica na identificação ou análise filogenética de espécies de Metarhizium. Além disso, foi desenvolvida uma técnica de bioensaio em laboratório para avaliação de patogenicidade de Metarhizium spp. sobre M. fimbriolata com mortalidade da testemunha inferior a 12%, após 28 dias de avaliação. A caracterização da expressão dos genes pr1A, mad1 e mpl relacionados à virulência de três isolados de M. anisopliae (ESALQ 1037, ESALQ 1641 e ESALQ 1204) cultivados em meio mínimo e meio mínimo com cutícula de M. fimbriolata, D. saccharalis e T. molitor não revelou uma associação entre a expressão relativa desses genes ea virulência dos fungos in vivo. As informações contidas neste trabalho poderão contribuir em estudos de identificação e caracterização de Metarhizium em habitats naturais e agrícolas de no Brasil e países vizinhos na América do Sul, assim como auxiliar no contínuo desenvolvimento e acompanhamento do programa de controle biológico de M. fimbriolata com Metarhizium na cultura da cana-de-açúcar. / Biological control of spittlebug with Metarhizium (Hypocreales: Clavicipitaceae) in sugarcane is an example of the successful application of sustainable pest management in Brazil. However little is known about the richness, distribution and ecology of Metarhizium species in agroecosystems and natural environments of Brazil. In this study, the genotypic diversity was accessed and species designation was assigned for 96 Metarhizium strains deposited in the Collection of Entomopathogens \"Prof. Sérgio Batista Alves\" from ESALQ-USP using the sequence variation at 5\'-TEF and the nuclear intergenic loci MzFG543igs and MzIGS3. Sequence diversity at these loci included 10, 11 and 17 sequence haplotypes, according to these loci, respectively. 41 strains were recovered from two sugarcane fields and consisted of 9 haplotypes according to MzIGS3. Five species of Metarhizium were observed, being the two most abundant taxa, Metarhizium anisopliae, Metarhizium robertsii and an additional three taxonomically unassigned lineages are referred to here as Metarhizium sp. indet. 1, Metarhizium sp. indet. 2 and Metarhizium sp. indet. 3. With a single exception, all strains isolated from insects belong to single clade of M. anisopliae, including the isolates infecting spittlebugs in sugarcane agroecosystems. M. robertsii was only recovered from soil or rhizosphere samples. Despite providing a greater degree of genetic resolution among strains, MzIGS3 revealed the inability to recapitulate the consensus phylogeny for the PARB clade and complicates its use as a stand-alone tool for species identification or phylogenetic analysis of Metarhizium. In addition, a laboratory bioassay technique was developed for pathogenicity screening of Metarhizium spp. on M. fimbriolata with low mortality on control group (8-12%) after 28 days of evaluation. The expression of genes pr1A, Mad1 and mpl of three M. anisopliae strains (ESALQ 1037, ESALQ1204 and ESALQ 1641) grown in minimal medium and minimal medium with M. fimbriolata, D. saccharalis or T. molitor cuticle apparently was not related to virulence of the fungi in vivo. Together these data will serve as resources for identification, discovery and communicating about Metarhizium biodiversity for insect biological control applications in Brazil and adjacent countries in South America, as well as assist in the ongoing development and monitoring of the biological control program of M. fimbriolata with Metarhizium in sugarcane fields.

A raiva é uma zoonose causada pelo vírus da raiva (VR), um membro do gênero Lyssavirus da família Rhabdoviridae. Apesar do VR ser considerado antigenicamente estável, amostras com variações antigênicas têm sido detectadas. Na busca de identificar possíveis variantes circulantes no Brasil, um dos objetivos do presente estudo foi identificar as características antigênicas de amostras de vírus rábico circulantes nas regiões Centro-Oeste e Norte do Brasil. Para tanto, amostras do VR coletadas naquelas regiões, isoladas de diferentes hospedeiros, tiveram seu perfil antigênico avaliado por imunofluorescência indireta frente a um painel de anticorpos monoclonais preparados contra antígenos de lissavírus. Foram identificados três perfís antigenicamente distintos: um característico de amostras de origem de cães domésticos, outro de amostras de morcegos hematófagos e outro de amostras de morcegos não hematófagos. O segundo objetivo deste estudo consistiu em avaliar a estabilidade antigênica e a patogenia de amostras com tais perfís antigênicos distintos. Para atingir este objetivo, três amostras de VR com diferentes perfís antigênicos foram submetidas a vinte inoculações sucessivas em camundongos. Á medida em que as passagens eram realizadas, o perfil antigênico das mesmas era monitorado. Os resultados obtidos revelaram que todas as amostras mantiveram-se relativamente estáveis e todas as amostras ao longo as 20 inoculações mantiveram altamente patogenicas. Duas delas (a amostra com perfil antigênico de cães e a amostra com perfil antigênico de morcegos hematófagos) mantiveram-se antigenicamente estáveis ao longo de todas as 20 inoculações. Por outro lado a amostra com perfil antigênico usualmente detectado em morcegos não hematófagos apresentou uma modificação antigênica após a sétima passagem sucessiva. Isto pode indicar diferenças no grau de adaptação do vírus à espécie hospedeira natural. Sumarizando os resultados desses estudos, conclui-se que as variantes do VR circulantes nas regiões Norte e Centro-Oeste do Brasil possuem características antigênicas comuns a amostras cujos hospedeiros naturais são cães domésticos, morcegos hematófagos e morcegos não hematófagos. As variantes detectadas apresentam um elevado grau de estabilidade antigênica; a variante cujo hospedeiro natural são morcegos não hematófagos parece menos estável antigenicamente. Essa menor estabilidade antigênica poderia ter relação com o grau de adaptação à espécie hospedeira natural, hipótese que será examinada mais profundamente em estudos futuros. / Rabies is caused by rabies virus (RV), a member of the genus Lyssavirus within the family Rhabdoviridae. Despite the acknowledged antigenic stability of RV, variants have been identified. In search for RV variants circulating in Brazil, one of the objectives of the present study was to identify the antigenic profile of RV isolates from different natural host species in North and Central West regions of Brazil. The isolates had its antigenic profiles determined by indirect immunofluorescence with a panel of monoclonal antibodies prepared to lyssavirus antigens. Three distinct antigenic profiles were detected: one characteristic of isolates from domestic dogs, another in isolates from vampire bats and another in non haematophagous bats. A second aim of the present study was to evaluate the degree of antigenic stability and patogeny of RV isolates with such distinct antigenic profiles. For that, three RV isolates were submitted to twenty successive inoculations in mice and periodically monitored in search for antigenic alterations. The results obtained revealed that in fact the three isolates were quite stable antigenically and all strains after 20 consecutive inoculations maintained higly patogenics. Two of the viruses (dog and vampire bat profiles) remained antigenically stable throughout the twenty successive passages in mice. On the other hand, the isolate with an antigenic profile commonly found in non haematophagous bat viruses revealed an antigenic modification after the seventh passage in mice. This could be indicative of differences in the degree of adaptation of the isolate to its natural host species. Summarizing the results of theses studies, it was concluded that RV variants circulating in the Centre-West and North regions of Brazil display antigenic profiles common to those usually detected in isolates whose natural hosts are domestic dogs, haematophagous and non hematophagous bats. Such variants display a relatively high degree of antigenic stability; however, the variant whose natural hosts are non haematophagous bats seem less antigenically stable. Such lesser degree of antigenic stability might be related to the degree of adaptation of the virus to its natural host species. Such hypothesis shall be examined more deeply in future studies.

Escherichia coli patogênicas aviárias (APEC) causam infecções extraintestinais em aves, que podem ser localizadas ou sistêmicas, denominadas colibacilose. O patotipo de APEC não está definido, mas vários genes de virulência são associados a essas cepas, como os genes plasmidiais iroN, ompT, hlyF, iss e iutA, propostos, em 2008, como preditores da virulência de APEC. Além dos genes de virulência conhecidos, outros fatores podem estar associados à patogenicidade bacteriana, como as maquinarias de secreção protéica denominadas Sistemas de Secreção. O Sistema de Secreção do Tipo 6 (T6SS), descrito em 2006, tem sido associado à virulência de cepas APEC. Este trabalho divide-se em duas partes: a primeira teve como objetivo avaliar a frequência dos genes iroN, ompT, hlyF, iss e iutA em 401 cepas aviárias de E. coli e sua relação com a patogenicidade in vivo dessas cepas. A segunda parte teve como objetivos verificar a frequência de genes componentes do T6SS (clpV, vgrG, icmF e dotU), em uma coleção de 187 cepas APEC; e, em algumas cepas positivas para os genes, verificar a expressão de um fenótipo relacionado ao sistema, bem como a expressão do efetor vgrG e da ATPase do sistema clpV2, além da secreção de proteínas, no meio de cultura e durante contato com células eucarióticas. Os resultados da primeira parte indicam que cepas com dois ou mais dos genes analisados tem maior probabilidade de serem patogênicas do que cepas com apenas um ou nenhum dos genes. Já os da segunda parte mostram que várias cepas apresentaram duas cópias de pelo menos um dos genes testados, e algumas delas apresentaram resistência à predação por D. discoideum. Não foram encontradas diferenças entre a expressão dos genes vgrG (1 e 2) e clpV2 em cultura pura ou em contato com células eucarióticas. Este trabalho apresenta a triagem de genes plasmidiais em uma grande coleção de amostras de Escherichia coli, e a primeira triagem de genes do T6SS em uma coleção de isolados APEC. / Avian pathogenic Escherichia coli (APEC) causes extraintestinal infections in birds, which can be localized or systemic, known as colibacillosis. The APEC pathotype is still undefined, but several virulence genes are associated with these strains, as the plasmid-linked genes iroN, ompT, hlyF, iss and iutA, proposed in 2008 as APEC virulence predictors. Besides the known virulence genes, other factors may be associated with bacterial pathogenicity, such as the protein secretion machineries called Secretion Systems. Described in 2006, Type 6 Secretion System (T6SS) has been associated with virulence of APEC strains. This work is divided in two parts: the first aimed to evaluate the frequency of iroN, ompT, hlyF, iss and iutA genes in 401 avian strains of E. coli and its relationship with in vivo pathogenicity of these strains. The second part aimed to verify the frequency of T6SS genes (clpV, vgrG, icmF and dotU) in a collection of 187 APEC strains; and verify, in some positive strains, the expression of a phenotype related to the system, as well as the gene expression of effector vgrG and ATPase clpV2, besides the secretion of proteins into the culture medium and during contact with eukaryotic cells. The results of the first part of this study indicate that isolates harboring two or more of the genes analyzed were most likely to be pathogenic than strains harboring only one or none of the genes. The results of the second part show that several strains harbored two copies of at least one of the genes tested, and some of them were resistant to predation by D. discoideum. No differences were found between the expression of genes vgrG (1 and 2) and clpV2 in pure culture or in contact with eukaryotic cells. This work presents the screening of plasmidial genes in a large collection of Escherichia coli isolates, and the first screening of T6SS genes in a collection of APEC isolates.

Amebas de vida livre (AVL) do gênero Acanthamoeba estão amplamente distribuídas no ambiente e podem tornar-se amebas patogênicas ao homem. O objetivo deste trabalho foi isolar em de água de torneira amebas de vida livre do gênero Acanthamoeba, identificá-las e classificá-las. Um total de 132 amostras de água de torneira foi coletado de escolas estaduais e municipais entre os meses de março a novembro de 2009. As amostras passaram pelo processo de filtração e as membranas foram semeadas em ágar não-nutriente 1,5% coberto por uma suspensão de E. coli inativadas pelo calor. Todas as amostras positivas para AVL foram submetidas à clonagem celular e identificadas como pertencentes ao gênero Acanthamoeba, através da morfologia dos cistos e trofozoitos e pela PCR utilizando oligonucleotídeos gênero-específicos que amplificam a região ASA.S1 do gene 18S rDNA. Ensaios fisiológicos de termo e osmotolerância foram utilizados para avaliar a patogenicidade dos isolados. Vinte sete isolados foram positivos para AVL e 10 foram identificados como pertencentes ao gênero Acanthamoeba tanto pelas características morfológicas quanto pela análise molecular. Destes, nove isolados apresentaram características do grupo II e um do grupo III, segundo Pussard e Pons (1977). A análise do sequenciamento através da comparação das sequências dispostas no GenBank, demonstrou a distribuição no grupo genotípicos T2 (40%), T2/T6 (40%), T6 (10%) e T4 (10%). Nos ensaios de termotolerância e osmotolerância 50% dos isolados obtiveram um baixo potencial patogênico. Os resultados indicaram a presença do gênero Acanthamoeba em água tratada no estado do RS, revelando sua importância epidemiológica e a necessidade de mais estudos para determinar sua distribuição no ambiente e seu potencial patogênico. / Free-living amoebae (FLA) of Acanthamoeba genus are widely distributed in the environment and can become human pathogenic amoebae. The aim of this study was to isolate from tap water in free-living amoebae of Acanthamoeba, identify them and then classify them. A total of 132 samples of tap water was collected from state and municipal schools between march and november 2009. The samples passed through the filtration process and the membranes were seeded in non-nutrient 1.5% covered by a suspension of E. coli heatinactivated. All samples of AVL were cloned and identified as belonging to the genus Acanthamoeba by the morphology of cysts and trophozoites by PCR using primers and genus-specific primers that amplify the ASA.S1 region of 18S rDNA gene. Tests of physiological thermotolerance and osmotolerance were used to evaluate the pathogenicity of the isolates. Twenty seven isolates of AVL and 10 were identified as belonging to the genus Acanthamoeba through the morphological and molecular analysis. Nine of the isolates showed characteristics of group II and one isolate showed characteristics of group III, according Pussard and Pons (1977). The sequencing analysis by comparing the sequences submitted to GenBank, showed that genotype distribution in group T2 (40%), T2/T6 (40%), T6 (10%) and T4 (10%). In tests of thermotolerance and osmotolerance 50% of isolates had a low pathogenic potential. The results indicated the presence of Acanthamoeba in tap water in the RS, revealing its importance and the need for more epidemiological studies to determine their distribution in the environment and its pathogenic potential.

Espécies de Brucella são causadoras da brucelose, uma das doenças zoonóticas mais difundidas em todo o mundo, que é causa aborto em animais domésticos e infecção potencialmente debilitante em humanos. Apesar da identificação de diferentes espécies dentro do gênero, baseada na diferença de hospedeiro e patogenicidade, o gênero tem sido descrito como geneticamente homogêneo. Técnicas moleculares têm sido empregadas com o intuito de diferenciar e tipificar estes microrganismos, sendo que a abordagem mais promissora visa a identificação de polimorfismos entre as espécies e biovares. O objetivo do trabalho foi analisar o perfil genético de diferentes cepas de B. abortus obtidos a partir da técnica de SE-AFLP a fim de determinar a sequência dos fragmentos obtidos e genes que poderiam estar presentes nos fragmentos selecionados e compará-las com bancos de genes e de proteínas de procariotos. Foram selecionados 19 fragmentos, que foram purificados, sequenciados e, as sequências obtidas, submetidas a diversas ferramentas de bioinformática visando sua caracterização e identificação. Nenhum dos fragmentos de nucleotídeos apresentou similaridade entre si e/ou com outra sequência já conhecida de outros microrganismos, inclusive com sequências conhecidas do gênero Brucella. Das 114 proteínas hipotéticas geradas pela tradução destas sequências genômicas 57% (65 sequências) apresentaram baixo grau de similaridade com proteínas descritas e disponíveis em BLASTp (proteínas não-redundantes e SwissProt), variando entre 29 e 43. Do total de proteínas similares 85% foram atribuídas e proteínas funcionais e 14% a proteínas hipotéticas. Essas novas sequências deverão ser utilizadas em outros trabalhos visando verificar sua abrangência e especificidade dentro das espécies e biovares de Brucella. / Brucella species are the cause of brucellosis, one of the most widespread zoonotic diseases around the world, which is cause abortion in domestic animals and potentially debilitating infection in humans. Despite the identification of different species within the genus, based on the difference of host and pathogenicity, the genre has been described as genetically homogeneous. Molecular techniques have been employed in order to differentiate and classify these organisms, and the most promising approach aims to identify polymorphisms between species and biovars. The objective of this study was to analyze the genetic profile of different strains of B. abortus obtained by the technique of SE-AFLP to determine the sequence of the fragments obtained and genes that may be present in the selected fragments and compare them to databases of genes and proteins in prokaryotes. We selected 19 fragments that were purified, sequenced and the sequences obtained, subject to several bioinformatics tools aiming at its characterization and identification. None of the fragments showed nucleotide similarity between themselves and / or other sequence already known from other organisms, including known sequences of the genus Brucella. Of the 114 hypothetical proteins generated by translation of genomic sequences 57% (65 sequences) showed low level of similarity to proteins described and available in blastp (protein non-redundant and SwissProt), ranging between 29 and 43. Of the proteins similar 85% were attributed to functional proteins and 14% to hypothetical proteins. These new sequences should be used in other studies to verify its completeness and specificity within the species and biovars of Brucella.

Foram coletadas amostras de água de piscinas térmicas e não térmicas na cidade de Porto Alegre, RS, Brasil entre os meses de maio de 2006 e março de 2007, com o objetivo de determinar a presença do gênero Acanthamoeba, bem como realizar a caracterização fenotípica e genotípica dos isolados. Amebas foram isoladas em cultivo monoxênico com Escherichia coli. A identificação dos isolados foi baseada na morfologia dos cistos e trofozoítos e na amplificação por PCR com oligonucleotídeos gênero-específico. O potencial patogênico foi avaliado usando testes de osmotolerância e termotolerância. Das 65 amostras analisadas, 13 (20%) foram positivas para amebas de vida livre e identificados morfologicamente como pertencentes ao gênero Acanthamoeba. Destas, 9 possuíam características compatíveis com o grupo morfológico II e 4 com o grupo III. Todos os isolados identificados morfologicamente quando submetidos à Reação de PCR, confirmaram pertencer ao gênero Acanthamoeba e 38% (5/13) dos isolados foram considerados potencialmente patogênicos a partir dos testes de osmotolerância e termotolerância. Neste estudo, o método molecular de RAPD ("Random Amplified Polymorphic-DNA") foi utilizado para investigar a relação genética entre os 13 isolados de piscinas e dois isolados de referência da ATCC. De 10 oligonucleotídeos decaméricos testados, quatro foram selecionados por gerarem produtos de amplificação passíveis de análise. A similaridade entre os isolados foi calculada utilizando-se o coeficiente de Jaccard e o dendrograma construído pelo método da média das distâncias entre grupos ("Average Linkage"). Quatro grupos distintos (G1-G4) de isolados foram formados de acordo com a similaridade genética entre eles. Sugeriu-se que os isolados do G1 por agruparem-se aos isolados de referência de A. castellanii (ATCC 30010 e 50492) possam pertencer a esta espécie. Os dados fenotípicos, tais como, morfologia e testes de tolerância foram relacionados aos dados genotípicos de RAPD e permitiram a caracterização dos isolados. Os resultados deste primeiro estudo de isolamento e caracterização de Acanthamoeba de água de piscinas na cidade de Porto Alegre-RS, Brasil confirmam a presença de isolados potencialmente patogênicos que podem representar um risco à saúde humana. / Water samples were collected from both heated and unheated swimming pools in the city of Porto Alegre, RS, Brazil between May 2006 and March 2007, to determine the presence of Acanthamoeba in the water of swimming pools as well as perform the phenotypic and genotypic characterization of the isolates. Amoebae were isolated in monoxenic culture with Escherichia coli. The identification of the isolates was based on the trophozoites and cysts morphology and on the amplification through PCR with genus-specific oligonucleotides. The potential pathogenic was assessed by osmotolerance and temperature tolerance assays. From the 65 samples analyzed, 13 (20%) were positive for free-living amoebae, and the isolates morphologically identified as belonging to the genus Acanthamoeba. Out of these, 9 presented characteristics compatible with morphological group II, and 4 with group III. All the morphologically identified isolates, when submitted to PCR, were confirmed as belonging to the genus Acanthamoeba, and 38% (5/13) of the isolates were considered potentially pathogenic according to osmotolerance and temperature tolerance assays. In this study, the molecular RAPD method (Random Amplified Polymorphic-DNA) was used to investigate the genetic relationship among 13 isolates from swimming pools and two strains from the ATCC reference. From the ten decameric oligonucleotides tested, four were selected for generating products of amplification possible to be analyzed. The similarity between isolates was calculated using the Jaccard coefficient and the dendrogram constructed by using the method of the average distances between groups ("Average Linkage"). Four distinct groups (G1-G4) of isolates were separated according to genetic similarity between them. It was suggested that the isolates from G1 once group up with the reference isolates of A. castellanii may belong to this species. The phenotypic data such as morphology and tolerance tests were related to RAPD genotypic data and led to the characterization of isolates. The results of this study about isolation and characterization of Acanthamoeba in swimming pools water at Porto Alegre, RS, Brazil confirm the presence of potentially pathogenic isolates which can present risks to human health.

Pasteurella multocida, apesar de ser uma bactéria que compõe a microbiota respiratória, sob algumas circunstâncias pode manifestar-se como um agente patogênico primário ou secundário, causando doença em aves e outros animais. Como agente primário, P. multocida leva a grandes perdas econômicas, causando cólera em aves, rinite atrófica em suínos e septicemia hemorrágica em bovinos e bubalinos. P. multocida é uma espécie heterogênea, e a patogenicidade dos isolados pode ser amplamente variável. A suscetibilidade do hospedeiro à essas cepas varia consideravelmente entre espécies. Inoculações experimentais de P. multocida em camundongos e aves são comumente usadas para avaliar a patogenicidade de diferentes cepas, mas os resultados são geralmente subjetivos e pouco mensuráveis. O objetivo deste trabalho foi estabelecer uma nova metodologia para classificar a patogenicidade de cepas de P. multocida, através da formulação de um índice padrão. Para determinar esse índice, foram usadas 97 amostras de P. multocida, isoladas de cólera em aves e rinite em suínos. Cem microlitros (105 UFC) de uma cultura bacteriana contendo 106 UFC/mL, de cada isolado de P. multocida foram inoculados, por via intraperitoneal, em 10 pintos de um dia. Além da mortalidade causada pela inoculação, o tempo de morte e as lesões macroscópicas foram avaliados. Diferenças significativas foram observadas entre isolados de aves e suínos em relação aos índices de patogenicidade. O número de lesões e a porcentagem de bactérias recuperadas dos animais inoculados também variaram de acordo com a origem do isolado. A partir dos indices observados, os isolados foram distribuídos em três classes de patogenicidade: alta, média e baixa. O índice de patogenicidade desenvolvido neste trabalho permite a mensuração e classificação da patogenicidade de isolados de P. multocida e pode ser uma alternativa aos modelos subjetivos de triagem de patogenicidade usados até o momento. / Pasteurella multocida, despite being a bacteria that makes up the respiratory microbiota, under some circumstances can manifest as primary or secondary pathogenic agent, causing disease in birds and other animals. As primary agent, P. multocida leads to large economic losses, causing fowl cholera in birds, atrophic rinitis in swine and haemorragic septicemia in cattle and buffalos. P. multocida is a heterogeneous specie, and the pathogenicity of the samples can be widely variable. Host susceptibility to these strains varies considerably between species. Experimental inoculations of P. multocida in mice and birds are commonly used to evaluate the pathogenicity of the different strains, but the results are generally subjective and difficult to evaluate them. The aim of this work was to establish a new methodology to classify the pathogenicity of a specific strain, through the formulation of a standard score. To determine this score, we used 97 samples of P. multocida, from fowl cholera in birds and rhinitis in swine. One-hundred microliters (105 CFU) of bacterial culture containing 106 CFU/mL of each P. multocida isolate were inoculated, by intraperitoneal route, in 10 one-day-old chicks. Besides mortality caused by the inoculation, time of death and gross lesions were also evaluated. Significant differences were observed between avian and swine isolates in relation to pathogenicity scores. The number of lesions and the percentage of bacteria recovered from the inoculated animals also varied according to the origin of the isolate. From the observed scores, the isolates were distributed into three pathogenicity classes: high, medium and low. The pathogenicity score developed here allows the measurement and classification of the pathogenicity of P. multocida isolates and can be an alternative to subjective current models of pathogenicity screening used so far.

Cryptococcus neoformans e C. gattii são as principais espécies do gênero que causam infecção no homem, C. albidus e C. laurentii são espécies menos envolvidas. O presente trabalho teve por objetivos avaliar a patogenicidade in vivo, os fatores e os genes relacionados à virulência, e verificar o perfil de suscetibilidade ao fluconazol de 10 isolados ambientais de cada uma das espécies: C. neoformans, C. albidus e C. laurentii, antes e após a inoculação em camundongos BALB/c imunocompetentes; pesquisar os sorotipos, mating types e realizar a tipagem molecular. Proteinase, fosfolipase, urease, produção de melanina e crescimento à 37ºC foram pesquisados utilizando metodologias clássicas, e a pesquisa dos genes e determinação dos sorotipos e mating types foram feitas por PCR. A tipagem molecular foi realizada por PCR-fingerprinting, com os iniciadores (GACA)4 e M13. A determinação da CIM do fluconazol foi realizada pelo método da microdiluição em caldo. Todos os isolados de C. neoformans foram sorotipos A e MAT-alfa. A inoculação em animais mostrou que 9 isolados de C. neoformans mataram 100% deles em até 33 dias, e 1 levou os animais à morte num período entre 40 e 82 dias; 9 isolados foram recuperados dos pulmões e cérebro dos animais em 7 e 14 dias, e um deles levou todos os animais à morte em 12 dias, sendo possível recuperá-lo somente no 7º dia. Os animais inoculados com C. albidus e C. laurentii permaneceram vivos até negativação das culturas dos órgãos avaliados. C. albidus foi isolado principalmente do fígado e dos pulmões até 10 dias após a inoculação, C. laurentii dos pulmões e do cérebro até 120 dias. Todos os isolados das 3 espécies produziram cápsula antes e após a inoculação. Todos C. neoformans, 6 C. albidus e 6 C. laurentii cresceram à 37ºC antes e depois da inoculação. Melanina foi produzida por todos os isolados de C. neoformans e nenhum C. albidus nas duas ocasiões; e por 6 e 9 isolados de C. laurentii, antes e depois da inoculação, respectivamente. Seis isolados de C. neoformans e 1 de C. laurentii produziram proteinase nas duas ocasiões. Sete isolados de C. albidus produziram proteinase antes e todos depois da inoculação. Fosfolipase foi produzida por todos C. neoformans e C. albidus, e por 6 C. laurentii nas duas ocasiões. A avaliação da atividade da urease realizada em meio líquido foi positiva em 24 a 48 horas pelos isolados de C. neoformans e C. laurentii, e em 24 a 96 horas por C. albidus. A CIM de fluconazol variou de 2 a 8 ug/mL para C. neoformans, de 8 a >= 64 ug/mL para C. albidus, e de 1 a 64 ug/mL para C. laurentii, nas duas ocasiões. Todos os isolados de C. neoformans apresentaram os genes lacase (Lac1), fosfolipase (PLB1), proteinase (cnap1), calcineurina (CNA1), urease (URE1), e ERG11, com os oligonucleotídeos utilizados. A PCR com ERG11 mostrou uma banda no gel de agarose para todos C. albidus, porém nenhum dos outros genes pesquisados foram amplificados em C. albidus e C. laurentii. A tipagem molecular por PCR-fingerprinting dos isolados de C. neoformans revelou 2 tipos moleculares: VNI (7 isolados) e VNII (3 isolados). A maioria dos isolados de C. albidus apresentou homogeneidade nos padrões de bandas gerados, e C. laurentii foi a espécie que demonstrou maior diversidade genética por esta metodologia. Concluímos que a passagem dos isolados pelos animais não alterou os fenótipos estudados e nenhuma alteração foi detectada pela análise molecular. No entanto, verificamos a grande heterogeneidade molecular dos isolados de C. laurentii estudados. / Species of Cryptococcus neoformans and C. gattii are the main ones in the genus causing infection in man while C. albidus and C. laurentii are less involved. This study evaluated the in vivo pathogenicity, factors and genes related to virulence and the susceptibility to fluconazole before and after inoculation in immunocompetent BALB/c mice of ten environmental isolates of C. neoformans, C. albidus and C. laurentii. Serotypes, mating types and molecular typing were also determined to complete the evaluation. Enzymes like proteinases, phospholipase, urease, production of melanin and growth at 37oC were investigated by classical methods, but gene characterization and determination of serotypes and mating types were investigated by PCR. Molecular typing was done by PCR-fingerprinting with primers (GACA)4 and M13. The microdilution method was used to determine the minimum inhibitory concentration (MIC) of flucozanole. All C. neoformans isolates were serotype A and MAT-alfa and 9 of them when inoculated in animals killed 100% in up to 33 days. One isolate inoculated killed the animals in 40 to 82 days. Nine isolates were recovered from the animal lungs and brain in 7 and 14 days and the one which killed all animals in 12 days was only recovered on the 7th day. Animals inoculated with C. albidus and C. laurentii were alive until the tissue cultures of evaluated organs were negative. C. albidus was isolated mainly from the liver and lungs in up to 10 days after inoculation and strains of C. laurentii from the lungs and brain in up to 120 days. All isolates in the 3 species were capsule producers before and after inoculation. All strains of C. neoformans, 6 C. albidus and 6 C. laurentii grew at 37oC both before and after inoculation. All C. neoformans produced melanin and 6 C. laurentii produced it before inoculation and nine after. None was produced by C. albidus. Six isolates of C. neoformans and one of C. laurentii produced proteinases in both situations, before and after inoculation. Seven C. albidus isolates produced the protein hydrolyzing enzyme before inoculation and all after. Phospholipase enzyme was produced by all C. neoformans, and C. albidus and by 6 C. laurentii in both conditions, before and after inoculation. Urease activity was detected between 24 and 48 hours after incubation in a liquid medium for C. neoformans and C. laurentii cultures and after 24 to 96 hours for C. albidus. Fluconazole MICs ranged from 2 to 8 ug/ mL for C. neoformans isolates, from 8 to >= 64 ug/mL for C. albidus and from 1 to 64 ug/mL for C. laurentii in both conditions. Genes laccase (Lac1), phopholipase (PLB1) proteinase (cnap1), calcineurine (CNA1), urease (URE1) and ERG11, detected with the primers used were present in all C. neoformans. With exception of ERG11, which showed a band in agarose electrophoresis by all C. albidus, the other genes were not amplified in C. albidus and C. laurentii. Molecular typing by PCR-fingerprinting showed two molecular types in C. neoformans: VNI in 7 isolates and VNII in 3 isolates. Most C. albidus showed homogenous patterns in the bands generated and C. laurentii was the species with the higher genetic diversity by this methodology. It is concluded that isolate inoculations in animals does not alter phenotypes and no alteration is detected by molecular analysis. However, the high molecular heterogeneity of C. laurentii was detected.

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:53:11Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo5103_1.pdf: 2655923 bytes, checksum: 4a8cd8dfda72129aa8308dbf088c4d10 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2004 / Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae var. anisopliae e Metarhizium flavoviride var. flavoviride são fungos entomopatogênicos com ação comprovada contra várias espécies, embora não tenham sido testados em Chrysomya albiceps, um díptero de importância na saúde pública. Assim, objetivou-se avaliar a ação de B. bassiana, M. anisopliae var. anisopliae e M. flavoviride var. flavoviride em ovos, larvas e adultos de C. albiceps, utilizando as concentrações 104, 105, 106, 107, 108 conídios.mL-1, considerando o percentual de eclosão de larvas, período de pré-pupa, pupa, percentual de emergência de adultos, ritmo de emergência, morte acumulativa, longevidade, período de postura e percentual de eclosão a partir de fêmeas infectadas. O comportamento dos fungos reisolados também foi avaliado através dos parâmetros biológicos: percentual de germinação, número de conídios, número e diâmetro de colônias, bem como a citologia no que se refere à descrição das estruturas vegetativas e reprodutivas. De acordo com a metodologia empregada, verificou-se que os três fungos apresentaram ação contra ovos, larvas e adultos de C. albiceps. Já em relação ao comportamento, foi observado que os fungos reisolados de larva apresentaram o melhor desempenho em relação ao controle e os aspectos citológicos não diferiram quando comparados ao controle. Esses resultados sugerem a possibilidade do emprego desses fungos no controle de C. albiceps