Os objetivos deste trabalho foram detectar e identificar os fungos presentes em amostras de sementes de ipê-amarelo (Tabebuia serratifolia), ipê-roxo (Tabebuia impetiginosa), aroeira-pimenteira (Schinus terebinthifolius) e aroeira-salsa (Schinus molle), coletadas em diferentes localidades (Piracicaba-SP, Mogi-Guaçu-SP, Rio das Pedras-SP, Ijaci-MG, Itumirim-MG e Lavras-MG) uma parte das amostras foram submetidas à assepsia e a outra não; verificar o efeito desses fungos na germinação dessas sementes; avaliar a transmissão de fungos das sementes para as plântulas; avaliar a patogenicidade de Pestalotiopsis sp. em mudas de aroeira-pimenteira e comparar o efeito de diferentes fungicidas (captam, carbendazim+tiram e carboxim+tiram) na incidência dos fungos e na germinação. Constatou-se que os fungos mais frequentes e em maior incidência encontrados associados às sementes, tanto de ipê-amarelo quanto de ipê-roxo, foram Cladosporium sp., Alternaria alternata, Epicoccum sp., Phoma sp., Geotrichum sp., Penicillium sp., Trichothecium sp., Phomopsis sp., Drechslera sp., Aspergillus spp., Curvularia sp. e Fusarium spp. De maneira geral, a assepsia proporcionou uma redução drástica de todos os fungos, em ambas espécies. Não houve diferença significativa na porcentagem de plântulas normais, entre as amostras, porém o tratamento com hipoclorito de sódio, reduziu a germinação em 64%. Na transmissão observou-se, em média, 17% e 10% de plântulas com sintomas, nas amostras sem assepsia e com assepsia, respectivamente. Os fungos mais freqüentes transmitidos pelas sementes de ipê foram: Alternaria alternata., Fusarium spp., Aspergillus spp., Phoma sp. e Phomopsis sp. Em relação às espécies de aroeira, os fungos quantificados foram Cladosporium sp., Alternaria alternata, Aspergillus spp., Pestalotiopsis sp., Penicillium sp., Fusarium spp., Epicoccum sp., Nigrospora sp., Curvularia sp., Drechslera sp., Trichoderma sp., Myrothecium sp. e Phoma sp. A assepsia reduziu ou manteve a incidência dos fungos, exceto para Pestalotiopsis sp. e Aspergillus spp. que aumentaram em algumas amostras de sementes de aroeira-pimenteira. Não houve diferença estatística da germinação das com e sem assepsia e entre amostras; para aroeira-salsa não verificou-se germinação. Foi confirmada a transmissão, principalmente dos fungos Cladosporium sp., Aspergillus spp. e Pestalotiopsis sp. Em mudas de aroeira-pimenteira verificou-se a patogenicidade de Pestalotiopsis sp. No tratamento de sementes com fungicidas, todos, de uma maneira geral, mostram resultados satisfatórios no controle de todos os fungos detectados, tanto para ipê quanto para aroeira. Captam apresentou resultado satisfatório principalmente em sementes de ipê, onde não foi verificado efeito fitotóxico em relação aos demais fungicidas comparados. Porém, o uso de copolímero de poliéter e silicone, um espalhante adesivo utilizado para facilitar a distribuição do produto, interferiu de forma negativa nos resultados de germinação de sementes de ipê; para aroeira não foi verificado este efeito. Torna-se necessário comparar diferentes doses e produtos para não só controlar fungos associados às sementes mas evitar problemas durante a germinação das mesmas e garantir a produção de mudas sadias e vigorosas em viveiros. / The objectives of this work were to detect and to identify the fungi present in samples of native forest seeds of ipê-amarelo (Tabebuia serratifolia), ipê-roxo (Tabebuia impetiginosa), aroeira-pimenteira (Schinus terebinthifolius) and aroeira-salsa (Schinus molle), collected at different places (Piracicaba-SP, Mogí-Guaçu-SP, Rio das Pedras-SP, Ijaci-MG, Itunirim-MG and Lavras-MG), submiting some parts of the asepsis and the other no; to verify the effect of these fungi in the germination of these seeds; to evaluate the transmission of seed fungi associated to seedlings; to evaluate the patogenicity of Pestalotiopsis sp. in aroeira-pimenteira seedlings and to compare the effect of different fungicides (captan, carbendaxim+tiram and carboxim+tiram) in the fungi incidence and germination. The results showed that the most incident and frequent fungi found associated to the seeds of ipê-amarelo and ipê-roxo were Cladosporium sp., Alternaria alternata, Epicoccum sp., Phoma sp., Geotrichum sp., Penicillium sp., Trichothecium sp., Phomopsis sp., Drechslera sp., Aspergillus spp., Curvularia sp. and Fusarium spp. In general, the asepsis provided a drastic reduction of all fungi, in both species. There was no significantive difference in the normal seedling percentage, independent of the sample, however the treatment with sodium hipoclorite, in the asepsis, reduced the germination in 64%. In the transmission was observed, on average, 17% and 10% of seedlings with symptoms, in the samples without asepsis and with asepsis, respectively. The most frequent fungi transmitted by ipê seeds were: Alternaria alternata., Fusarium spp., Aspergillus spp., Phoma sp. e Phomopsis sp.. In relation to aroeira species, the quantified fungi were: Cladosporium sp., Alternaria alternata, Aspergillus spp., Pestalotiopsis sp., Penicillium sp., Fusarium spp., Epicoccum sp., Nigrospora sp., Curvularia sp., Drechslera sp., Trichoderma sp., Myrothecium sp. e Phoma sp.. The The asepsis reduced or maintained the fungi incidence, except for Pestalotiopsis sp. and Aspergillus spp. That increased in some aroeira-pimenteira seeds. The germination results showed that there was no statistical difference in relation to seeds with and without asepsis and among samples. The transmission was confirmed, mainly of the fungi Cladosporium sp., Aspergillus spp. e Pestalotiopsis sp.. In aroeira-pimenteira seedlings the patogenicity of Pestalotiospsis sp. was verified. In the seeds treatment with fungicides, all, in a general way, showed satisfactory results in the control of all detected fungi, as much for ipê as for aroeira. Captan presented satisfactory result principally in ipê seeds, where fitotoxic effect had not been verified in relation to the other compared fungicides. However, the use of copolímero of polyeter and silicon, an adhesive dispersed, used to facilitate the product distribution, negatively interfered on the germination results; for aroeira this effect had not been verified in the germination. To compare different doses, products not only to control fungi associated to the seeds but to avoid problems during the germination of the same ones and to guarantee the production of healthy seedlings and vigorous in nurseries becomes necessary.

Xylella fastidiosa é o agente etiológico de diversas doenças em plantas, incluindo a Clorose Variegada dos Citros (CVC), uma séria ameaça à indústria citrícola. Os níveis de transcritos sob diferentes disponibilidades de ferro foram medidos com microarranjos de DNA representando 2608 (91,6%) sequências codificadoras (CDS) da cepa 9a5c de X. fastidiosa. Na presença de 100 uM pirofosfato férrico, 218 e 256 CDS foram consideradas como reguladas positiva e negativamente, respectivamente. Quando tratada com o quelante de ferro 2,2\'-dipiridil, 193 CDS foram consideradas como reguladas positivamente e 216 negativamente. A expressão diferencial de um subconjunto de 44 CDS foi também avaliada por RT-qPCR, que mostrou uma correlação de Pearson de 0,77 com os resultados dos microarranjos. As CDS diferencialmente expressas nas variações de concentração de ferro participam em diversas funções celulares. Muitas CDS envolvidas com funções regulatórias, patogenicidade e estrutura celular foram moduladas em ambas as condições testadas, sugerindo que grandes mudanças na arquitetura celular e metabolismo ocorrem quando células de X. fastidiosa são expostas a variações extremas na concentração de ferro. Interessantemente, as CDS moduladas incluem as de síntese e secreção de bacteriocinas similares à colicina tipo V e funções ligadas a formação de pilus e fímbria. Nós também investigamos a contribuição do regulador transcricional Fur no stimulon do ferro em X. fastidiosa. Para tal, as regiões promotoras do genoma da cepa 9a5c foram varridas em busca de Fur boxes putativas. Nossas análises identificaram que regiões promotoras de 49 CDS contem elementos com características de Fur boxes. A funcionalidade de pelo menos uma das Fur boxes identificadas foi confirmada através de ensaios de alteração de mobilidade eletroforética que demonstraram sua interação específica com a proteína recombinante Fur de X. fastidiosa. Entretanto, nem todos os genes cuja expressão é modulada por alterações na concentração de ferro, são diretamente regulados por Fur, apoiando a hipótese de que Fur não é o único responsável pela modulação do stimulon de ferro em X. fastidiosa. Em conjunto, nossos dados apresentam novas evidências da relação entre a disponibilidade de ferro e a regulação de determinantes de patogenicidade e virulência em X. fastidiosa. / Xylella fastidiosa is the etiologic agent of a wide range of plant diseases including citrus variegated chlorosis (CVC), a major threat to citrus industry. Transcript levels in different iron availabilities were assessed with DNA microarrays representing 2608 (91.6%) coding sequences (CDS) of X. fastidiosa CVC strain 9a5c. In the presence of 100 uM of ferric pyrophosphate, 218 and 256 CDS were considered as up- and down-regulated, respectively. When treated with the iron chelator 2,2\'-dipyridyl, 193 CDS were considered as up-regulated and 216 as down-regulated. Differential expression for a subset of 44 CDS was further evaluated by RT-qPCR that showed a Pearson correlation of 0.77 with array results. The CDS differentially expressed upon the iron concentration shift participate in diverse cellular functions. Many CDS involved with regulatory functions, pathogenicity and cell structure, were modulated in both conditions tested suggesting that major changes in cell architecture and metabolism occur when X. fastidiosa cells are exposed to extreme variations in iron concentration. Interestingly, the modulated CDS include those related to colicin V-like bacteriocin synthesis and secretion and to pili/fimbriae functions. We also investigated the contribution of the ferric uptake regulator Fur to the iron stimulon of X. fastidiosa. Thus, the promoter regions of strain 9a5c genome were screened for putative Fur boxes. Our analyses identified Fur boxes-like elements in promoter regions of 49 CDS. The functionality of at least one Fur box was confirmed by electrophoretic mobility shift assays which demonstrated its interaction with X. fastidiosa recombinant Fur. However, not all genes that appeared to be modulated by iron concentration shift are directly regulated by Fur. This supports the hypothesis that Fur is not solely responsible for the modulation of the iron stimulon of X. fastidiosa. Taken together, our data present novel evidence for iron regulation of pathogenicity and virulence determinants in X. fastidiosa.

O isolamento do vírus da raiva (genótipo 1) a partir de morcegos não hematófagos está se tornando cada vez mais freqüente nas grandes cidades do Brasil. Este trabalho foi delineado para investigar a patogenicidade de um isolado do vírus da raiva, do morcego insetívoro Lassiurus ega, procedente do município de Presidente Prudente SP, em comparação ao vírus fixo da raiva, amostra CVS/32 (Challenge Vírus Standard). Os vírus foram reativados por meio de inoculação intracerebral em camundongos e os experimentos de patogenicidade foram realizados em camundongos e hamsters, desafiando-os pelas vias intramuscular (IM), intradérmica (ID), intranasal (IN) e abrasão superficial da pele (AP). A presença do vírus nos cérebros de animais que haviam manifestado sinais compatíveis à raiva, foi confirmada mediante a prova de imunofluorescência direta. Foram considerados para a avaliação da patogenicidade o quadro clínico, proporção de mortos, e a duração dos períodos de incubação (PI) e clínicos (PC) em dias. Em hamsters, o isolado de L. ega exibiu um quadro furioso, com proporção total de mortos de 2.60%; assim discriminada: 2.08% IM (PI: 11 dias; PC: 6 dias) e 8.33% IN (PI:10.66 ± 1.15 e PC: 7.33 ± 1.54). A presença do vírus no SNC foi detectada apenas em animais inoculados por essas vias. Por outro lado, o vírus CVS produziu um quadro paralítico com mortalidade total de 39.84%, com a seguinte distribuição: 62.50% IM (PI 7.50 ± 2.33; PC: 5.13 ± 1.89) 78.12% ID (PI 9.13 ± 2.23; PC 3.88 ± 2.23) 18.75% IN (PI 12.00 ± 2.77; PC 7.14 ± 2.54). Em camundongos, o isolado do L. ega manifestou sinais de agressividade e a raiva foi confirmada em animais inoculados IM e IN. A proporção de mortos observados em camundongos foi de 50.00% (PI 16.80 ± 2.20; PC 1.4 ± 0.54) e 30% (PI 14 ± 4.35; PC: 2.66 ± 0.57) respectivamente e o vírus CVS produziu mortalidade de 45.00% (PI: 6.30 ± 0.67; PC: 1.5 ± 0.70), 70% (PI: 7.14 ± 1.34; PC 2.28 ± 1.25) e 30% (PI:10.00; PC:1) pelas vias mencionadas acima, com quadro clínico de paralisia. O isolado de L. ega mostrou diferenças na proporção de mortos e quadro clínico furioso quando comparado com o CVS nos dois modelos animais. Os resultados sugerem que o contato com os morcegos insetívoros infectados pelo vírus da raiva representa um risco de transmissão da doença, por meio de ferimentos superficiais da pele provocadas pelas mordeduras ou ainda pela via respiratória, supostamente por meio de aerossóis. Pelo sequenciamento completo da proteína G viral do isolado do L. ega, foram observadas substituições na seqüência de aminoácidos nos sítios antigênicos AI, AII, assim como no domínio de fusão dependente de baixo pH. Os resultados obtidos, sugerem que as diferenças no comportamento biológico podem estar associadas às substituições encontradas na sequencia de aminoácidos da proteína G. / The isolation of rabies virus (genotype 1) from the non-hematophagous bats is becoming frequent in heavy urbanized areas in Brazil. This work intended to investigate the pathogenicity of a Brazilian rabies virus isolate from the insectivorous bat Lassiurus ega, from PresidentePrudente-SP, comparing with the CVS/32 (Challenge Virus Standard) fixed rabies virus strain. The viruses were reactivated through intracerebral inoculation into mice and the pathogenicity experiments were made in hamsters and mice, challenged by intramuscular (IM), intradermal (ID) and intranasal (IN) routes and by superficial abrasion of skin. The presence of virus in the brain of animals manifesting the signs compatible with rabies was confirmed by the direct immunofluorescence test. For the evaluation of the pathogenicity, the clinical manifestations, incubation (IP) and clinical (CP) periods in days and the mortality were considered. In hamsters, the isolate of L. ega exhibited a furious form of rabies with total mortality rate of 2.60%, with following distribution: 2.08% IM (IP: 11 days; CP: 6 days) and 8.33% IN (IP: 10.66 ± 1.15 and PC: 7.33 ± 1.54). The presence of rabies virus in the CNS was detected only in animals inoculated through IM and IN routes. The CVS strain has provoked paralytic disease with a total mortality rate of 39.84% as the follow: 62.50% IM (IP 7.50 ± 2.33; CP: 5.13 ± 1.89), 78.12% ID (IP 9.13 ± 2.23; CP 3.88 ± 2.23) and 18.75% IN (IP 12.00 ± 2.77; CP 7.14 ± 2.54). In mice, the isolate of L. ega manifested signs of aggressiveness and rabies was confirmed in animals that were inoculated intramuscularly and intranasally. The total mortality rate observed in mice was 20%, by the IM route was 50% (IP 16.80 ± 2.20; CP 1.4 ± 0.54) and 30% by the intranasal route (IP 14.00 ± 4.35; CP: 2.66 ± 0.57) respectively. The CVS strain showed a total mortality rate of 45.00% and by the IM route, 100% (PI: 6.30 ± 0.67; CP: 1.5 ± 0.70), by the ID route, 70% (IP: 7.14 ± 1.34; CP 2.28 ± 1.25) and by IN, 30% (IP: 10, 00; C: 1.00) showing signs of paralysis. Compared to the CVS strain, the isolate of L. ega showed difference in mortality rate and signs of aggressiveness were found both in hamster and mouse model. The results suggest that the contact with the insectivorous bats infected with rabies virus would represent a risk of disease transmission, by means of superficial wounds of the skin inflicted by bites or by inhalation of aerosols. By the complete sequencing of the viral G protein of the isolate of L. ega, sequencings of amino acids substitutions were observed at antigenic sites AI, AII, as well as the in domain of fusion dependent on low pH. According to the results, differences in the biological behavior may be associated to the substitutions found in the amino acids sequence of the G protein.

Hipercolesterolemia familiar (HF) é uma doença autossômica dominante, caracterizada por elevados níveis plasmáticos da lipoproteína de baixa densidade (LDL), desenvolvimento de xantoma tendíneo e arco corneal, além do aumento do risco de doença coronariana e acidente vascular cerebral prematuros. Frequentemente subdiagnosticada, estima-se que apenas 10% dos 400.000 indivíduos com HF no Brasil têm conhecimento da própria doença; afetando, desta forma, a qualidade e a expetativa de vida dos pacientes. Mutações no gene do receptor da LDL (LDLR) são consideradas as alterações genéticas mais frequentes para o desenvolvimento da hipercolesterolemia familiar, pois comprometem a capacidade de remoção das partículas de LDL circulantes, promovendo seu aumento em níveis plasmáticos. Já foram descritas mais de 1600 mutações diferentes no gene LDLR associadas ao fenótipo da HF; entretanto, ainda é difícil determinar em muitas delas o efeito deletério na atividade do receptor. O objetivo desse estudo foi identificar e caracterizar funcionalmente mutações no gene LDLR não descritas na literatura para determinar sua patogenicidade na hipercolesterolemia familiar. Foi avaliada a atividade residual de LDLR através da captação de LDL marcado com fluoróforo lipofílico em cultura de linfócitos T dos pacientes portadores das mutações analisadas após estimulação dos linfócitos T por mitógenos específicos. As mutações Cys82Ser, Thr404Ser, Gly529Arg e His285Tyr foram consideradas patogênicas por acarretarem diminuição da atividade residual do receptor de LDL. As mutações Glu 602X e His388ProfsX53 confirmaram sua patogenicidade e podem ser considerados como controle positivo para futuros ensaios funcionais. Estudos que esclareçam os mecanismos moleculares da HF e da relação genótipo/fenótipo abrem perspectivas para o desenvolvimento de terapias mais específicas na redução dos níveis de colesterol e, consequentemente, da morbidade e mortalidade associadas às doenças cardiovasculares. / Familial hypercholesterolemia (FH) is an autosomal dominant disorder characterized by elevated plasma levels of low-density lipoprotein (LDL), and development of corneal arcus tendinous xanthoma, and increased risk of coronary heart disease and premature stroke. Often misdiagnosed, it is estimated that only 10% of the 400.000 patients with FH in Brazil has knowledge of the disease itself, affecting in this way the quality and life expectancy of patients. Mutations in the LDL receptor (LDLR) are considered the most frequent genetic alterations for the development of familial hypercholesterolemia because compromise the ability of removal of circulating LDL particles, promoting its increase in plasma levels. Have been described over 1600 different mutations in the LDLR gene associated with the phenotype of FH, however, it is still difficult to determine in many of the deleterious effects on receptor activity. The aim of this study was to identify mutations in the LDLR gene and functionally characterize mutations not described in the literature to determine its pathogenicity in familial hypercholesterolemia. The residual activity of LDLR was evaluated by raising LDL labeled with lipophilic fluorophore in cultured T lymphocytes of patients with the analyzed mutations after stimulation of T lymphocytes by specific mitogen. The substitution mutations Cys82Ser, Thr404Ser, Gly529Arg e His285Tyr were considered pathogenic because it causes decrease of the residual activity of the LDL receptor in T lymphocytes. The His388ProfsX53 and Glu602X mutations confirmed their pathogenicity and can be considered as positive control for future functional assays. Studies to clarify the molecular mechanisms of HF and genotype/ phenotype open perspectives for the development of more specific therapies for reducing cholesterol levels, and therefore the morbidity and mortality associated with cardiovascular diseases.

Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2017-06-21T17:57:41Z No. of bitstreams: 1 michelecristineribeirodefreitas.pdf: 1495355 bytes, checksum: 2dcd69bdf9054b1d66175c1f6955b8bd (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2017-08-07T19:18:16Z (GMT) No. of bitstreams: 1 michelecristineribeirodefreitas.pdf: 1495355 bytes, checksum: 2dcd69bdf9054b1d66175c1f6955b8bd (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-07T19:18:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 michelecristineribeirodefreitas.pdf: 1495355 bytes, checksum: 2dcd69bdf9054b1d66175c1f6955b8bd (MD5) Previous issue date: 2010-05-14 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A espécie Bacteroides fragilis é um anaeróbio Gram negativo membro da microbiota indígena do trato gastrintestinal, e é comumente isolado de infecções clínicas. À medida que as drogas antimicrobianas são introduzidas no ambiente, os microrganismos respondem, tornando-se resistentes, podendo gerar alterações na fisiologia celular, e que podem interferir na relação bactéria-hospedeiro. Nosso objetivo foi investigar alterações em B . fragilis após exposição a concentrações subinibitórias de ampicilina (AMP), ampicilina/sulbactam (AMS), clindamicina (CLI) e cloranfenicol (CLO); e investigar aspectos da relação droga-bactéria-hospedeiro, após desafio experimental em camundongos. Foram obtidas 4 linhagens bacterianas: BfAMP, BfAMS, BFCLI e BfCLO. Alterações na morfologia, padrões de crescimento, habilidades bioquímicas e fisiológicas, perfis de expressão protéica e semelhança genética foram avaliadas comparativamente entre as linhagens obtidas e a linhagem Bf parental ATCC 25285. Infecção experimental foi realizada em camundongos convencionais, desafiados intraperitonealmente. Histologia de baço e fígado, além de dosagem das citocinas TNF-α, IL-6, IL-10, IL-17 e IFN-γ no intestino, foram realizadas. Ampicilina e ampicilina/sulbactam induziram alterações morfológicas significativas nas células bacterianas na primeira exposição. Foi verificada diminuição da sensibilidade aos antimicrobianos em todas as linhagens selecionadas. Além disso, a exposição aos antimicrobianos foi capaz de induzir alterações nos padrões bioquímico-fisiológicos bacterianos, se comparado com a amostra parental. Em relação à capacidade de formação de biofilme, observou-se alteração em todas as linhagens, quando comparadas à parental, sendo que as linhagens selecionadas pela exposição aos antimicrobianos tiveram capacidade de aderência diminuída. A identidade genética das linhagens bacterianas obtidas foi confirmada e não foram detectados fragmentos de DNA polimórfico. Variações nos perfis de citocinas foram verificadas nos animais desafiados com a linhagem BfAMS. Alterações histopatológicas também foram observadas no baço e fígado dos animais desafiados com as linhagens de B . fragilis selecionadas por exposição aos antimicrobianos. Nossos resultados permitem sugerir fenômenos relacionados à regulação da expressão gênica como uma resposta momentânea ou evolutiva dos microrganismos. Estes resultados podem ainda sugerir que essas drogas tem diferentes interações com a célula bacteriana, que podem ser prejudiciais para a interação bactéria-hospedeiro. Assim, nossos resultados chamam a atenção para o risco de terapia antimicrobiana inadequada, mesmo com baixas concentrações de fármacos, que poderiam alterar os níveis de expressão gênica de uma bactéria e modular sua patogenicidade. / Bacteroides fragilis is an anaerobic Gram negative rod member of resident gut microbiota, isolated from clinical infections due in part to its potent virulence factors. As antimicrobial drugs are introduced into the environment, microorganisms respond by becoming resistant and may cause changes in cell physiology. These changes can interfere with the bacterium-host relationship. The aim of this study was to investigate changes in B . fragilis after exposure to ampicillin (AMP), ampicillin/sulbactam (AMS), clindamycin (CLI) and chloramphenicol (CLO); and to investigate changes in host-bacteria relationships after experimental challenge in mice. Four bacterial strains were obtained: BfAMP, BfAMS, BFCLI e BfCLO. Morphological changes, growth patterns, biochemical and physiological abilities, protein expression profile and genetic relationships were comparatively evaluated among the drug-selected strains and Bf parent ATCC 25285. Experimental infection was performed intraperitoneally in conventional mice. Liver and spleen histology, besides cytokines determinations were performed in the intestines. Ampicillin and ampicillin/sulbactam induced the highest significant morphological alterations in the bacterial cells after the initial drug exposure. Decreased sensitivity to all antimicrobials was observed for all drug-selected bacteria strains. Furthermore, drug-exposure was able to induce changes in biochemical pathways and bacterial physiology, if compared with the Bf parent strain. Regarding the ability of biofilm formation, alterations in adherence properties were observed for all drug-selected bacteria, being this characteristic down regulated. The genetic identities were confirmed for the selected strains and no DNA polymorphisms were detected. The cytokine patterns in the intestines from mice challenged with drug-selected bacteria were highly altered, mainly considering the BfAMS strain, as well as the histological aspect concerning the liver and the spleen excised from the experimentally challenged animals. Our results may suggest phenomena related to the gene expression regulation, as a microbial momentary or evolutionary response to the selective pressure of the antimicrobial drugs. These results may also suggest that these drugs have different interactions with the bacterial cell which can be harmful to the host-bacteria relationships. In this way, the data ask for attention regarding the risks of inappropriate chemotherapy, even with low concentrations of the antimicrobial drugs, which might the bacteria genetic expression levels and modulate their pathogenicity

Orientadores: Regina Maura Bueno Franco, Eliete Maria Silva, Jancarlo Ferreira Gomes / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-21T03:30:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rebolla_MayraFrozoni_M.pdf: 5078074 bytes, checksum: 0e330cef23d1c66a5672e38240041608 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Parasitoses intestinais são frequentes na população usuária do Sistema Único de Saúde de São Sebastião da Grama, município do interior do estado de São Paulo. Durante a ocorrência de um surto de gastroenterite em uma das creches do município, objetivou-se investigar a ocorrência de enteroparasitos nos trabalhadores e crianças das instituições municipais urbanas de educação infantil, avaliar o desempenho de técnicas diagnósticas na detecção de Giardia duodenalis em amostras fecais provenientes de creche, local de surto de gastroenterite, e implantar um programa de controle desta parasitose, o "Programa de Controle da Giardiose em Creches e Pré-escolas" (PCGCP) a fim de avaliar a adesão de gestores, trabalhadores e famílias das crianças às medidas higiênicas no ambiente escolar infantil. Para tanto se utilizou amostras fecais de 172 crianças e 33 trabalhadores, processadas pelos métodos Three Fecal Test Conventional® e Modified®, diagnosticando-se 89,53 % das crianças e 71,87 % dos trabalhadores positivos para parasitos e comensais. Blastocystis hominis foi o parasito intestinal de maior prevalência entre as crianças (86,62 %) e trabalhadores (65,62 %). Os casos de monoparasitismo foram mais frequentes que os de poliparasitismo entre as crianças e os trabalhadores estudados, bem como a prevalência de protozoários foi maior que a de helmintos. O modelo de regressão logística evidenciou associação significativa entre criança atendida na creche e a frequência de infecção por enteroparasitos (p = 0,01), por G. duodenalis (p = 0,00), por B. hominis (p = 0,02), e pelos protozoários intestinais (p = 0,01). Entre criança menor de um ano e a frequência de infecção por G. duodenalis (p = 0,00), e entre crianças cujos domicílios não possuíam coleta de lixo e a frequência de infecção por helmintos (p = 0,03). Os resultados obtidos utilizando-se os métodos de Faust et al. e ELISA foram concordantes substancialmente, contudo, a presença de resultados falsos positivos verificados no imunoensaio limitam sua aplicabilidade como teste diagnóstico em uma situação de surto. Como ferramenta de controle e prevenção da giardiose, foi implantado e avaliado o PCGCP nestes ambientes do estudo. A adesão e ativo engajamento dos gestores, trabalhadores e famílias das crianças ao PCGCP foi considerada satisfatória, e os resultados sugerem que o treinamento das práticas para se evitar a giardiose deva ser mantido de forma permanente a fim de se alcançar uma efetiva prevenção nos ambientes escolares infantis / Abstract: Intestinal parasites are common in the population using the Unified Health System of São Sebastião da Grama, a municipality in the state of São Paulo. The aims of this study to investigate the occurrence of intestinal parasites in children and workers of urban municipal institutions of early childhood education, to evaluate the performance of diagnostic techniques for detection of Giardia duodenalis in stool samples from daycare centers, where outbreaks of gastroenteritis occur. To implement a program to control this parasite, the "Program of Control of Giardiasis in Day Care Centers and Preschools" (PCGCP), in order to assess the commitment of managers, workers and children?s families to hygienic measures within these school environments. For this purpose we used fecal samples from 172 children and 33 workers, processed using the Conventional and Modified Three Fecal Test® method. As a result, 89,53 % of the children and 71,87 % of workers were diagnosed positive for pathogenic parasites and commensals. Blastocystis hominis was the most prevalent intestinal parasite among children (86,62 %) and employees (65,62 %). Monoparasitism cases were more frequent than those of multiple parasitic infections among children and workers. The prevalence of protozoa was greater than that of helminths. The logistic regression model revealed a significant association between child attended in the day care center and the frequency of infection with intestinal parasites (p = 0,01), by G. duodenalis (p = 0,00), by B. hominis (p = 0,02), and the intestinal protozoa (p = 0,01). Higher indices were found among children under one year of age (frequency of infection with G. duodenalis (p = 0,00)) and among children whose homes had no waste collection (frequency of helminth infection (p = 0,03)).The results obtained using the methods of Faust et al. and ELISA were substantially consistent. However, the presence of false positive results observed in the immunoassay limits its applicability as a diagnostic test in an outbreak situation. As a tool for control and prevention of giardiasis, the program PCGCP was implemented and its adherence was evaluated in the sites investigated, places considered at the scope of this study. The commitment and active engagement of managers, workers and families with children to PCGCP was considered satisfactory, and the results suggest that training practices to avoid giardiasis should be made permanent for an effective prevention in day care centers and preschools environments to be achieved / Mestrado / Parasitologia / Mestre em Parasitologia

Orientador: Wanderley Dias da Silveira / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-21T23:45:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rojas_ThaisCabreraGalvao_D.pdf: 2609032 bytes, checksum: 23a0546c76c17eff8087d0160c69308d (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: A bactéria Escherichia coli coloniza o trato intestinal de aves e humanos, de maneira comensal sem causar processos infecciosos. No entanto alguns clones adquiriram fatores de virulência específicos, permitindo o desenvolvimento de diferentes doenças como infecção do trato urinário, diarréia e meningite em humanos e colibacilose em aves. As linhagens que causam doença em aves são tipicamente denominadas APEC (Avian Pathogenic Escherichia coli). Neste trabalho foram sequenciados e anotados os genomas de quatro linhagens APECs (SCI-07, SEPT362, S17 e O8)que, juntamente com mais nove genomas referentes a linhagens de Escherichia coli patogênicas para aves e patogênicas para humanos foram utilizados para a busca de genes sob seleção positiva. Os genes homólogos foram agrupados,e posteriormente submetidos ao alinhamento de códons e das sequencias protéicas correspondentes. Uma árvore filogenética foi gerada para cada grupo de proteínas homólogas. Testes estatísticos determinaram qual entre os modelos de seleção neutra ou seleção positiva melhor explicou os dados existentes (alinhamentos de códons e árvores filogenéticas). Essas análises detectaram duzentas e cinquenta e quatro grupos de genes homólogos com evidência de seleção positiva. Para cada grupo foi realizado um teste de recombinação para verificar se o aumento na variação das sequencias não era devido à conversão gênica, resultando em cento e dezesseis grupos de genes homólogos sob seleção positiva. A proteína correspondente a um gene de cada grupo de genes homólogos foi identificada, por meio da ferramenta Blast. Diversos fatores de virulência, já conhecidos, e proteínas regulatórias puderem ser detectados. Os genes sob seleção positiva, também foram submetidos à anotação considerando o termo GO (Gene Ontology),apenas da categoria processo biológico. Dos cento e dezesseis genes apenas cinquenta e sete puderam ser identificados por meio dessa metodologia. O resultado da classificação dos genes dentro da classe GO, considerando o terceiro nível hierárquico,mostrou que a maioria dos genes anotados (31) tinha relação com o metabolismo primário.As proteínas cuja identificação, por meio do blast, não foi possível (proteínas hipotéticas)foram submetidas à análise de predição de localização subcelular e de peptídeo sinal. Essas análises revelaram que três proteínas desconhecidas (hypothetical proteinECIAI39_1028, hypothetical proteinZ0639e hypothetical proteinEC042_3791) são potenciais alvos para estudos que visam à busca de novos fatores de virulência de Escherichia coli patogênicas / Abstract: The bacterium Escherichia coli colonizesthe intestinal tract of birds and humans, in a commensal relationship without causing infection. However, some clones have acquired specific virulence factors allowing the development of various diseases such as urinary tract infection, diarrhea and meningitis in humans and colibacillosis in poultry. The strains that cause disease in birds are typically named APEC (Avian Pathogenic Escherichia coli). In this study we sequenced and annotated the genomes of four APECs strains (SCI-07, SEPT362, S17 and O8). These genomes and nine others avian pathogenic Escherichia coli and humans pathogenic strains genomes were used for studying genes under positive selection. The homologous genes were grouped and then subjected to codons and corresponding protein sequences alignment. A phylogenetic tree was generated for each group of homologous proteins. Statistical tests determined which among neutral or positive selection models best explains the existing data (codon alignments and phylogenetic trees). This analyzes detected two hundred fifty-four groups of homologous genes with positive selection evidence. For each group a recombination test was conducted to verify if the variation increase in the sequences was not due to gene conversion, resulting in one hundred and sixteen groups of homologous genes under positive selection. The protein corresponding to a gene of each group of homologous genes under positive selection was identified through Blast tool. Genes under positive selection were annotated considering the GO term (Gene Ontology), just for the biological process category. Only fifty-seven genes could be identified using this methodology. The gene classification within the GO classes, considering only the third hierarchical level showed that most of the annotated genes (31) were related with the primary metabolism. Proteins which blast identification was not possible (hypothetical proteins) were subjected to sub cellular localization and signal peptide prediction analyzes. These analyzes revealed that three unknown proteins (hypothetical protein ECIAI39_1028, hypothetical protein Z0639e hypothetical protein EC042_3791) are potential targets for studies, in order to search for new virulence factors of pathogenic Escherichia coli / Doutorado / Microbiologia / Doutora em Genética e Biologia Molecular

Orientadores : Thales Rocha de Mattos Filho, Francisco Carlos Groppo / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-04T03:41:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Motta_RogerioHeladioLopes_D.pdf: 659292 bytes, checksum: 254fb5f4f10c3501c081c5129d2db30f (MD5) Previous issue date: 2005 / Doutorado / Farmacologia, Anestesiologia e Terapeutica / Doutor em Odontologia

A Mancha marrom é uma das principais doenças do trigo, causada pelo fitopatógeno Bipolaris sorokiniana, responsável por grandes perdas econômicas no cultivo do trigo em todo mundo. Este fungo apresenta uma grande diversidade morfológica, fisiológica e genética. O objetivo do trabalho foi utilizar marcadores moleculares e fenotípicos para avaliar a variabilidade genética em isolados monopóricos e polispóricos de Bipolaris sorokiniana de sementes de trigo oriundos do Brasil e outros países. A caracterização molecular envolveu as metodologias URP-PCR, PCR-RFLP, REP-PCR, BOX-PCR, ERIC-PCR assim como testes isoenzimáticos e de patogenicidade. A análise de patogenicidade revelou que isolados polispóricos são mais severos para as sementes que para as partes aéreas das plantas quando comparados com os monospóricos. A caracterização isoenzimática e molecular através das técnicas URP-PCR, PCR-RFLP, REP-PCR, BOX-PCR, ERIC-PCR exibiram uma grande diversidade intra-populacional. REP-PCR e ERIC-PCR revelaram maior diversidade entre os isolados, com uma similaridade inferior a 70%. No entanto, as amplificações realizadas com o BOX-PCR apresentaram um perfil com uma maior similaridade. Com os resultados obtidos a partir das amplificações com BOX-PCR um par de primers foi desenhado a partir de um fragmento comum a todos os isolados e que foi capaz de amplificar um produto único ao gênero Bipolaris sp. entre as amostras testadas. Com a realização de mais ensaios com outros microrganismos é possível que o mesmo possa ser utilizado como um marcador deste gênero. A técnica de PCR-RFLP utilizando as enzimas HaeIII, HinfI, HhaI, EcoRI e HindIII apresentaram perfis de restrição com variação no número de fragmentos e no peso molecular. Uma possível explicação para à variabilidade observada em todas as técnicas utilizadas pode ser atribuída à condição multinucleada das células de B. sorokiniana bem como a heterocariose, que pode levar a recombinação mitótica e ao polimorfismo. / The brown spot is a major disease of wheat caused by the pathogen Bipolaris sorokiniana, responsible for large economic losses in wheat cultivation worldwide. This fungus has a wide morphological, physiological and genetic diversity. The main objective of this work was to characterize monosporic and polisporic B. sorokiniana isolates of wheat seeds from Brazil and other countries. Pathogenicity tests were conducted to evaluate the feasibility of virulence genes as well as different molecular methodologies were tested as: URP-PCR, PCR-RFLP, REP-PCR, BOX-PCR, ERIC-PCR and isoenzyme patterns of the isolates. The pathogenicity assay reveals that the polysporic isolates caused a more severe disease to seeds than to aerial parts of the plants when compared to single spore isolates. Isoenzyme and molecular characterization through the URP-PCR, PCR-RFLP, REP-PCR, BOX-PCR, ERIC-PCR techniques showed a large intra-population diversity among the isolates. REP and ERIC-PCR revealed greater diversity among the isolates with a similarity below 70%. However, the amplification results using with BOX- PCR showed a highest similarity. The PCR-RFLP using HaeIII, HinfI , HhaI , EcoRI and HindIII restriction enzymes showed a profile variation between all isolates in relation to the number and molecular weight of the fragments. However the results obtained with BOX- PCR amplifications a higher similarity was obtained. With this result a primer was designed, based on a fragment common to all isolates, and the amplifications using these primers produced a unique fragment with the Bipolaris genus among others isolates tested. More phytopatogeneic isolates must be tested in order to confirme the specificity for Bipolaris sp. With the PCR-RFLP assay, using the enzymes HaeIII, HinfI, HhaI, EcoRI e HindIII, variability was observed among the restriction patterns realated to the number of fragments and molecular weight. One possible explanation for the observed variability in all techniques used may be attributed to the condition of multinucleated cells of B. sorokiniana and the heterokaryosis which can lead to mitotic recombination and polymorphis.

O cancro cítrico é considerado na atualidade uma das doenças mais perigosas e prejudiciais à citricultura brasileira e mundial, devido aos danos causados na produção e qualidade dos frutos, sendo a Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) a bactéria fitopatogênica responsável por tais prejuízos. Nosso laboratório iniciou estudos de identificação e análise funcional das interações proteína-proteína de Xac envolvendo sistemas importantes para sua patogenicidade (Alegria et. al., 2004). Nosso objetivo principal foi o estudo funcional e fisiológico de interações já identificadas entre proteínas do sistema de secreção do tipo III (T3SS) da Xac. O foco de nossa pesquisa foi tentar desvendar a importância biológica, na patogenicidade de Xac, das interações proteína-proteína: HrpB2-HrcU; HpaA-HpaB-HrcV; HrpD6-HrpB1- HrpW. Com este intuito clonamos, expressamos e purificamos as proteínas recombinantes. Produzimos soros policlonais específicos contra cada uma das proteínas citadas acima. Estudamos a interação entre as proteínas in vitro por meio de técnicas como Far-Western Blot, Pull Down, fluorescência e dicroísmo circular. Outro enfoque do nosso trabalho foi monitorar a contribuição individual destas proteínas no desenvolvimento da doença in planta. Para isso produzimos cepas de Xac mutantes para os genes hrpB2, hrcU, hpaA, hpaB, hrpB1 e hrpG. Os nocautes não polares foram infiltrados em plantas de laranja pêra, assim como também as cepas de complementação correspondentes, e assim foi testada a habilidade de desenvolver o cancro cítrico e/ou reverter os sintomas da doença. Também foi monitorada a capacidade de multiplicação e sobrevida in planta das cepas Xac ΔhrpB2, ΔhrcU e ΔhpaB, assim como a secreção das proteínas HrpB2 e HpaA pelo T3SS de Xac. Estudamos com mais detalhe a possível função de HrpB2 no T3SS de Xac, desenvolvendo experimentos para determinar a região da proteína imprescindível para sua função permanecer inalterada. Realizamos mutações sítio dirigidas, a fim de introduzir códons de terminação em diferentes regiões da proteína e testar a habilidade desses fragmentos de reverter os sintomas da doença na planta. Monitoramos a capacidade de proteínas mutantes de reverter fenótipos de patogenicidade em citrus, ausentes na cepa Xac ΔhrpB2 e revertidos na cepa de complementação Xac ΔhrpB2+pUFR047_hrpB2. Desta maneira, determinamos que os últimos seis aminoácidos de HrpB2 estão envolvidos no desenvolvimento da/s função/ões em Xac. / Citrus canker, caused by the bacterial pathogen Xanthomonas axonopodis pv citri (Xac), is a disease with significant economic consequences for the Brazilian and global citrus industry due to reductions in production and fruit quality. Our laboratory has initiated studies for the identification and functional analysis of protein-protein interactions involving Xac systems involved in pathogenicity (Alegria et. al., 2004). One objective has been to study functional and physiological interactions between proteins that make up the Xac Type III secretion system (T3SS). The focus of the present study is to unravel the biological significance in Xac pathogenicity of the following previously identified protein-protein interactions: HrpB2-HrcU; HpaA-HpaBHrcV; HrpD6-HrpB1-HrpW. With therefore cloned, expressed and purified the above-mentioned recombinant proteins. Specific polyclonal serum were produced and interactions between the proteins were studied in vitro using a variety of methods, including Far-Western Blot, Pull Down, fluorescence and circular dichroism. To monitor the individual contribution of these proteins in disease development in planta, we produced mutant Xac strains in which the hrpB2, hrcU, hpaA, hpaB, hrpB1 and hrpG genes were disrupted. The nonpolar knockouts as well as the corresponding complementation strains were infiltrated into Citrus sensensis plants and the development of citrus canker symtoms and bacterial proliferation in planta was evaluated. We also evaluated the T3SS-dependent secretion of proteins HpaA and HrpB2 by these Xac mutant strains. Structure-function relationships of the HrpB2 protein were studied in more detail. We developed experiments to determine the region of the protein essential for its function. We produced a series of hrpB2 mutants which were used to complement the hrpB2 knockout strain and evaluated their abilities to reverse the symptoms of the disease in the plant. The results demonstrate that the last six amino acids HrpB2 are important for its function in the development of disease symptoms by Xac.