O fungo Moniliophthora perniciosa é o agente causal da vassoura de bruxa no cacaueiro (Theobroma cacao L.). Três biótipos distintos (biótipos -C, -L e -S) são reconhecidos de acordo com a especificidade quanto ao hospedeiro. O presente estudo teve como objetivo a análise da diversidade genética com o uso de marcadores microssatélites de 134 isolados dos biótipos -C, -L e -S de M. perniciosa coletados principalmente na Amazônia Brasileira e áreas de cultivo. A diversidade genética foi associada com virulência e/ou agressividade dos isolados a acessos diferenciais (suscetíveis ou resistentes) de T. cacao. Os biótipos -S e -L apresentaram uma diversidade gênica e genotípica superior em comparação com o biótipo-C. A população do biótipo-C com maior diversidade genotípica foi a do Acre, seguida pelo Oeste do Amazonas, ambas correspondendo a áreas em que se encontra cacaueiro nativo no Brasil. A população com menor diversidade genotípica foi a da Bahia, que corresponde a uma área onde a presença de M. perniciosa foi registrada mais recentemente, no final da década de 1980. Dos 134 isolados, 83 correspondem a genótipos multilocos únicos, sendo encontrados apenas dois indivíduos com genótipos idênticos para o biótipo-S, e nenhum para o biótipo-L. No biótipo-C foram identificados 61 genótipos multilocos em 111 isolados coletados em áreas de ocorrência natural e cultivo de cacau. Os dados de similaridade genética corroboram que o biótipo-C e também o -S que são homotálicos evoluíram de um biótipo heterotálico, possivelmente o biótipo-L. As populações do biótipo-C do estado do Pará e Leste do Amazonas compartilham ancestrais comuns em Ji-Paraná (RO) e Assis Brasil (AC), enquanto que a região sob a influência do rio Amazonas possui outra ascendência, que seria em Atalaia do Norte (Alto Solimões). Os genótipos multilocos da Bahia exibiram origens análogas as da população do Baixo Amazonas, com ascendência em Ji-Paraná (RO) e Alenquer (PA). Na avaliação de agressividade de M. perniciosa, a concentração do inóculo se mostrou determinante para a manifestação dos sintomas, com o aumento de plântulas com sintomas à medida que aumenta a concentração de basidiósporos. Dentre as progênies avaliadas, \'PA 195 x CAB 214\' apresentou menor proporção de plântulas com sintomas. Na inoculação com isolados de M. perniciosa oriundos do Acre e Amazonas, a proporção de plântulas com sintomas foi superior quando inoculadas com o isolado de Tabatinga (AM). O genótipo de cacaueiro que apresentou uma reação diferenciada foi o \'CAB 214\', para o qual nenhuma plântula apresentou sintomas quando inoculada com o isolado de Marechal Thaumaturgo (AC). Com o uso de microssatélites os genótipos multilocos de Tabatinga (AM) e Marechal Thaumaturgo (AC) foram identificados em grupos distintos. Na análise de treze genes de patogenicidade induzidos pela limitada disponibilidade de N, o gene 88KD foi o que demonstrou o maior número de transcritos acumulados. Os isolados que apresentaram uma mesma tendência em seus genes mais expressos foram Tabatinga (AM) e Óbidos (PA) que apesar de possuírem origens geográficas distintas, foram identificados no mesmo grupo na análise com microssatélites / The fungus Moniliophthora perniciosa is the causal agent of witches\'broom in cacao (Theobroma cacao L.). Three different biotypes (C-; S-; and L-biotypes) are recognized according to host specificity. The present study aimed to analyze the genetic diversity using microsatellite markers for 134 isolates of the C-, L- and S- biotypes of M. perniciosa collected mainly in the Brazilian Amazon and areas of cultivation. Genetic diversity was associated with virulence and/or aggressiveness of isolates in differential accesses (susceptible or resistant) of T. cacao. The L- and S- biotypes showed a higher genetic and genotype diversity compared with C-biotype. Of the 134 isolates, 83 corresponded to unique multilocus genotypes, and found only two individuals with identical genotypes for the S-biotype, and none for the L-biotype. In the C-biotype were identified 61 multilocus genotypes in 111 isolates collected in areas of natural occurrence and cultivation of cocoa. The genetic similarity data corroborate that the C- and S- biotypes that are apparently homothallic evolved from a heterothallic biotype, possibly L-biotype. The populations of C-biotype of the state of Para and Amazonas East share common ancestors, in Ji-Paraná (RO) and Assis Brazil (AC), while the region under the influence of the Amazon River has another descent that would be in the Atalaia do Norte (Upper Solimões). The multilocus genotypes from Bahia showed a similar origin of the population of the Lower Amazon, with ancestry in Ji-Paraná (RO) and Alenquer (PA). In the evaluation of aggressiveness of M. perniciosa, the inoculum concentration proved to be decisive for the manifestation of symptoms, with the increase of seedlings with symptoms as increases the concentration of basidiospores. Among the progenies, \'PA 195 x CAB 214\' showed a lower proportion of seedlings with symptoms. In inoculation with M. perniciosa from Acre and Amazonas, the proportion of seedlings with symptoms was higher when inoculated with the isolate from Tabatinga (AM). The genotype of cocoa that had a differentiated reaction was the \'CAB 214\', for which no plants showed symptoms when inoculated with the isolate Marechal Thaumaturgo (AC). With the use of microsatellite, the multilocus genotypes of Tabatinga (AM) and Marechal Thaumaturgo (AC) were identified in different groups. In the analysis of thirteen genes of pathogenicity induced by the limited availability of N, 88KD gene showed the highest number of transcripts. The isolates that showed a similar trend in their more expressed genes were Tabatinga (AM) and Óbidos (PA) that despite having different geographical origins were identified in the same group in the analysis with microsatellite

Colletotrichum species are considered one of the most economically important plant pathogens. They cause many losses in tropical, subtropical and temperate regions affecting a wide range of plant species. In tropical and subtropical regions C. gloeosporioides and C. acutatum are associated with significant losses on pre and post-harvest anthracnoses. There are still many features to understand about Colletotrichum biology and its systematics. The accurate identification of species involved with each anthracnose is of high relevance to establish management strategies to control the disease. Although the great advances on Colletotrichum systematics, species complex such as C. gloeosporioides and C. acutatum are used in a broad sense in Brazil. These complexes were recently investigated and showed to be highly genetic and geographic variable. In this study multigene analysis were carried out based on ITS, GAPDH, CHS-1, TUB2 and CAL or HIS3 partial sequences for strains of C. gloesporioides and C. acutatum complexes collected from fruit crops in Brazil. Strains from different countries and exepitypes and others sequences available on GenBank from the species accepted on both complexes were added on dataset. Six strains from C. gloeosporiodes complex and five for C. acutatum were selected based on multigene phylogeny to investigate the pathogenicity through inoculations on detached fruit. The multigene phylogenies showed the occurrence of species in Brazil related to those complexes with a high genetic variability among them. The phylogeny of Brazilian strains belonging to the C. gloeosporioides complex showed that C. siamense represents the most genetically and host-specific variable clade. In contrast, C. asianum clade grouped only strains isolated from mango. The strains from this clade used on pathogenic test were not able to infect avocado and one of the strains caused symptoms only on mango. All strains from Brazil grouped in one subclade within the C. fructicola clade and seem to represent a genetically distinct group. C. theobromicola is first reported causing anthracnose on acerola fruit. Three new species (C. polyphialidicum, C. paranaense and C. pruni) belonging to the C. acutatum complex were recognized and their morphologic descriptions were provided. The pathogenic test for the strains in the C. acutatum complex showed their cross infection ability, but in some cases the larger lesions were produced on the original host. Most brazilian strains from C. acutatum complex grouped in one subclade within the C. nymphaeae clade and seem to be genetically distinct. / Fungos do gênero Colletotrichum são considerados um dos mais importantes economicamente na Fitopatologia. Espécies desse gênero são encontradas amplamente disseminadas e estão associadas a diversas espécies de plantas hospedeiras. Em regiões tropicais e subtropicais, espécies dos complexos C. gloeosporioides e C. acutatum são a principal causa das antracnoses em pré e póscolheita de frutos e consequentemente causam significantivas perdas. Ainda há muitos aspectos a serem compreendidos sobre o gênero Colletotrichum, como a biologia e a sistemática. A acurada identificação das espécies associadas a antracnoses é de suma importância para o estabelecimento de estratégias de controle. No entanto, apesar dos grandes avanços na sistemática desse gênero, complexos de espécies como aquelas citadas acima são tratados de modo genérico no Brasil. Estes complexos de espécies foram recentemente estudados e considerados geneticamente e geograficamente variáveis. Neste sentido, o presente trabalho teve como objetivo caracterizar isolados de Colletotrichum spp. associados a diferentes frutos e regiões do Brasil por meio de análise filogenética. Para análise multilocus, foram utilizadas sequências parciais dos genes ITS, GAPDH, CHS-1, TUB2 and CAL ou HIS3. Sequências de espécies-tipos disponíveis no GenBank e de isolados de diferentes países foram adicionadas ao conjunto de dados. Com base nos resultados obtidos por meio de filogenia multilocus, seis isolados do complexo C. gloeosporiodes e cinco do complexo C. acutatum foram escolhidos para testes de patogenicidade cruzada. A espécie C. siamense, pertencente ao complexo C. gloeosporioides, foi a mais variável geneticamente e quanto ao hospedeiro de origem. Diferentemente, apenas isolados obtidos de manga se agruparam no clado C. asianum. Isolados agrupados neste clado não infectaram abacate e um dos isolados (CPC 20969) causou sintomas apenas em manga. No clado C. fructicola, isolados coletados no Brasil se agruparam em um subclado e parecem representar um grupo geneticamente distinto. A espécie C. theobromicola é relatada pela primeira vez em acerola. Foram identificadas três novas espécies, C. polyphialidicum, C. paranaense e C. pruni, pertencentes ao complexo C. acutatum. Isolados brasileiros agrupados no clado C. nymphaeae parecem representar um grupo geneticamente distinto, todos se agruparam em um subclado. Isolados do complexo C. acutatum utilizados no teste de patogenicidade provocaram sintomas nos hospedeiros testados, porém, em algumas inoculações, as lesões foram maiores no hospedeiro de origem.

Orientador: Antonio Carlos Monteiro / Banca: Odair Aparecido Fernandes / Banca: Luis Garrigós Leite / Resumo: A broca da cana Diatraea saccharalis (Fabricius, 1794) (Lepidoptera: Crambidae) é responsável por grandes prejuízos na cultura da cana-deaçúcar. O controle tem como alvo principal somente a fase de lagarta. No entanto, a eficiência pode ser maior atingindo fases do ciclo da praga mais expostas aos agentes de controle. O objetivo deste estudo foi avaliar a patogenicidade de Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorok. Beauveria bassiana (Bals.) Vuill. e Isaria farinosa (Holmsk.) Fr. para ovos, lagartas, pupas e adultos de D. saccharalis e avaliar, através da análise de parâmetros biológicos, os efeitos no ciclo de vida da praga. Ovos postos no período de 24 horas, lagartas com 15 dias de desenvolvimento, pupas recém formadas e adultos com 24 horas de vida foram inoculados com os fungos nas concentrações de 108, 107 e 106 conídios mL-1. A viabilidade dos ovos foi afetada significativamente no tratamento com 108 con. mL-1 de M. anisopliae, mas as lagartas sobreviventes não foram afetadas em nenhum outro parâmetro avaliado. M. anisopliae e B. bassiana causaram mortalidade de lagartas principalmente nas concentrações de 108 e 107 con. mL-1, enquanto a viabilidade pupal e o peso de pupas fêmeas formadas a partir de lagartas tratadas foram reduzidos apenas pelos tratamentos com 108 e 107 con. mL-1 de M. anisopliae, respectivamente. I. farinosa não se mostrou patogênico para as fases de ovo e lagarta de D. saccharalis. O tratamento com 108 con. mL-1 de M. anisopliae e B. bassiana produziu 52,0 e 42,0% de mortalidade de pupas, respectivamente, afetando também a viabilidade de pupas e a longevidade de adultos emergidos. A fecundidade destes adultos foi severamente afetada por I. farinosa na concentração 108 con. mL-1 e pelos outros fungos em todas as concentrações avaliadas. Verificou-se grande mortalidade de adultos tratados com todas as concentrações de M. anisopliae... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The sugarcane borer Diatraea saccharalis (Fabricius, 1794) (Lepidoptera: Crambidae) is responsible for high losses in sugarcane. The larval stage is the main target of control. However, the efficiency can be higher by reaching different and more exposed stages with more exposure to the control agents. The aim of this study was to evaluate the pathogenicity of Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorok. Beauveria bassiana (Bals.) Vuill. and Isaria farinosa (Holmsk.) Fr. to eggs, larvae, pupae and adults of D. saccharalis and to evaluate the effects on pest lifecycle. Eggs with 24 hours, larvae with 15 days of development, newly formed pupae and adults with 24 hours of life were inoculated with fungi at concentrations of 108, 107 and 106 conidia mL-1. The eggs viability was significantly affected in the treatment with 108 con. mL-1 of M. anisopliae, but the survival larvae were not affected in any of the analyzed parameters. M. anisopliae and B. bassiana caused larval mortality mainly at concentrations of 108 and 107 con. mL-1, while pupae viability and female pupal weight formed from treated larvae were reduced only by treatments with 108 and 107 con. mL-1 of M. anisopliae, respectively. I. farinosa wasn't pathogenic to eggs and larvae of D. saccharalis. The treatment with 108 con. mL-1 of M. anisopliae and B. bassiana produced 52.0 and 42.0% pupae mortality respectively, also affecting the pupal viability and the longevity of adults. The fecundity of these adults was severely affected by I. farinosa in the concentration of 108 con. mL-1 and by other fungi in all evaluated concentrations. High mortality of treated adults with all concentrations of M. anisopliae and with 107 con. mL-1 was observed. The longevity and fecundity were not affected by the fungi, and the eggs viability laid by treated females was significantly reduced by treatment with 106 and 108 con. mL-1 of B. bassiana... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Submitted by FLÁVIA CAMPOS FREITAS VIEIRA (flavia.camposfv@yahoo.com.br) on 2018-06-28T14:09:18Z No. of bitstreams: 1 Tese_Flávia_Vieira_2018.pdf: 8871588 bytes, checksum: e1ee1b7f2e2e7170f04d44c1a1e76d6a (MD5) / Approved for entry into archive by Neli Silvia Pereira null (nelisps@fcav.unesp.br) on 2018-06-29T18:42:12Z (GMT) No. of bitstreams: 1 vieira_fcf_dr_jabo.pdf: 8871588 bytes, checksum: e1ee1b7f2e2e7170f04d44c1a1e76d6a (MD5) / Made available in DSpace on 2018-06-29T18:42:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 vieira_fcf_dr_jabo.pdf: 8871588 bytes, checksum: e1ee1b7f2e2e7170f04d44c1a1e76d6a (MD5) Previous issue date: 2018-06-04 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Os citros são um grupo de espécies vegetais, com alto potencial produtivo, porém, acometido por várias doenças. Do gênero de bactérias Xanthomonas, três espécies são patogênicas a citros: Xanthomonas citri subsp. citri, agente causal do cancro cítrico, uma das doenças de maior preocupação da citricultura; X. fuscans subsp. aurantifolii tipos B e C, que causam a cancrose; e X. alfalfae subsp. citrumelonis, responsável por causar a mancha bacteriana dos citros. Diante disso, o objetivo desse trabalho foi a análise e descrição, em nível anatômico e ultraestrutural, dos processos de infecção de bactérias do gênero Xanthomonas, causadoras de doenças em citros, a correlação do fenótipo da interação XfaC-citros com o transcriptoma e a análise dos fatores de virulência das estirpes estudadas. O processo de infecção das estirpes Xac306, Xac636, Xac828, Xacm1510, XfaC1632 e XfaC1630 em lima ácida ‘Galego’ e/ou laranja doce ‘Hamlin’, foi avaliado em diferentes períodos de infecção, pelas técnicas de microscopia de luz e eletrônicas de varredura e transmissão. As seguintes características relacionadas a virulência das estirpes foram avaliadas: formação in vitro de biofilme, produção de goma, motilidade “swimming” e auto agregação celular. Os resultados mostraram que Xac306 é a estirpe mais agressiva dentre as demais, visto pelos sintomas e pela intensidade das alterações anatômicas no tecido de ‘Hamlin’ e ‘Galego’. O processo de infecção em lima ácida ‘Galego’ foi semelhante em todas as estirpes de Xanthomonas estudadas, pois induziram hiperplasia e hipertrofia, porém, em diferentes intensidades, sendo que as alterações provocadas pelas estirpes Xac828 e Xacm1510 não resultaram no rompimento da epiderme; todas as estirpes produziram goma, envolvendo as bactérias e favorecendo a colonização no ambiente intercelular. A microscopia de luz permitiu identificar alterações na anatomia de lima ácida ‘Galego’ infectada e a diferença de susceptibilidade entre as variedades de citros inoculadas com Xac306 e estirpes de XfaC. As microscopias eletrônicas de varredura e transmissão permitiram a identificação de aspectos em comum às estirpes, independente da variedade cítrica. A HR induzida por estirpes de XfaC foi caracterizada pela microscopia eletrônica de transmissão. Com a análise de microscopia, não foi possível estabelecer uma relação direta entre os testes de formação in vitro de biofilme, produção de goma e motilidade “swimming” das estirpes. A análise dos dados de transcriptoma revelou que a resposta de defesa de laranja ‘Hamlin’ contra XfaC foi uma resposta rápida e eficiente que levou a indução de HR, que em última instância, conteve a infecção pela morte celular programada no local da infecção. Esse trabalho ampliou o conhecimento da área sobre o comportamento de diferentes estirpes de Xanthomonas causadoras de doenças em citros, fornecendo informações sobre sua interação com o hospedeiro suscetível e a resposta de defesa de XfaC em interação incompatível. / Citrus are a diverse group of plant species, with high yield potential, but affected by several diseases. The bacteria genus Xanthomonas has three species pathogenic to citrus: Xanthomonas citri subsp. citri, causal agent of citrus canker, one of the most important diseases of citrus crop; X. fuscans subsp. aurantifolii types B and C, causing citrus cancrosis; and X. alfalfae subsp. citrumelonis, which causes citrus bacterial spot. Therefore, the goal of this work was to analyze and describe, at the anatomical and ultrastructural level the infectious processes of Xanthomonas causing diseases in citrus, the correlation of the XfaC-citrus interaction phenotype with the transcriptome and the comparative analysis of virulence related factors, in order to elucidate morphophysiological traits of host-pathogen interaction. The infection process of Xac306, Xac636, Xac828, Xacm1510, XfaC1632 and XfaC1630 strains in 'Galego' Mexican lime and 'Hamlin' sweet orange were evaluated at different points of infection by light microscopy and scanning and transmission electron microscopy. The following virulence related characteristics of the strains were evaluated: in vitro biofilm formation, gum production, swimming motility and cellular auto aggregation. The results showed that Xac306 is the most aggressive strain among the others, due to the intensity of the symptoms and anatomical alterations in 'Hamlin' and 'Galego' tissue. The infection process in the susceptible host ('Galego' Mexican lime) was similar for all Xanthomonas strains studied, since they induced hyperplasia and hypertrophy, however in different intensities, and the alterations caused by Xac828 and Xacm1510 strains did not result in epidermis rupture; all strains produce gum, involving bacteria and assisting colonization in the intercellular environment. Light microscopy was able to identify anatomical alterations in 'Galego' Mexican lime infected tissue and the susceptibility differences between citrus varieties inoculated with Xac306 and XfaC strains. The scanning and transmission electron microscopies was able to identify common traits to the strains, regardless of the citrus variety. The HR induced by XfaC strains was characterized by transmission electron microscopy. We could not stablish a direct relation between the in vitro biofilm formation, gum production and "swimming" motility of the strains with the microscopy analysis. The transcriptome analysis revealed that 'Hamlin' defense response against XfaC is a quick and effective response that led to an HR induction, which ultimately contained the infection, by programmed cell death at the site of infection. This work expanded our knowledge about the behavior of different Xanthomonas strains causing citrus diseases, providing information on its interaction with the susceptible host and the defense response of XfaC in an incompatible interaction.

Essa tese teve como objetivo avaliar todos os casos de candidose sistêmica por Candida albicans identificadas através de kit comercial ID 32C® (bioMérieux), diagnosticados no Laboratório de Micologia da Santa Casa de Misericórdia de Porto Alegre/RS, durante o período de 1999 a 2009, buscando identificar a prevalência de C. dubliniensis, bem como avaliar os fatores de virulência e diferença de perfil de suscetibilidade antifúngica entre os isolados clínicos. Foi realizado um levantamento clínico-epidemiológico dos casos incluídos no estudo, avaliando sexo, idade, manifestações clínicas, evolução, região proveniente do paciente, doença de base, condições predisponentes, utilização de corticóides e antibióticos e resposta ao tratamento recebido. Para a diferenciação das duas espécies utilizou-se testes fenotípicos (arranjo dos clamidosporos, teste de termotolerância, formação do tubo germinativo, crescimento em meio hipertônico e niger), molecular (espectrometria de massa) e genotípico (reação em cadeia da polimerase - PCR). Em adição, foi avaliada a eficácia do método de conservação das leveduras estocadas a -20ºC e comparamos quatro substratos (soro fresco, soro congelado, ágar e caldo Mueller-Hinton) para a prova do tubo germinativo. Determinou-se a produção da fosfolipase e proteinase em isolados incluídos no estudo. A atividade in vitro dos antifúngicos fluconazol, anfotericina B e anidulafungina frente aos isolados estudados foi determinada através da concentração inibitória mínima (CIM), a concentração fungicida mínima (CFM) e ponto de corte epidemiológico (ECV). Os casos de candidemia por C. albicans diagnosticados durante 10 anos ocorreram com maior frequência em pacientes adultos com presença de cateteres. Observamos que houve maior chance de ocorrência desta em pacientes oncológicos. O percentual de alta nos pacientes foi baixo. O método utilizado para a conservação de leveduras nesse estudo apresentou taxa de 70% de viabilidade. O ágar e o caldo Mueller-Hinton demonstraram sensibilidade de 90% e especificidade de 100%. Os isolados de C. albicans provenientes de hemocultivos apresentaram produção de fosfolipase em 78% e proteinase em 97% dos isolados. A espécie C. dubliniensis não foi identificada em isolados de hemocultivos, sendo todos os casos de candidemia por C. albicans. Os testes microcultivo em ágar fubá, espectrometria de massa, caldo niger e caldo hipertônico concordaram com o teste genotípico. Os isolados de C. albicans apresentaram maior suscetibilidade a anidulafungina, entretanto, os menores valores obtidos em 90% dos isolados (CIM90) foi pela anfotericina B. E através do ECV, os isolados poderiam ser resistentes ao fluconazol, demonstrando a importância da associação desses dois parâmetros. / The aim this tesis was to evaluate systemic candidiasis cases by Candida albicans through ID 32C® (bioMérieux), at Mycology Laboratory of the Santa Casa de Porto Alegre/RS, during 1999 to 2009, seeking to identify the C. dubliniensis prevalence, as well as evaluating the virulence factors and antifungal susceptibility profile difference of among isolates. The clinical and epidemiological survey was made through gender, age, clinical manifestations, evolution, patient's region, underlying disease, predisposing conditions, steroids and antibiotics use, and response to treatment. The phenotypic tests (tthermotolerance, germ tube, hypertonic and Niger medium), molecular (mass spectrometry) and genotypic (polymerase chain reaction – PCR) was used for two species identification. We also assessed if the mantainance of C. albicans stored at - 20ºC in a freezer with sterile distilled water was usefull.The four substrate (fresh and frozen serum, agar and broth Mueller-Hinton®) were used for germ tube formation and the phospholipase and proteinase activity were evaluated. The in vitro activity of fluconazole, amphotericin B and anidulafungin were compared through the minimum inhibitory concentration (MIC), the minimum fungicidal concentration (MFC) and epidemiological cutoff value (ECV). The candidemia cases by C. albicans for ten years occurred more frequently in adult and catheters use. We observed the more chance this occurrence in cancer patients. The survival percentage was low. The used method in the study for yeast stored had 70% of viability. The agar and broth Mueller-Hinton were 90% sensitivity and 100% specificity. The boodstream isolates of C. albicans produce virulence factors, such the germ tube production and hydrolytic enzymes (78% of phospholipase and 97% of protease) production. The C. dubliniensis was not identified in bloodstream isolates, thus all candidemia cases were by C. albicans. The mass spectrometry, cornmeal agar, Niger and hypertonic broth agreed with genotypic test. The isolates exhibited more susceptibility to anidulafungin, and 90% of them (MIC90) exhibited the lowest values against amphotericin B. Based on ECV and Pfaller classification, isolates could be resistant to fluconazole, demonstrating the importance of the combination of these parameters.

Made available in DSpace on 2015-06-12T13:55:08Z (GMT). No. of bitstreams: 2 378.pdf: 2569017 bytes, checksum: a251ac616bcce584ad81bcd947e3562a (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2012 / Os mosquitos Aedes aegypti e Aedes albopictus são considerados os principais vetores da dengue, doença que afeta mais de 100 países e atinge, a cada ano, mais de 50 milhões de pessoas. Para que uma espécie seja incriminada como vetor de uma doença, ela deve ser capaz de se infectar com um determinado patógeno via oral, resistir à replicação deste no seu interior e transmiti-lo a um hospedeiro susceptível. Esta habilidade é denominada competência vetorial. Os rápidos avanços da biologia molecular têm facilitado o surgimento de novas abordagens que podem ser utilizadas para avaliar quantitativamente alguns aspectos da competência vetorial. Neste sentido, a RT-PCR quantitativa (qRT-PCR) tem sido amplamente usada em estudos sobre a interação vírus-vetor. O presente estudo visou avaliar o processo de infecção do vírus Dengue (DENV) em amostras de intestinos e glândulas salivares Ae. aegypti e Ae. albopictus, através da quantificação de partículas virais de três sorotipos de DENV via PCR em tempo real. Os resultados mostraram que as três populações de Ae. aegypti (RecLab, Recife e Petrolina) analisadas no presente estudo foram suscetíveis à infecção com DENV-1, DENV-2 e DENV-3. De uma maneira geral, as populações de Ae. aegypti de campo (Recife e Petrolina) foram mais competentes para a infecção do que a colônia de laboratório (RecLab). Considerando a espécie Ae. albopictus, as duas populações (laboratório e campo) também foram suscetíveis à infecção com os três sorotipos, porém a colônia de laboratório foi mais suscetível à infecção do que a população de campo. Os dados obtidos no presente estudo indicam que diferenças na carga viral usada durante a alimentação artificial podem influenciar nas taxas de infecção do vírus no intestino, porém não influenciam a disseminação dos vírus para as glândulas salivares. Outro aspecto importante foi o curto período de incubação extrínseco (PIE) apresentado pelas duas espécies, exceto na população de Ae.aegypti de Petrolina, diferente do que é descrito na literatura. Este resultado tem uma grande importância epidemiológica, pois quanto menor o PIE, maior será o tempo que a espécie vai ser capaz de transmitir o vírus para um hospedeiro sadio, aumentando assim as chances de transmissão de dengue. Além disso, revela a necessidade da implementação de estratégias mais rápidas para bloquear a transmissão da doença. Estas informações serão necessárias para os estudos de avaliação de risco de transmissão da dengue

E. coli Patogênicas Aviárias (APEC) são uma das causas de doenças extra-intestinais em aves, as quais trazem grande prejuízo econômico para o setor avícola mundial. Os avanços nas pesquisas vêm aumentando o entendimento dos mecanismos de patogenicidade das APEC, demonstrando a grande importância da interação dos diversos fatores de virulência na determinação da sua patogenicidade. Redes Neurais Artificiais (RNAs) têm mostrado ser uma poderosa ferramenta para uma vasta gama de aplicações. Neste trabalho, o foco na aplicação da RNA é na predição (0 a 10) da patogenicidade de amostras APEC. Em 489 isolados APEC foram analisados a presença de 38 genes associados a virulência, o Índice de Patogenicidade (IP) in vivo e a motilidade das amostras. Duas RNAs foram construídas utilizando o software Neuroshell Classifier 2.1 (Ward Systems Group, Inc., Frederick, MD, USA) em duas fases distintas: treinamento e validação. Utilizou-se como camada de entrada, informações sobre a presença ou ausência dos 38 genes de virulência e a motilidade de cada uma das amostras, com uma camada de saída formada pelo IP in vivo previamente determinado. As RNAs construídas apresentaram uma classificação correta acima de 90%, sendo que a rede 1 apresentou uma classificação de 91,62 e a rede 2 de 99,03%. A rede 2 obteve uma especificidade superior a 99,64% em todas as categorias e uma sensibilidade superior a 92,86%. Isso demonstra que o método aqui proposto, revelou ser uma ótima ferramenta de suporte às decisões de médico veterinário, descartando no futuro a inoculação de animais. / Avian Pathogenic Escherichia coli (APEC) are one of the causes of extraintestinal diseases in birds, and cause considerable economic losses to the poultry industry worldwide. Advances in research have increased understanding of pathogenic mechanisms of APEC, and have demonstrated the importance of the interaction of several virulence factors in determining their pathogenicity. Artificial Neural Networks (ANN) have shown to be a powerful tool for a wide range of applications. In this paper, the focus on neural network applications in the prediction (index of 0-10) of the pathogenicity of isolates APEC. In 489 APEC isolates were analyzed: 38 virulenceassociated genes, the Pathogenicity Index (PI) in vivo and motility of the strains. Two ANNs were constructed using the software Neuroshell Classifier 2.1 (Ward Systems Group, Inc., Frederick, MD, USA) in two distinct phases: training and validation. We used as input layer, information about the presence or absence of the 38 virulenceassociated genes and the motility of each of the samples, with an output layer formed by a previously-determined PI in vivo. The ANNs showed a correct classification of the PI above of 90%, being that the network 1 had a rating of 91.62% and the network 2 of 99.03%. The network 2 obtained a specificity of over 99.64% and sensitivity greater than 92.86% in all categories. This demonstrates that the method proposed here has proven to be a great decision support tool for the veterinarian, thereby dispensing the inoculation of animals in the future.

A bactéria Escherichia coli é responsável por perdas econômicas significativas mundialmente, incluindo-se aquelas que ocorrem na produção avícola. O controle e a prevenção da colibacilose aviária são complexos, pois envolve a distinção de isolados que comumente habitam o trato gastrointestinal das aves daquelas consideradas patogênicas. Embora tenha sido assumido que a maioria dos isolados não possui potencial zoonótico, estudos recentes têm sugerido que isolados isoladas de humanos e de aves poderiam compartilhar o maquinário genético necessário para causar a doença no hospedeiro. Desta forma, os animais de produção poderiam atuar como reservatórios de estirpes potencialmente patogênicas para humanos. O objetivo deste trabalho foi realizar a caracterização molecular em grupos filogenéticos de E. coli isoladas de aves (APEC) e de humanos (UPEC) e propor um futuro acompanhamento da flutuação da patogenicidade dos isolados APEC em planteis avícolas. Foram selecionadas 450 isolados UPEC e 460 APEC para classificação em quatro grupos filogenéticos (A, B1, B2 e D) através de um protocolo de multiplex-PCR. Estes resultados foram comparados com a presença ou ausência de 38 genes associados à virulência e com o índice de patogenicidade in vivo estabelecido para cada isolado em estudo anterior. Em relação aos isolados APEC, 31,1% foram classificadas no grupo D, 25,2% no grupo B2, 24,1% no grupo B1 e 19,6% no grupo A. Entre os isolados UPEC, 53,6% das foram classificadas no grupo B2, 25,3% no grupo D, 15,1% no grupo A e apenas 6,0% no grupo B1. Os isolados virulentos geralmente classificam-se no grupo B2, porém algumas podem ser classificadas no grupo D. Enquanto que os isolados comensais em geral pertencem aos grupos A e B1. Observou-se associação entre determinados genes e os grupos filogenéticos, tanto para isolados APEC quanto UPEC. Observou-se diferença significativa entre os índices de patogenicidade conforme a fonte de isolamento, sendo que os isolados de lesões apresentaram os maiores índices. Também foi observada uma associação direta entre os índices de patogenicidade obtidos in vivo e os grupos filogenéticos. Os isolados do grupo B2 e D apresentaram maiores índices em relação aos isolados B1 e A. Uma vez que a distribuição dos isolados APEC nos grupos filogenéticos apresentou associação significativa com a patogenicidade, o multiplex-PCR torna-se uma importante ferramenta disponível para o screening da patogenicidade das amostras isoladas na cadeia avícola. / Escherichia coli is responsible for significant economic losses, including those occurring in poultry production. The control and prevention of avian colibacillosis are complex because it involves the distinction of pathogenic strains and those that are commonly found in the gastrointestinal tract flora of health birds. Although it has been assumed that most strains do not have zoonotic potential, recent studies have suggested that strains isolated from humans and poultry could share the genetic machinery needed to cause the disease in the host. Therefore, production animals could act as reservoirs of strains potentially pathogenic to humans. The aim of this study was to carry out the molecular characterization in phylogenetic groups of strains of E. coli isolated from poultry (APEC) and humans (UPEC), and to propose a future monitoring of the pathogenicity of APEC strains in poultry farms. A total of 450 UPEC and 460 APEC strains were selected for classification into four phylogenetic groups (A, B1, B2 and D) using a multiplex-PCR protocol. These results were compared with the presence or absence of 38 virulence-associated genes and the in vivo pathogenicity index established for each strain in a previous study. Regarding the APEC strains, 31.1% were classified in group D, 25.2% in group B2, 24.1% in group B1 and 19.6% in group A. Among the UPEC strains, 53.6% were classified in group B2, 25.3% in group D, 15.1% in group A and only 6.0% in group B1. Virulent strains are generally classified in group B2, but some may be classified in group D. While commensal isolates generally belong to groups A or B1. It was observed an association between certain genes and phylogenetic groups, both for APEC and UPEC strains. A significant difference was observed among pathogenicity indices according to the source of isolation, and the strains isolated from lesions presented the highest indices. A direct association between pathogenicity indices obtained in vivo and phylogenetic groups was also observed. Strains of groups B2 and D showed higher indices compared to strains from B1 and A. Since the distribution of APEC strains in phylogenetic groups showed a significant association with pathogenicity, multiplex-PCR becomes an important tool available for screening pathogenicity of the isolated samples in the poultry chain.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The native forest specie Cedrela fissilis Vell. had its population reduced because of the extraction of its wood. The worry of its extinction has been favoring researches related with the specie perpetuation, including those which involve seeds quality. However, there is little knowledge about the pathogens which could contribute to the low germination or other problems in adult individuals. This research has the objective to evaluate the physiological and sanitary quality of C. fissilis seeds, from different places of the south of Brazil. The vigor was evaluated with different tests, the sanitary with two methods of detection and transmission of fungi by seeds, pathogenicity of fungi isolated from the seeds and seeds treatment. The vigor tests showed that the seeds from different places had different physiological potentials. Both of detection methods were efficient to identify the most of the fungi found in the seeds. Some of the fungi were identified on high incidences and in both tests: Penicillium sp., Pestalotia sp., Phomopsis sp. and Rhizoctonia sp. This last one and Fusarium sp. were transmitted by seeds. One of the Rhizoctonia sp. isolates was pathogenic, causing roots rotting, and damping-off. The seeds treatment with garlic extract (Allium sativum) and physical treatment (70°C for 48 hours) could be use to reduce the fungi incidence or to eliminate these, respectively. For the treatment of inoculated and noninoculated seeds with Rhizoctonia sp., the combination of biological (Thichoderma spp.) and chemic treatments was efficient to reduce the incidence of most of fungi, including that which was inoculated in the seeds. / O cedro (Cedrela fissilis) é uma espécie florestal nativa, cuja população foi reduzida em função da extração de sua madeira. A preocupação com sua extinção vêm favorecendo pesquisas relacionadas à perpetuação da espécie, dentre estas, aquelas envolvendo a qualidade de suas sementes. Porém, pouco se sabe sobre patógenos que podem estar contribuindo para a baixa germinação de sementes, ou para problemas futuros em indivíduos já estabelecidos. Diante disto, este trabalho tem como objetivo geral avaliar a qualidade fisiológica e sanitária de sementes de cedro, procedentes de diferentes localidades dos estados do sul do Brasil. Avaliou-se o vigor destas sementes, através de diferentes testes; a qualidade sanitária, por dois métodos de detecção e teste de transmissão; a patogenicidade de fungos isolados de sementes; e o efeito de diferentes tratamentos. Os testes de vigor demonstraram que as sementes possuíam diferentes potenciais fisiológicos, dependendo da procedência. Ambos os testes de detecção utilizados, foram eficientes para a maioria dos fungos associados às sementes de cedro. Alguns fungos ocorreram em altas incidências, em ambos os testes: Penicillium sp., Pestalotia sp., Phomopsis sp. e Rhizoctonia sp., sendo este e Fusarium sp., os únicos transmitidos via sementes. A patogenicidade, realizada com isolados de Rhizoctonia sp. identificou um isolado patogênico, provocando apodrecimento de raízes e colo, e posterior tombamento. Os tratamentos de sementes com extrato de alho (Allium sativum) e tratamento físico (estufa a 70°C por 48 horas) são promissores para a redução da incidência de fungos ou mesmo erradicação de alguns deles, respectivamente. Tratamentos com sementes inoculadas e não-inoculadas com Rhizoctonia sp. demonstraram que a combinação de produto biológico, à base de Trichoderma spp. (Agrotrich Plus®), mais um fungicida protetor (Captan) é eficiente para redução de patógenos, incluindo àquele inoculado nas sementes.

O fungo Moniliophthora perniciosa é o agente causal da vassoura de bruxa no cacaueiro (Theobroma cacao L.). Três biótipos distintos (biótipos -C, -L e -S) são reconhecidos de acordo com a especificidade quanto ao hospedeiro. O presente estudo teve como objetivo a análise da diversidade genética com o uso de marcadores microssatélites de 134 isolados dos biótipos -C, -L e -S de M. perniciosa coletados principalmente na Amazônia Brasileira e áreas de cultivo. A diversidade genética foi associada com virulência e/ou agressividade dos isolados a acessos diferenciais (suscetíveis ou resistentes) de T. cacao. Os biótipos -S e -L apresentaram uma diversidade gênica e genotípica superior em comparação com o biótipo-C. A população do biótipo-C com maior diversidade genotípica foi a do Acre, seguida pelo Oeste do Amazonas, ambas correspondendo a áreas em que se encontra cacaueiro nativo no Brasil. A população com menor diversidade genotípica foi a da Bahia, que corresponde a uma área onde a presença de M. perniciosa foi registrada mais recentemente, no final da década de 1980. Dos 134 isolados, 83 correspondem a genótipos multilocos únicos, sendo encontrados apenas dois indivíduos com genótipos idênticos para o biótipo-S, e nenhum para o biótipo-L. No biótipo-C foram identificados 61 genótipos multilocos em 111 isolados coletados em áreas de ocorrência natural e cultivo de cacau. Os dados de similaridade genética corroboram que o biótipo-C e também o -S que são homotálicos evoluíram de um biótipo heterotálico, possivelmente o biótipo-L. As populações do biótipo-C do estado do Pará e Leste do Amazonas compartilham ancestrais comuns em Ji-Paraná (RO) e Assis Brasil (AC), enquanto que a região sob a influência do rio Amazonas possui outra ascendência, que seria em Atalaia do Norte (Alto Solimões). Os genótipos multilocos da Bahia exibiram origens análogas as da população do Baixo Amazonas, com ascendência em Ji-Paraná (RO) e Alenquer (PA). Na avaliação de agressividade de M. perniciosa, a concentração do inóculo se mostrou determinante para a manifestação dos sintomas, com o aumento de plântulas com sintomas à medida que aumenta a concentração de basidiósporos. Dentre as progênies avaliadas, \'PA 195 x CAB 214\' apresentou menor proporção de plântulas com sintomas. Na inoculação com isolados de M. perniciosa oriundos do Acre e Amazonas, a proporção de plântulas com sintomas foi superior quando inoculadas com o isolado de Tabatinga (AM). O genótipo de cacaueiro que apresentou uma reação diferenciada foi o \'CAB 214\', para o qual nenhuma plântula apresentou sintomas quando inoculada com o isolado de Marechal Thaumaturgo (AC). Com o uso de microssatélites os genótipos multilocos de Tabatinga (AM) e Marechal Thaumaturgo (AC) foram identificados em grupos distintos. Na análise de treze genes de patogenicidade induzidos pela limitada disponibilidade de N, o gene 88KD foi o que demonstrou o maior número de transcritos acumulados. Os isolados que apresentaram uma mesma tendência em seus genes mais expressos foram Tabatinga (AM) e Óbidos (PA) que apesar de possuírem origens geográficas distintas, foram identificados no mesmo grupo na análise com microssatélites / The fungus Moniliophthora perniciosa is the causal agent of witches\'broom in cacao (Theobroma cacao L.). Three different biotypes (C-; S-; and L-biotypes) are recognized according to host specificity. The present study aimed to analyze the genetic diversity using microsatellite markers for 134 isolates of the C-, L- and S- biotypes of M. perniciosa collected mainly in the Brazilian Amazon and areas of cultivation. Genetic diversity was associated with virulence and/or aggressiveness of isolates in differential accesses (susceptible or resistant) of T. cacao. The L- and S- biotypes showed a higher genetic and genotype diversity compared with C-biotype. Of the 134 isolates, 83 corresponded to unique multilocus genotypes, and found only two individuals with identical genotypes for the S-biotype, and none for the L-biotype. In the C-biotype were identified 61 multilocus genotypes in 111 isolates collected in areas of natural occurrence and cultivation of cocoa. The genetic similarity data corroborate that the C- and S- biotypes that are apparently homothallic evolved from a heterothallic biotype, possibly L-biotype. The populations of C-biotype of the state of Para and Amazonas East share common ancestors, in Ji-Paraná (RO) and Assis Brazil (AC), while the region under the influence of the Amazon River has another descent that would be in the Atalaia do Norte (Upper Solimões). The multilocus genotypes from Bahia showed a similar origin of the population of the Lower Amazon, with ancestry in Ji-Paraná (RO) and Alenquer (PA). In the evaluation of aggressiveness of M. perniciosa, the inoculum concentration proved to be decisive for the manifestation of symptoms, with the increase of seedlings with symptoms as increases the concentration of basidiospores. Among the progenies, \'PA 195 x CAB 214\' showed a lower proportion of seedlings with symptoms. In inoculation with M. perniciosa from Acre and Amazonas, the proportion of seedlings with symptoms was higher when inoculated with the isolate from Tabatinga (AM). The genotype of cocoa that had a differentiated reaction was the \'CAB 214\', for which no plants showed symptoms when inoculated with the isolate Marechal Thaumaturgo (AC). With the use of microsatellite, the multilocus genotypes of Tabatinga (AM) and Marechal Thaumaturgo (AC) were identified in different groups. In the analysis of thirteen genes of pathogenicity induced by the limited availability of N, 88KD gene showed the highest number of transcripts. The isolates that showed a similar trend in their more expressed genes were Tabatinga (AM) and Óbidos (PA) that despite having different geographical origins were identified in the same group in the analysis with microsatellite