Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2016-10-19T13:04:45Z No. of bitstreams: 1 Tese_BCM_CarlotaJosefoviczBelisário.pdf: 4313033 bytes, checksum: 60ab172cbc6f3043ea324ea72968567a (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2016-10-19T13:13:14Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese_BCM_CarlotaJosefoviczBelisário.pdf: 4313033 bytes, checksum: 60ab172cbc6f3043ea324ea72968567a (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-19T13:13:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese_BCM_CarlotaJosefoviczBelisário.pdf: 4313033 bytes, checksum: 60ab172cbc6f3043ea324ea72968567a (MD5) Previous issue date: 2012 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas René Rachou. Belo Horizonte, MG, Brasil / A doença de Chagas (DC) é uma enfermidade causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi, cuja principal forma de transmissão é através das fezes de triatomíneos infectados. O Panstrongylus megistus atualmente é o principal vetor do Brasil, sendo responsável pela transmissão da DC na região da Serra do Cipó, MG, na década de 80. O P. megistus possui alta capacidade de reinfestação das casas, exigindo permanente vigilância contra a instalação de novos focos. O peridomicílio apresenta grande importância para a manutenção de triatomíneos e do T. cruzi circulando entre barbeiros e os animais que o frequentam. O objetivo do trabalho foi avaliar o cenário ecoepidemiológico da doença de Chagas no entorno do Parque Nacional da Serra do Cipó (ParnaCipó), visando subsidiar o programa de controle do P. megistus. O estudo se realizou nos municípios de Jaboticatubas e Santana do Riacho que, juntamente com Morro do Pilar e Itambé do Mato Dentro, integram o ParnaCipó. O perfil de infestação pelo P. megistus foi determinado através de captura de triatomíneos nas unidades domiciliares (setembro de 2007 a setembro de 2010) e capturas silvestres, que também incluiram avaliação da infecção em marsupiais e roedores. Cães levados à campanha de vacinação antirrábica de Jaboticatubas foram examinados a fim de determinar sua importância epidemiológica na região. Exemplares de P. megistus capturados foram utilizados para análise populacional pela morfometria geométrica. Os exemplares provenientes de Jaboticatubas foram ainda analisados por RAPD para estudo populacional. As cepas isoladas dos reservatórios e vetores foram caracterizadas como pertencentes ao grupo T. cruzi I ou T. cruzi II utilizando‐se DNA satélite como alvo. A maioria dos exemplares P. megistus foi capturada em galinheiros; no intradomicílio o ecótopo preferencial foi o quarto. Foram realizadas pesquisas em 15 áreas silvestres com a captura de 105 mamíferos, com taxa de infecção de 6,7%; todas as cepas foram caracterizadas como T. cruzi I. A prevalência em cães foi de 2,4%. Em palmeiras foram capturados Rhodnius neglectus, P. megistus e Triatoma sordida. Dentre as cepas isoladas de triatomíneos domiciliados e silvestres, apenas uma cepa proveniente do ambiente domiciliar foi caracterizada como T. cruzi II, as demais, T. cruzi I. A morfometria diferenciou a população silvestre das domiciliares. A RAPD demonstrou grande variabilidade dos P. megistus de Jaboticatubas, entretanto, sem diferenciação populacional. Frente aos resultados, podemos concluir que a população rural dos dois municípios permanece sob o risco de infecção pelo T. cruzi, uma vez que são encontrados vetores e reservatórios infectados no ambiente artificial e natural, e podem infestar as habitações a partir de diversos focos, domiciliares ou silvestres. / Chagas disease (CD) is caused by the protozoan Trypanosoma cruzi, whose main mode of transmission is through the feces of infected bugs. Panstrongylus megistus is currently the main vector in Brazil, being responsible for the CD transmition in Serra do Cipo, MG, in the 80s. P. megistus has high capacity to reinfestate the houses, requiring constant vigilance against the installation of new focus. The peridomicile has great importance for the maintenance of triatomine bugs and the T. cruzi circulating among triatomines and the animals that occure in this environment. The objective of this study was to evaluate the ecoepidemiologic scenario of Chagas disease in the surrounding of the National Park of Serra do Cipo (ParnaCipó), aiming to support the control program of the P. megistus. The study was conducted in the municipalities of Jaboticatubas and Santana do Riacho, which together with Morro do Pilar and Itambé do Mato Dentro, integrate the ParnaCipó. P. megistus infestation profile was determined by capturing triatomines in the households (September 2007 to September 2010) and in wild captures, which were also performed to evaluate the rodents and marsupials infection. Dogs carried to the anti‐rabies vaccination campaign of the Jaboticatubas were examined to determine their prevalence in the region. The P. megistus exemplaries captured were used to the geometric morphometry analisis. Specimens from Jaboticatubas were further analyzed by RAPD for population study. The strains isolated from reservoirs and vectors were characterized as T. cruzi I or T. cruzi II using satellite DNA as target. Most P. megistus was captured in chicken coops; inside the houses the preferred ecotope was the bedroom. Were investigated 15 wild areas with the capture of 105 mammals, with infection rates of 6.7%, all strains were characterized as T. cruzi I. The prevalence in dogs was 2.4%. In the palm trees examined were captured Rhodnius neglectus, P. megistus and Triatoma sordida. Among the strains isolated from the domiciled and wild triatomines, only one from the intradomicile was characterized as T. cruzi II, the others were T. cruzi I. The morphometric analysis differentiated the wild from the domestics populations. The RAPD showed great variability of P. megistus in Jaboticatubas, however, without population differentiation. Based on the results, we conclude that the rural population of both municipalities remains at risk of infection by T. cruzi, since the infected vectors in artificial and natural environment follow to be found, and can infest the dwellings from various domestic or wild focus.

A produção de alimentos inócuos, aptos ao consumo humano, é de extrema importância tanto à saúde pública quanto para atividade econômica. O queijo colonial é tipicamente consumido pela população do Rio Grande do Sul, porém ainda há poucos dados sobre a qualidade microbiológica desse produto. Sendo assim, os objetivos do presente estudo foram: (i) avaliar a qualidade microbiológica de queijos coloniais comercializados em feiras modelo e mercado público de Porto Alegre; (ii) caracterizar as cepas de Staphylococcus aureus e Listeria monocytogenes presentes neste produto quanto a alguns fatores de patogenicidade, resistência e tipificação genotípica. Para tanto, no período de novembro de 2014 a maio de 2015, foram analisadas 205 amostras de queijo colonial inspecionado, compreendendo 17 marcas distintas comercializadas em feiras modelos e no Mercado Público de Porto Alegre. As análises microbiológicas evidenciaram que 47,31% dos queijos estavam não conformes com pelo menos um dos parâmetros microbiológicos estabelecidos na RDC nº12, portanto impróprios ao consumo humano. Com relação à quantificação de coliformes termotolerantes e Staphylococcus coagulase positiva, 10,73% e 40,48% das amostras apresentaram contagens superiores ao limite máximo estabelecido na legislação, respectivamente. Valores acima do padrão aceitável foram observados em 5,85% dos queijos amostrados para ambos os parâmetros. No que diz respeito à pesquisa de Salmonella sp., todas as amostras apresentaram-se em conformidade. Listeria sp. foi detectado em 12,19% dos queijos, dos quais 24% foram classificados como L. monocytogenes, 52% L. inoccua, 16% L. welshimeri/L. seeligeri e 8% L. grayi. / The production of innocuous food, fit for human consumption, is of extreme importance to both public health and economic activity. Colonial cheese is typically consumed by the population of Rio Grande do Sul, but there is still limited data on the microbiological quality of this product. Thus, the objectives of the present study were: (i) to evaluate the microbiological quality of colonial cheeses marketed in model fairs and central market in Porto Alegre; (ii) to characterize Staphylococcus aureus and Listeria monocytogenes strains present in these products according to some pathogenicity and resistance factors as well as to their genotype. Thus, from November 2014 to May 2015, we analyzed 205 samples of colonial cheese, comprising 17 different brands marketed in model fairs and in the Public Market of Porto Alegre. Microbiological analyzes showed that 47.31% of the samples were not compliant with at least one of the microbiological parameters established in RDC nº12, therefore unfit for human consumption. Regarding the quantification of thermotolerant coliforms and Staphylococcus coagulase positive, 10.73% and 40.48% of the samples presented counts higher than the maximum limit established in the legislation, respectively. Values above the acceptable standard were observed in 5.85% of the samples for both parameters. With regard to Salmonella sp., all samples were negative. Listeria sp. was detected in 12.19% of the samples, of which 24% were classified as L. monocytogenes, 52% L. inoccua, 16% L. welshimeri / L. seeligeri and 8% L. grayi. Concomitant isolation of L. monocytogenes and L. inoccua species was observed in one sample. Two samples presented counts of 3.6 NMP.g-1 and 11 NMP.g-1 of Listeria sp.,; in the others, the population found was <3.0 NMP.g-1. Serotyping of L. monocytogenes indicated the presence of serovars 1 / 2a, 1 / 2b and 1 / 2c and the PFGE profile showed five pulse types. The amplification of the nuc gene, confirmed the 83 isolates of Staphylococcus coagulase positive as S. aureus. Regarding the antimicrobial susceptibility profile, all strains were susceptible to cefoxetin, oxacillin and vancomycin. Strains resistant to: penicillin (26.5%) were detected, all of them confirmed as beta-lactamase producers; ciprofloxacin and erythromycin (9.63%); tetracycline (7.22%) and gentamicin (4.81%). Of the total strains, 66.26% were susceptible to all antimicrobials tested, while 6.02% were considered multiresistant. The gene blaZ was detected in 31.32% of the strains. All strains were negative for mecA and lukS-F genes. As for the presence of genes coding for classical SEs, 16.86% amplified some gene being sea and sec the most frequent. From the molecular typing of the 83 strains of S. aureus it was possible to detect 19 different spa types among the 11 brands of cheeses commercialized; the t127 and t002 genotypes were predominant. Three different types of sequences were detected in the four strains of S. aureus selected for typing by the MLST technique performed in silico: ST-133, ST-5 and ST-1. The colonial cheese marketed in model fairs and in the public market of Porto Alegre, was confirmed as a possible carrier of microorganisms that cause DTA. Among these pathogens, the frequency of isolation of L. monocytogenes and, especially, of S. aureus is noteworthy.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:21:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 3253.pdf: 2155477 bytes, checksum: 03c92d367d865f20f90059d887400f1f (MD5) Previous issue date: 2010-08-30 / Financiadora de Estudos e Projetos / Citrus canker is an economically important disease that affects many citrus growing areas around the world, and there is no effective control or cure. The causative agents are bacteria from the genus Xanthomonas, recently classified as two novel species, X. citri e X. fuscans. The most virulent strain is X. citri subsp. citri (Xac). In this study, we did a differential proteomic analysis of a periplasmatic proteins enriched fraction from Xac, by comparison of the protein profiles after cellular growth in pathogenicity inducing medium (XAM1) or non-inducing medium (Nutrient Broth). We performed Bidimensional Electrophoresis (2D-PAGE) in triplicate and statistical analyses were done with the software Image Master Platinum (GE). At least 80 spots showed significant differences on protein expression (p<0.05) between the two conditions tested (induction/ non-induction) and had their proteins digested by trypsin. The peptides were analyzed by mass spectrometry (LCESI- Q-Tof) and the results were compared with proteins from genome databases using the Mascot tool. Among Xac proteins identified with higher expression in in vitro pathogenicity inducing situation, two are classified as proteins involved with Pathogenicity, Virulence, and Adaptation (in according to the genome annotation): superoxidase dismutase (XAC2386) e phosphoglucomutase (XAC3579). A highly differential spot (46), increased in the inducing condition, had their proteins identified as lytic murein transglycosilase (XACb0007) and/or transglycosylase (XAC3225), oxidoreductase (XAC1160) and DNA polymerase III subunit beta (XAC0002). The spot 46 was isolated from several 2D gels and used to produce antibody in mouse. The expressions of these proteins were analyzed by Western blot in others citrus canker genome strains, which differ from Xac in the virulence and host types. This analysis showed that proteins from the spot 46 had different expression pattern among these strains, with higher expression in Xac growing in inducing condition. We conclude that the proteomic study of proteins from periplasmic fraction is an important strategy to detect Xac proteins involved with pathogenicity and virulence, even including proteins transported outside the cell. Proteins found in this fraction could be used as biomarkers, however more experiments are still necessary. / O cancro cítrico é uma doença economicamente importante para a citricultura, não existindo atualmente medidas preventivas e curativas eficazes para combatê-la. Os agentes etiológicos são bactérias do gênero Xanthomonas, classificadas em duas espécies, X. citri e X. fuscans. A variedade mais agressiva aos citros é a bactéria X. citri subsp. citri (Xac). Pelo presente trabalho, realizamos a análise proteômica diferencial de uma fração celular de Xac enriquecida em proteínas periplasmáticas, após indução in vitro da sua patogenicidade, comparativamente à condição de não indução de patogenicidade (controle). As proteínas dessa fração foram separadas por eletroforese bidimensional (2D-PAGE), sendo a análise estatística das intensidades dos spots realizada por meio do software Image Master Platinum (GE). Aproximadamente 80 spots apresentaram expressão diferencial significativa (p<0,05) entre as duas condições estudadas, os quais foram isolados do gel e sua(s) proteína(s) constituinte(s) digerida(s) com tripsina. Os peptídeos resultantes da digestão foram analisados por espectrometria de massas (LC-ESI-QTof) e os dados obtidos utilizados na identificação da proteína por pesquisa em bancos de Xac e/ou de outros organismos com o software Mascot. Dentre as proteínas de Xac identificadas como mais expressas após indução de patogenicidade in vitro duas estão classificadas como proteínas relacionadas com Patogenicidade, Virulência e Adaptação (segundo anotação do genoma de Xac), sendo elas: superoxidase dismutase (XAC2386) e fosfoglicomutase (XAC3579). Proteínas pertencentes a um spot com notável aumento de expressão em situação de indução de patogenicidade (spot 46) foram identificadas por espectrometria de massas, sendo elas: proteína lytic murein transglycosilase (XACb0007) e/ou transglycosylase (XAC3225), oxidoredutase (XAC1160) e subunidade beta da DNA polimerase III (XAC0002). O spot 46 foi isolado a partir de vários géis 2D e utilizado para produção de anticorpos em camundongos. A análise da expressão da(s) proteína(s) pertencente(s) ao spot 46 foi realizada por meio de Western blot nas linhagens-genoma B e C do cancro cítrico, as quais diferem de Xac na virulência e tipo de citros- hospedeiro. Por esta análise foi verificado que proteínas do spot 46 possuem expressão muito distinta entre as linhagens genoma do cancro cítrico, sendo sua expressão preponderante em Xac, especialmente em situação de indução de patogenicidade. Concluímos que o estudo das proteínas utilizando a fração periplasmática como objeto de estudo é de grande interesse para investigação de proteínas envolvidas com patogenicidade e virulência em Xac, e que tenham passagem pelo periplasma, inclusive de proteínas transportadas para o meio extracelular. Além disso, algumas proteínas desta fração possuem potencial para serem utilizadas como biomarcadores ou como possível alvo de combate ao cancro cítrico.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:35:00Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2005-11-01Bitstream added on 2014-06-13T18:45:54Z : No. of bitstreams: 1 wenzel_im_dr_botfca.pdf: 544393 bytes, checksum: f67161337e2bde1fdbfde14613c06462 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Secretaria Agricultura / Este trabalho teve como objetivo avaliar a patogenicidade do isolado JAB 02 de Lecanicillium lecanii (Zimm.) Zare & Gams ao ácaro rajado Tetranychus urticae e a sua compatibilidade com agrotóxicos, nematóides entomopatogênicos e ácaros predadores. Os conídios do fungo, produzidos em arroz, foram avaliados nas concentrações de 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, 1 x 108 e 5 x 108 conídios/mL. A partir das porcentagens de mortalidade de T. urticae, que variaram entre 49 e 90% no décimo dia de avaliação, foi determinada a CL50 de 5,25 x 106 con./mL. A compatibilidade em laboratório foi verificada misturando-se os agrotóxicos em meio de cultura BDA e os parâmetros utilizados para a avaliação foram crescimento vegetativo, esporulação e viabilidade do entomopatógeno. Em condições de estufa, as suspensões dos produtos químicos e, posteriormente, a do fungo foram pulverizadas em plantas de crisântemo. Após a aplicação, quatro folhas foram coletadas e lavadas obtendo-se uma suspensão que foi plaqueada em BDA, sendo então avaliado o crescimento das colônias do fungo. Verificou-se, em laboratório, que a maioria dos inseticidas e os acaricidas foram compatíveis ao fungo, com exceção do inseticida Thiodan® classificado como muito tóxico. Todos os fungicidas testados foram classificados como tóxico e muito tóxico. Em condições de estufa, no tratamento com o fungicida Rovral® foi observado um número de colônias fúngicas formadas compatível com a testemunha. Essa compatibilidade repetiu-se para os produtos Alto 100® e Thiodan® em alguns dos tempos avaliados. No teste de patogenicidade, os conídios produzidos em meio de cultura com inseticidas e acaricidas, a partir da compatibilidade em laboratório, não tiveram sua viabilidade afetada e foram patogênicos ao ácaro rajado Tetranychus urticae. Além disso, foram realizados... / The objective of this study was to evaluate the pathogenicity of Lecanicillium lecanii (Zare & Gams), isolate JAB 02, to the two-spotted mite Tetranychus urticae (Koch), its compatibility with agrochemical products and its selectivity to entomopathogenic nematodes and predatory mites. The pathogenicity of the fungus produced in rice to T. urticae was evaluated at the concentrations of 5 x 106, 1 x 107, 5 x107, 1 x 108 and 5 x 108 conidia/mL. The mortality rates of T. urticae ranged from 49 and 90 % in the tenth evaluation day and the LC50 was 5,25 x 106 conidia/mL. The compatibility in laboratory was verified by adding chemical products to the PDA media and the evaluated parameters were the vegetative growth, sporulation and viability of the entomopathogen. In greenhouse, L. lecanii were sprayed on chrysanthemum plants after the pulverization of the chemical products; subsequently, four leaves of each treatment were collected and washed to obtain a suspension that were transferred to PDA medium to evaluate the growth of the fungus colonies in laboratory conditions. The acaricides and the most of insecticides were compatible to the isolate JAB 02, except the insecticide Thiodan®, which was classified as very toxic. All the evaluated fungicides were classified as toxic or very toxic. In greenhouse assays, the fungicide Rovral® produced a number of grown colonies similar to those of the control and this compatibility was also showed by the products Alto 100® and Thiodan® in some of the evaluated periods. In another pathogenicity test, when L. lecanii were grown in culture media containing the insecticides, the conidia viability were not affected and the fungus were pathogenic to T. urticae, with mortality rates superior to the control in some cases. Also, compatibility bioassays involving L. lecanii at 5 x 106, 1 x 107 and 5 x 107 con./mL and the entomopathogenic nematodes Steinernema sp. (CB n6) and Heterorhabditis indica (CB n5) were conducted.

A poluição, alteração física do habitat e a introdução de espécies invasoras via água de lastro, representam os maiores impactos antropogênicos para os ambientes costeiros. Foram pesquisadas em amostras da região costeira de S. Paulo, regiões portuárias brasileiras e de tanques de lastro de navios, bactérias das espécies Vibrio cholerae (Vc), V. parahaemolyticus (Vp) e V. vulnificus (Vv) que são as que têm maior implicação na saúde pública. As amostras foram avaliadas levando-se em conta parâmetros físico-químicos e microbiológicos e suas relações com a presença de Vc, Vp e Vv. As relações clonais foram verificadas através das técnicas de ERIC, BOX e REP-PCR. Foram identificadas 90 cepas de Vp e 11 de Vc. Foram observadas correlações entre alguns parâmetros microbiológicos e a presença de vibrios. A análise clonal permitiu verificar a alta diversidade das cepas. Concluiu-se que Vc e Vp são autóctones do ambiente costeiro brasileiro e podem ser tornar reservatórios para determinados fatores associados à virulência, gerando cepas com potencial epidêmico. / Pollution, physical alteration of habitat and the introduction of alien species through ballast water constitute the biggest anthropogenic impacts on coastal environments. We examined samples taken from the coastal region of S. Paulo state, Brazilian ports and ship ballast tanks, for bacteria of the species Vibrio cholerae (Vc), V. parahaemolyticus (Vp) and V. vulnificus (Vv) which have the most significant implication for public health. The samples were evaluated for microbiological and physical-chemical parameters as well as the presence of Vc, Vp and Vv. Clonal relationships of bacterial isolates were determined through ERIC, BOX and REP-PCR. A total of 90 strains of Vp and 11 of Vc were identified. Correlations between some microbiological parameters and the presence of vibrios were observed. The clonal analysis revealed extensive strain diversity. We concluded that Vc and Vp are autochthonous bacteria of the Brazilian coastal environment that can become reservoirs for factors associated with virulence, and are capable of generating strains with epidemic potential.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:51:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1830082 bytes, checksum: ec907521bfa48f79975e5fe22c20d972 (MD5) Previous issue date: 2009-10-01 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / The filamentous fungus Colletotrichum lindemuthianum (Sacc & Magnus) Briosi & Cav., causal agent of anthracnose, is an important pathogen of common bean (Phaseolus vulgaris L.). This fungus is an excellent model organism for understanding the infection process of pathogenic fungi. A C. lindemuthianum non-pathogenic mutant (LVSa1) with partial deficiency in the production of melanin was obtained through plasmid insertional mutagenesis. The aim of this study was to isolate and characterize the interrupted gene in theLVSa1 mutant and demonstrate its importance in the plant infection process. The mutated gene was isolated from a C. lindemuthianum genomic bank and named slnCl1. The sequence analysis revealed that slnCl1 encodes a histidine kinase. The sequence presents an ORF of 3555 base pairs, interrupted by three putative introns, containing 51, 87 and 89 bp. The multiple alignment of the deduced sequence of the protein, including sequences of all histidine kinases classes available in the databases, grouped SlnCl1 in class VI; possessing highly conserved regions characteristic of histidine kinase, and related to its function. A mutant with partial deficiency for the production of melanin was obtained through site-directed insertional mutagenesis using a gene fragment. This mutant showed a significant reduction in the ability to infect bean leaves, demonstrating that SlnCl1 is important to the pathogenicity process of this fungus. As many histidines kinases already described in fungi, SlnCl1 is involved in osmoregulation and adaptation to different osmotic concentrations in C. lindemuthianum. Furthermore, through this sensor protein, the fungus can distinguish the osmotic stress caused by high concentrations of sugars and salts. The mutant was sensitive to fungicides that target a MAPK signaling pathway, probably regulated by slnCl1. The results suggest that C. lindemuthianum must have other histidines kinases involved in the osmoregulation process. The study of the signaling cascade regulated by slnCl1 may represent a major advance in understanding the pathogenicity and developing new methods to combat this disease. / O fungo filamentoso Colletotrichum lindemuthianum (Sacc & Magnus) Briosi & Cav., agente causal da antracnose, é um importante patógeno do feijoeiro comum (Phaseolus vulgaris L.). Esse fungo é um excelente modelo de estudo para o entendimento do processo de infecção de fungos fitopatogênicos. Por meio de mutagênese por inserção de plasmídeo foi obtido um mutante (LVSa1) não patogênico de C. lindemuthianum com deficiência parcial na produção de melanina. O objetivo desse trabalho foi isolar e caracterizar o gene interrompido no mutante LVSa1 e comprovar a sua importância no processo de infecção da planta. O gene mutado foi isolado de um banco genômico de C. lindemuthianum e denominado slnCl1. A análise da sequência revelou que slnCl1 codifica uma histidina quinase. A sequência apresenta uma ORF de 3555 pares de bases, interrompida por três íntrons putativos, contendo 51, 87 e 89 pb. O alinhamento múltiplo da sequência deduzida da proteína, com sequências de todas as classes de histidinas quinases disponíveis nos bancos de dados agrupou SlnCl1 na classe VI, possuindo regiões extremamente conservadas características de histidina quinases e relacionadas a sua função. Por meio de mutagênese insercional sítio dirigida utilizando um fragmento do gene, foi obtido um mutante que apresentou deficiência parcial na produção de melanina. Esse mutante apresentou uma redução significativa na capacidade de infectar folhas de feijoeiro, demonstrando que SlnCl1 é importante no processo de patogenicidade desse fungo. Como muitas histidinas quinases já descritas em fungos, SlnCl1 apresenta envolvimento no processo de osmorregulação e adaptação a diferentes concentrações osmóticas em C. lindemuthianum. Além disso, por meio dessa proteína sensora, o fungo pode distinguir o estresse osmótico causado por altas concentrações de açúcares e de sais. O mutante mostrou-se sensível a fungicidas que tem como alvo uma via de sinalização MAPK, provavelmente regulada por slnCl1. Os resultados obtidos sugerem que C. lindemuthianum deve possuir outras histidinas quinases envolvidas no processo de osmorregulação. O estudo da cascata de sinalização regulada por slnCl1 pode representar um grande avanço no entendimento do processo de patogenicidade e na elaboração de novos métodos de combate a doença.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:51:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 952076 bytes, checksum: 7fbcb43414ecacd3439620826b6172cd (MD5) Previous issue date: 2012-07-20 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Colletotrichum lindemuthianum is the causal agent of common bean anthracnose. Genes that encode cell wall-degrading enzymes are essential for the development of this disease. The pectinases are characterized as the most important group of cell wall- degrading enzymes produced by phytopathogen fungi. The gene coding for pectate lyase, pecCl1, was previously identified in a suppressive subtractive library of bean infected with C. lindemuthianum. Isolation of the gene pecCl1 made it possible to obtain mutants and to analyze the regulation of this gene during development of anthracnose, determining whether the pectate lyase is a pathogenic factor. Thus, the aim of our study was structurally and functionally characterize the gene encoding pectate lyase in C. lindemuthianum. Initially, was performed the structural analysis of the gene pecCl1. The complete nucleotide sequence of the gene pecCl1 was deposited in Genbank with accession number JX270683. The analysis of the promoter region revealed some putative cis-elements and potential binding motifs of transcription factors involved in the regulation of pectate lyase gene expression. The deduced amino acid sequence of pecCl1 showed sequence identity with the pectate lyase F of Colletotrichum higginsianum and the pectate lyase C of Glomerella graminicola M1.001. Furthermore, it was found putative conserved domain pfam03211 of the pectate lyases superfamily. The gene pecCl1 is represented by a single copy in the C. lindemuthianum genome. However, into the genome of Colletotrichum graminicola, three sequences encoding pectate lyase showed sequence identity with the gene pecCl1 of C. lindemuthianum, and into the genome of C. higginsianum seven sequences encoding pectate lyase showed sequence identity with the gene pecCl1 of C. lindemuthianum, indicating that the C. lindemuthianum genome can possess other genes encoding pectate lyase. Phylogenetic analysis of pectate lyase amino acid sequences of filamentous fungi exhibited the formation of two distinct groups which are grouped on the basis of members of the pectate lyases multigene family. The Split-Marker technique was effective in C. lindemuthianum pecCl1 gene inactivation, allowing the study of pecCl1 function in a mutant by specific integrations and without ectopic integrations. The pecCl1 gene inactivation did not lead to complete loss of the pectate lyase activity, and consequently only decreased anthracnose symptoms in its host, which is consistent with the presence of other genes coding pectate lyase, allowing greater flexibility in pathogen aggressiveness. The analysis of differential expression of gene pecCl1 by qPCR was performed at different stages of bean infection and were observed expression levels of pecCl1 at all stages of development of the fungus in the plant, but a significant increase was observed five days after infection, in the onset of necrotrophic stage. At this stage, secondary hyphae cause extensive degradation of plant cell wall through the secretion of wide range of depolymerases, among these, the pectate lyase. Thus, the pectate lyase encoded by the gene pecCl1 is important to aggressiveness of C. lindemuthianum. The analysis of pectate lyases in C. lindemuthianum can not only assist in understanding the disease, but may also lead to discovery of one more target for disease control. / Colletotrichum lindemuthianum é o agente causal da antracnose do feijoeiro comum. Genes que codificam enzimas que degradam a parede celular são essenciais para o desenvolvimento dessa doença. As pectinases são caracterizadas como o grupo de enzimas que hidrolisam a parede celular mais importante produzidas por fungos fitopatogênicos. O gene pecCl1, que codifica pectato liase, foi previamente identificado em uma biblioteca subtrativa supressiva de feijoeiro infectado com C. lindemuthianum. O isolamento do gene tornou possível a obtenção de mutantes e análise da regulação deste gene durante o desenvolvimento da antracnose, visando determinar se a pectato liase é um fator de patogenicidade. Desta forma, o objetivo do nosso trabalho foi caracterizar estruturalmente e funcionalmente o gene que codifica pectato liase em C. lindemuthianum. Inicialmente, foi realizada a análise estrutural do gene pecCl1. A sequência completa de nucleotídeos do gene pecCl1 foi deposita no Genbank com número de acesso JX270683. A análise da região promotora revelou alguns possíveis cis-elementos e sítios de ligação a fatores de transcrição envolvidos na regulação da expressão gênica da pectato liase. A sequência de aminoácidos deduzida de pecCl1 apresentou identidade de sequências com a pectato liase F de Colletotrichum higginsianum e a pectato liase C de Glomerella graminicola M1.001. Além disso, detectou-se um possível domínio conservado pfam03211 da superfamília de pectato liases. O gene pecCl1 encontra-se representado por uma cópia única no genoma de C. lindemuthianum. No entanto, no genoma de Colletotrichum graminicola, três sequências que codificam pectato liase apresentaram identidade de sequências com o gene pecCl1 de C. lindemuthianum, e no genoma de C. higginsianum sete sequências que codificam pectato liase apresentaram identidade de sequências com o gene pecCl1 de C. lindemuthianum, indicando que o genoma de C. lindemuthianum pode possuir além do gene pecCl1 outros genes que codificam pectato liase. A análise filogenética de sequências de aminoácidos de pectato liases de fungos filamentosos mostrou a formação de dois grupos distintos, que se agruparam com base nos membros da família multigênica de pectato liases. A técnica de Split-Marker mostrou-se eficiente na inativação do gene pecCl1 de C. lindemuthianum, possibilitando o estudo da função do gene pecCl1, em um mutante com integração específica e livre de integrações ectópicas. A inativação do gene pecCl1 não levou a perda completa da atividade de pectato liase, e consequentemente, somente diminuiu os sintomas de antracnose em seu hospedeiro, o que é consistente com a presença de outros genes que codificam pectato liase no fungo, permitindo ao patógeno uma maior flexibilidade em sua agressividade. Foi realizada a análise da expressão diferencial do gene pecCl1 por qPCR nos diferentes estágios de infecção no feijoeiro e foram observados transcritos de pecCl1 em todas as fases de desenvolvimento do fungo na planta, mas houve um aumento significativo destes transcritos cinco dias após a infecção, no início da fase necrotrófica do fungo. Nesta fase, as hifas secundárias causam degradação extensiva da parede celular vegetal por meio da secreção de vasta gama de despolimerases, dentre estas, a pectato liase. Portanto, a pectato liase codificada pelo gene pecCl1 é importante para agressividade de C. lindemuthianum. A análise de pectato liases poderá não somente auxiliar na compreensão da antracnose em feijoeiro comum, mas também poderá levar a descoberta de mais um alvo para o controle dessa doença.

Orientador: Antonio Batista Filho / Banca: Carlos Frederico Wilcken / Banca: Antonio Carlos Monteiro / Banca: Jose Eduardo Marcondes Almeida / Banca: Luis Garrigos Leite / Resumo: Este trabalho teve como objetivo avaliar a patogenicidade do isolado JAB 02 de Lecanicillium lecanii (Zimm.) Zare & Gams ao ácaro rajado Tetranychus urticae e a sua compatibilidade com agrotóxicos, nematóides entomopatogênicos e ácaros predadores. Os conídios do fungo, produzidos em arroz, foram avaliados nas concentrações de 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, 1 x 108 e 5 x 108 conídios/mL. A partir das porcentagens de mortalidade de T. urticae, que variaram entre 49 e 90% no décimo dia de avaliação, foi determinada a CL50 de 5,25 x 106 con./mL. A compatibilidade em laboratório foi verificada misturando-se os agrotóxicos em meio de cultura BDA e os parâmetros utilizados para a avaliação foram crescimento vegetativo, esporulação e viabilidade do entomopatógeno. Em condições de estufa, as suspensões dos produtos químicos e, posteriormente, a do fungo foram pulverizadas em plantas de crisântemo. Após a aplicação, quatro folhas foram coletadas e lavadas obtendo-se uma suspensão que foi plaqueada em BDA, sendo então avaliado o crescimento das colônias do fungo. Verificou-se, em laboratório, que a maioria dos inseticidas e os acaricidas foram compatíveis ao fungo, com exceção do inseticida Thiodan® classificado como muito tóxico. Todos os fungicidas testados foram classificados como tóxico e muito tóxico. Em condições de estufa, no tratamento com o fungicida Rovral® foi observado um número de colônias fúngicas formadas compatível com a testemunha. Essa compatibilidade repetiu-se para os produtos Alto 100® e Thiodan® em alguns dos tempos avaliados. No teste de patogenicidade, os conídios produzidos em meio de cultura com inseticidas e acaricidas, a partir da compatibilidade em laboratório, não tiveram sua viabilidade afetada e foram patogênicos ao ácaro rajado Tetranychus urticae. Além disso, foram realizados...(Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The objective of this study was to evaluate the pathogenicity of Lecanicillium lecanii (Zare & Gams), isolate JAB 02, to the two-spotted mite Tetranychus urticae (Koch), its compatibility with agrochemical products and its selectivity to entomopathogenic nematodes and predatory mites. The pathogenicity of the fungus produced in rice to T. urticae was evaluated at the concentrations of 5 x 106, 1 x 107, 5 x107, 1 x 108 and 5 x 108 conidia/mL. The mortality rates of T. urticae ranged from 49 and 90 % in the tenth evaluation day and the LC50 was 5,25 x 106 conidia/mL. The compatibility in laboratory was verified by adding chemical products to the PDA media and the evaluated parameters were the vegetative growth, sporulation and viability of the entomopathogen. In greenhouse, L. lecanii were sprayed on chrysanthemum plants after the pulverization of the chemical products; subsequently, four leaves of each treatment were collected and washed to obtain a suspension that were transferred to PDA medium to evaluate the growth of the fungus colonies in laboratory conditions. The acaricides and the most of insecticides were compatible to the isolate JAB 02, except the insecticide Thiodan®, which was classified as very toxic. All the evaluated fungicides were classified as toxic or very toxic. In greenhouse assays, the fungicide Rovral® produced a number of grown colonies similar to those of the control and this compatibility was also showed by the products Alto 100® and Thiodan® in some of the evaluated periods. In another pathogenicity test, when L. lecanii were grown in culture media containing the insecticides, the conidia viability were not affected and the fungus were pathogenic to T. urticae, with mortality rates superior to the control in some cases. Also, compatibility bioassays involving L. lecanii at 5 x 106, 1 x 107 and 5 x 107 con./mL and the entomopathogenic nematodes Steinernema sp. (CB n6) and Heterorhabditis indica (CB n5) were conducted. / Doutor

The ex situ fungal cultures collections represent important biological heritage and is useful for mycologists and plant pathologists, supporting several scientific works. They provide viable pathogens anytime and assisting at identification, morpho-physiological aspects, life cycle, epidemiology, resistance to fungicides and breeding programs in resistance of diseases. However, there is not a universal preservation method that is efficient and suitable for the different groups of fungi. The most appropriate is the one that maintain, even after long periods, the original characteristics of culture: viability, sporulation and pathogenicity, excluding mutations and undesirable contamination. The choice will depend of the laboratory infrastructure, micro-organism, objectives, preferences and knowledge of the researcher. For necrotrophic fungi, after passing their life cycle stage as saprophytes they can be isolated in growing medium, using different preservation methods, especially: periodic transfer, dried host tissues, sterile water (Castellani), mineral oil, sterile soil, freezing, silica gel, lyophilization and cryopreservation. The study aimed to describe the efficiency of sterile soil (68 isolates), resistant structures (Sclerotinia sclerotiorum) in 4°C (10 strains), gelatin (17 strains), mineral oil (31 strains) and silica gel (14 strains) on the maintenance of viability, sporulation and colonization-pathogenicity of phytopathogenic necrotrophic fungi preserved in different dates, in Laboratório de Micologia e Proteção de Plantas (LAMIP), Uberlândia (MG), and in Laboratório de Microbiologia e Fitopatologia (LAMIF), Monte Carmelo (MG). The gelatine method has never been tested for fungi. The viability remained in 38 strains of sterile soil; three of mineral oil, 10 of gelatin. Sclerotia s maximum time of preservation was four years, and all fungal strains were viable on silica gel. / As coleções ex situ de culturas fúngicas são um importante patrimônio biológico, úteis à micologia e fitopatologia como suporte em trabalhos científicos. Disponibilizam patógenos a qualquer momento para: identificação, estudos morfofisiológicos, ciclo de vida, epidemiologia, resistência aos fungicidas e programas de melhoramento, visando resistência a doenças. Não há um método de preservação que seja eficiente e recomendado para os diferentes grupos de fungos, sendo mais adequado aquele que mantiver, mesmo após longos períodos, as características originais da cultura viabilidade, esporulação e patogenicidade , evitando mutações e contaminações indesejadas. A escolha irá depender da infraestrutura do laboratório, do microrganismo em estudo, dos objetivos do trabalho e de preferências e conhecimentos do pesquisador. Para os fungos necrotróficos, que passam alguma fase de seu ciclo de vida como saprófitas, podendo ser isolados em meio de cultivo, utilizam-se: repicagens periódicas, tecidos secos do hospedeiro, Castellani, óleo mineral, terriço, congelamento, sílica-gel, liofilização e criopreservação. O trabalho objetivou avaliar a eficiência de métodos de preservação e o tempo máximo de manutenção da viabilidade, esporulação, colonização/patogenicidade de fungos fitopatogênicos necrotróficos utilizados no Laboratório de Micologia e Proteção de Plantas (LAMIP) em Uberlândia (MG) e no Laboratório de Microbiologia e Fitopatologia (LAMIF) em Monte Carmelo (MG), preservados pelos métodos: terriço (68 isolados), escleródios (Sclerotinia sclerotiorum) em 4 °C (10 isolados), gelatina (17 isolados), óleo mineral (31 isolados) e sílica-gel (14 isolados), em diferentes datas. Mantiveram-se viáveis 38 isolados em terriço, três isolados em óleo mineral e 10 isolados em gelatina. O tempo máximo de preservação de escleródios foi de quatro anos, sendo que todos os isolados em sílica-gel permaneceram viáveis. / Mestre em Agronomia

A produção de alimentos inócuos, aptos ao consumo humano, é de extrema importância tanto à saúde pública quanto para atividade econômica. O queijo colonial é tipicamente consumido pela população do Rio Grande do Sul, porém ainda há poucos dados sobre a qualidade microbiológica desse produto. Sendo assim, os objetivos do presente estudo foram: (i) avaliar a qualidade microbiológica de queijos coloniais comercializados em feiras modelo e mercado público de Porto Alegre; (ii) caracterizar as cepas de Staphylococcus aureus e Listeria monocytogenes presentes neste produto quanto a alguns fatores de patogenicidade, resistência e tipificação genotípica. Para tanto, no período de novembro de 2014 a maio de 2015, foram analisadas 205 amostras de queijo colonial inspecionado, compreendendo 17 marcas distintas comercializadas em feiras modelos e no Mercado Público de Porto Alegre. As análises microbiológicas evidenciaram que 47,31% dos queijos estavam não conformes com pelo menos um dos parâmetros microbiológicos estabelecidos na RDC nº12, portanto impróprios ao consumo humano. Com relação à quantificação de coliformes termotolerantes e Staphylococcus coagulase positiva, 10,73% e 40,48% das amostras apresentaram contagens superiores ao limite máximo estabelecido na legislação, respectivamente. Valores acima do padrão aceitável foram observados em 5,85% dos queijos amostrados para ambos os parâmetros. No que diz respeito à pesquisa de Salmonella sp., todas as amostras apresentaram-se em conformidade. Listeria sp. foi detectado em 12,19% dos queijos, dos quais 24% foram classificados como L. monocytogenes, 52% L. inoccua, 16% L. welshimeri/L. seeligeri e 8% L. grayi. / The production of innocuous food, fit for human consumption, is of extreme importance to both public health and economic activity. Colonial cheese is typically consumed by the population of Rio Grande do Sul, but there is still limited data on the microbiological quality of this product. Thus, the objectives of the present study were: (i) to evaluate the microbiological quality of colonial cheeses marketed in model fairs and central market in Porto Alegre; (ii) to characterize Staphylococcus aureus and Listeria monocytogenes strains present in these products according to some pathogenicity and resistance factors as well as to their genotype. Thus, from November 2014 to May 2015, we analyzed 205 samples of colonial cheese, comprising 17 different brands marketed in model fairs and in the Public Market of Porto Alegre. Microbiological analyzes showed that 47.31% of the samples were not compliant with at least one of the microbiological parameters established in RDC nº12, therefore unfit for human consumption. Regarding the quantification of thermotolerant coliforms and Staphylococcus coagulase positive, 10.73% and 40.48% of the samples presented counts higher than the maximum limit established in the legislation, respectively. Values above the acceptable standard were observed in 5.85% of the samples for both parameters. With regard to Salmonella sp., all samples were negative. Listeria sp. was detected in 12.19% of the samples, of which 24% were classified as L. monocytogenes, 52% L. inoccua, 16% L. welshimeri / L. seeligeri and 8% L. grayi. Concomitant isolation of L. monocytogenes and L. inoccua species was observed in one sample. Two samples presented counts of 3.6 NMP.g-1 and 11 NMP.g-1 of Listeria sp.,; in the others, the population found was <3.0 NMP.g-1. Serotyping of L. monocytogenes indicated the presence of serovars 1 / 2a, 1 / 2b and 1 / 2c and the PFGE profile showed five pulse types. The amplification of the nuc gene, confirmed the 83 isolates of Staphylococcus coagulase positive as S. aureus. Regarding the antimicrobial susceptibility profile, all strains were susceptible to cefoxetin, oxacillin and vancomycin. Strains resistant to: penicillin (26.5%) were detected, all of them confirmed as beta-lactamase producers; ciprofloxacin and erythromycin (9.63%); tetracycline (7.22%) and gentamicin (4.81%). Of the total strains, 66.26% were susceptible to all antimicrobials tested, while 6.02% were considered multiresistant. The gene blaZ was detected in 31.32% of the strains. All strains were negative for mecA and lukS-F genes. As for the presence of genes coding for classical SEs, 16.86% amplified some gene being sea and sec the most frequent. From the molecular typing of the 83 strains of S. aureus it was possible to detect 19 different spa types among the 11 brands of cheeses commercialized; the t127 and t002 genotypes were predominant. Three different types of sequences were detected in the four strains of S. aureus selected for typing by the MLST technique performed in silico: ST-133, ST-5 and ST-1. The colonial cheese marketed in model fairs and in the public market of Porto Alegre, was confirmed as a possible carrier of microorganisms that cause DTA. Among these pathogens, the frequency of isolation of L. monocytogenes and, especially, of S. aureus is noteworthy.