Orientadores: Wanderley Dias da Silveira, Marcelo Brocchi / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-25T05:13:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Paiva_JacquelineBoldrinde_D.pdf: 5619127 bytes, checksum: 79177e4233fdbb891e6530eb0f3438bd (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Escherichia coli patogênica para aves (APEC) é responsável por inúmeras perdas no setor avícola mundial, por causar uma série de doenças nas aves que se apresentam de forma sistêmica ou localizada as quais são, coletivamente, denominadas colibacilose. Os mecanismos de virulência destas linhagens patogênicas para aves e, possivelmente, patogênicas para seres humanos ainda não foram totalmente elucidados. Este trabalho foi desenvolvido com o intuito de estudar genes possivelmente envolvidos com a patogenicidade de uma linhagem APEC causadora de Síndrome da Cabeça Inchada (SCI-07) ONT:H31, a partir de resultados obtidos em um microarranjo realizado in vitro, o qual comparou a linhagem em estudo à linhagem padrão E. coli EHEC 8624 (linhagem enterohemorrágica). Nove genes, detectados como sendo super-expressos no microarranjo, nas condições estudadas, foram selecionados para construção de mutantes nulos e de seus complementos [feoA (transporte de ferro), nirC (transportador de nitrito), flgE ( gancho flagelar), tyrR (regulador de transcrição da síntese de aminoácidos aromáticos), potF (subunidade periplasmática do transportador putrescina), yehD (possível fimbria), bfr (bacterioferrina), csgA ( subunidade principal da curlina) e entD (enteroquelina)]. Os mutantes construídos foram avaliados quanto as suas capacidades de adesão e invasão em cultivos celulares, e quanto ao seu potencial patogênico em aves de um dia de idade em comparação à cepa selvagem. As linhagens ?bfr, ?csgA e ?nirC apresentaram diminuição da capacidade de adesão em fibroblastos de aves (linhagem FEG) em comparação à linhagem selvagem em ambos os modelos adotados: na presença e ausência de alpha-D-mannopyranoside; a linhagem ?potF apresentou diminuição da adesão apenas na ausência de alpha-D-mannopyranoside. Os mutantes ?csgA e ?tyrR apresentaram redução na capacidade de invadir linhagem de células de trato respiratório humano (linhagem Hep-2). Nenhum mutante avaliado mostrou alteração na capacidade de invadir fibroblastos de aves (linhagem CEC-32). Os mutantes ?flgE e ?tyrR mostraram diminuição na capacidade de invadir e sobreviver em macrófagos de aves (linhagem HD11). A motilidade das linhagens mutantes ?csgA, ?bfr, ?yehD, ?potF, ?entD, ?nirC e ?feoA foi aumentada enquanto o mutante ?tyrR mostrou redução de motilidade e o mutante ?flgE tornou-se imóvel. Nenhuma linhagem mutante obtida mostrou a mesma capacidade da linhagem selvagem em causar mortalidade em aves de um dia; ?feoA tornou-se hipervirulenta e todos os demais mutantes apresentaram atenuação em diferentes graus, sendo a linhagem ?entD totalmente atenuada e, portanto, promissora quanto ao seu uso como linhagem vacinal.para o combate à colibacilose em aves, ou como linhagem carreadoras de epítopos presentes em outras linhagens APEC / Abstract: Avian Pathogenic Escherichia coli (APEC) is responsible for significant economic loses in the poultry industry worldwide, by cause a range of systemic or localized diseases in poultry collectively termed colibacillosis. The virulence mechanisms of these pathogenic strains for poultry and possibly pathogenic for humans have not been fully elucidated. This work was developed in order to study genes potentially involved in the pathogenicity of an APEC strain isolated from a Swollen Head Syndrome case (SCI- 07) ONT:H31; since the results obtained in a microarray performed in vitro, which compared the SCI-07 strain to the standard strain E. coli 8624 EHEC (enterohemorrhagic strain). Nine overexpressed genes in microarray under the conditions studied were selected for construction of null mutants and their complements [feoA (iron transport), nirC (nitrite transporter), flgE (flagellar hook), tyrR (transcriptional regulator of the aromatic amino acids biosynthesis), potF (periplasmic putrescine transporter subunit), yehD (putative adhesin), bfr (bacterioferritin), csgA (major curling subunit) and entD (enterochelin)]. The mutants constructed were evaluated for their capacity for adhesion and invasion in cell cultures, and for its pathogenic potential in one-day-old chickens in comparison to the wild type strain (WT). The ?bfr, ?csgA and ?nirC strains showed decreased adhesion capacity on avian fibroblasts (CEF cells) compared to the WT in both models adopted: in the presence and absence of alpha-D-mannopyranoside, the ?potF strain showed decrease on adhesion only in the absence of alpha-D-mannopyranoside. The ?csgA and ?tyrR mutants had reduced ability to invade human larynx cell line (Hep-2 cells). No mutant showed changes in the capacity of invade avian fibroblasts birds (CEC-32cells). The ?flgE and ?tyrR mutants showed decreased ability to invade and survive into avian macrophages (HD11 cells). The motility of mutant strains ?csgA, ?bfr, ?yehD, ?potF, ?entD, ?nirC and ?feoA was increased while the ?tyrR mutant showed reduced motility and the mutant ?flgE became nonmotile. No mutant strain showed the same capacity of the WT in cause mortality in one-day-old chickes; ?feoA became hipervirulenta and all other mutants showed attenuation in different degrees, including the ?entD that was completely attenuated and a promising vaccine candidate strain to combat colibacillosis in poultry, or as a carrier strain of epitopes present in other APEC strains / Doutorado / Genetica de Microorganismos / Doutora em Genética e Biologia Molecular

Made available in DSpace on 2014-08-20T14:38:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_isabel_madrid.pdf: 2158071 bytes, checksum: 0cdf6bd60773cb623d04e6df539e8aa9 (MD5) Previous issue date: 2011-02-25 / Sporotrichosis has been receiving attention in any world in the several areas of the health as an important fungal disease. So, this work aimed: (i) to study cases of sporotrichosis diagnosed in the south region of Rio Grande do Sul in a period of ten years, (ii) to study the morphological and pathogenicity characteristics of S. schenckii isolates, (iii) to determine the sensitivity of S. schenckii isolates to the commercial disinfectants. Sporotrichosis cases were analysed as for geographical distribution, it clinical forms of the disease, presence of the fungus in different anatomical sites and tecidual inflammatory response. The 42 S. schenckii isolates originating from clinical cases, environment isolates and reference strains used in the phenotypic study were evaluated as for macromorphology in Sabouraud agar added of chloramphenicol, potato agar and ágar lactrimel, incubated 25ºC and 35ºC for 21 days. The micromorphology was analyzed in potato agar to 25ºC whereas the termotholerance was evaluated in ágar Sabouraud added of 1% yeast extract, incubated 41ºC for seven days. Ultraestructural study of nine clinical isolates and two reference strains of S. schenckii were carried by transmission electron microscopy. Susceptibility of 12 S. schenckii isolates to disinfectants was performed by the techniques of broth microdilution, agar diffusion and direct exposute test. The 103 cases of sporotrichosis in animals demonstrated that this is an endemic mycosis in the south region of Rio Grande do Sul being more frequent in young felines and adult dogs. The felines developed disseminated cutaneous form with more frequency. Therefore, in canines, the fixed cutaneous form was predominant though it has taken place in 18.2% of the dog to respiratory form with absence of cutaneous lesions. Research of the S. schenckii in nails, oral cavity, conjunctival mucosa, blood and testicles demonstrated high fungal positivity in samples of oral cavity (45.2%) and testicles (46.6%). The study of the hematological alterations related with the clinical form of the disease demonstrated that animals with the cutaneous fixed form of the mycosis do not present alterations in the blood count. However, animals with the cutaneous disseminated form develop important alterations characterized mainly for leucocytosis with neutrophilia and anaemia. Morphological analyzes of 42 clinical and environmental isolates of S. schenckii demonstrated macro and micromorphogical differences in the different culture medium utilized. In the thermotolerance evaluation 26.2% isolates were capable of growth at 41oC, specially isolates of feline sporotrichosis. The ultraestructural study showed presence of granules of melanin in all S. schenckii isolates of canine sporotrichosis and correlation among melanin and cell wall thickness. In vitro evaluation of disinfectants demonstrated chlorexidine digluconate antifungal activity in the microdilution broth and agar diffusion techniques and the sodium hypochlorite showed best performance in the direct exposure test. The presence of the organic matter interfered in the antifungal action of both disinfectants. Sodium hypochlorite showed better results with total elimination of the fungal load in the absence of organic matter and a reduction of 60 % of the fungal load in the presence of this. / A esporotricose tem se destacado mundialmente nas diversas áreas da saúde como uma importante doença fúngica. Assim, este trabalho teve como objetivos: (i) estudar casos de esporotricose diagnosticados na região sul do Rio Grande do Sul num período de dez anos, (ii) estudar as características morfológicas e de patogenicidade de isolados de Sporothrix schenckii, (iii) determinar a suscetibilidade de S. schenckii a desinfetantes comerciais. Os casos de esporotricose foram analisados quanto a distribuição geográfica, forma clíinica da doença, presença do fungo em diferentes sítios anatômicos e resposta tecidual. Os 42 isolados de S. schenckii provenientes de casos clínicos, isolados do ambiente e cepas de referência utilizados no estudo fenotípico foram avaliados quanto a macromorfologia em ágar Sabouraud acrescido de cloranfenicol, ágar batata e ágar lactrimel incubados a 25ºC e 35ºC por 21 dias. A micromorfologia foi avaliada em ágar batata a 25ºC enquanto que a termotolerância foi avaliada em ágar Sabouraud acrecido de extrato de levedura 1% incubado a 41ºC por sete dias. O estudo ultraestrural dos nove isolados clínicos e duas cepas de referência de S. schenckii foi realizado por microscopia eletrônica de transmissão. A suscetiblidade de 12 isolados de S. schenckii a desinfetantes foi realizada pelas técnicas de microdiluição em caldo, difusão em agar e teste de exposição direta. Os 103 casos de esporotricose em animais demonstraram que esta é uma micose endêmica na região sul do Rio Grande do Sul ocorrendo com mais freqüência em felinos jovens e cães adultos. Os felinos desenvolveram principalmente a forma cutânea disseminada enquanto que em caninos, a forma cutânea fixa foi a mais freqüente embora tenha ocorrido em 18,2% dos caninos, a forma respiratória com ausência de lesões cutâneas. A pesquisa do fungo S. schenckii em unhas, cavidade oral, mucosa conjuntival, sangue e testículos revelou alta positividade fúngica em amostras de testículos (46,6%) e cavidade oral (45,2%). O hemograma de animais com a forma cutânea fixa não apresentou alterações nos valores hematológicos enquanto que aqueles com a forma cutânea disseminada apresentaram alterações tanto no leucograma como no eritrograma, caracterizadas por leucocitose por neutrofilia e anemia normocítica e normocrômica. A análise morfológica de 42 isolados clínicos e do ambiente de S. schenckii demonstrou diferenças macro e micromorfológicas nos diferentes meios de cultivo utilizados. Na avaliação da termotolerância obteve-se 26,2% dos isolados termotolerantes, sendo a maioria proveniente de casos de esporotricose felina. O estudo ultraestrutural revelou presença de grânulos de melanina em todos os isolados de S. schenckii originados de esporotricose canina e correlação entre presença de melanina e espessura da parede celular. A avaliação in vitro de desinfetantes demonstrou maior ação antifúngica do digluconato de clorexidina nas técnicas de microdiluição em caldo e difusão em agar enquanto que o hipoclorido de sódio apresentou melhor eficácia na técnica de exposição direta. A presença de matéria orgânica interferiu na ação antifúngica de ambos os desinfetantes, entretanto, o hipoclorito de sódio apresentou melhores resultados com inativação total da carga fúngica na ausência de matéria orgânica e redução de 60% da carga fúngica na presença desta.

P. aeruginosa PA14 é uma linhagem isolada de queimadura que apresenta vários fatores de patogenicidade comuns no quadro de infecção de hospedeiros filogeneticamente distintos (plantas, mamíferos ou invertebrados). O gene kerV foi revelado numa busca por mutantes atenuados em virulência em uma biblioteca de mutantes por transposons da linhagem PA14 (Rahme et al., 1997). A caracterização da linhagem D12, mutante em kerV, confirmou sua virulência atenuada (Apidianakis et al., 2005 e An et al., 2009) e resultados do transcriptoma mostraram alteração na expressão de mais de 500 genes, sendo alguns relacionados com o sistema de \"quorum sensing\" (Rahme et al, dados não publicados). O gene kerV está próximo à montante ao gene gloB, envolvido em detoxificação de metilglioxal, e à jusante aos genes rnhA e dnaQ, que codificam proteínas envolvidas na replicação e reparo do DNA. Este trabalho teve como objetivo estudar a função molecular do produto de kerV e a expressão dos genes do lócus kerV-rnhA-dnaQ. Análises de bioinformática indicam que a proteína KerV é uma metiltransferase dependente de S-adenosil-metionina (SAM), apresentando um domínio conservado de ligação a SAM e uma arquitetura de domínio compatível com a organização em fitas-beta e hélices-alfa alternadas descritas para a família das metiltransferases dependentes de SAM. Ela não apresenta outros domínios conservados que indiquem seu substrato de metilação. A expressão heteróloga desta proteína em E. coli, mostrou que ela é expressa de maneira parcialmente solúvel quando co-expressa com as chaperoninas GroEL/GroES em baixas temperaturas ou quando fusionada a MBP ou GST. A purificação desta proteína mostra que ela é co-eluída com a chaperonina GroEL sugerindo que para atingir sua conformação nativa ela necessita dessas proteínas acessórias. MBP-KerV purificado foi usado para ensaios \"in vitro\" de atividade de metiltransferase e ligação a SAM, que não foram conclusivos, pois não há certeza do seu correto estado de enovelamento. Ensaios de duplo-híbrido mostraram que KerV não interage com os produtos de rnhA e dnaQ, sugerindo que KerV não está diretamente relacionado com suas funções. A freqüência de mutação na linhagem D12 está levemente aumentada (aproximadamente quatro vezes), o que sugere que KerV não está diretamente envolvida no reparo de DNA do tipo ´mismatch repair`. Os ensaios usados para detectar metilação do DNA, proteínas e rRNAs não revelaram que KerV estaria envolvido com a metilação destes substratos. Os inícios de transcrição dos genes kerV, rnhA e dnaQ foram determinados. A deleção de kerV causa um efeito polar na transcrição do gene rnhA, que não se reflete nos níveis da proteína. A deleção também afeta a expressão de dnaQ, sugerindo que KerV seja importante para sua regulação. Os ensaios de complementação da virulência em modelos invertebrados e de células epiteliais de pulmão mostram que apenas a presença dos três genes e seus produtos em níveis normais são capazes de reverter a maioria dos fenótipos atenuados. KerV se mostrou essencial para a inibição da translocação de NF-kB para o núcleo das células, comprovando que esta proteína é relevante para a virulência de PA14, contribuindo com o silenciamento da resposta imune do hospedeiro. O conjunto dos resultados indicam uma complexa inter-relação entre a expressão dos genes kerV, rnhA e dnaQ e seu papel na biologia de P. aeruginosa. / P. aeruginosa PA14 is a burn isolate multi-host pathogen strain. The screening for virulence attenuated mutants in a PA14 transposon mutant library revealed the kerV gene (Rahme et al., 1997). The characterization of D12 strain, a kerV mutant, confirmed the attenuated virulence phenotype (Apidianakis et al., 2005 and An et al., 2009) and transcriptome analysis showed the expression of more than 500 genes are affected in D12, some of these genes are related with quorum sensing (Rahme et al, unpublished data). kerV is upstream of the gloB gene, related with methylglioxal detoxification and downstream of the rnhA and dnaQ genes, both related with DNA replication and repair. The purpose of this work was to study the molecular function of KerV product and the expression of kerV-rnhA-dnaQ locus. Bioinformatics analysis indicated that KerV is a SAM dependent methyltransferase that have a conserved SAM binding domain with architecture compatible with classic alternating β-stranded and α-helical regions. KerV does not show any other conserved motif that could indicate its methylation substrate. Heterologous expression in E. coli showed that KerV is partially soluble only when co-expressed with GroeL/GroES chaperones at low temperatures or when KerV is in fusion with MBP or GST tag. During the purification process KerV was copurified with GroEL chaperone suggesting that this association may be required for the correct folding of KerV. Methyltransferase activity and SAM binding assays were done with purified MBPKerV and the results were not conclusive since the proper conformation of MBP-KerV cannot be verified. Yeast two-hybrid assays indicated that RNaseH and DnaQ are not interaction partners of KerV, suggesting that their functions are not directly related. The mutation frequency of D12 strain increased only about four times in relation to PA14, suggesting that KerV is not directly involved with DNA mismatch repair. The assays to detect methylation in DNA, RNAs and proteins do not show that KerV is involved with methylation of these substrates. The transcription start sites of kerV, rnhA and dnaQ genes were mapped through 5\'-RACE- and primer extension experiments. The kerV deletion causes a polar effect on the transcription of rnhA gene, which is not reflected on RNaseH protein levels. The kerV deletion also affects dnaQ expression, suggesting that KerV is important for its regulation.The virulence complementation assays in flies and lung epithelial cells showed that the fully rescue of the wild type phenotype was achieved only when the entire locus is present. KerV was essential to inhibit the NF-kB nucleus translocation, demonstrating that KerV is relevant to PA14 virulence, contributing for the silencing of host immune system. Altogether, these data showed a complex inter-relation among kerV, rnhA and dnaQ genes and its role in P. aeruginosa biology

Pseudomonas aeruginosa é uma proteobactéria do grupo gama, que pode se comportar como um patógeno oportunista. A linhagem PA14 apresenta duas ilhas de patogenicidade. A maior delas, PAPI-1, contém dois grupos de genes envolvidos com virulência, transcritos de maneira oposta e que estão entre duas seqüências repetidas diretas. O primeiro grupo compreende quatro genes dispostos em dois operons, que codificam para proteínas de sistemas de dois componentes (PvrS, PvrR, RcsC e RcsB). PvrS e RcsC são proteínas sensoras híbridas, que apresentam domínios de histidina-quinase e de reguladores de resposta. PvrR é um regulador de resposta com um domínio EAL com atividade de fosfodiesterase de diGMP cíclico e RcsB apresenta um domínio de ligação a DNA, além de um domínio fosfoaceptor. O outro grupo é composto de cinco genes, cupD1 a cupD5, que codificam para uma fímbria do tipo chaperone-usher e que apresenta alta similaridade com cupA, envolvido na formação de biofilme em outras linhagens de P. aeruginosa. Trabalhos anteriores mostraram que pvrS, pvrR, rcsC, rcsB e cupD2 estão relacionados com a virulência de PA14. Como estes grupos de genes parecem ter sido inseridos na ilha em um único evento de recombinação, este trabalho investigou se os sistemas de dois componentes estão relacionados com a regulação da expressão de cupD. Foi observado que a expressão de cupD é maior a 28ºC do que que a 37ºC e é influenciada positivamente pelo regulador global de expressão, MvaT, uma proteína tipo H-NS. Ensaios de β-galactosidase a partir de uma fusão de transcrição mostraram que a atividade promotora de cupD é cerca de 50% menor numa linhagem com deleção em rcsB em relação à linhagem selvagem. Nenhuma diferença consistente foi observada entre as linhagens com deleções em pvrS, pvrR, rcsC e rcsB e PA14 em relação a motilidade dos tipos swarming, swimming ou twitching ou à formação de biofilme. A linhagem de P. aeruginosa PA14 superexpressando RcsB mostrou níveis exacerbados de mRNA de cupD1, sendo a atuação de RcsB específica em cupD, já que os outros grupos de genes cup presentes em PA14 não mostraram a mesma variação na expressão, conforme analisado por RT-PCR quantitativo. Essa linhagem mostrou também um aumento na formação de biofilme, sem que a motilidade fosse alterada. Ainda visando elucidar os mecanismos de regulação de cupD, linhagens que superexpressam pvrR também foram analisadas quanto a estes fenótipos. Nesse caso, a superexpressão de pvrR diminuiu a formação de biofilme, conforme esperado, aumentou a motilidade do tipo swarming, porém não alterou a expressão de cupD. Os dados do presente trabalho demonstraram que a cupD é regulado pelos genes do sistemas de dois componentes adjacentes a ele e que o ativador de transcrição RcsB está relacionado com a formação de biofilme em tubos de vidro, provavelmente via a fímbria CupD. / Pseudomonas aeruginosa is a γ-proteobacteria that can behave as an opportunistic pathogen. The strain PA14 carries two pathogenicity islands, the largest of them, PAPI-1, contains two gene clusters between two direct repeat sequences that are transcribed in opposite directions and are involved in virulence. The first group consists of four genes arranged in two operons encoding two-component system proteins (PvrS, PvrR, RcsC and RcsB). PvrS and RcsC are hybrid sensor proteins, which contain domains of histidine kinase and response regulator domains. PvrR is a response regulator with a phosphodiesterase EAL domain and RcsB presents a C- terminal HTH DNA biding domain, in addition to a phosphoaceptor domain. The other group is composed of five genes, cupD1-5, that encodes components and assembly factors of a putative fimbrial CupD, which has high similarity with CupA, involved in the biofilm formation in other P. aeruginosa strains. Earlier work showed that pvrS, pvrR, rcsC, rcsB and cupD2 are related to the virulence of PA14. As these groups of genes appear to have been inserted on the island in a single event of recombination, this study investigated whether the two-component systems are related to the regulation of cupD expression. It was observed that cupD promoter activity is higher at 28oC than at 37oC and it is positively influenced by the global regulator, MvaT, a H-NS like protein. A lacZ transcriptional fusion showed about 50% less promoter activity of cupD from a strain with deletion in rcsB as compared to PA14. No consistent differences were found among the strains with deletions in pvrS, pvrR, rcsC and rcsB and PA14 on swarming, swimming and twitching motilities or biofilmsformation. A strain overexpressing overexpression showed heigher levels of cupD1mRNA of, and the role of RcsB as an activator is specific to cupD, as the other groups of cup genes present in PA14 did not show the same variation in the expression, as analyzed by quantitative RT-PCR. This strain also showed an increase in biofilm formation. In further assays aiming to elucidate the mechanisms of regulation of cupD, a strains overexpressing pvrR was also analyzed. Overexpression of pvrR decreased the formation of biofilm, as expected, and increased swarming motility, but did not alter the expression of cupD. The data from this study demonstrated that cupD is regulated by RcsB, and that this transcriptional activator is involved in the formation of biofilm in glass tubes, probably via CupD fimbriae.

A produção de alimentos inócuos, aptos ao consumo humano, é de extrema importância tanto à saúde pública quanto para atividade econômica. O queijo colonial é tipicamente consumido pela população do Rio Grande do Sul, porém ainda há poucos dados sobre a qualidade microbiológica desse produto. Sendo assim, os objetivos do presente estudo foram: (i) avaliar a qualidade microbiológica de queijos coloniais comercializados em feiras modelo e mercado público de Porto Alegre; (ii) caracterizar as cepas de Staphylococcus aureus e Listeria monocytogenes presentes neste produto quanto a alguns fatores de patogenicidade, resistência e tipificação genotípica. Para tanto, no período de novembro de 2014 a maio de 2015, foram analisadas 205 amostras de queijo colonial inspecionado, compreendendo 17 marcas distintas comercializadas em feiras modelos e no Mercado Público de Porto Alegre. As análises microbiológicas evidenciaram que 47,31% dos queijos estavam não conformes com pelo menos um dos parâmetros microbiológicos estabelecidos na RDC nº12, portanto impróprios ao consumo humano. Com relação à quantificação de coliformes termotolerantes e Staphylococcus coagulase positiva, 10,73% e 40,48% das amostras apresentaram contagens superiores ao limite máximo estabelecido na legislação, respectivamente. Valores acima do padrão aceitável foram observados em 5,85% dos queijos amostrados para ambos os parâmetros. No que diz respeito à pesquisa de Salmonella sp., todas as amostras apresentaram-se em conformidade. Listeria sp. foi detectado em 12,19% dos queijos, dos quais 24% foram classificados como L. monocytogenes, 52% L. inoccua, 16% L. welshimeri/L. seeligeri e 8% L. grayi. / The production of innocuous food, fit for human consumption, is of extreme importance to both public health and economic activity. Colonial cheese is typically consumed by the population of Rio Grande do Sul, but there is still limited data on the microbiological quality of this product. Thus, the objectives of the present study were: (i) to evaluate the microbiological quality of colonial cheeses marketed in model fairs and central market in Porto Alegre; (ii) to characterize Staphylococcus aureus and Listeria monocytogenes strains present in these products according to some pathogenicity and resistance factors as well as to their genotype. Thus, from November 2014 to May 2015, we analyzed 205 samples of colonial cheese, comprising 17 different brands marketed in model fairs and in the Public Market of Porto Alegre. Microbiological analyzes showed that 47.31% of the samples were not compliant with at least one of the microbiological parameters established in RDC nº12, therefore unfit for human consumption. Regarding the quantification of thermotolerant coliforms and Staphylococcus coagulase positive, 10.73% and 40.48% of the samples presented counts higher than the maximum limit established in the legislation, respectively. Values above the acceptable standard were observed in 5.85% of the samples for both parameters. With regard to Salmonella sp., all samples were negative. Listeria sp. was detected in 12.19% of the samples, of which 24% were classified as L. monocytogenes, 52% L. inoccua, 16% L. welshimeri / L. seeligeri and 8% L. grayi. Concomitant isolation of L. monocytogenes and L. inoccua species was observed in one sample. Two samples presented counts of 3.6 NMP.g-1 and 11 NMP.g-1 of Listeria sp.,; in the others, the population found was <3.0 NMP.g-1. Serotyping of L. monocytogenes indicated the presence of serovars 1 / 2a, 1 / 2b and 1 / 2c and the PFGE profile showed five pulse types. The amplification of the nuc gene, confirmed the 83 isolates of Staphylococcus coagulase positive as S. aureus. Regarding the antimicrobial susceptibility profile, all strains were susceptible to cefoxetin, oxacillin and vancomycin. Strains resistant to: penicillin (26.5%) were detected, all of them confirmed as beta-lactamase producers; ciprofloxacin and erythromycin (9.63%); tetracycline (7.22%) and gentamicin (4.81%). Of the total strains, 66.26% were susceptible to all antimicrobials tested, while 6.02% were considered multiresistant. The gene blaZ was detected in 31.32% of the strains. All strains were negative for mecA and lukS-F genes. As for the presence of genes coding for classical SEs, 16.86% amplified some gene being sea and sec the most frequent. From the molecular typing of the 83 strains of S. aureus it was possible to detect 19 different spa types among the 11 brands of cheeses commercialized; the t127 and t002 genotypes were predominant. Three different types of sequences were detected in the four strains of S. aureus selected for typing by the MLST technique performed in silico: ST-133, ST-5 and ST-1. The colonial cheese marketed in model fairs and in the public market of Porto Alegre, was confirmed as a possible carrier of microorganisms that cause DTA. Among these pathogens, the frequency of isolation of L. monocytogenes and, especially, of S. aureus is noteworthy.

Escherichia coli enteropatogênica atípica (aEPEC) faz parte de um grupo de patógenos capazes de formar um tipo de lesão característica em cultura de tecidos epiteliais, denominada attaching and effacing (A/E). Os genes que são necessários para produção da lesão A/E estão localizados em uma ilha de patogenicidade denominada região LEE (locus of enterocyte effacement). A transcrição de genes da região LEE está sujeita a regulação por vários fatores, entre eles quorum sensing, termo utilizado para designar um mecanismo de regulação gênica dependente da concentração celular. Esse mecanismo é usado por bactérias Gram-positivas e Gram-negativas e em ambos os casos envolve a produção e detecção de moléculas sinalizadoras extracelulares, denominadas autoindutores. Até o momento, pelo menos quatro sistemas de quorum sensing foram descritos, entre eles o sistema de autoindutor AI-3 encontrado em bactérias Gram-positivas e Gram-negativas. Diversos mecanismos celulares, entre eles a expressão de fatores de virulência em amostras de EPEC e EHEC, são regulados por esse fenômeno. O principal objetivo deste estudo foi verificar se existe uma possível regulação por quorum sensing na interação in vitro de uma amostra de E. coli da microbiota intestinal com amostras de aEPEC. Após a confirmação da produção de AI-3 por amostras de E.coli da microbiota intestinal foram realizados ensaios de adesão e quantificação utilizando meio pré-condicionado com esta amostra, epinefrina e bloqueadores que confirmaram que os padrões de adesão de aEPEC obtidos em menor tempo são devidos a presença de AI-3 no meio pré-condicionado, indicando a participação de quorum sensing nessa interação. Além disso, foi observado um fenômeno citotóxico nas células que não é produzido pelo AI-3. / Atypical Enteropathogenic Escherichia coli (aEPEC) are part of a group of pathogens capable of forming a type of lesion characteristic of epithelial tissues in culture, called attaching and effacing (A/E). The genes that are required for production of A/E lesion are located in a pathogenicity island called LEE region (locus of enterocyte effacement). The transcription of LEE genes in the region is subject to regulation by various factors, including quorum sensing, a term used to describe a mechanism of gene regulation dependent on cell concentration. This mechanism is used by Gram-positive and Gram-negative and in both cases involves the production and detection of extracellular signaling molecules, called autoinducers. So far, four systems of quorum sensing have been described, including the system of autoinducers AI-3 found in Gram-positive and Gram-negative bacteria. Several cellular mechanisms, including expression of virulence factors in EPEC and EHEC are regulated by this phenomenon. The main objective of this study was to determine whether there is a possible regulation by quorum sensing in the in vitro interaction of a strains of E. coli of the intestinal microbiota with strains aEPEC. After confirming the production of AI-3 in E. coli of the intestinal microbiota were performed adhesion assays and quantification using means preconditioned with this strains, epinephrine, and blockers who confirmed that patterns of adherence of aEPEC obtained in less time are due to the presence of AI-3 in the preconditioned means, indicating the involvement of quorum sensing in this interaction. Furthermore, we observed a phenomenon that cytotoxic cells is not produced by AI-3.

Bacillus thuringiensis (Bt) é uma bactéria entomopatogênica utilizada como biopesticida contra insetos, principalmente Lepidoptera, Coleoptera e Diptera, e na produção de organismos geneticamente modificados. Com a descoberta da capacidade de Bt se movimentar sistemicamente em plantas, potencialmente atingindo insetos sugadores, surge uma nova possibilidade para o controle de Diaphorina citri Kuwayama, que transmite bactérias associadas ao Huanglongbing, uma séria doença da citricultura. O objetivo do trabalho foi desenvolver sistemas de aquisição de Bt por D. citri, in vitro e in planta, para estudos de patogenicidade. Uma estirpe de Bt transformada com o gene green fluorescent protein (Btk-gfp), cultivada em meio NYSM, foi usada como marcador de aquisição pelo inseto e movimentação nas plantas. Para o sistema de aquisição in vitro, selecionaram-se dietas com base na sobrevivência e atividade alimentar de D. citri. Btk-gfp foi adicionada à dieta selecionada, composta por uma solução de sacarose a 30% em água mineral com corantes alimentícios (verde 0,1% e amarelo 0,4%). A dieta foi acondicionada em um sachê formado por duas membranas de Parafilm®, sobre a parte inferior de uma placa de Petri de 40 mm de diâmetro (gaiola de alimentação). Dez insetos foram confinados em cada gaiola para períodos de acesso à aquisição (PAA) de até 48 h, estabelecendo-se 10 gaiolas por tratamento; como controle, utilizou-se a dieta sem Btk-gfp. Para testes de aquisição in planta, suspensões de Btk-gfp foram inoculadas em ramos novos cortados e no solo, próximo à haste de seedlings de laranja doce [Citrus sinensis (L.) Osbeck] e de murta [Murraya paniculata (L.) Jack], e em diferentes concentrações, avaliando-se a movimentação da bactéria após um período de 48 h. Posteriormente, adultos e ninfas de D. citri foram confinados nestas plantas para avaliar a aquisição de Btk-gfp, usando-se plantas inoculadas apenas com água como controle. Para os bioensaios de patogenicidade a D. citri, 21 estirpes de Bt foram testadas no sistema de aquisição em ramos cortados de murta e 5 estirpes em ramos cortados de laranja para ninfas de 3º. ínstar. In vitro, testaram-se 3 estirpes contra ninfas de 3º. ínstar e 9 contra adultos. Btgfp foi absorvido pelas raízes e ramos novos cortados de seedlings de laranja doce e de murta, e translocado até as folhas, mostrando movimentação sistêmica. Esta estirpe foi adquirida por adultos e ninfas de D. citri que se alimentaram nos ramos novos cortados, mantidos em suspensão bacteriana. O sistema de alimentação in vitro permitiu a aquisição de Bt-gfp (pellet ressuspendido na dieta de sacarose com corantes) por adultos de D. citri com apenas 12 h de PAA, mas 30 h é um período ótimo para exposição do inseto ao sistema. Nenhuma das nove estirpes testadas no sistema in vitro foi patogênica aos adultos de D. citri. Das 21 estirpes testadas contra ninfas de 3º. ínstar em ramos novos de murta, cinco causaram mortalidade de 24 a 45%, em 5 dias. Essas cinco estirpes também foram testadas contra ninfas dem ramos de citros cortados, causando mortalidade de 35 a 75% em 48 h. / Bacillus thuringiensis (Bt) is an entomopathogenic bacterium widely used as a biopesticide against insect pests, mainly Coleoptera, Lepidoptera and Diptera, or for engineering genetically-modified plants. The recent finding that Bt is able to move systemically within plants, potentially targeting piercing-sucking insects, suggests that the bacterium may be effective for microbial control of Diaphorina citri Kuwayama, the vector of Huanglongbing-associated bacteria, a serious citrus disease. The goal of this research was to develop in vitro and in planta acquisition systems of Bt by D. citri for pathogenicity assays. A transformed Bt strain with the green fluorescent protein gene (Btk-gfp), grown in NYSM medium, was used as a marker to demonstrate bacterial acquisition by the insect and movement within the plants. Artificial diets were selected for the in vitro acquisition system based on insect survival and feeding activity. Btk-gfp was added to the selected diet, a 30% sucrose solution in mineral water with green (0.1%) and yellow (0.4%) food coloring. The diet was placed inside a Parafilm® membrane sachet, covering the opening of the lower half of a 40-mm diameter culture plate, and forming the feeding cage. Ten D. citri adults or nymphs were introduced in each cage and allowed acquisition access periods (AAP) of up to 48 h on the diet; as a control, a diet without Btk-gfp was used. For testing the in planta acquisition system, Btk-gfp suspensions were inoculated in young stem cuttings or in the soil, near the stem of Citrus sinensis (L.) Osbeck and Murraya paniculata (L.) Jack seedlings, as well as in different concentrations, and bacterial movement was assessed after 48 h; plants inoculated with water were used as controls. D. citri adults and nymphs were confined on inoculated plants to verify Btk-gfp acquisition. In pathogenicity assays, 21 Bt strains were tested against 3rd instars of D. citri using the acquisition system with stem cuttings of M. paniculata and 5 strains were tested using citrus stem cuttings. The in vitro acquisition system was used to test pathogenicity of 3 and 9 Bt strains against 3rd-instar nymphs and adults, respectively. Bt-gfp absorbed by roots or young stem cuttings of inoculated C. sinensis and M. paniculata was detected in the leaves, showing systemic movement. Bt-gfp was isolated from groups of nymphs and adults that were fed on inoculated stem cuttings or on artificial diets with bacterial suspension, showing that both in planta and in vitro acquisition take place. D. citri adults can acquire Bt-gfp within 12 h of AAP to the artificial diet with bacterium inoculum, but 30 h is the optimum AAP. None of the nine Bt strains assayed in vitro were pathogenic to D. citri adults. Of 21 strains tested for pathogenicity against nymphs using inoculated stem cuttings of M. paniculata, five caused mortality rates varying from 24 to 45% mortality within 5 days. These five Bt strains were also tested against D. citri nymphs using young stem cuttings of C. sinensis, causing mortality rates of 35 to 75% within 48 h.

Estudou-se prospectivamente o comportamento das calcificações, da atrofia, das alterações da substância branca e alterações vasculares nas imagens de tomografia computadorizada de crânio de 162 crianças e adolescentes infectados pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV) por transmissão vertical e que estavam ou estiveram em acompanhamento clínico no Ambulatório de Infectologia Pediátrica do Instituto da Criança do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, entre 1992 e 2002. Analisaram-se as possíveis correlações entre estas alterações e seu aspecto evolutivo. Para tal finalidade, foram avaliadas 606 tomografias computadorizadas de crânio (média de 3,74 exames por paciente), as quais constituíram o grupo de estudo. Após a caracterização quanto à presença ou não das alterações supracitadas, e suas possíveis inter-relações, realizou-se a análise estatística dos resultados obtidos através do teste exato de Fisher com nível de significância de 5%. Posteriormente, os mesmo aspectos foram avaliados em função do seu comportamento evolutivo em um subgrupo de 61 pacientes (média, 4,18 exames por paciente, totalizando 321 exames tomográficos). Estes pacientes tinham, pelo menos, quatro estudos tomográficos seriados (com intervalo mínimo de noventa dias entre os exames subseqüentes e pelo menos dois anos de intervalo total entre o primeiro e o último exame). As alterações tomográficas foram abordadas individual e qualitativamente segundo o critério de presença e intensidade. Inicialmente, o conjunto dos resultados foi tratado de forma individual (para cada paciente) e, depois, em relação à totalidade do grupo em questão. As calcificações foram encontradas em 46,30% dos pacientes; a atrofia, em 37,65%; as alterações da substância branca, em 25,93%; as anomalias vasculares, em 25,19%. Constatou-se uma correlação significativa entre as alterações de substância branca e a atrofia, bem como entre as calcificações e as alterações vasculares. A análise evolutiva destas características demonstrou haver um acréscimo significativo das alterações entre o momento inicial e o quarto momento no conjunto das alterações, sobretudo para as calcificações e para as alterações vasculares. Concluiu-se que as calcificações e a atrofia foram as alterações mais freqüentes nesta série de crianças e adolescentes com HIV adquirido por transmissão vertical. A atrofia e as alterações da substância branca apresentaram uma inter-relação importante na amostra descritiva, assim como as alterações vasculares e as calcificações mostraram uma associação evolutiva significativa em relação à sua progressão / We prospectively studied the behavior of calcifications, atrophy, white matter and vascular abnormalities on the images of computed tomography (CT) of 162 children and adolescents infected with the human immunodeficiency virus (HIV) acquired by vertical transmission, who are or were clinically followed in the Ambulatory of Pediatric Infectology of the Children Institute at the Clinics Hospital of University of São Paulo Medical School, from 1992 to 2002. We analyzed the possible correlation between these abnormalities, as well as, their evolutive aspects. For this purpose, we evaluated 606 CT scans (mean 3.74 exams per patient), which composed the group of study. After the characterization according to the presence or not of the anomalies mentioned above, and their possible inter-relations, we performed a statistical analysis of the obtained results with the Fisher test with a level of significance below 5%. Later, these aspects were evaluated regarding its evolutive behavior in a subgroup of 61 patients (mean, 4.18 exams per patient, summing 321 exams). These patients had, at least, four serial cranial CT (with minimum interval of ninety days between the subsequent exams and, at least, two years of total interval between the first and the fourth exam). The cranial CT abnormalities presented were assessed individually as absent or present. Initially, the set results were assessed individually (for each patient) and, later in relation to the totality of the group. Calcifications were found in 46.30% of all patients, atrophy in 37.65%, white matter abnormalities in 25.93% and vascular anomalies in 25.19%. We found a significant correlation between white matter abnormalities and atrophy, as well as, between calcifications and vascular anomalies. Evolutive analysis of these characteristics demonstrated a significant increase of the abnormalities between the first and the fourth moment, with emphasis to the calcifications and vascular anomalies. We concluded that, calcifications and atrophy were the most frequent abnormalities in this series of children and adolescents with HIV acquired by vertical transmission. Atrophy and white matter abnormalities presented a significant correlation in the descriptive sample, as well as, vascular anomalies and calcifications that also demonstrated a significant evolutive association regarding its progression

O Cancro Cítrico, um dos mais graves problemas fitossanitários da citricultura atual, é uma doença causada pelo fitopatógeno Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac). Um estudo funcional do genoma de Xac foi iniciado com o intuito de identificar interações proteína-proteína envolvidas em processos de patogenicidade de Xac. Através da utilização do sistema duplo-híbrido de levedura, baseado nos domínios de ligação ao DNA e ativação da transcrição do GAL4, nós analisamos os principais componentes dos mecanismos de patogenicidade de Xac, incluindo o Sistema de Secreção do Tipo III (TTSS), Sistema de Secreção do Tipo IV (TFSS) e Sistema de \"Quorum Sensing\" composto pelas proteínas Rpf. Componentes desses sistemas foram utilizados como iscas na triagem de uma biblioteca genômica de Xac. O TTSS é codificado pelos genes denominados hrp (\"hypersensitive response and pathogenicity\"), hrc (\"hrp conserved\") e hpa (\"hrp associated\") localizados no locus hrp do cromossomo de Xac. Esse sistema de secreção é capaz de translocar proteínas efetoras do citoplasma bacteriano para o interior da célula hospedeira. Nossos resultados mostraram novas interações proteínaproteína entre componentes do próprio TTSS além de associações específicas com uma proteína hipotética: 1) HrpG, um regulador de resposta de um sistema de dois componentes responsável pela expressão dos genes hrp, e XAC0095, uma proteína hipotética encontrada apenas em Xanthomonas spp; 2) HpaA, uma proteína secretada pelo TTSS, HpaB e o domínio C-terminal da HrcV; 3) HrpB1, HrpD6 e HrpW, 4) HrpB2 e HrcU e 5) interações homotrópicas envolvendo a ATPase HrcN. Em Xac, foram encontrados dois loci vir que codificam proteínas que possuem similaridade com componentes do TFSS envolvido em processos de conjugação/secreção bacteriana: TFSS-plasmídeo localizado no plasmídeo pXAC64 e TFSS-cromossomo localizado no cromossomo de Xac. O TFSS-plasmídeo, o qual possui maior similaridade com sistemas de conjugação, mostrou interações envolvendo proteínas cujos genes estão localizados na mesma região do plasmídeo pXAC64: 1) interação homotrópica da TrwA; 2) XACb0032 e XACb0033; 3) interações homotrópicas da proteína XACb0035; 4) VirB1 e VirB9; 5) XACb0042 e VirB6; 6) XACb0043 e XACb0021b. O TFSS-cromossomo apresentou interações envolvendo as proteínas: 1) VirD4 e um grupo de 12 proteínas que contém similaridade entre si, incluindo XAC2609 cujo gene encontra-se no locus vir, 2) XAC2609 e XAC2610; 3) Interações homotrópicas da VirB11; 4) XAC2622 e VirB9. A análise do sistema de \"Quorum-Sensing\" composto pelas proteínas Rpf mostrou interações envolvendo componentes do próprio sistema: 1) RpfC e RpfF; 2) RpfC e RpfG; 3) interações homotrópicas da RpfF; 4) RpfC e CmfA, uma proteína similar a Cmf de Dictyostelium discoideum que, neste organismo, é fundamental para processos de \"quorum-sensing\". As interações proteína-proteína encontradas permitiram-nos entender melhor a composição, organização e regulação dos fatores envolvidos na patogenicidade de Xac. / Citrus Canker, caused by the bacterial plant pathogen Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) presents one of the most serious problems to Brazilian citriculture. We have initiated a project to identify protein-protein interactions involved in pathogenicity of Xac. Using a yeast two-hybrid system based on GAL4 DNA-binding and activation domains, we have focused on identifying interactions involving subunits, regulators and substrates of: Type Three Secretion System (TTSS), Type Four Secretion System (TFSS) and Quorum Sensing/Rpf System. Components of these systems were used as baits to screening a random Xac genomic library. The TTSS is coded by the hrp (hypersensitive response and pathogenicity), hrc (hrp conserved) and hpa (hrp associated) genes in the chromosomal hrp locus. This secretion system can translocate efector proteins from the bacterial cytoplasm into the host cells. We have identified several previously uncharacterized interactions involving: 1) HrpG, a two-component system response regulator responsible for the expression of Xac hrp operons, and XAC0095, a previously uncharacterized protein encountered only in Xanthomonas spp; 2) HpaA, a protein secreted by the TTSS, HpaB and the C-terminal domain HrcV; 3) HrpB1, HrpD6 and HrpW; 4) HrpB2 and HrcU; 5) Homotropic interactions were also identified for the ATPase HrcN. Xac contains two virB gene clusters, one on the chromosome and one on the pXAC64 plasmid, each of which codes for a unique and previously uncharacterized TFSS. Components of the TFSS of pXAC64, which is most similar to conjugation systems, showed interactions involving proteins coded by the same locus: 1) Homotropic interactions of TrwA; 2) XACb0032 and XACb0033; 3) XAC0035 homotropic interactions; 4) VirB1 and VirB9; 5) XACb0042 and VirB6; 6) XACb0043 and XACb0021 b. Components of the chromosomal TFSS exhibited interactions involving: 1) VirD4 and a group of 12 uncharacterized proteins with a common C-terminal domain motif, include XAC2609 whose gene resides within the vir locus; 2) XAC2609 and XAC261 O; 3) Homotropic interactions of VirB11; 4) XAC2622 and VirB9. Analysis of Quorum Sensing/Rpf System components revealed interactions between the principal Rpf proteins which control Xanthomonas quorum sensing: 1) RpfC and RpfF; 2) RpfC and RpfG; 3) RpfF homotropic interactions; 4) RpfC and CmfA, a protein that presents similarity with Cmf (conditioned medium factor) of Dictyostelium discoideum, which contrais quorum sensing in this organism. The protein-protein interactions that we have detected reveal insights into the composition, organization and regulation of these important mechanisms involved in Xanthomonas pathogenicity.

Com a finalidade de estudar a soroprevalência do Vírus da Imunodeficiência Humana, HIV, e infecções com transmissão relacionadas, entrevistamos e colhemos sangue de 197 usuários de drogas injetáveis, UDIs, amostrados através da metodologia de \"bola de neve\" (snow-balling), da cidade de Santos, São Paulo, Brasil. Nesta cidade a estimativa de UDIs, 10.000 indivíduos, compreende cerca de 2% de sua população. Soroprevalências de HIV, hepatites B e C, sífilis e HTLV (1 ou 2) foram obtidas e comparadas com 197 doadores de sangue pareados por idade e sexo. As soroprevalências encontradas foram de 62% para HIV, 75% para HCV, 75% para HBV, 34% para sífilis, e 25% para o HTLV (1 e 2) entre os UDIs, comparado com 0%; 2%; 23%; 12% e 1% entre os doadores do banco de sangue, respectivamente. Os fatores de risco para transmissões parenterais nesta comunidade de UDIs são mais importantes que para transmissão sexual, embora a última deva ser considerada quando se planejar estratégias de controle. Além disso, estimamos a Razão de Reprodutibilidade Basal, R0, para o HIV entre os UDIs. Usando um modelo clássico para infecções transmitidas por vetores de Macdonald adaptado para \"agulhas\", o valor de R0 foi estimado em 28 e 98, considerando uma distribuição dos inóculos infectantes como homogênea ou heterogênea respectivamente . Esta estimativa foi baseada somente em parâmetros de transmissão parenteral nesta comunidade de UDIs. Usando este modelo a estimativa da soroprevalência do HIV no equilíbrio (0,67) é bem próxima à soroprevalência observada (0,62). / In order to study the seroprevalence of HIV and infections with related transmission patterns, as hepatitis B and C, syphilis and HTLV (1 and 2), we interviewed and bled 197 IDUs, sampled by snow-balling and compared with 197 blood donors matched for age and sex, both groups from the city of Santos, Sao Paulo, Brazil. Seroprevalences found were 62% for HIV, 75% for HCV, 75% for HBV, 34% for syphilis and 25% for HTLV (1 or 2) among IDUs, which compare with 0.0%, 2%, 23%, 12%, and 1% for blood donors, respectively. The risk for parenterally transmitted infections in this IDUs community is higher than that for sexually transmitted one. We also estimated the Basic Reproduction Ratio, R0, for HIV among IDUs. Using a model adapted from the classical Macdonald\'s model for vector-born infection, the R0 resulted in 28 and 98, assuming an homogeneous or heterogeneous distribution of infective inoculae, respectively. This estimation was based only on parenteral transmission. Using this model the expected equilibrium for HIV seroprevalence (0.67) is close to the observed seroprevalence (0.62)