Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / The development of the work plan proposed for this dissertation refers to the production of xanthan gum from sugarcane juice using the bacterium Xanthomonas campestris pv. campestris NRRL B-1459. Tests were conducted in 500 mL erlenmeyers flasks and in a 2.0-L reactor, in sucrose concentration range from 15 to 40 g/L, judiciously following the pre-established experimental designs, when the process variables and its levels were defined. Firstly, two varieties of sugarcane, RB 835486 and SP 791011 were tested in different production media, aiming at selecting the variety and the fermentative media whose K values (rate of consistence) and n (behavior rate) for the fermented must represented in a better way the condition of pseudoplastic fluid. In the sequence, two factorial designs in two levels and three variables defined the appropriate composition of the medium for later investigations related to the gum biosynthesis. However, the third design appears with two variables and three levels, rendering favorable an evaluation of the optimum point through surfaces generated for each response analyzed. Above all, an increase in the scale researched until then guided the execution of tests in reactor for checking, under controlled conditions, the growth of microorganisms, decrease of sucrose concentration and the product formation, the viscosity of fermented must, and the 1% solution of gum after recovery and purification. Tests in erlenmeyer flasks were carried out in stirring table at 120 rpm and 28ºC while in the reactor, the agitation, aeration, and pH maintained their values in 800 rpm, 0.5 vvm and 7.3, respectively. In that way, results found in this study indicate that the variety of sugarcane SP 791011 has remarkable potential for the production of xanthan gum and after execution of two designs was defined too the medium of production constituted by dilute sugarcane, fortified with four components for effecting the 3rd and 4th designs. Then, the feasibility of the production process of xanthan gum was attested in reactor, reaching 15.1 g/L of gum concentration, 0.629 g/Lh of productivity, 0.579 g.g-1 of conversion from substrate to product, 21509.9 cP of viscosity at 0.75 s-1 for 1% solution of xanthan gum. Gums produced were compared to a commercial sample and presented a similar spectroscopy near infrared region. / O desenvolvimento do plano de trabalho proposto para esta dissertação refere-se à produção de goma xantana a partir de caldo de cana utilizando a bactéria Xanthomonas campestris pv. campestris NRRL B-1459. Os ensaios foram conduzidos em erlenmeyers de 500 mL e em reator de 2,0 L, numa faixa de concentração de sacarose de 15 a 40 g/L, seguindo criteriosamente planejamentos experimentais pré-estabelecidos, uma vez definidas as variáveis de processo e seus níveis. Primeiramente, duas variedades de cana-de-açúcar, RB 835486 e SP 791011, foram testadas em diferentes meios de produção visando selecionar a variedade e os meios fermentativos cujos valores de K (índice de consistência) e n (índice de comportamento) para o mosto fermentado representaram melhor a condição de fluido pseudoplástico. Na seqüência, dois planejamentos fatoriais a dois níveis e três variáveis definiram a composição adequada do meio para posteriores investigações relacionadas à biossíntese da goma. Contudo, surge o 3o planejamento com duas variáveis a três níveis, propiciando uma avaliação do ponto ótimo através das superfícies geradas para cada resposta analisada. Sobretudo, um aumento na escala pesquisada até então direcionou a execução dos ensaios em reator para verificar, sob condições controladas, o crescimento de microrganismos, o decréscimo da concentração de sacarose, a formação de produto, a viscosidade do mosto fermentado e a da solução 1% da goma após recuperação e purificação. Os testes em erlenmeyers foram realizados em mesa agitadora a 120 rpm e a 28o C enquanto no reator a agitação, a aeração e o pH mantiveram seus valores em 800 rpm, 0,5 vvm e 7,3 respectivamente. Dessa forma, os resultados encontrados nesse estudo apontam a variedade de cana SP 791011 com potencialidade notável para a produção de goma xantana e definiu-se também após execução de dois planejamentos o meio de produção constituído por caldo de cana diluído fortificado com quatro componentes para efetuar o 3o e 4o planejamentos. Logo, a viabilidade do processo de produção da goma xantana foi atestada em reator, atingindo 15,1 g/L de concentração de goma, 0,629 g/Lh de produtividade, 0,579 g.g-1 de conversão de substrato a produto, 21509,9 cP de viscosidade a 0,75 s-1 para solução 1% de goma. As gomas produzidas foram comparadas a uma amostra comercial e apresentaram espectroscopia na região do infravermelho similares. / Mestre em Engenharia Química

Neste trabalho, polissacarídeos não amiláceos (PNAs) da banana madura com potencial de propriedades imunomoduladoras foram obtidos por meio da remoção dos açúcares solúveis (glicose, frutose e sacarose) do purê de banana submetido a duas técnicas de extração: sólido-líquido (ESL) com agitação mecânica e assistida por ultrassom (EAU) usando etanol a 99,5 g/100 g como solvente. Para o estudo em batelada, diferentes razões da matéria-prima/solvente (1:5, 1:7 e 1:10) g/mL, tempos de extração (30, 60 e 90) min e duas temperaturas de (25 e 65) °C foram estudados. No estudo cinético, o impacto da redução da razão matéria-prima/solvente de 1:5 para 1:3 g/mL foi estudado até 90 min, nas mesmas condições estudadas na extração em batelada. O teor de açúcares solúveis (AS) medido nos extratos foi superior na temperatura de 65°C, porém às razões de 1:7 e 1:10, não resultou em maior quantidade de AS nos extratos, portanto, menores quantidades de etanol podem ser usadas diminuindo custos. Com o emprego da técnica EAU à 25 °C e tempo de extração de 30 min, foi observado que uma redução da razão matéria-prima/solvente até 1:3 g/mL produz maior rendimento de processo. No entanto, foi observado que maiores tempos de extração promoveram degradação da parede celular da matéria-prima. Entre os modelos cinéticos testados, o ajuste do modelo de Patricelli aos dados experimentais indicou que a ESL é regida pela fase de lavagem em que ocorreu 85 % da extração dos AS. Frações molares de glicose, ácidos galacturônicos, manose, arabinose, xilose, galactose de conteúdo monossacarídeo foram observadas nos rafinados, indicando possivelmente serem parte de polissacarídeos do tipo ?-glicanos, xilomananos glucomananos, arabinogalactanos e arabinoxilanos. / In this work, non-starch polysaccharides (PNAs) of ripe bananas with potential for immunomodulatory properties were obtained by means removing the soluble sugars (glucose, fructose and sucrose) from banana puree submitted to two extraction techniques: solid-liquid (SLE) with mechanical stirring and ultrasonic assisted (UAE) using 99.5 g/ 100 g ethanol as solvent. For the batch study, different ratios of the raw material/ solvent (1:5, 1:7 and 1:10) g/ mL, extraction times of (30, 60 and 90) min and two temperatures of (25 and 65 ) °C were studied. In the kinetic study, the impact of reducing the raw material/ solvent ratio from 1:5 to 1:3 g/ mL was studied up to 90 min, under the same conditions studied in batch extraction. The soluble sugar content (AS) measured in the extracts was higher at temperature of 65 °C, however, at the ratios of 1:7 and 1:10, did not result in higher amount of AS in the extracts, therefore, smaller amounts of ethanol can be costs. With the use of the UAE technique at 25 °C and extraction time of 30 min, it was observed that a reduction of the raw material / solvent ratio up to 1:3 g / mL produces a higher process yield. However, it was observed that longer extraction times promoted degradation of the cell wall of the raw material. Among the kinetic models tested, the adjustment of Patricelli model to the experimental data indicated that the SLE the predominance is by the washing phase in which 85% of the AS extractions occurred. Glucose molar fractions, galacturonic acids, mannose, arabinose, xylose, galactose of monosaccharide content were observed in the raffinates, indicating possibly being part of polysaccharides as ?-glycan, xylomannans, glucomannans, arabinogalactans and arabinoxylans.

A tecnologia de conjugação melhorou a imunogeniddade de vacinas constituídas de polissacarídeo, especialmente em crianças. Polissacarídeos conjugados a proteínas carregadoras, como o toxóide tetânico, induzem resposta imunológica dependente de célula T e memória imunológica de longa duração. No entanto, esta tecnologia apresenta custo elevado. Assim, foi investigada a capaddade dos lipossomos de aumentar a resposta imunológica ao polissacarídeo C de Neisseria meningitidis (PSC). Camundongos foram imunizados com Iipossomos contendo PSC, conjugado toxóide tetânico-PSC ou PSC livre como controle, com dose de reforço constituída de PSC livre. Foram gerados anticorpos IgG e IgM contra PSC nos camundongos imunizados com conjugado ou Iipossomo. Os resultados mostram que lipossomos contendo PSC têm potencial para substituir a vadna conjugada toxóide tetânico-PSC. / Conjugation technology has improved the immunogenicity of polysaccharide vaccines, specially in small children. Polysaccharides conjugated to various carrier proteins, e.g. tetanus toxoid, stimulate a T cell-dependent antibody response and induce a long-term immunological memory. However, protein-polysaccharide conjugation technology is expensive and this could constitute an important drawback. Thus, immunopotentiation of Neisseria meningitidis serogroup C polysaccharide (PSC) by use of liposomes as an alternative to protein-polysaccharide C conjugates was investigated. Mice were immunized with liposomes containing PSC or tetanus toxoid-PSC conjugate or free PSC as control and boosted with free PSC. Immunogenicity of these different preparations was compared with each other. Conjugate and liposome containing PSC induced both IgG and IgM antibodies against the polysaccharide. These results show that liposomes containing entrapped PSC have potential to be used as an alternative to tetanus toxoid-PSC conjugate vaccine.

O etanol celulósico a partir da palhada de cana pode elevar a produção do bioetanol, porém esta é normalmente decomposta no campo. A degradação da parede celular no campo não foi elucidada e compreender este processo auxiliará na produção de etanol celulósico. O objetivo deste trabalho foi caracterizar a degradação da palhada de cana de açúcar no campo durante um ano. Foi analisada a composição da parede celular por fracionamento e composição dos monossacarídeos. Na parede celular, observou-se redução de 26% no teor de celulose enquanto houve aumento de 13% na fração de hemiceluloses mais solúveis. Mudanças na composição dos monossacarídeos das frações mostraram que o arabinoxilano (AX) foi o primeiro polímero a ser solubilizado (após 3 meses) seguido dos <font face=\"Symbol\">b-glucanos e celulose (após 6 meses). Isto sugere que o AX é a hemicelulose mais exposta e sua solubilização permitiu a degradação da celulose após 6 meses. A partir dos dados obtidos, sugeriu-se a utilização de xilanases seguidas de glucanases numa possível ordem de enzimas para produção de etanol celulósico. / The sugarcane straw cellulosic ethanol can increase bioethanol production, but the straw is usually degraded in the field. However, the process that leads the cell wall disassembly under field conditions is unknown and understanding how this happens can improve cellulosic ethanol production. In the present work we aimed at studying how sugarcane straw is degraded in the field during a year. Cell wall composition was determined by fractioning and determination of monosaccharide composition. Results showed a decrease (ca.26%) in cellulose content and an increase of 13% in high solubility hemicelluloses fraction. Changes in monosaccharide composition showed that the first polymer to be solubilised is the arabinoxylan (AX) (after 3 months) followed by <font face=\"Symbol\">b-glucans and cellulose (after 6 months). This suggests that AX is the most exposed hemicelullose and its solubilisation allowed cellulose degradation after 6 months. Our data suggest the use of xylanases followed by glucanases as an enzyme order to be used in cellulosic ethanol production from sugarcane straw.

A parede celular vegetal, estrutura essencial para as plantas, é extremamente importante para a economia humana, já que apresenta diversas utilidades, como por exemplo, fabricação de papel, fibras de vestuário, construção civil, entre outras. A maior parte da parede celular vegetal primária (aproximadamente 90%), é formada por polissacarídeos como celulose, hemiceluloses e pectinas. Os monossacarídeos, unidades formadoras dos polissacarídeos, são sintetizados, nas plantas, a partir de diferentes açúcares nucleotídeos, sendo que, o suprimento desses, pode afetar a biossíntese dos polissacarídeos da parede celular. Visando analisar o impacto da alteração do fluxo metabólico do carbono na composição da parede celular, o presente projeto de pesquisa teve como objetivo alterar a composição dos polissacarídeos da parede celular de Nicotiana tabcum, através da modulação da expressão do gene uxs, responsável pela codificação da enzima UDP-D-glucuronato descarboxilase (UDPGlcADC, EC 4.1.1.35) que converte UDP-D-glucuronato em UDP-D-xilose, importante açúcar nucleotídeo, precursor do monossacarídeo xilose. Para isso, após a clonagem do gene uxs de ervilha, foram obtidas plantas transgênicas de tabaco superexpressando esse gene. Diversas análises foram realizadas para determinação da composição química da parede celular primária e secundária dessas plantas. Pela análise de FTIR da parede celular primária, verificou-se que três linhagens transgênicas apresentaram espectrotipos consistentes, indicando uma redução na quantidade de pectinas e ligações ésteres carboxílica nessas linhagens transgênicas. Apesar de não terem sido detectadas alterações na proporção dos monossacarídeos ramnose, xilose, arabinose, manose e galactose, e na quantidade de celulose, na parede celular primária das plantas transgênicas, foram observadas diferenças na proporção de galactose não esterificada, nas linhagens que apresentaram espectrotipo. Com relação à parede celular secundária, observou-se que algumas linhagens transgênicas apresentaram maior concentração de lignina solúvel relacionada a uma redução no conteúdo de lignina insolúvel. / The plant cell wall is not only an essential structure for plants, but also an extremely important raw material in human economy. The plant cell wall has diverse utilities, for example, papermaking, textile fiber, civil construction. Polysaccharides, such as cellulose, hemicelluloses and pectins, are the major components of the primary plant cell wall (approximately 90%). These polysaccharides are formed by monosaccharides, which are synthesized in the plant from different nucleotide sugars. The suppliment of the nucleotide sugars can affect plant cell wall polysaccharides biosynthesis. Aiming at analyzing the impact of the alteration in the metabolic carbon flux on cell wall composition, the objective of this research project was to alterate the plant cell wall polysaccharides composition by the modulation of the uxs gene. This gene encodes the UDP-D-glucuronic acid decarboxylase enzyme (UDPGlcADC, EC 4.1.1.35) that promotes the conversion of UDP-D-glucuronic acid to UDP-D-xylose, an important sugar nucleotide precursor of xylose monosaccharide. To achieve this goal, the pea uxs gene was cloned and transgenic tobacco plants overexpressing this gene were obtained. Several analyses were performed to determinate the primary and secondary cell wall composition of those transgenic plants. The primary cell wall analysis by FTIR identified three transgenic lines that show different spectrotypes compared to wild type and those transgenic spectrotypes had the same features. The results indicate a reduction of pectin and ester carbonyl binding in the transgenic plants. No alterations were detected in the monosaccharide (rhamnose, xylose, arabinose, manose and galactose) proportions and the amount of cellulose in the primary cell wall of the transgenic plants. Nevertheless, differences in the proportion of unesterified galactose were observed in the same transgenic lines that showed spectrotypes. With regard to secondary cell wall, some transgenic lines showed an increase in soluble lignin which is related to a reduction in insoluble lignin.

Sementes de Sesbania virgata (Cav.) Pers. acumulam suas reservas de carbono no endosperma na forma de um polissacarídeo de parede celular, o galactomanano. Os galactomananos são polissacarídeos constituídos de uma cadeia principal de resíduos de D-manose ligadas &beta;-1,4, ramificada por resíduos de D-galactose &alpha;-1,6 ligados. A mobilização deste ocorre após a germinação e envolve três enzimas hidrolíticas (&alpha;-galactosidase, endo-&beta;-mananase e exo-&beta;-manosidase). A &alpha;-galactosidase é a primeira enzima atuar sobre o galactomanano hidrolisando as ligações &alpha;-1,6 das galactoses ramificadas a cadeia principal de manano (ligados &beta;-1,4), permitindo a ação da endo-&beta;-mananase, que hidrolisará o polissacarídeo a oligossacarídeos, onde a &beta;-manosidase atuará (ligações &beta;-1,4), transformando oligossacarídeos a monossacarídeos a serem utilizados no desenvolvimento do embrião. Buscando a compreensão das características da &alpha;-galactosidase e modo de ação sobre o galactomanano, procedeu-se com a purificação, em três etapas,e caracterização bioquímica (pH ótimo, temperatura ótima e aspectos cinéticos) da &alpha;-galactosidase de sementes de Sesbania virgata (Cav.) Pers. Além disso, visando evidenciar a modulação da enzima endo-&beta;-mananase pela distribuição de ramificações de galactose no galactomanano (estrutura fina do galactomanano), procedeu-se com hidrólises enzimáticas do galactomanano de Sesbania virgata (Cav.) Pers. utilizando a enzima endo-&beta;-mananase de Aspergillus niger (Megazyme&reg;) somente ou em conjunto com a &alpha;-galactosidase semipurificada de Sesbania virgata (Cav.) Pers. (Capítulo 1) ou com a &alpha;-galactosidase comercial de Cyamopsis tetragonoloba (Megazyme&reg;), seguido de análise dos oligossacarídeos por HPAEC-PAD (High Performance Anion Exchange Chromatography with Pulsed Amperometric Detection). Também procedeu-se com hidrólises enzimáticas de galactomananos de 6 espécies com razão manose:galactose variando de 1:1 a 150:1 com endo-&beta;-mananase de Aspergillus niger (Megazyme&reg;) e análise dos oligossacarídeos produzidos por HPAEC-PAD. A &alpha;-galactosidase semipurificada possui, aproximadamente, 42 kDa de peso molecular em condições desnaturantes e, aproximadamente 72 kDa de peso molecular na forma nativa, sugerindo que a enzima assuma estrutura quartenária. A temperatura ótima apresentada se encontra na faixa de 50°C a 55°C, pH ótimo na faixa de 4,4 a 5,4, Km= 1,8276 mM e a velocidade máxima de 0,5024 &mu;molGal.min-1.mgprot-1. A espectrometria de massas gerou os fragmentos: ALADYV-HSK-RMPGSLGHEE-QDAK-TT-GDIEDNWNSM-TSIADS NDKW-ASYAGPGGWN-DPDMLEVGNG-GMTTEEYR-AP-LLVGCDIR-VAVIL-WNR, estando a proteína referente a esta sequência relacionada à mobilização de reserva. Durante a purificação e sequenciamento interno da &alpha;-galactosidase e demais proteínas foram detectadas isoformas da &alpha;-galactosidase de pesos moleculares variados (42 kDa a 20 kDa). Sugere-se que estas isoformas encontradas inicialmente na purificação estejam relacionadas com outras funções da &alpha;-galactosidase, enquanto as isoformas encontradas após todas as etapas de purificação e identificação por espectrometria de massas estejam relacionadas com ativação e adaptação da &alpha;-galactosidase durante todo o processo de mobilização de reservas. Os dados gerados das comparações dos oligossacarídeos produzidos em cada hidrólise sugerem que as ramificações do galactomanano podem modular o reconhecimento de sítios de clivagem pela endo-&beta;-mananase: (1) existe a produção de oligossacarídeos limites de digestão F1, F2 e F3 após hidrólise do galactomanano com endo-&beta;-mananase, como demonstrado para xiloglucanos; (2) os oligossacarídeos F1 possuem proporções distintas quando da hidrólise do galactomanano com endo-&beta;-mananase em diferentes concentrações (ExP I e EXP IV), evidenciando preferência por sítios com menor grau de galactosilação; (3) a presença da &alpha;-galactosidase diminui a produção dos oligossacarídeos F2 e F3, mostrando que estes não possuem resistência intrínseca a hidrólise e que a reação atinge o equilíbrio mesmo quando ainda existem sítios de clivagem ainda disponíveis (EXP III); (4) polissacarídeos com estruturas diferentes, razão manose:galactose variando entre 150:1 a 1:1, são digeridos em diferentes taxas de hidrólise pela mesma enzima, evidenciando que a ramificação com galactose dificulta a ação da endo-&beta;-mananase. Dessa forma, sugere-se que a estrutura do polissacarídeo galactomanano também contenha, pelo menos, parte da informação requerida para seu próprio metabolismo, código para a sua degradação, estando esta informação contida na distribuição das ramificações com resíduos de D-galactose. Sendo assim, sugere-se que as diferentes isoformas da &alpha;-galactosidase relacionadas à degradação da reserva de galactomanano de sementes de Sesbania virgata (Cav.) Pers. seriam produto da ação proteolítica da própria enzima a fim de melhorar a afinidade da &alpha;-galactosidase ao substrato durante o processo de mobilização de reserva. O aumento da afinidade da &alpha;-galactosidase ao substrato durante todo o processo de mobilização garantiria a liberação das ramificações com galactose de forma contínua, permitindo e aumentando a eficiência da ação da enzima endo-&beta;-mananase aos sítios de clivagem, garantindo a degradação do polissacarídeo a oligossacarídeos de forma regulada, passível de bloqueio, pelo acúmulo de oligossacarídeos e galactose livre que inibem a ação das enzimas endo-&beta;-mananase e &alpha;-galactosidase, respectivamente, e dificultando a ação de microorganismos, propiciando ao embrião a maior quantidade de açúcares para o seu desenvolvimento, aumentando as chances de sucesso no estabelecimento da plântula / The seeds of Sesbania virgata (Cav.) Pers. have an endosperm which accumulates galactomannan as a storage polysaccharide in the cell walls. Galactomannans are composed of a linear backbone of &beta;-(1,4)-linked D-mannose residues with D-galactose &alpha;-(1,6)-linkages substitutions. The galactomannans are hydrolysed after protrusion of the radicle. This process is perfomed by three enzymes (&alpha;-galactosidase, endo-&beta;-mannanase and exo-&beta;-manosidase). The &alpha;-galactosidase is the first enzyme to cleave the polysaccharides, removing the D-galactose residues, allowing the performance of the endo-&beta;-mannanase, which hydrolyses the mannan backbone to mannan oligosaccharides. The last part of the process includes exo-&beta;-manoside, that cleaves the mannan oligosaccharides to mannose residues, which could be used by the embryo during growth. Aiming at understanding the function of ?-galactosidase in the process of galatomanannan degradation, we studied its mode of action on mannans and galactomannans. The &alpha;-galactosidase of Sesbania virgata (Cav.) Pers. was purified and characterized (pH and temperature optimum and the enzyme kinetics). We found that the semipurified &alpha;-galactosidase molecular weight was 42kDa at denaturating conditions, but in native conditions was 72kDa, suggesting that the enzyme has a quaternary structure. The enzyme optimum pH was between 4,4-5,4, optimum temperature between 50°C-55°C, Km= 1,8276 mM and Vmáx= 0,5024 &mu;molGal.min-1.mgprot-1. Mass spectrometry measures resulted the following fragments: ALADYV-HSK-RMPGSLGHEE-QDAK-TT-GDIEDNWNSMTSIADS-NDKW-ASYAGPGGWN-DPDMLEVGNG-GMTTEEYR-AP-LLVGCDIR-VAVIL-WNR, being the protein from this sequence related with storage mobilization. Possible &alpha;-galactosidase isoforms were detected during the purification, suggesting other functions for the enzyme. The &alpha;-galactosidase isoforms detected after all purification steps and with measured mass spectrometry (from 42kDa to 20kDa) should be related to the storage mobilization. We suggest that the &alpha;-galactosidase isoforms in Sesbania virgata (Cav.) Pers. seeds represents products of the enzyme self-digestion, this process being correlated with the enzyme/polysaccharide affinity and at last, correlated to the galactomannan mobilization. An extract semipurified from Sesbania virgata (Cav.) Pers. and enriched with &alpha;-galactosidase activity, was used along with endo-&beta;-mannanase from Aspergillus niger (Megazyme&reg;) or both endo-&beta;-mannanase and &alpha;-galactosidase (semipurified from Sesbania virgata seeds - Chapter 1- or commercial enzyme from Cyamopsis tetragonoloba - Megazyme&reg;) were used to study the fine structure of galactomannans. Hydrolysis of galactomannans from six species with different mannose:galactose (1:1 to 150:1) ratio were performed with endo-&beta;-mananase from Aspergillus niger. The oligosaccharides from all hydrolysis were analyzed by HPAEC-PAD (High Performance Anion Exchange Chromatography with Pulsed Amperometric Detection). The hydrolysis fragments data (HPAEC-PAD) suggest that the side-chains of the polysaccharides can modulate the hydrolytic sites recognition on the galactomannan by the endo-&beta;-mannanase. This conclusion is supported by: (1) the presence of limited digest oligosaccharides F1 and dimmers (F2) and trimers (F3) of the F1 oligosaccharides; (2) the presence of different F1 oligosaccharides proportions after hydrolysis with endo-&beta;-mannanase at different concentrations, showing preference on less-branched hydrolytic sites; (3) the &alpha;-galactosidase digestion avoided the accumulation of oligosaccharides F2 and F3, showing that these oligosaccharides do not present intrinsic resistance to hydrolysis and that the reaction reaches an equilibrium even when sites of hydrolysis are still available; (4) polymers with different fine structure (ratio mannose:galactose 1:1 to 150:1) were hydrolysed at different rates by the endo-&beta;-mannanase, showing that galactose branching interferes on the enzyme action. Considering that, the branching pattern of the polysaccharide seems to have direct influence on the interaction of the enzyme with substrate; we suggest that the structure of the galactomannan holds part of information required for its own degradation. The higher enzyme x substrate affinity, ensure the galactose branches digestion, improving the endo-&beta;-mannanase action, ensuring the degradation of the polysaccharides to oligosaccharides. This highly regulated degradation process prevents microorganisms predation and increases the plantlet establishement

As microalgas vêm sendo utilizadas na área ambiental nos processos de biomitigação de CO2, uma vez que o utilizam em seu metabolismo para produzirem biomassa celular, a qual pode ser utilizada para fins nutricional e comercial. Neste sentido, o presente trabalho teve como objetivo a obtenção de oligossacarídeos prebióticos oriundos de biomassa microalgal por meio de hidrólise fosfórica em diferentes condições moderadas de pH e termopressurização. Foi utilizada biomassa de um cultivo utilizado no sistema de tratamento de efluente gasoso de uma churrascaria de Curitiba, comparativamente com duas biomassas comerciais, Chlorella vulgaris e Spirulina platensis. Foram realizadas análises microscópicas e físico-químicas para a caracterização das biomassas, tais como umidade, cinzas, teor de carboidratos, lipídeos e proteínas. A partir da massa lipídica total foram realizadas transesterificações alcalinas e os resultados analisados por métodos cromatográficos, antes e após clarificação dos ésteres metílicos. A título de comparação inicial com as biomassas in natura, as biomassas passaram por pré-tratamentos: remoção dos lipídeos com organossolventes, purificação da parede celular com detergente SDS (Sódio Dodecil Sulfato) e recuperação do resíduo polimérico extraído pelo detergente. Estas biomassas derivadas bem como as integrais foram hidrolisadas em termopressurizador a 4,5 atm (156 oC), utilizando ácido fosfórico a pH 2,0 ou controles com água (solvólise). Adicionalmente foram realizados ensaios enzimáticos com α-amilase e β-1,3 glucanase nos oligossacarídeos resultantes dos hidrolisados fosfóricos das biomassas in natura. Com as três biomassas de microalgas in natura foi realizado planejamento fatorial 32, frente às variáveis ácido fosfórico (pH 2,5, 2,0, e 1,5) e pressão atmosférica (3 atm – 147 oC, 4,5 – 156 oC e 6,0 atm – 175 oC). Para todos os hidrolisados foram analisados pH após a hidrólise, teor de açúcar redutor e de açúcar total e perfil cromatográfico. Os oligossacarídeos obtidos foram utilizados como fonte de carbono para o cultivo de microrganismos probióticos, Bifidobacterium animalis e Lactobacillus casei, para avaliação do crescimento, pH e produção de ácidos graxos de cadeia curta (AGCC). Os resultados indicaram que apesar de ter sido inoculada uma cepa de C. vulgaris no sistema de fotobiorreatores de mitigação de CO 2 da churrascaria, não se instalou um cultivo puro e, portanto, foi denominado de mescla Devons. O componente majoritário para todas as biomassas foi proteína, sobretudo para S. platensis (59,5 %). As transesterificações alcalinas mostraram a eficiência no processo, indicando semelhança no perfil da cromatografia gasosa da mescla Devons e C. vulgaris. O tratamento com SDS mostrou maior eficiência na remoção de proteínas, sobretudo em S. platensis. As hidrólises das biomassas pré-tratadas mostraram maior teor de oligossacarídeos na amostra in natura para mescla Devons, deslipidificada e tratada com SDS para C. vulgaris e semelhança entre a in natura e os dois primeiros tratamentos para S. platensis. Os resultados dos ensaios enzimáticos indicaram predominância de oligossacarídeos oriundos de laminarina (β-1,3 glucana), portanto prebióticos e resistentes à ação amilásica do trato gastrointestinal (TGI) superior. Os resultados do planejamento fatorial mostraram que a biomassa in natura de S. platensis foi a que apresentou os melhores resultados de hidrólise em quantidade de açúcar liberado, seguida da biomassa de mescla Devons e C. vulgaris. As melhores condições de produção e pureza de oligossacarídeos foram próximas ao ponto central do planejamento fatorial. Os cultivos dos probióticos utilizando os hidrolisados fosfóricos permitiu o crescimento das baterias benéficas (Lactobacillus e Bifidobacterium), e diferenças no pH, bem como na produção de AGCC, sobretudo ácido lático, monitorado por cromatografia líquida. Portanto, este trabalho mostra que foram produzidos oligossacarídeos prebióticos a partir do tratamento fosfórico da biomassa de microalgas, resultando uma nova aplicação em potencial de tal biomassa formada a partir do CO2 e outros componentes voláteis presentes no efluente gasoso da churrascaria. / Microalgae have been utilized in the environmental area in CO2 biomitigation processes as they use it in their metabolism for the production of cellular biomass, which can then be utilized for nutritional and commercial purposes. Within this scope, the current research elected as the main objective, the obtention of nutraceutical oligosaccharides from microalgae biomasses through a phosphoric acid hydrolysis under different and moderated pH and thermopressurization conditions. One biomass, coming from a gaseous effluent treatment system from a steakhouse was compared to commercial biomasses, Chlorella vulgaris e Spirulina platensis. Microscopic and physicochemical analyses were carried for these biomasses characterization, namely moisture, ashes, carbohydrates, lipids and protein contents. Alkaline methyl transesterifications were realized in the total lipid fractions and then the corresponding products analyzed by chromatographic methods. As compared to the native biomasses, they were subjected to pretreatments: organic solvents removal of lipids, cell wall purification with detergent SDS (Sodium Dodecyl Sulphate) and recovery of polymeric molecules of the later extracts. These derived biomasses fractions, as well as the whole ones were partially or totally hydrolyzed with thermopressurization at 4.5 atm (156 °C) using diluted phosphoric acid at pH 2 or with water as controls (solvolysis). Enzyme assays were further performed with α- amylase and β-1,3 glucanase in the phosphoric acid hydrolyzed oligosaccharides from native biomasses. A 32 factorial design was carried out with the three samples of whole microalgae biomasses, considering the variables phosphoric acid pH (2.5, 2.0, e 1.5) and atmospheric pressure (3 atm – 147 oC, 4.5 – 156 oC and 6.0 atm – 175 o C). For all hydrolysates were analyzed pH after hydrolysis, total and reducing sugar contents and chromatographic profiles. The resulting oligosaccharide samples were offered as carbon source for the culture of probiotic microorganisms Bifidobacterium animalis e Lactobacillus casei for the evaluation of bacterial growth and short chain fatty acids (SCFAs) production. Overall results indicated that irrespective to the pure native of the C. vulgaris inoculum into the CO2 mitigation system of the steakhouse, a pure massive biomass did not result and hence the designation of Devons’ blend for. The major component of microalgae biomasses was protein, above all for S. platensis (59.5 %). Alkaline transesterification showed the efficiency of the process, indicating similarity among the methyl esters arising either from C. vulgaris or the Devons’ blend as analyzed by gas chromatography. SDS treatment was more efficient for protein removal in the case of S. platensis biomass. The pretreated biomasses once hydrolysed displayed higher oligosaccharide contents for the Devons’ blend native, C. vulgaris delipidified and SDS-treated sample as well some similarity between native and both pretreatments in the case of S. platensis. The enzymatic assay indicated predominance of laminarin oligosaccharides (β-1,3 glucan), therefore prebiotics are resistants to amylasic action in upper gastroinstestinal tract. The factorial design showed that the particular S. platensis native biomass led to the best result of hydrolysis to reducing simple and oligosaccharidic sugars, then decreasingly followed by the Devons’ blend and C. vulgaris and the best conditions for the production and purity of the oligosaccharides were close to the central point of the factorial design. Probiotic cultures from the phosphoric acid hydrolysates allowed the Lactobacillus and Bifidobacterium, beneficial bacteria growth, pH differences and short chain fatty acids production, above all, lactic acid, as monitored by high performance liquid chromatography. Therefore, this research indicated the feasibility of nutraceutical or prebiotic oligosaccharide production from microalgae biomasses, thus revealing a novel technological destination for these particular biomasses and fractions, once formed at the expense of CO2 and other volatile components from the gaseous effluent from a steakhouse.

Sementes de Sesbania virgata (Cav.) Pers. acumulam suas reservas de carbono no endosperma na forma de um polissacarídeo de parede celular, o galactomanano. Os galactomananos são polissacarídeos constituídos de uma cadeia principal de resíduos de D-manose ligadas &beta;-1,4, ramificada por resíduos de D-galactose &alpha;-1,6 ligados. A mobilização deste ocorre após a germinação e envolve três enzimas hidrolíticas (&alpha;-galactosidase, endo-&beta;-mananase e exo-&beta;-manosidase). A &alpha;-galactosidase é a primeira enzima atuar sobre o galactomanano hidrolisando as ligações &alpha;-1,6 das galactoses ramificadas a cadeia principal de manano (ligados &beta;-1,4), permitindo a ação da endo-&beta;-mananase, que hidrolisará o polissacarídeo a oligossacarídeos, onde a &beta;-manosidase atuará (ligações &beta;-1,4), transformando oligossacarídeos a monossacarídeos a serem utilizados no desenvolvimento do embrião. Buscando a compreensão das características da &alpha;-galactosidase e modo de ação sobre o galactomanano, procedeu-se com a purificação, em três etapas,e caracterização bioquímica (pH ótimo, temperatura ótima e aspectos cinéticos) da &alpha;-galactosidase de sementes de Sesbania virgata (Cav.) Pers. Além disso, visando evidenciar a modulação da enzima endo-&beta;-mananase pela distribuição de ramificações de galactose no galactomanano (estrutura fina do galactomanano), procedeu-se com hidrólises enzimáticas do galactomanano de Sesbania virgata (Cav.) Pers. utilizando a enzima endo-&beta;-mananase de Aspergillus niger (Megazyme&reg;) somente ou em conjunto com a &alpha;-galactosidase semipurificada de Sesbania virgata (Cav.) Pers. (Capítulo 1) ou com a &alpha;-galactosidase comercial de Cyamopsis tetragonoloba (Megazyme&reg;), seguido de análise dos oligossacarídeos por HPAEC-PAD (High Performance Anion Exchange Chromatography with Pulsed Amperometric Detection). Também procedeu-se com hidrólises enzimáticas de galactomananos de 6 espécies com razão manose:galactose variando de 1:1 a 150:1 com endo-&beta;-mananase de Aspergillus niger (Megazyme&reg;) e análise dos oligossacarídeos produzidos por HPAEC-PAD. A &alpha;-galactosidase semipurificada possui, aproximadamente, 42 kDa de peso molecular em condições desnaturantes e, aproximadamente 72 kDa de peso molecular na forma nativa, sugerindo que a enzima assuma estrutura quartenária. A temperatura ótima apresentada se encontra na faixa de 50°C a 55°C, pH ótimo na faixa de 4,4 a 5,4, Km= 1,8276 mM e a velocidade máxima de 0,5024 &mu;molGal.min-1.mgprot-1. A espectrometria de massas gerou os fragmentos: ALADYV-HSK-RMPGSLGHEE-QDAK-TT-GDIEDNWNSM-TSIADS NDKW-ASYAGPGGWN-DPDMLEVGNG-GMTTEEYR-AP-LLVGCDIR-VAVIL-WNR, estando a proteína referente a esta sequência relacionada à mobilização de reserva. Durante a purificação e sequenciamento interno da &alpha;-galactosidase e demais proteínas foram detectadas isoformas da &alpha;-galactosidase de pesos moleculares variados (42 kDa a 20 kDa). Sugere-se que estas isoformas encontradas inicialmente na purificação estejam relacionadas com outras funções da &alpha;-galactosidase, enquanto as isoformas encontradas após todas as etapas de purificação e identificação por espectrometria de massas estejam relacionadas com ativação e adaptação da &alpha;-galactosidase durante todo o processo de mobilização de reservas. Os dados gerados das comparações dos oligossacarídeos produzidos em cada hidrólise sugerem que as ramificações do galactomanano podem modular o reconhecimento de sítios de clivagem pela endo-&beta;-mananase: (1) existe a produção de oligossacarídeos limites de digestão F1, F2 e F3 após hidrólise do galactomanano com endo-&beta;-mananase, como demonstrado para xiloglucanos; (2) os oligossacarídeos F1 possuem proporções distintas quando da hidrólise do galactomanano com endo-&beta;-mananase em diferentes concentrações (ExP I e EXP IV), evidenciando preferência por sítios com menor grau de galactosilação; (3) a presença da &alpha;-galactosidase diminui a produção dos oligossacarídeos F2 e F3, mostrando que estes não possuem resistência intrínseca a hidrólise e que a reação atinge o equilíbrio mesmo quando ainda existem sítios de clivagem ainda disponíveis (EXP III); (4) polissacarídeos com estruturas diferentes, razão manose:galactose variando entre 150:1 a 1:1, são digeridos em diferentes taxas de hidrólise pela mesma enzima, evidenciando que a ramificação com galactose dificulta a ação da endo-&beta;-mananase. Dessa forma, sugere-se que a estrutura do polissacarídeo galactomanano também contenha, pelo menos, parte da informação requerida para seu próprio metabolismo, código para a sua degradação, estando esta informação contida na distribuição das ramificações com resíduos de D-galactose. Sendo assim, sugere-se que as diferentes isoformas da &alpha;-galactosidase relacionadas à degradação da reserva de galactomanano de sementes de Sesbania virgata (Cav.) Pers. seriam produto da ação proteolítica da própria enzima a fim de melhorar a afinidade da &alpha;-galactosidase ao substrato durante o processo de mobilização de reserva. O aumento da afinidade da &alpha;-galactosidase ao substrato durante todo o processo de mobilização garantiria a liberação das ramificações com galactose de forma contínua, permitindo e aumentando a eficiência da ação da enzima endo-&beta;-mananase aos sítios de clivagem, garantindo a degradação do polissacarídeo a oligossacarídeos de forma regulada, passível de bloqueio, pelo acúmulo de oligossacarídeos e galactose livre que inibem a ação das enzimas endo-&beta;-mananase e &alpha;-galactosidase, respectivamente, e dificultando a ação de microorganismos, propiciando ao embrião a maior quantidade de açúcares para o seu desenvolvimento, aumentando as chances de sucesso no estabelecimento da plântula / The seeds of Sesbania virgata (Cav.) Pers. have an endosperm which accumulates galactomannan as a storage polysaccharide in the cell walls. Galactomannans are composed of a linear backbone of &beta;-(1,4)-linked D-mannose residues with D-galactose &alpha;-(1,6)-linkages substitutions. The galactomannans are hydrolysed after protrusion of the radicle. This process is perfomed by three enzymes (&alpha;-galactosidase, endo-&beta;-mannanase and exo-&beta;-manosidase). The &alpha;-galactosidase is the first enzyme to cleave the polysaccharides, removing the D-galactose residues, allowing the performance of the endo-&beta;-mannanase, which hydrolyses the mannan backbone to mannan oligosaccharides. The last part of the process includes exo-&beta;-manoside, that cleaves the mannan oligosaccharides to mannose residues, which could be used by the embryo during growth. Aiming at understanding the function of ?-galactosidase in the process of galatomanannan degradation, we studied its mode of action on mannans and galactomannans. The &alpha;-galactosidase of Sesbania virgata (Cav.) Pers. was purified and characterized (pH and temperature optimum and the enzyme kinetics). We found that the semipurified &alpha;-galactosidase molecular weight was 42kDa at denaturating conditions, but in native conditions was 72kDa, suggesting that the enzyme has a quaternary structure. The enzyme optimum pH was between 4,4-5,4, optimum temperature between 50°C-55°C, Km= 1,8276 mM and Vmáx= 0,5024 &mu;molGal.min-1.mgprot-1. Mass spectrometry measures resulted the following fragments: ALADYV-HSK-RMPGSLGHEE-QDAK-TT-GDIEDNWNSMTSIADS-NDKW-ASYAGPGGWN-DPDMLEVGNG-GMTTEEYR-AP-LLVGCDIR-VAVIL-WNR, being the protein from this sequence related with storage mobilization. Possible &alpha;-galactosidase isoforms were detected during the purification, suggesting other functions for the enzyme. The &alpha;-galactosidase isoforms detected after all purification steps and with measured mass spectrometry (from 42kDa to 20kDa) should be related to the storage mobilization. We suggest that the &alpha;-galactosidase isoforms in Sesbania virgata (Cav.) Pers. seeds represents products of the enzyme self-digestion, this process being correlated with the enzyme/polysaccharide affinity and at last, correlated to the galactomannan mobilization. An extract semipurified from Sesbania virgata (Cav.) Pers. and enriched with &alpha;-galactosidase activity, was used along with endo-&beta;-mannanase from Aspergillus niger (Megazyme&reg;) or both endo-&beta;-mannanase and &alpha;-galactosidase (semipurified from Sesbania virgata seeds - Chapter 1- or commercial enzyme from Cyamopsis tetragonoloba - Megazyme&reg;) were used to study the fine structure of galactomannans. Hydrolysis of galactomannans from six species with different mannose:galactose (1:1 to 150:1) ratio were performed with endo-&beta;-mananase from Aspergillus niger. The oligosaccharides from all hydrolysis were analyzed by HPAEC-PAD (High Performance Anion Exchange Chromatography with Pulsed Amperometric Detection). The hydrolysis fragments data (HPAEC-PAD) suggest that the side-chains of the polysaccharides can modulate the hydrolytic sites recognition on the galactomannan by the endo-&beta;-mannanase. This conclusion is supported by: (1) the presence of limited digest oligosaccharides F1 and dimmers (F2) and trimers (F3) of the F1 oligosaccharides; (2) the presence of different F1 oligosaccharides proportions after hydrolysis with endo-&beta;-mannanase at different concentrations, showing preference on less-branched hydrolytic sites; (3) the &alpha;-galactosidase digestion avoided the accumulation of oligosaccharides F2 and F3, showing that these oligosaccharides do not present intrinsic resistance to hydrolysis and that the reaction reaches an equilibrium even when sites of hydrolysis are still available; (4) polymers with different fine structure (ratio mannose:galactose 1:1 to 150:1) were hydrolysed at different rates by the endo-&beta;-mannanase, showing that galactose branching interferes on the enzyme action. Considering that, the branching pattern of the polysaccharide seems to have direct influence on the interaction of the enzyme with substrate; we suggest that the structure of the galactomannan holds part of information required for its own degradation. The higher enzyme x substrate affinity, ensure the galactose branches digestion, improving the endo-&beta;-mannanase action, ensuring the degradation of the polysaccharides to oligosaccharides. This highly regulated degradation process prevents microorganisms predation and increases the plantlet establishement