Tesis por compendio / [EN] DELLA proteins are plant-specific transcriptional regulators known to relay environmental information to the transcriptional networks to modulate growth and development accordingly. The view of DELLAs as signalling hubs is justified by two characteristics: first, they control the activity of a large number of transcriptional factors (TFs) and other transcriptional regulators through physical interaction; and, second, they are degraded by the 26S proteasome in response to the phytohormone gibberellin (GA), whose metabolism is very sensitive to environmental stimuli (e.g. light, temperature, salt stress). However, at least two observations indicate that this mechanistic framework is still incomplete: (i) warm temperature destabilizes the GA-insensitive DELLA rga-¿17, indicating that DELLAs cannot be destabilized only by changes in GA levels; and (ii) when found at the chromatin, DELLAs are localized not only in gene promoters, but also in gene bodies, suggesting that DELLAs may regulate transcription through interactions with proteins other than TFs. In this Thesis, we provide evidence that shows how a different E3 ubiquitin ligase controls the stability of DELLAs in a GA-independent manner, and how DELLAs regulate gene expression by directly interacting with the basal transcriptional machinery. In the first chapter, using a combination of genetic, physiological, and molecular approaches we demonstrate that DELLAs are targeted to proteolytic degradation by the E3 ubiquitin ligase CONSTITUTIVELY PHOTOMORPHOGENIC 1 (COP1). We show that COP1 interacts with the DELLAs GAI and RGA in vitro and in vivo, and that it promotes their polyubiquitination. We propose that COP1 represents a major pathway to degrade DELLAs in response to shade or to warm temperature. In the second chapter, we describe the interaction between DELLAs and the transcription elongation complex Polymerase-Associated Factor 1 (Paf1c). We show that Paf1c is required for the genome-wide deposition of monoubiquitinated H2B (H2Bub), a mark necessary for the progression of RNA polymerase II (RNAPII), and that this function is largely dependent on the presence of DELLAs. Likewise, impaired Paf1c or DELLA function results in a similar alteration in the accumulation and distribution of RNAPII in the Paf1c-target genes. We propose that DELLAs would exert this action by modulating the recruitment of Paf1c to the chromatin. These two new mechanisms underscore the importance of DELLAs as a central node in the environmental signalling network and should be considered in any potential application of DELLAs as biotechnological targets. / [ES] Las proteínas DELLA son reguladores transcripcionales específicos de plantas que transmiten información ambiental a las redes transcripcionales que modulan el crecimiento y el desarrollo. La propuesta de que las DELLAs actúan como "hubs" en redes de señalización se justifica por dos razones: primero, controlan la actividad de un gran número de factores de transcripción (FTs) y otros reguladores transcripcionales mediante interacción física; y segundo, son degradadas por el proteosoma 26S en respuesta a la fitohormona giberelina (GA), cuyo metabolismo es muy sensible a los estímulos ambientales (p. ej. luz, temperatura, estrés salino). Sin embargo, al menos dos observaciones sugieren que la información relativa a estos mecanismos no es completa: (i) las temperaturas altas desestabilizan incluso a rga-¿17, una versión de DELLA insensible a GAs, lo que indica que la estabilidad de las DELLAs no depende sólo de cambios en los niveles de GAs; y (ii) cuando se encuentran en la cromatina, las DELLAs no solo se posicionan en los promotores, sino también a lo largo de las regiones codificantes, lo que sugiere que las DELLAs podrían regular la transcripción mediante interacciones con otras proteínas diferentes a FTs. En esta Tesis, proporcionamos evidencia sobre una nueva E3 ubicuitina ligasa que controla la estabilidad de las DELLAs de una manera independiente a las GAs, y cómo las DELLA regulan la expresión génica interaccionando directamente con la maquinaria de transcripción basal. En el primer capítulo, usando una combinación de aproximaciones genéticas, fisiológicas y moleculares, demostramos que las DELLAs son marcadas para su degradación proteolítica por la E3 ubicuitina ligasa CONSTITUTIVELY PHOTOMORPHOGENIC 1 (COP1). Mostramos que COP1 interacciona al menos con las DELLAs GAI y RGA in vitro e in vivo, y que promueve su poliubicuitinación. Proponemos que COP1 representa una vía importante de degradación de DELLAs en respuesta a sombra y temperaturas altas. En el segundo capítulo, describimos la interacción entre las DELLAs y el complejo de elongación transcripcional Polymerase-Associated Factor 1 (Paf1c). Mostramos que, como en animales, Paf1c se requiere para la deposición a nivel genómico de la H2B monoubiquitinada (H2Bub), una marca necesaria para la progresión de la RNA polimerasa II (RNAPII), y que esta función depende en gran medida de la presencia de DELLAs. Asimismo, la reducción de la función de las DELLAs provoca defectos equivalentes a los de la pérdida de función de Paf1c en cuanto a la acumulación y distribución de la RNAPII en los genes diana de Paf1c. Proponemos que las DELLAs podrían por tanto regular la transcripción modulando el reclutamiento de Paf1c a la cromatina. Estos nuevos mecanismos inciden en la importancia de las DELLAs como nodos centrales en las redes de señalización al ambiente y podrían ser considerados como dianas biotecnológicas en aproximaciones futuras. / [CA] Les proteïnes DELLA són reguladors transcripcionals específics de les plantes conegudes per transmetre informació mediambiental a les xarxes transcripcionals per modular el creixement i desenvolupament. La visió actual de DELLAs com a "hubs" de senyalització es justifica per dues característiques: en primer lloc, controlen l'activitat d'un gran nombre de factors transcripcionals (FTs) i d'altres reguladors transcripcionals mitjançant la interacció física; i, en segon lloc, es degraden pel proteosoma 26S en resposta a la fitohormona giberel.lina (GA), el metabolisme de la qual és molt sensible als estímuls ambientals (per exemple, la llum, la temperatura, l'estrès salí). No obstant això, almenys dues observacions indiquen que aquest marc mecanicista encara és incomplet: (i) la temperatura càlida desestabilitza la DELLA rga-¿17, que és insensible a GAs, indicant que les DELLA no es desestabilitzen només per canvis en els nivells d'aquesta fitohormona; i (ii) quan es troben a la cromatina, les DELLA no només es localitzen en els promotors dels gens, sinó també a la regió que es transcriu, cosa que suggereix que poden regular la transcripció mitjançant interaccions amb proteïnes diferents de FTs. En aquesta tesi, proporcionem evidències que mostren com una ubiquitina E3 lligasa diferent controla l'estabilitat de les proteïnes DELLA de manera independent de GAs, i com les DELLA regulen l'expressió gènica interactuant directament amb la maquinària transcripcional basal. En el primer capítol, mitjançant una combinació d'enfocaments genètics, fisiològics i moleculars, demostrem que les DELLA s'envien a la degradació proteolítica mitjançant la ubiquitina E3 lligasa CONSTITUTIVELY PHOTOMORPHOGENIC 1 (COP1). Mostrem que la COP1 interacciona amb els DELLA GAI i RGA in vitro i in vivo, i que afavoreix la seva poliubiquitinació. Proposem que COP1 representa la via principal per degradar les DELLA en resposta a l'ombra o a la temperatura càlida. Al segon capítol, es descriu la interacció entre les DELLA i el complex d'allargament de transcripció Polymerase Associated Factor 1 (Paf1c). Mostrem que Paf1c es requereix per a la deposició a tot el genoma de H2B monoubiquitinada (H2Bub), una marca necessària per a la progressió de l'ARN Polimerasa II (RNAPII), i que aquesta funció depèn en gran part de la presència de DELLA. De la mateixa manera, quan la funció Paf1c o DELLA està deteriorada, es produeix una alteració similar en l'acumulació i distribució de RNAPII als gens diana de Paf1c. Proposem que les DELLA realitzen aquesta acció modulant el reclutament de Paf1c a la cromatina. Aquests dos nous mecanismes posen de manifest la importància de les proteïnes DELLA com a node central de la xarxa de senyalització ambiental i haurien de ser considerats en qualsevol aplicació potencial de DELLA com a objectius biotecnològics. / La realización de esta Tesis Doctoral ha sido posible gracias a un contrato predoctoral para la formación de doctores (BES-2014-068868) y a la ayuda a la movilidad predoctoral para la realización de estancias breves (EEBB-I-16-11070) del Ministerio de Economía y Competitividad, y a una beca EMBO Short-Term (number 8047). / Blanco Touriñán, N. (2020). New mechanisms of DELLA protein regulation and activity in Arabidopsis [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/149477 / Compendio

Intellectual disability is a prevalent developmental disorder for which no effective treatments are available. Mutations of the X-linked protein PHF6 cause the Börjeson-Forssman-Lehmann syndrome (BFLS) that is characterized by intellectual disability and epilepsy. However, the biological role of PHF6 relevant to BFLS pathogenesis has remained unknown. Here, I present my dissertation research demonstrating that knockdown of PHF6 profoundly impairs neuronal migration in the mouse cerebral cortex in vivo, leading to the formation of white matter heterotopias that harbor aberrant patterns of neuronal activity. Importantly, BFLS patient specific mutation of PHF6 blocks its ability to promote neuronal migration. I also elucidate the mechanism by which PHF6 drives neuronal migration in the cerebral cortex. PHF6 physically associates with the PAF1 transcription elongation complex, and inhibition of PAF1 phenocopies the PHF6 knockdown-induced migration phenotype in vivo. I further identify Neuroglycan C (NGC), a susceptibility gene for schizophrenia, as a critical downstream target of PHF6 and the PAF1 complex, and I demonstrate that NGC mediates PHF6-dependent neuronal migration. These findings define PHF6, the PAF1 transcription elongation complex, and NGC as components of a novel cell-intrinsic transcriptional pathway that orchestrates neuronal migration in the brain, with important implications for the pathogenesis of intellectual disability and potentially other neuropsychiatric disorders.

Relations among transcription, pre-mRNA processing and chromatin modifications are only partially understood. The human protein SNW1/SKIP belongs to factors which couple these processes. The protein plays role in pre-mRNA splicing and transcription on the level of both initiation and elongation. According to the hypothesis of K. Jones laboratory, it physically and functionally interacts with positive transcription elongation factor b during transcription elongation and influences methylation of histone H3 on lysine 4, a modification characteristic for active transcription (Bres et al., Genes Dev. 19:1211-26, 2005, Bres et al., Mol Cell. 36:75-87, 2009). The yeast ortholog of SNW1/SKIP, Prp45, was until now reported only in connection with splicing regulation. However, unpublished results from our Laboratory and others showed that it is employed in transcription elongation as well. The aim of the diploma project was to search for the relations between Prp45 and the factors regulating transcription. It was confirmed that the mutation prp45(1 169) results in the delay of PHO5 and PHO84 expression during transcriptional induction. Next, we discovered new genetic interactions between PRP45 and several genes encoding the effectors of chromatin modifications. How Prp45 influences the expression of PHO5 and PHO84...

Le complexe Scc2-Scc4 est essentiel pour l’association du complexe cohésine sur l’ADN. Les proteines Cohésine génèrent la cohésion entre les chromatides sœurs, ce qui est essentiel pour la ségrégation des chromosomes. Scc2 (également connu sous le nom NIPBL) est muté chez les patients atteints du syndrome de Cornelia de Lange, une maladie multi-organique caractérisée par des anomalies du développement du visage, de la developpement mental cardiaque et du tractus gastro-intestinal. Comment les mutations localisées au niveau du gène codant pour la proteine Scc2 conduisent à des anomalies du développement chez les patients n’a pas encore été élucidé. Une des hypothèses est que la liaison de Scc2 / cohésine à différentes régions du génome a une incidence sur la transcription. Chez la levure de bière, il a été montre que Scc2 se lie aux genes transcrits par l'ARN Pol III (les ARNt et spliceosomals) , ainsi qu‘aux gènes transcrits par l'ARN Pol II codant pour des petits ARN nucléolaires et nucléaires (snARN et snoARNs ) et des gènes de protéines ribosomiques. Nous rapportons ici que Scc2 est important pour l'expression de ces gènes. Scc2 et le régulateur transcriptionnel Paf1 collaborent pour promouvoir la production de Box H / ACA snoARNs qui guident la pseudouridylation des ARN y compris l'ARN ribosomal. Une mutation de Scc2 a été associée à des défauts dans la production d'ARN ribosomal, la biogenèse des ribosomes, et del’épissage. Alors que le mutant Scc2 n'a pas de défaut général de la synthèse protéique, il montre un déphasage accrue et une réduction de l’utilisation du site interne d'entrée ribosomale (IRES)/ coiffe-indépendante. Ces résultats suggèrent que Scc2 favorise normalement un programme d'expression génétique qui prend en charge la fidélité de la traduction. Nous émettons l'hypothèse que le dysfonctionnement de traduction peut contribuer au syndrome de Cornelia de Lange, qui est causé par des mutations dans Scc2. / The Scc2-Scc4 complex is essential for loading the cohesin complex onto DNA. Cohesin generates cohesion between sister chromatids, which is critical for chromosome segregation. Scc2 (also known as NIPBL) is mutated in patients with Cornelia de Lange syndrome, a multi-organ disease characterized by developmental defects in head, limb, cognition, heart, and the gastrointestinal tract. How mutations in Scc2 lead to developmental defects in patients is yet to be elucidated. One hypothesis is that the binding of Scc2/cohesin to different regions of the genome will affect transcription. In budding yeast, Scc2 has been shown to bind to RNA Pol III transcribed genes (tRNAs, and spliceosomal), as well as RNA Pol II-transcribed genes encoding small nuclear and nucleolar RNAs (snRNAs and snoRNAs) and ribosomal protein genes. Here, we report that Scc2 is important for gene expression. Scc2 and the transcriptional regulator Paf1 collaborate to promote the production of Box H/ACA snoRNAs which guide pseudouridylation of RNAs including ribosomal RNA. Mutation of Scc2 was associated with defects in the production of ribosomal RNA, ribosome biogenesis, and splicing. While the scc2 mutant does not have a general defect in protein synthesis, it shows increased frameshifting and reduced internal ribosomal entry site (IRES) usage/cap-independent translation. These findings suggest Scc2 normally promotes a gene expression program that supports translational fidelity. We hypothesize that translational dysfunction may contribute to the human disorder Cornelia de Lange syndrome, which is caused by mutations in Scc2.