Bien que grandement complexes, les animaux, les tissus vivants et les cellules, la plus petite unité de vie, sont assujettis aux lois de la physique. Dans les tissus vivants, des processus de régulation permanents ou transitoires, tels que des interactions biochimiques et mécaniques entre une cellule isolée et son environnement, sont essentiel au développement et au maintient de la structure et des fonctions du tissu. Ces interactions interviennent dans des processus biologiques tel que la différentiation cellulaire et l'expression génétique. Les cellules cancéreuses et les métastases échappent au contraire à toutes régulations. Elles prolifèrent et migrent à travers les tissus, ignorant les signaux de régulation environnant. Leurs propriétés mécaniques et d'adhésion sont très différentes de celles des cellules saines. L'étude suivante présente différentes expériences qui cherchent à mimer les conditions in vivo en appliquant un stress uniaxial à une cellule isolée sous conditions physiologiques. Simultanément, la force appliquée à la cellule, sa déformation et sa forme, sont mesurées. La déformation uniaxiale est appliquée à une cellule isolée adhérant sur deux plaques de verre. De tels essais mécaniques réalisés à constante déformation ou à constante force permettent la quantification des propriétés mécaniques cellulaire et une description physique des données par le modèle de Kelvin. Des lipides bioactifs tel que la sphingosylphosphorylcholine et l'acide lysophosphatidique, modifient l'architecture du cytosquelette. Ces modifications influencent fortement les propriétés mécaniques des fibroblastes ou les cellules cancéreuses du pancréas.

L'insuffisance pancréatique se définit comme un déficit de production d'enzymes pancréatiques par le pancréas. Ceci entraîne une mauvaise digestion des aliments et des vitamines liposolubles, mais peut rarement entraîner la mort. Plusieurs affections du pancréas peuvent entraîner un tel déficit, mais il est généralement engendré par la pancréatite chronique et la mucoviscidose. L'insuffisance elle-même peut être contrée en donnant aux malades un produit pharmaceutique composé d'extraits pancréatiques. Généralement issu de pancréas porcin, cet extrait pancréatique doit être apte à résister à l'environnement gastrique pour pouvoir se répandre promptement dans le duodénum en gardant des hauts taux d'activité enzymatique. Plusieurs méthodes de dosage existent pour permettre d'évaluer l'activité enzymatique des enzymes pancréatiques comme agents actifs, dont celles recommandées par la Pharmacopée américaine. Vu les désavantages reliés à l'utilisation de ces méthodes (longues et laborieuses), ce projet a été mené pour déterminer si des méthodes alternatives pourraient être équivalentes tout en éliminant ces désavantages. Suite à des recherches préliminaires, des méthodes chromogéniques en fluorescence ont été sélectionnées pour évaluer leur potentiel d'utilisation pour le dosage de l'activité de la pancrélipase vu leurs avantages comme la rapidité et la sensibilité. L'objectif de ce projet a donc été de développer et d'optimiser des méthodes chromogéniques en fluorescence pour l'évaluation des enzymes pancréatiques en formulation pharmaceutique. Les paramètres réactionnels furent étudiés, optimisés et harmonisés. Le type et la concentration du tampon, le pH, la température et les cofacteurs enzymatiques ont été déterminés, car ce sont des paramètres pouvant fortement influencer l'activité enzymatique de la lipase, de l'amylase et des protéases. Les paramètres cinétiques ont également été déterminés et les valeurs trouvées ont été respectivement 2,63, 11,56 et 15,46 µg/mL pour les Km et de 666,67, 138,89 et de 135,14 RFU/min pour les Vmax de la lipase, de l'alpha-amylase et des protéases. Les plages de concentration des enzymes ainsi que le temps de réaction permettant une évaluation précise ont été déterminés: 0,01 à 1 mU et 10 min de réaction cinétique de la lipase, 0,04 mU à 6 mU et 20 min de cinétique pour l'alpha-amylase et de 4 à 24 mU et 40 min de cinétique pour les protéases. Les enzymes pancréatiques des deux principes actifs « Pancreactic Enzymes Concentrate », PEC A et B, ont été dosées en présence et en absence des excipients de leur formulation respective. La précision et l'exactitude des méthodes chromogéniques ont été évaluées et comparées aux valeurs trouvées par les méthodes USP de la Pharmacopée américaine. Elles ont été trouvées équivalentes pour les deux méthodes et aucune interférence significative n'a été trouvée entre l'enzyme et les divers excipients (désintégrants, lubrifiants, liants, enrobant, etc.). En conclusion, ces méthodes chromogéniques en fluorescence peuvent être considérées adéquates pour l'évaluation de la pancréatine et de la pancrélipase. Leurs avantages pour les analyses de formulations pharmaceutiques justifient l'intérêt à les prendre en considération comme méthodes rapides de dosages enzymatiques. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Méthode chromogénique fluorescente, Méthode USP, Lipase, Alpha-amylase, Protéases, Pancrelipase.

Au-delà de l'intérêt cognitif de la démarche, la compréhension des mécanismes qui régissent le développement pancréatique humain reste la clé pour décrypter les acteurs physiopathologiques des maladies du pancréas et pour développer des approches thérapeutiques innovantes. En outre, alors que la cellule bêta de rongeurs et la cellule bêta humaine partagent un grand nombre de similitudes, certaines données indiquent également des différences marquées entre les espèces. L'absence de systèmes expérimentaux robustes , à partir de matériel humain, n'a pas permis un examen détaillé du développement pancréatique humain jusqu'à présent. Dans le laboratoire, il a été précédemment validé un modèle de xénogreffe de pancréas immature humain sous la capsule rénale de souris immuno-incompétentes SCID. Il a été démontré que celui-ci permettait de récapituler l'ensemble des étapes du développement endocrine humain. Néanmoins le site de greffe limitait les possibilités de modifier ce développement, notamment par infection virale. Dans ce travail, nous avons développé et validé un nouveau site de greffe dans le muscle squelettique, plus simple et plus superficiel. En outre, nous démontrons qu'il est possible de créer un pancréas humain partiellement transgénique in vivo en réalisant du transfert de gènes médié par des lentivirus, après injection directe de la solution virale dans le greffon. Ce modèle de greffe dans le muscle est une nouvelle approche permettant d'envisager des études longitudinales, dans lesquelles il serait possible d'étudier la régulation de certains gènes ou le devenir de certaines lignées marquées par des gènes rapporteurs apportés par le virus à différents stades de développement.

Le diabète de type 1 (DT1) résulte de la destruction des cellules β productrices d’insuline par le système immunitaire. Cette condition représente un enjeu de santé publique majeur car, malgré les thérapies actuelles, les patients atteints développent trop souvent des complications cardio-vasculaires. Des thérapies alternatives se doivent donc d’être mises au point. Ainsi, diverses approches visent à reprogrammer/différencier (in vitro ou in vivo) différents types cellulaires pancréatiques afin de générer des cellules β (productrices d’insuline) fonctionnelles. Dans ce but, notre laboratoire a notamment montré que les cellules α (productrices de glucagon) embryonnaires peuvent être régénérées et converties en cellules β fonctionnelles par l’expression ectopique du seul gène Pax4 (un gène normalement impliqué dans la spécification embryonnaire du lignage β - (Collombat and Mansouri, 2009)). Dans la première partie de ce travail, nous démontrons que les cellules α à l’âge adulte (Al-Hasani et al., 2013) retiennent leur capacité de régénération et de conversion en cellules β, celles-ci étant fonctionnelles et capable de remplacer plusieurs fois l’ensemble des cellules β du pancréas. Cependant, cette approche transgénique serait difficile à mettre en œuvre chez l’homme. De nombreux cribles furent donc initiées dans le but de trouver des petites molécules/composés chimiques mimant les effets de Pax4. Un composé potentiel, GABA, fut ainsi identifié et caractérisé. / Type 1 diabetes (T1D) results from the destruction of insulin-producing β-cells by the immune system. This condition is a major public health issue because, despite current therapies, patients often develop cardiovascular complications. Therefore alternative therapies need to be developed. Thus, various approaches are designed to reprogram / differentiate (in vitro or in vivo) different pancreatic cell types to generate functional (insulin-producing) β-cells. To this end, our laboratory has shown that especially the embryonic α-cells (producing glucagon) can be regenerated and converted into functional β-cells by the ectopic expression of the Pax4 gene (usually a gene involved in the specification of embryonic lineage β - (Collombat and Mansouri, 2009)). In the first part of this work, we show that α-cells in adulthood (Al-Hasani et al., 2013) retain their capacity for regeneration and conversion into β-cells, the latter being functional and able to replace repeatedly all the β-cells of the pancreas. However, this transgenic approach would be difficult to implement in humans. Many screens were therefore initiated in order to find small molecules / chemical compounds that mimic the effects of Pax4. A potential compound, GABA, was identified and characterized. Our results demonstrate that treatment of WT mice with GABA results in a significant increase in the number and size of the islets (caused by insulin+ cell hyperplasia). By using lineage tracing tools, our results indicate that these "β-like" neo-generated cells are coming from glucagon+ cells.

L'adénocarcinome pancréatique est un des cancers les plus létaux, avec une survie à 5 ans après diagnostic de seulement 5%. L'absence de traitement curatif et les nombreux échecs des thérapies ciblées mettent en avant l'urgence d'identifier une stratégie thérapeutique efficace. L'atteinte de cet objectif doit passer par l'identification de biomarqueurs diagnostic et pronostic, l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques et la connaissance des mécanismes de résistance induits par les thérapies ciblées. La voie PI3K/Akt/mTOR, une des voies les plus altérées dans les cancers, est suractivée dans les cancers du pancréas et corrélée à un mauvais pronostic. Chez les Vertébrés, la famille des phosphoinositide-3-kinases (PI3K) de classe I est constituée des isoformes p110a, p110ß, p110d et p110?. Bien qu'elles réalisent toutes la même réaction biochimique (phosphorylation du PIP2 en PIP3, second messager lipidique), chaque isoforme de PI3K possède des rôles physiologiques spécifiques. Les inhibiteurs globaux de PI3Ks actuellement testés en phase I/II dans les cancers solides avancés présentent un bénéfice thérapeutique limité à des doses maximales tolérées. Les inhibiteurs des isoformes de PI3K sont actuellement les agents les plus prometteurs car ils offrent les avantages d'être, à de faibles doses, plus efficaces, plus puissants dans l'inhibition d'une PI3K et donc moins toxiques que les inhibiteurs pan-PI3K. Les objectifs de cette thèse sont de déterminer les rôles isoforme-spécifiques des PI3K et l'intérêt thérapeutique de cibler une ou plusieurs isoformes dans la pancréatite et l'adénocarcinome pancréatique, par l'identification de voies isoforme-spécifiques et l'étude des réponses adaptatives induites par le ciblage d'une ou de toutes les isoformes de PI3K. Dans un premier temps, mon travail a permis de mettre en évidence, valider et compléter des résultats obtenus dans l'équipe, visant à démontrer l'importance de la signalisation PI3K/Akt dans ces deux processus physiopathologiques : la pancréatite chronique et l'initiation de la carcinogenèse pancréatique. Plus précisément, l'hyperactivation de la voie PI3K/Akt observée dans des échantillons humains et murins atteints de pancréatique chronique est corrélée avec l'enrichissement d'une signature transcriptomique d'activation de l'isoforme p110a. Par ailleurs, l'inactivation génétique et pharmacologique de p110a lors d'une inflammation chronique pancréatique ou en présence de Kras oncogénique empêche l'apparition de métaplasies acino-canalaires, structures associées à l'initiation de la carcinogenèse pancréatique. L'élaboration d'un protocole de transdifférenciation acino-canalaire in vitro m'a permis de valider que seule l'isoforme p110a est nécessaire à cette étape d'initiation de la carcinogenèse pancréatique en régulant les petites GTPases Rho, essentielles au remodelage du cytosquelette d'actine. Dans un deuxième temps, grâce à une analyse quantitative du phosphoprotéome d'une lignée cancéreuse pancréatique traitée ou non à différents temps par un inhibiteur pan- ou isoforme-sélectif, j'ai démontré pour la première fois l'existence de cibles, de réseaux de signalisation et de réponses adaptatives régulés par chaque isoforme de PI3K. Pour conclure, l'ensemble des résultats démontrent le rationnel de l'utilisation combinatoire d'inhibiteurs isoforme-spécifiques de PI3K chez les patients atteints de cancer du pancréas pour une meilleure réponse clinique. / Pancreatic ductal adenocarcinoma is one of the most lethal cancers, with a 5 year-survival rate below 5%. Lack of curative treatment and failure of targeted therapies urge the need to identify novel efficient therapeutic strategy. Achievement of this goal will be obtained through the identification of diagnosis and prognosis biomarkers, identification of novel therapeutic targets and the knowledge of resistance mechanisms induced by these targeted therapies. PI3K/Akt/mTOR signalling, one of the most altered in cancers, is overactivated in pancreatic cancer and correlated with poor prognosis. In the Vertebrates, the family of class I phosphoinoitide-3-kinase (PI3K) includes four isoforms: p110a, p110ß, p110d and p110?. Although they all perform the same biochemical reaction (phosphorylation of PIP2 in PIP3, a membrane lipid messenger), each isoform were demonstrated to have specific physiological roles. Global PI3K inhibitors are currently being tested in phase I/II clinical trials in advanced solid cancers, but show at maximal doses tolerated a limited therapeutic benefit. Isoform-selective PI3K inhibitors are currently the most promising agents because, at low doses, they are more efficient to inhibit one PI3K isoform, and thus, less toxic than pan-PI3K inhibitors. The objectives of this thesis are to determine isoform-specific PI3K roles and the therapeutic interest to target one or more isoforms in pancreatitis and PDAC, by the identification of isoform-specific pathways and the study of adaptive responses induced by targeting of one or all isoforms of PI3K. In a first part, my work has highlighted, validated and completed results obtained in the team, to demonstrate the significance of PI3K/Akt signalling in two physiological processes: chronic pancreatitis and initiation of pancreatic carcinogenesis. Precisely, the overactivation of PI3K/Akt pathway measured on human and murine chronic pancreatitis samples is correlated with a specific p110a activation gene expression signature. Moreover, genetic and pharmacologic inactivation of p110a during pancreatic chronic inflammation or cancerogenesis (by oncogenic Kras) prevents the formation of acino-ductal metaplasia, structures at the origin of pancreatic carcinogenesis initiation. Development of in vitro acino-ductal transdifferentiation protocol allowed me to demonstrate that only p110a is necessary at this initial step of pancreatic carcinogenesis by the regulation of Rho small GTPases, further regulating actin remodelling. In the second part, by a phosphoproteomic-based approach, I quantified PI3K downstream phosphorylation-regulated targets in a pancreatic cancer cell line treated or not by a pan- or selective PI3K inhibitor at different times. I demonstrated for the first time existence of targets, signalling pathways and adaptive responses regulated by each PI3K isoform. To conclude, all these results demonstrate the rational of combinatorial use of isoform-specific PI3K inhibitors in patients with pancreatic cancer for better clinical response.

Au-delà de l’intérêt cognitif de la démarche, la compréhension des mécanismes qui régissent le développement pancréatique humain reste la clé pour décrypter les acteurs physiopathologiques des maladies du pancréas et pour développer des approches thérapeutiques innovantes. En outre, alors que la cellule bêta de rongeurs et la cellule bêta humaine partagent un grand nombre de similitudes, certaines données indiquent également des différences marquées entre les espèces. L'absence de systèmes expérimentaux robustes , à partir de matériel humain, n'a pas permis un examen détaillé du développement pancréatique humain jusqu’à présent. Dans le laboratoire, il a été précédemment validé un modèle de xénogreffe de pancréas immature humain sous la capsule rénale de souris immuno-incompétentes SCID. Il a été démontré que celui-ci permettait de récapituler l’ensemble des étapes du développement endocrine humain. Néanmoins le site de greffe limitait les possibilités de modifier ce développement, notamment par infection virale. Dans ce travail, nous avons développé et validé un nouveau site de greffe dans le muscle squelettique, plus simple et plus superficiel. En outre, nous démontrons qu’il est possible de créer un pancréas humain partiellement transgénique in vivo en réalisant du transfert de gènes médié par des lentivirus, après injection directe de la solution virale dans le greffon. Ce modèle de greffe dans le muscle est une nouvelle approche permettant d’envisager des études longitudinales, dans lesquelles il serait possible d’étudier la régulation de certains gènes ou le devenir de certaines lignées marquées par des gènes rapporteurs apportés par le virus à différents stades de développement. / Whilst sporadic human genetic studies have permitted some comparisons between rodent and human pancreatic development, the lack of a robust experimental system has not permitted detailed examination of human pancreatic development. We previously developed a xenograft model of immature human fetal pancreas grafted under the kidney capsule of immune-incompetent mice, which allowed the development of human pancreatic beta cells. Here, we compared the development of human and murine fetal pancreatic grafts either under skeletal muscle epimysium or under the renal capsule. We demonstrated that human pancreatic beta cell development occurs) both by differentiation of pancreatic progenitors and by proliferation of developing beta cells. The superficial location of the skeletal muscle graft and its easier access permitted in vivo lentivirus-mediated gene transfer which targeted specific cells. This model of engraftment under the skeletal muscle epimysium is a new approach for longitudinal studies, which allows localized manipulation to determine the regulation of human pancreatic development.

L'adénocarcinome pancréatique canalaire présente une composante stromale très abondante. Les fibroblastes associés au cancer (CAFs) sécrètent énormément de facteurs participant à la survie des cellules cancéreuses ainsi qu'à leur chimiorésistance. Nos travaux démontrent la possibilité d'atténuer les propriétés chmioprotectrices des CAF en ciblant leur voie de signalisation mTOR/4E-BP1 qui est retrouvée fortement activée notamment dans les primo cultures de CAF isolées à partir de résections chirurgicales humaines. Les CAF expriment exclusivement le récepteur de somatostatine sst1. L'analogue SOM230 (Pasiréotide) active ce récepteur et inhibe la signalisation mTOR/4E-BP1 conduisant à une nette diminution du niveau de synthèse protéique des CAF. En conséquence, la croissance tumorale ainsi que la chimiorésistance des tumeurs (co xénogreffes réalisées chez la souris nude) ont été limitées lorsque la combinaison thérapeutique SOM230 / Gemcitabine a été appliquée. Tandis que, seule, la gemcitabine ne présente pas d'effet, le SOM230 sensibilise la tumeur à son action cytotoxique en agissant sur le stroma et en présentant un rôle anti fibrotique. Nous proposons alors une nouvelle approche thérapeutique qui consiste à cibler la synthèse protéique des CAF exprimant sst1 par un analogue de la somatostatine afin de limiter leur potentiel chimio protecteur et restaurer indirectement la sensibilité des cellules cancéreuses pancréatiques à l'action cytotoxique de la gemcitabine. / Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is extremely stroma-rich. Cancer-associated fibroblasts (CAFs) secrete proteins that activate survival and promote chemoresistance of cancer cells. Our results demonstrate that CAF secretome-triggered chemoresistance is abolished upon inhibition of the protein synthesis mTOR/4E-BP1 regulatory pathway which we found highly activated in primary cultures of a-SMA-positive CAFs, isolated from human PDAC resections. CAFs selectively express the sst1 somatostatin receptor. The SOM230 analogue (Pasireotide) activates the sst1 receptor and inhibits the mTOR/4E-BP1 pathway and the resultant synthesis of secreted proteins including IL-6. Consequently, tumour growth and chemoresistance in nude mice xenografted with pancreatic cancer cells and CAFs, or with pieces of resected human PDACs, are reduced when chemotherapy (gemcitabine) is combined with SOM230 treatment. While gemcitabine alone has marginal effects, SOM230 is permissive to gemcitabine-induced cancer cell apoptosis and acts as an antifibrotic agent. We propose that selective inhibition of CAF protein synthesis with sst1-directed pharmacological compounds represents an anti-stromal-targeted therapy with promising chemosensitization potential.

La mucine MUC4 est un acteur important de la cancérogenèse pancréatique. Elle favorise la progression tumorale et son expression est associée à un mauvais pronostic. Il a également été montré l’implication de la mucine MUC4 dans la résistance aux chimiothérapies. L’ensemble de ces données souligne l’intérêt de la mucine MUC4 comme cible thérapeutique. De plus, sa néoexpression dès les stades précoces de la cancérogenèse pancréatique lui confère un rôle potentiel de marqueur précoce de la carcinogenèse. Les mécanismes moléculaires responsables de l’induction précoce de l’expression de MUC4 sont toutefois encore peu connus.L’étude de la régulation de l’expression de la mucine MUC4 contribuerait donc mieux à comprendre son rôle dans la cancérogenèse. Ainsi, il a été montré que le gène MUC4 est régulé in vitro par des mécanismes transcriptionnels et par des mécanismes épigénétiques de méthylation de l’ADN et des modifications post-traductionnelles des histones. En revanche, la régulation post-transcriptionelle de l’expression de MUC4 notamment par les miARN est peu connue. Nos travaux ont pour but d’identifier les miARN dérégulés dans le cancer du pancréas et/ou ciblant potentiellement MUC4, de déterminer le(s) miARN inhibant l’expression de la protéine oncogénique MUC4 et l’impact de l’administration de ce(s) miARN dans la cancérogenèse pancréatique, et d’identifier les miARN impliqués dans la chimiorésistance médiée par MUC4 dans le cancer du pancréas.Dans un premier temps, nous avons dressé le profil d’expression des miARN dans des lignées cellulaires pancréatiques humaines normales et cancéreuses par puces miARN. Nous avons pu mettre en évidence une signature d’expression de miARN qui a permis de valider nos modèles cellulaires. Puis, à l’aide des bases de données TargetScan, Microcosm et MiRanda, nous avons identifié les miARN ciblant potentiellement MUC4. L’analyse par PCR quantitative a permis de montrer que seuls le miR-145 et miR-219-1-3p étaient sous-exprimés dans l’ensemble des lignées cancéreuses étudiées. Finalement, uniquement miR-219-1-3p est capable d’inhiber l’expression protéique de MUC4 ; c’est pourquoi nous nous sommes intéressés à son rôle dans le cancer du pancréas.Nous avons observé une perte d’expression du miR-219-1-3p dans des tissus de patients atteints d’adénocarcinome pancréatique. Par deux approches complémentaires de surexpression (transitoire ou stable) ou d’inhibition de miR-219-1-3p, nous avons montré qu’il était capable de réprimer l’expression de MUC4 au niveau protéique en se fixant directement sur son 3’-UTR. Nous avons observé une inhibition de la migration et de la prolifération cellulaires associées à une diminution de l’expression de la cycline D1 et de l’activation des voies de signalisation Akt et Erk. In vivo, la croissance tumorale est fortement ralentie après l’injection intratumorale de miR-219-1-3p. Grâce au modèle murin Pdx1-Cre;LSL-KrasG12D de lésions PanIN, nous avons pu mettre en évidence que la perte d’expression du miR-219-1-3p intervient précocement dès les stades PanIN-1/2 de la cancérogenèse pancréatique et qu’il existait une corrélation inverse entre l’expression de miR-219-1-3p et celle de la mucine Muc4.Par ailleurs, nous avons observé que le traitement des cellules cancéreuses pancréatiques humaines par la gemcitabine induit une forte surexpression du miR-219-1-3p qui laisse penser à un rôle potentiel de ce miARN dans la sensibilité des cellules à la chimiothérapie. Cependant, cette surexpression n’a montré aucun effet sur la survie cellulaire après traitement. Nous avons par la suite mis en évidence un profil d’expression différentiel des miARN entre les cellules invalidées pour MUC4 et les cellules contrôles. [...] / The MUC4 mucin is an important actor of pancreatic tumorigenesis as it contributes to tumor progression and its expression correlates with a poor prognosis. It has also been shown that MUC4 is involved in resistance of cells to chemotherapies. In this context, MUC4 is a potential therapeutic target in pancreatic cancer. MUC4 neoexpression at early stages of carcinogenesis confers to this mucin a potential interest as an early marker. Molecular mechanisms responsible for MUC4 induction of expression are not well defined. Thus, studying MUC4 gene expression regulation would contribute to better understand its role in tumorigenesis. MUC4 gene is regulated at the transcriptional level and epigenetically by DNA methylation and histone modifications mechanisms. However, MUC4 post-transcriptional regulation notably by miRNA is largely unknown. Our work aimed at (i) identifying miRNA dysregulated in pancreatic cancer and/or potentially targeting MUC4, (ii) determining miRNA(s) inhibiting MUC4 expression and its (their) impact on pancreatic carcinogenesis and finally (iii) identifying miRNAs involved in chemoresistance mediated by MUC4 in pancreatic cancer.First, using miRNA microarrays we established the miRNA expression profile of normal and cancerous pancreatic cell lines. We showed a cancer-specific miRNA signature which allows us to validate our cellular models. Then, performing in silico studies with TargetScan, Microcosm and MiRanda databases led us to identify miRNA potentially targeting MUC4. Analysis by qRT-PCR showed that miR-145 and miR-219-1-3p were downregulated in human pancreatic cancer cell lines. Finally, only miR-219-1-3p inhibited MUC4 expression thus we focused on its role in pancreatic cancer.We observed a loss of miR-219-1-3p expression in pancreatic cancer tissues. Complementary approaches overexpressing (transiently or stably) and inhibiting miR-219-1-3p expression, led us to show that miR-219-1-3p represses MUC4 protein expression by interacting directly with its 3’-UTR. We observed a decrease of cell migration and cell proliferation which was associated with an inhibition of cyclin D1 expression and an inhibition of Akt and Erk activation. Tumor growth in scid mice was strongly slowed down following miR-219-1-3p intratumoral injection. In the Pdx1-Cre;LSL-KrasG12D mouse model of PanIN, loss of miR-219-1-3p expression was an early event as soon as PanIN1/2 and miR-219-1-3p expression was conversely correlated to Muc4 expression.While the strong induction of miR-219-1-3p following gemcitabine treatment of pancreatic cancer cells suggests a potential role of this miRNA in sensitivity of cells,miR-219-1-3p has no effect on survival rate of cells treated with gemcitabine. We then established the miRNA expression profile of MUC4 knocked-down (MUC4-KD) cells and control cells (Mock) and showed a dysregulation of miRNA expression in MUC4-KD compared to Mock cells.To conclude, our results indicate that miR-219-1-3p, downregulated in pancreatic cancer, negatively regulates MUC4 expression, alters cancer cell biological properties and has an antimoral effect in vivo. Altogether, these results propose miR-219-1-3p as tumor suppressor in pancreatic cancer. Loss of MUC4 leads to an aberrant miRNA expression profile suggesting a potential role of miRNA as markers of chemoresistance in pancreatic cancer.

Les diabètes de type 1 et de type 2 sont caractérisés par une sécrétion insuffisante d’insuline et une diminution de la masse des cellules bêta. Pouvoir régénérer une masse de cellules bêta fonctionnelle est donc un enjeu thérapeutique dans le traitement du diabète. Dans cet optique, nous cherchons à identifier des facteurs et mécanismes permettant d’augmenter la masse de cellules bêta. Nous nous sommes intéressés aux mécanismes de plasticité des cellules bêta dans un contexte d’insulino résistance.Dans un modèle murin d’insulino-résistance provoquée par administration chronique de glucocorticoïdes, nous avons mis en évidence une adaptation de fonction des cellules bêta par hypersécrétion d’insuline. De manière intéressante une augmentation continue et progressive de la masse des cellules bêta par prolifération mais surtout par néogénèse de cellules bêta a pu être observée. Bien que la néogénèse de cellules bêta ait été décrite dans d’autres modèles murins comme un processus récapitulant le programme de différenciation fœtale c’est à dire dérivant de cellules canalaires marquées par l’expression de Sox9 et re-exprimant Ngn3, nos expériences de lignage endocrine ont révélé que les cellules bêta néoformées ne dérivent pas des cellules Sox9 ou Ngn3. L’invalidation du récepteur aux glucocorticoïdes (GR) dans le pancréas n’altère pas l’adaptation pancréatique par néogénèse dans notre modèle d’hypercorticisme, suggérant un effet indirect des GC sur la néogénèse de cellules bêta. Cette hypothèse a pu être confirmée par la mise en évidence de la présence dans le sérum des souris CORT d’un facteur capable de stimuler la néogénèse des cellules bêta in vitro. Enfin après déplétion totale des cellules bêta, l’administration de GC permet une restauration partielle de la masse de cellules béta par néogénèse.Nos résultats apportent la preuve d’une néogénèse active et induite de cellules bêta dans le pancréas adulte de souris insulino-résistantes. Cette adaptation pancréatique résulte d’une communication inter organe adaptative et l’identification du facteur pro-néogénique représente une piste thérapeutique pour les pathologies liées aux déficiences du pancréas endocrine. / Type 1 and type 2 diabetes are characterized by an insufficient insulin secretion and a decrease of beta cell mass. Regenerate a functional beta cell mass is a therapeutic issue in the treatment of diabetes. In this context we search to identify factors and mechanisms for increasing beta cell mass. We investigated mechanisms of beta cell plasticity in a context of insulin resistance.In a mouse model of insulin resistance caused by chronic administration of glucocorticoids, we demonstrated an adaptation of beta cell function by an important increase of insulin secretion. Interestingly, a continuous and progressive increase in the mass of beta cells by proliferation but especially by neogenesis of beta cells was observed.Although beta cell neogenesis has been described in other mouse models as a process recapitulating the fetal differentiation program deriving from ductal cells labeled with Sox9 expression and re-expressing Ngn3, our endocrine lineage model revealed that neoformed beta cells do not derive from Sox9 or Ngn3 cells. Inactivation of the glucocorticoid (GR) receptor in the pancreas does not alter pancreatic adaptation by neogenesis in our model of hypercorticism, suggesting an indirect effect of GCs on beta cell neogenesis. This hypothesis could be confirmed by demonstrating the presence in the serum of CORT mice of a factor able to stimulate neogenesis of beta cells in vitro. Finally, after complete depletion of beta cells, GC administration allows a partial restoration of the beta cells mass by neogenesis.Our results provide evidence of an active and induced beta-cell neogenesis in the adult pancreas of insulin-resistant mice. This pancreatic adaptation results from an inter-organ adaptive communication and the identification of the pro-neogenic factor represents a therapeutic track for pathologies related to endocrine pancreas deficiencies.

L’adénocarcinome du pancréas qui représente la quatrième cause de cancer en termes d’incidence reste une tumeur mal comprise et l’ensemble des traitements insuffisamment efficaces. Depuis quelques années, la prise en charge des patients cancéreux s’est individualisée et tente de proposer des traitements à la carte en prenant en compte divers paramètres tumoraux. Pour le cancer du pancréas, la pertinence des hypothèses biologiques pour le pronostic et le traitement des patients, a été très peu évaluée si bien qu’a coté des facteurs cliniques et histologiques, il n’existe pas de marqueurs moléculaires clairement identifiés. <p>Dans la première partie de nos traveaux, nous avons évalué l’intérêt pronostique d’une série de biomarqueurs dont les chimiorécepteurs CXCR4 et CXCR7. CXCR4 est exprimé par les ACP et joue un rôle dans la migration des cellules cancéreuses au travers la matrice extracellulaire, l’adressage métastatique, l’angiogénèse et la vasculogénèse tumorale. CXCR7 est impliqué dans la prolifération cellulaire. Ces deux chimiorécepteurs partagent le même ligand, CXCL12, qui est synthétisé par les cellules stellaires pancréatiques activées et est retrouvé en quantité importante dans le stroma fibrotique tumoral. L’expression de CXCR4 est en partie dépendante du facteur de transcription HIF-1&61537; (hypoxia inducible factor). L’expression de CXCR4, CXCR7, HIF-1&61537; et de Ki-67 à été évaluée par immunohistochimie et confrontée aux facteurs pronostiques classiques (cliniques et anatomopatholologiques). En analyse multivariée, le niveau d’expression de CXCR4 était un facteur pronostique indépendant associé à la survie sans récidive et la survie globale. De plus le niveau d’expression de CXCR4 était associé à la présence de métastase ganglionnaire sur la pièce opératoire et au risque de récidive hépatique.<p>Dans un deuxième temps, les protéines impliquées dans la métabolisation de la gemcitabine ont été évaluées à partir d’une cohorte de patients traités par radiochimiothérapie dans le cadre de deux protocoles cliniques multicentriques de phase II. La gemcitabine pénètre dans la cellule à travers la membrane plasmique soit par diffusion facilitée par des transporteurs nucléosidiques spécifiques appelés hENT (human equilibrative nucleoside transporter), soit par des transporteurs actifs Na+-dépendants ou hCNT (human concentrative nucleoside transporter). Dans la cellule, elle est métabolisée pour générer ses dérivés cytotoxiques actifs. La gemcitabine va tout d’abord être phosphorylée en dérivé monophosphate par la déoxycytidine kinase (dCK). La dCK est considérée comme étant l’enzyme limitante du métabolisme de la gemcitabine. Deux autres étapes de phosphorylation vont suivre faisant tout d’abord intervenir l’uridylate kinase (UMK) puis une troisième kinase qui, elle, est ubiquitaire.<p>In vitro, dans des lignées cellulaires d’adénocarcinome pancréatique, la résistance intrinsèque à la gemcitabine est associée à une diminution ou à une perte d’expression de hENT1 et de la dCK. En plus de son activité cytotoxique directe, la gemcitabine est un puissant radiosensibilisateur. La capacité de cet analogue pyrimidique à potentialiser les effets de la radiothérapie est en partie liée à sa capacité de pénétration. L’expression de hENT1, de hCNT3 et de la dCK a été évaluée et corrélée à la survie sans récidive et la survie globale des patients. En analyse multifactorielle, hENT1 et la dCK sont des facteurs pronostiques indépendants pour la survie sans récidive et la survie globale alors que hCNT3 est un facteur indépendant pour la survie globale. De plus l’analyse combinée de hENT1 et de hCNT3 s’avèrait plus discriminante dans l’identification des patients à haut rique de récidive que l’analyse de chacun de ces facteurs pris isolémment.<p> / Doctorat en Sciences médicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished