Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A leishmaniose visceral (LV) é um grave problema de saúde pública no Brasil. Na área urbana o cão é a principal fonte de infecção e o controle da LV no Brasil envolve a eliminação de cães infectados. Testes sorológicos são utilizados para os levantamentos rotineiros, mas estes apresentam problemas de especificidade e sensibilidade. Os métodos moleculares como a PCR são úteis tanto no diagnóstico como na identificação das espécies de Leishmania. São capazes de detectar animais infectados soronegativos e são mais sensíveis e específicos, particularmente no diagnóstico de cães assintomáticos. Um dos maiores obstáculos na implementação de ensaios moleculares é a falta de padronização. Mais de 400 publicações sobre o diagnóstico molecular da leishmaniose foram realizadas desde 1989, porém pouquíssimas compararam a eficiência das diversas técnicas disponíveis. O objetivo deste trabalho foi comparar diferentes métodos de PCR em diferentes amostras clínicas para o diagnóstico de leishmaniose visceral canina (LVC) em cães assintomáticos. Amostras clínicas de medula óssea, sangue periférico, swab conjuntival e biópsias de pele foram analisadas pelos métodos kDNA PCR hibridização, kDNA semi nested PCR (kDNA snPCR), Leishmania nested PCR (LnPCR) e Internal Transcribed Spacer 1 nested PCR (ITS-1 nPCR). Foram utilizados 30 cães assintomáticos positivos na sorologia e no exame parasitológico. Seis cães não infectados foram utilizados como controles. A extração de DNA a partir dos swabs foi realizada pelo método do Fenol-Clorofórmio. Para as amostras de sangue, medula e biópsias de pele foram utilizados kits comerciais. As análises pelo método kDNA PCR hibridização detectaram 5/30 (16,7%) cães positivos para as amostras de sangue periférico, 17/30 (57%) para pele, 19/30 (63,3%) para medula e 21/30 (70%) para swab conjuntival. Utilizando-se o método kDNA snPCR, foram encontrados 7/30 (23,3%) cães positivos para sangue periférico, 17/30 (57%) para pele, 12/30 (40%) para as amostras de medula e 24/30 (80%) para amostras de swab conjuntival. Através de método LnPCR foram detectados 9/30 (30%) cães positivos para as amostras de sangue periférico, 15/30 (50%) para medula, 13/30 (43,3%) para as amostras de pele e 19/30 (63,3%) para swab conjuntival. As análises pelo método ITS-1 nPCR das amostras de sangue periférico detectaram 19/30 (63,3%) cães positivos, 19/30 (63,33%) para pele, 29/30 (97%) para medula óssea e 29/30 (97%) para swab conjuntival. Quando comparados os métodos com base no somatório das positividades obtidas para todas as amostras clínicas, o método ITS-1 nPCR obteve 96/120 resultados positivos, o kDNA PCR hibridização 62/120, o kDNA snPCR 60/120 e o LnPCR 56/120. Na comparação da amostras com base na positividade obtida para todos os métodos o swab conjuntival apresentou 93/120 resultados positivos, a medula 68/120, a pele 63/120 e o sangue 40/120. Os resultados deste estudo indicam o swab conjuntival associado ao método ITS 1 nPCR como a melhor opção, entre os métodos e amostras testados, para o diagnóstico molecular da leishmaniose visceral canina em animais assintomáticos. Palavras-chave: Leishmaniose Visceral canina; Reação em Cadeia da Polimerase (PCR); Diagnóstico. / Visceral Leishmaniasis (VL) is a serious public health problem in Brazil. In the urban area the dog is the main source of infection and VL control in Brazil involves the elimination of infected dogs. Serological tests are used for routine surveys, but they present problems of specificity and sensitivity. Molecular methods as the PCR are useful in the diagnosis and identification of Leishmania species. PCR is able to detect seronegative animals and is more sensitive and specific, particularly in the diagnosis in asymptomatic dogs. One obstacle on the implementation of molecular assays is the lack of standardization. More than 400 articles on the diagnosis of leishmaniasis had been pubhished since 1989, however a few studies had compared the efficiency of the diverse available techniques. The aim of this work was compare different methods of PCR in different clinical samples for the diagnosis of canine visceral leishmaniasis (CVL) in asymptomatic animals. Bone marrow, peripheral blood, conjunctival swab and skin biopsies had been analyzed by the methods kDNA PCR - Hybridization, kDNA semi nested PCR (kDNA snPCR), Leishmania nested PCR (LnPCR) e Internal Transcribed Spacer 1 nested PCR (ITS-1 nPCR). Thirty positive asymptomatic dogs for serology and parasitology examination had been used. Six not infected dogs had been used as controls. The DNA extration from swabs was performed by Phenol-Chloroform method. Commercial kits had been used for DNA extraction of peripheral blood, bone marrow and skin biopsies. The kDNA PCR - Hybridization detected 5/30 (16.7%) positive dogs for peripheral blood, 17/30 (57%) for skin, 19/30 (63.3%) for bone marrow and 21/30 (70%) for conjunctival swab. Using the method kDNA snPCR had been found 7/30 (23.3%) positive dogs for peripheral blood, 17/30 (57%) for skin, 12/30 (40%) for bone marrow and 24/30 (80%) samples of conjunctival swab. Through LnPCR method 9/30 (30%) positive dogs for the samples of peripheral blood had been detected, 15/30 (50%) for bone marrow, 13/30 (43.3%) for the samples of skin and 19/30 (63.3%) for conjunctival swab. The ITS-1 nPCR analyse showed 19/30 (63.3%) positive dogs for peripheral blood, 19/30 (63.33%) for skin, 29/30 (97%) for bone marrow and 29/30 (97%) for conjunctival swab. The ITS-1 nPCR was superior to other methods based on the positivities obtained using the summatory of all clinical samples. The ITS-1 nPCR obtained 96/120 positive results, kDNA PCR-hibridization 62/120, kDNA snPCR 60/120 and LnPCR 56/120. The conjunctival swab presented the best result considering the summatory of the positivities obtained by all methods. The conjunctival swab obtained 93/120 positive results, medula 73/120, skin biopsies 68/120 and blood 40/120. The results of this study indicated the conjunctival swab associated to ITS-1 nPCR as the best option for the molecular diagnosis of visceral leishmaniasis in asymptomatic dogs, among the methods and samples analysed.

Nenhuma / O diagnóstico da leishmaniose visceral canina (LVC) é uma etapa importante do programa de controle da leishmaniose visceral no Brasil uma vez que o cão é o principal reservatório de Leishmania (Leishmania) infantum, agente etiológico da doença. O objetivo deste estudo foi avaliar o swab conjuntival (SC) como uma ferramenta de triagem em massa para o diagnóstico molecular da LVC em uma área endêmica classificada como prioritária para as ações de vigilância do Ministério da Saúde. Um total de 1.350 cães domiciliados foi envolvido neste estudo. Os animais foram avaliados por testes sorológicos (ELISA como triagem e IFI para confirmação) e moleculares. A PCR em tempo real, tendo como alvo os minicírculos do kDNA, foi o principal teste molecular utilizado para análise das amostras de SC. Dos 1.350 cães triados 369 (27,3%) foram positivos no SC-PCR em tempo real e 126 (9,3%) obtiveram resultado positivo por ELISA. Trinta e um por cento (39/126) dos cães positivos no teste de ELISA foram confirmados pelo IFI, enquanto que comparativamente 83,3% (105/126) obtiveram resultados positivos no método SC-PCR em tempo real. Entre os cães avaliados, um subgrupo de 484 animais foi adicionalmente submetido à avaliação clínica e diagnóstico molecular através do SC associado ao ITS-1 nested PCR. Neste subgrupo o número de animais positivos por SC-PCR em tempo real foi 156/484 (32,2%), por SC-ITS-1 nested PCR 44/484 (9,0%) e por ELISA 52/484 (10,7%). SC-PCR em tempo real foi capaz de detectar infecção em cães, independentemente do grau de sintomatologia (p> 0,05), enquanto ELISA foi mais sensível no grupo de cães que apresentavam três ou mais sinais clínicos relacionados à LVC (SII). Cães infectados com Leishmania (Viannia) braziliensis e L. (L.) amazonensis foram também identificados neste estudo através de RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism) dos amplicons obtidos por ITS-1 nested PCR. Os resultados do presente estudo demonstraram que o SC-PCR em tempo real foi capaz de detectar um maior número de cães infectados que o ELISA e que a prevalência de infecções caninas tem sido subestimada pelos testes sorológicos. A utilização de métodos diagnósticos altamente sensíveis como SC-PCR em tempo real, principalmente em áreas endêmicas, poderia dar uma contribuição significativa para o controle da enfermidade. / The canine visceral leishmaniasis (CVL) diagnosis is an important step of visceral leishmaniais control program in Brazil once the dog is the main animal reservoir host of Leishmania (Leishmania) infantum, the etiologic agent of the disease. The aim of this study was to evaluate conjunctival swab (CS) as a mass-screening tool for CVL molecular diagnosis in an endemic area classified as priority for the Brazilian Ministry of Healthy for surveillance action. A total of 1,350 domiciled dogs were screened. The animals were evaluated by the serological tests (ELISA as screening and IFI for confirmation) and by CS associated to real-time PCR using kDNA minicircles as targets. Of the 1,350 dogs screened 369 (27.3%) were positive by CS real-time PCR and 126 (9.3%) tested positive by ELISA. Thirty one percent (39/126) of the ELISA positive dogs were confirmed by IFI, while 83.3% (105/126) tested positive in the CS real-time PCR assay. Among the dogs screened, a sub-group of 484 animals were also submitted to clinical evaluation and molecular diagnosis using CS associate to ITS-1 nested PCR. In this sub-group the number of animais positive by CS real-time PCR was 156/484 (32.2%), by CS ITS-1 nested PCR 44/484 (9.0%) and by ELISA 52/484 (10.7%). The CS real-time PCR was able to detect infection in dogs independently of the symptomatology degree (p > 0.05), while ELISA was more sensitive in the group of dogs that present three or more clinical signs related to CVL (SII). Dogs infected by L. (Viannia) braziliensis and L. (L.) amazonensis were also found in this study by means of RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) analysis of ITS-1 nested PCR amplicons. The results of present study demonstrated that CS real-time PCR was able to detected a higher number of infected dogs than ELISA and that the prevalence of canine infections has been underestimated by the serological assays. The use of sensitive molecular diagnostic methods like CS real-time PCR, mainly in endemic areas, could greatly contribute to disease control.

As leishmanioses são causadas por protozoários do gênero Leishmania e apresentam diversas manifestações clínicas, sendo consideradas uma doença tropical negligenciada. Encontram-se atualmente presentes em 88 países, afetando 12 milhões de pessoas, com dois milhões de novos casos por ano. O tratamento das leishmanioses é realizado até hoje pelos mesmos quimioterápicos usados na década de 40, apesar da persistência dos efeitos colaterais. Neste sentido, o objetivo do trabalho consistiu na avaliação da atividade de derivados de benzofenonas em L. (L.) amazonensis. Além de buscar entender possíveis mecanismos de ação, através da avaliação da dosagem de óxido nítrico e do potencial de inibição enzimática nos contextos in silico e in vitro. Foram testados três benzofenonas precursoras (CM-A, CM-B e CM-C) comercialmente disponíveis e nove derivados (LFQM-115, LFQM-116, LFQM-117, LFQM-118, LFQM-119, LFQM-120, LFQM-121, LFQM-122 e LFQM-123). Inicialmente os testes foram realizados em formas promastigotas de L. (L.) amazonensis, apesar de todos os derivados serem mais eficazes que seus precursores, os melhores resultados foram exibidos por LFQM-115, LFQM-118 e LFQM-123 (IC50-PRO = 4,90; 5,05 e 5,94 μg/mL; respectivamente). A toxicidade a macrófagos peritoniais murinos foi também avaliada, e constatou-se que os derivados LFQM-117, LFQM-120, LFQM-121, LFQM-122 e LFQM123 foram os menos citotóxicos (CC50 = 140,06; 87,10; 116,20 e >160,00 μg/mL; respectivamente). A avaliação de atividade em formas amastigotas de L. (L.) amazonensis procedeu-se apenas com os derivados, sendo LFQM-120 o mais efetivo em formas intracelulares. O QlogP dos derivados de benzofenonas pode ser correlacionado com a atividade antipromastigota, bem como com a antiamastigota. A partir de então, os derivados que mostraram melhor perfil de atividade em ambas as formas do parasito e em macrófagos murinos foram selecionados (LFQM-116, LFQM-117, LFQM-119, LFQM-120 e LFQM-121) para os demais ensaios. Foi realizada a dosagem da produção de óxido nítrico (NO) nos sobrenadantes de cultura de macrófagos peritoneais murinos infectados com L. (L.) amazonensis. Neste verificou-se que os derivados benzofenônicos LFQM-119 e LFQM-120 estimularam a produção de NO, porém apenas o derivado LFQM-120 induziram uma produção de NO equivalente ao produzido por LPS. Algumas enzimas importantes para tripanossomatídeos (cruzaína, oligopeptidase B, ornitina descarboxilase e tripanotiona redutase) e representantes de importantes famílias de enzimas (papaína e tripsina) foram usadas na análise por docking molecular. Algumas destas foram também utilizadas para a avaliação do potencial de inibição enzimática experimental (papaína, cruzaína, tripsina e oligopeptidase B), tendo o derivado LFQM-116 exibido valores de IC50 = 7,54; 8,44; 8,59 e 14,25 μg/mL; respectivamente. Adicionalmente, é possível verificar a ação multi-alvo do derivado LFQM-120. Portando, este trabalho mostrou a ação de derivados de benzofenonas em ambas as formas de L. (L.) amazonensis, descrevendo ainda o ganho na atividade biológica com as modificações estruturais feitas em seus precursores. Além de ajudar a entender possíveis mecanismos de ação de tais compostos e ainda possibilitar a seleção dos compostos mais efetivos in vitro, os quais poderão então ser utilizados em futuros testes in vivo. / Leishmaniasis are caused by protozoa of the genus Leishmania and present diverse clinical manifestations being considered a neglected tropical disease. Are currently present in 88 countries affecting 12 million people with two million new cases per year. Treatment of leishmaniasis is held today by the same chemotherapy used in the 40s, despite the persistence of side effects. In this sense, the goal of the study was to evaluate the activity of benzophenone derivatives in L. (L.) amazonensis. Besides seeking to understand possible action mechanisms by evaluating the measurement of nitric oxide and the potential of enzyme inhibition in the contexts in silico and in vitro. Were tested three benzophenone precursors (CM-A, CM-B and CM-C) commercially available and nine derivatives (LFQM-115, LFQM-116, LFQM-117, LFQM-118, LFQM-119, LFQM-120-LFQM 121, LFQM-122 and LFQM-123). Initially tests were performed in promastigotes of L. (L.) amazonensis, although all derivatives being more effective than their precursors, the best results were exhibited by LFQM-115, LFQM-118 and LFQM-123 (IC50-PRO = 4.90, 5.05 and 5.94 μg/mL, respectively). The toxicity to murine peritoneal macrophages was also evaluated, and it was found that derivatives LFQM-117, LFQM-120, LFQM-121, LFQM-122 and LFQM-123 were less cytotoxic (CC50 = 140.06, 87.10, 116.20 and > 160.00 μg/mL, respectively). The assessment of activity in amastigotes of L. (L.) amazonensis proceeded only with derivatives, being LFQM-120 the most effective in intracellular forms. The QlogP of benzophenone derivatives can be correlated with antipromastigote activity, as well as antiamastigote one. Since, derivatives that showed better activity profile in both forms of the parasite and in murine macrophages were selected (LFQM-116, LFQM-117, LFQM-119, LFQM -120 and LFQM-121) for the remaining tests. Was performed the dosage of nitric oxide (NO) in the culture supernatants of murine peritoneal macrophages infected with L. (L.) amazonensis. In this, it has been found that benzophenone derivatives LFQM-119 and LFQM-120 stimulated NO production, but only the derivative LFQM-120 induced a NO production equivalent to that produced by LPS. Some important enzymes in trypanosomatids (cruzain, oligopeptidase B, ornithine decarboxylase and trypanothione reductase) and representatives of major families of enzymes (papain and trypsin) were used in the analysis by molecular docking. Some of these were also used to assess the potential for experimental enzyme inhibition assay (papain, cruzain, trypsin and oligopeptidase B), the results exhibited by LFQM-116 were IC50 = 7.54, 8.44, 8.59 and 14.25 μg/ml, respectively. Additionally, it’s possible to check the multi-target action of the derivative LFQM-120. Therefore, this work shows the action of benzophenone derivatives in both forms of L. (L.) amazonensis, also describing the gain in biological activity with structural changes made to their precursors. Besides helping to understand possible mechanisms of action of these compounds and also allow the selection of the most effective compounds in vitro, which may then be used in future in vivo tests. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais - FAPEMIG

A esquistossomose é uma doença parasitária grave e de larga distribuição geográfica, que acomete cerca de 200 milhões de pessoas no mundo e ao menos 700 milhões vivem em área de risco. No Brasil a doença é conhecida por xistose ou barriga dágua e é causada pelo Schistosoma mansoni, parasito pertencente ao filo Platyhelmintes, cujo verme adulto tem como hábitat o sistema porta do hospedeiro. O agente etiológico em questão apresenta um ciclo do tipo heteroxênico, sendo o caramujo do gênero Biomphalaria o hospedeiro intermediário e, o homem, o principal hospedeiro definitivo. Os saneamentos básicos juntamente com orientações à população constituem as principais medidas profiláticas. O tratamento também deve ser considerado no controle e na profilaxia da doença, o qual é baseado no uso de oxamniquina e praziquantel. Como somente o praziquantel tem sido usado na terapêutica de esquistossomose há a necessidade de descoberta de novos medicamentos para o tratamento dessa parasitose; além da urgente demanda relacionada ao aparecimento de linhagens do verme resistentes. A justificativa para novas alternativas terapêuticas está pautada em um tratamento com menor duração, menos efeitos adversos e que não apresente resistência do parasito. Sendo assim, este trabalho teve por objetivo avaliar a atividade esquistossomicida do extrato etanólico da semente de Garcinia brasiliensis, bem como das frações hexânica, acetato-etílica e aquosa, obtidas por partição, a partir do extrato etanólico da semente. Também foi analisada a atividade de um constituinte puro, isolado dessa espécie, uma benzofenona denominada Guttiferona-A. A avaliação do efeito do extrato da semente da planta, das frações e do composto purificado sobre o S. mansoni foi realizada em vermes adultos em testes in vitro, na qual se quantificou a taxa de mortalidade e monitoraram-se os danos na superfície da membrana e atividade do sistema excretor. Essas observações também foram realizadas com o uso dos marcadores fluorescentes Hoechst 33258 e Resorufin, respectivamente. Nos estudos realizados com a GUT-A, a atividade esquistossomicida significativa foi presenciada a partir da concentração de 18,0 μg/mL nos ensaios in vitro, onde foi capaz de matar 100,0% dos parasitos, com 24 horas de incubação, permitindo chegar ao valor de ED50 em 21,8 μg/mL. Os resultados mostraram a alta capacidade esquistossomicida do extrato da semente, das frações e da GUT-A em vermes adultos nos testes realizados in vitro. Os marcadores fluorescentes comprovaram a ação dos compostos testados, evidenciando os danos causados no sistema excretor dos parasitos, bem como lesões no tegumento, frente à exposição a várias concentrações analisadas. Ensaios posteriores serão realizados tendo como abordagem principal o mecanismo de ação da GUT-A em vermes adultos e em outras fases do ciclo de vida do S. mansoni, em testes in vitro e in vivo. / Schistosomiasis is a severe parasitic disease with large geographical distribution, affecting nearly 200 million people worldwide and at least 700 million live in risk areas. In Brazil the disease is known as “xistose” and “water belly” and is caused by Schistosoma mansoni, a parasite who belongs to the flatworm phylum, in which the adult worm lives in the portal system of the liver. The etiologic agent has a heterogenic life cycle, in which the intermediate hosts are snails of the Biomphalaria genus, and humans are the primary hosts. The main prophylactic measures include basic sanitation and public orientation. The treatment must also be considered in the control and prophylactics of the disease, which is based on the use of oxamniquine and praziquantel. Since only praziquantel has been used during schistosomiasis therapy there is a need for the discovery of new medications for parasite treatment; along with the urgent demand in relationship to resistant strains of the parasite. The justification for new, alternative therapy is guided by a shorter term treatment, with fewer side effects, and one that doesn’t provide resistance to the parasite. Thus, this work has as its objective to evaluate the schistosomicidal effect of the ethanolic extract of the Garcinia brasiliensis seed, along with the hexonic fractions, ethylic-acetate, and aquose, obtained through partition, from the ethanolic extract of the seed. The activity of a pure constituent which was isolated from this species, a benzophenone named Guttiferona-A. The evaluation of the seed extract, fraction, and pure compound effects on S. mansoni were done on adult worms in vitro, in which the mortality rate was quantified and excretory system, surface membrane damage was monitored. These observations were also made using the fluorescent markers Hoechst 33258 e Resorufin, respectively. On studies using GUT-A, significant schistosomicidal activity was witnessed in tests in vitro starting with concentrations of 18.0 μg/mL, where it was able to kill 100% of parasites, after 24 hours of incubation, allowing it to reach the ED50 value of 21.8 μg/mL. The results show a high schistosomicidal effect from the seed extract, from the fractions, and from GUT-A on adult worms used in tests in vitro. The fluorescent markets proved the effects of the compounds tested, showing the damaged caused to the excretory system, along with lesions to the integument, after exposure to various concentrations were examined. Further tests will be made having as a main approach the effect mechanism of GUT-A on S.mansoni adult worms and organisms in other phases of the life cycle, in tests in vitro and in vivo.

Membros de Acanthobothrium (Cestoda: Tetraphyllidea: Onchobothriidae) são primariamente parasitas elasmobrânquios em todos os oceanos. No entanto, algumas linhagens são encontradas em arraias de água doce da família Potamotrygonidae da região Neotropical. O reconhecimento das entidades taxonômicas que participam de um sistema parasita/hospedeiro é essencial para que estudos comparativos que visam elucidar os padrões e processos responsáveis pela diversificação destes systemas. Atualmente, 175 espécies são reconhecidas para o gênero, das quais apenas seis parasitam exclusivamente potamotrigonídeos (A. terezae, A. quinonesi, A. amazonensis, A. regoi, A. ramiroi e A. peruviense). Historicamente, a maioria das espécies de Acanthobothrium, em particular as espécies parasitas de potamotrigonídeos, foi descrita baseandose em um número restrito de exemplares provindos de localidades muito distantes umas das outras e coletados em poucas espécies de potamotrigonídeos. Esta prática tem conduzido pesquisadores a denominar novos táxons sob a premissa de que estas linhagens exibem pouca variação morfológica. Neste trabalho, foram examinados 649 espécimes de hospedeiros, representando 10 espécies e 14 morfo-espécies de potamotrigonídeos, provenientes de 10 sub-bacias hidrográficas. Somente cinco espécies de Acanthobothrium são reconhecidas neste trabalho para o sistema de água doce, A. terezae (sinônimo A. ramiroi), A. quinonesi (sinônimos A. regoie A. peruviense), A. amazonensis e duas novas espécies A. sp. n.1 e A. sp. n. 2. Verificouse que estas cinco espécies de Acanthobothrium parasitam 27 espécies de potamotrigonídeos em quase todas as sub-bacias hidrográficas da América do Sul, demonstrando um padrão de especificidade distinto de seus congêneres marinhos. As diferenças observadas nos padrões de especificidade entre estes dois ambientes pode decorrer da inexistência de amostras representativas de grupos monofiléticos de hospedeiros marinhos e/ou a despreocupação em obter amostragens adequadas de espécimens seja de hospedeiros ou parasitas. Novas fontes de dados (e.g., molecular) são necessárias para entender melhor os limites do atual status taxonômico das espécies de água doce de Acanthobothrium. Outra recomendação para acessar a variabilidade morfológica de tetrafilídeos, em geral, é o aumento do tamanho amostral considerando diferentes áreas e hospedeiros. A representatividade biogeográfica é fundamental para a compreensão da biodiversidade. Sistematas que trabalham com a taxonomia de tetrafilídeos devem ter cautela no uso de dados morfométricos e merísticos na diagnose de espécies que são descritas com base um material biológico reduzido. / Members of Acanthobothrium (Eucestoda: Tetraphyllidea: Onchobothriidae) are mainly parasites marine elasmobranchs throughout the oceans. However, few lineages are found in freshwater stingrays of the family Potamotrygonidae, which members are restricted to the Neotropic. The recognition of taxonomic units involved in a host/parasite system is essential for comparative studies so that the diversification process resulting from historic associations can be accurately elucidated. Currently, 175 species are recognized for the genus, but only six parasite potamotrygonids (A. terezae, A. quinonesi, A. amazonensis, A. regoi, A. ramiroi e A. peruviense). Historically, most species of Acanthobothrium, including freshwater ones, has been described based on a restricted number of specimens from distant localities and few potamotrygonid species. This practice has led researchers to describe new species based on the premises that those lineages present low morphological variation. In this study, 649 host specimens were examined, representing 10 species and 14 morphotypes of potamotrygonids from 10 river sub basins of South America. Only five Acanthobothrium species were recognized as valid for the freshwater system, Acanthobothrium terezae (synonym A. ramiroi), A. quinonesi (synonyms A. regoi and A. peruviense), A. amazonensis and two new species A. sp. n.1 and A. sp. n. 2. These five species of Acanthobothrium parasite 27 species of potamotrygonids in almost all river basins of South America, presenting a distinct host specificity pattern from their marine counterparts. The differences in the diversity patterns observed for marine and freshwater lineages could be due to inadequate sampling of monophyletic marine groups and/or to the lack of concern with obtaining a representative number of specimens attributed to one species (host or parasite). New sources of data (e.g., molecular) are necessary to better understand the limits of the present taxonomic status of freshwaters species of Acanthobothrium. Another recommendation to access morphological variability of tetraphyllideans is to increase the sample size to different areas and hosts. Meaningful biogeographical representation is fundamental to the comprehension of biodiversity. Systematists working on the taxonomy of tetraphyllideans should also be cautious when using morphometric and meristic characters to distinguish species, which are described based on reduced biological material.

Submitted by Dominick Jesus (dominickdejesus@hotmail.com) on 2015-11-06T18:12:42Z No. of bitstreams: 2 Dissertação_Joelma Soares da Silva.pdf: 3973131 bytes, checksum: e2d308bc76b0d2e137227d73bfb0719f (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-11-06T18:12:43Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação_Joelma Soares da Silva.pdf: 3973131 bytes, checksum: e2d308bc76b0d2e137227d73bfb0719f (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2011-02-23 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / In Amazonas state have been isolated 57 strains of Bacillus thuringiensis, these five have shown toxicity to Aedes aegypty. Isolates did not show the genes of Cry toxins 4AA; 4ba; 10Aa; 11Aa and 11Ba, except BtAM- 27 lineage that showed all genes analyzed. Data from the larvicidal activity of Amazonian isolates were not superior to those obtained with the standard strain Bti IPS-82, entrtanto BtAM 27 showed similar toxicity to this, the isolated enters obtained in this work, IBt-07 and IBt-28 were the most toxic . / No estado do Amazonas foram isolados 57 estirpes de Bacillus Thuringiensis, destas, cinco mostraram toxicidade às larvas de Aedes aegypty. Os isolados não apresentaram os genes das toxinas Cry 4Aa; 4Ba; 10Aa; 11Aa e 11Ba, com exceção da linhagem BtAM- 27 que apresentou todos os genes analisados. Os dados da atividade larvicida dos isolados do Amazonas não foram superiores aos obtidos com a estirpe padrão Bti IPS-82, entrtanto BtAM 27 mostrou toxicidade similar á esta, entra os isolados obtidos neste trabalho, IBt-07 e IBt-28 foram os mais tóxicos.

Submitted by Dominick Jesus (dominickdejesus@hotmail.com) on 2015-11-06T19:31:35Z No. of bitstreams: 2 Dissertação_Rafaela Augusta Mouzinho Bordalo.pdf: 3519525 bytes, checksum: c2c6204c8420d2aff0e7e7a06f977edb (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-11-06T19:31:35Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação_Rafaela Augusta Mouzinho Bordalo.pdf: 3519525 bytes, checksum: c2c6204c8420d2aff0e7e7a06f977edb (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2011-03-14 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / It conducted a taxonomic study for the Culex species nigripalpus based on analyzes imorfológicas and molecular analysis with the "barcode" region of the COI gene. The analysis indicated that individuals in the US and Brazil do not differ as to infer that make up a species complex. In this case, the wide geographic distance did not represent a high genetic and morphological divergence. / Foi realizado um estudo taxonômico para a espécie Culex nigripalpus com base em análises morfológicas e moleculares, com a região "barcode" do gene COI. As análises indicaram que os indivíduos dos EUA e do Brasil não diferem entre si a ponto de inferir que compõem um complexos de espécies. Neste caso, a ampla distância geográfica não representou uma elevada divergência genética e morfológica.

Submitted by Setor de Tratamento da Informa??o - BC/PUCRS (tede2@pucrs.br) on 2015-04-17T14:54:06Z No. of bitstreams: 1 467370 - Texto Completo.pdf: 6072599 bytes, checksum: 169f7ff123882c0b088732b04ad1956d (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-17T14:54:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 467370 - Texto Completo.pdf: 6072599 bytes, checksum: 169f7ff123882c0b088732b04ad1956d (MD5) Previous issue date: 2014-06-27 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior - CAPES / Schistososmiasis is a chronic endemic infection caused by parasites of the genus Schistosoma, and it occurs in 74 countries in Africa, South America and Asia. The three main agents of this infection in humans are: Schistosoma mansoni and Schistosoma japonicum, that cause the hepatic-intestinal disease, and Schistosoma haematobium, responsible for the genitourinary infection. Despite the effective treatment like praziquantel, schistososmiasis remains as the second most prevalent parasitic disease in the world. Diagnosis of the intestinal schistososmiasis is achieved through the direct visualization of the eggs in fecal samples. The current method recommended by the World Health Organization in epidemiological studies is the Kato-Katz method. Despite it being simple and cheap, in areas of low endemicity this technique loose sensibility, leading to the occurrence of false-negative cases and underestimation of the prevalence in the studied area. Helmintex? is a coproparasitological method highly sensitive that allows the isolation of Schistosoma eggs from 30 grams of feces, based in the interaction between the eggs and paramagnetic microspheres in a magnetic field. However, this method demands time and specialized equipment, being of difficult manipulation in work field. The mechanism that promotes the interaction between the paramagnetic spheres with the Schistosoma eggs is not known. Considering the necessity of sensitive diagnostic tools of easy applicability in epidemiological studies in low endemicity areas, this work has the purpose to study the surface physical-chemical characteristics of S. mansoni and S. japonicum eggs, in order to enhance the efficiency of the Helmintex? method. S. mansoni and S. japonicum eggs were isolated from livers of experimentally infected mice. The eggs were submitted to morphological and structural analysis using Scanning and Transmission Electron Microscopy and elemental analysis using Energy Disperssion Spectroscopy. The magnetic susceptibility was determined using SQUID (Superconducting Quantum Interference Device) and the concentration of the chemical elements was determined through Atomic Emission Spectroscopy. Experiments to elucidate the interaction properties of the eggs of the eggs and the microspheres were conducted incubating the eggs from both species with different paramagnetic microspheres. The results show that the egg surface of both species is recovered by a dense layer of microspines, being those shorter and less spaced in S. mansoni. The eggs spontaneously bind the particles, with a greater preference for magnetic material. S. japonicum eggs have a higher affinity for paramagnetic microspheres than S. mansoni eggs. The presence of streptavidin in the surface of the microspheres enhances the affinity of both species for non-magnetic material, however it decreases the affinity for paramagnetic microspheres. Despite the presence of iron in the eggshell of S. mansoni and S. japonicum, the origin of the interaction does not seem to be magnetic, but, based in the difference of electrostatic charges present in the surface of the eggs and the microspheres. The continuity of this study is important to determine the physical-chemical characteristics of eggs from human feces, and it can lead to the upgrading and optimization of the Helmintex? method. Studies using Atomic Force Microscopy are in progress. / A esquistossomose ? uma infec??o cr?nica end?mica causada por parasitos do g?nero Schistosoma, e ocorre em pa?ses 74 pa?ses na ?frica, Am?rica do Sul e ?sia. Os tr?s principais agentes desta infec??o em humanos s?o: Schistosoma mansoni e Schistosoma japonicum, causadores da doen?a hepato-intestinal, e Schistosoma haematobium, respons?vel pela infec??o genitourin?ria. Apesar de haver tratamento efetivo como o praziquantel, a esquistossomose permanece como a segunda infec??o parasit?ria mais prevalente no mundo. O diagn?stico da esquistossomose intestinal ? feito atrav?s da direta visualiza??o dos ovos em amostras fecais. O m?todo atualmente recomendado pela Organiza??o Mundial de Sa?de em estudos epidemiol?gicos ? o m?todo de Kato-Katz. Apesar de simples e barato, em ?reas de baixa endemicidade esta t?cnica perde sensibilidade, levando ? ocorr?ncia de casos falso-negativos e subestima??o da preval?ncia da ?rea estudada. O Helmintex? ? um m?todo coproparasitol?gico altamente sens?vel que permite o isolamento de ovos de Schistosoma ? partir de 30 gramas de fezes, baseado na intera??o entre os ovos e esferas paramagn?ticas em um campo magn?tico. Entretanto, este m?todo demanda tempo e equipamentos especializados, sendo de dif?cil manipula??o em estudos de campo. O mecanismo que promove a intera??o das esferas paramagn?ticas com os ovos de Schistosoma n?o ? conhecido. Tendo em vista a necessidade de ferramentas diagn?sticas sens?veis e de f?cil aplicabilidade em estudos epidemiol?gicos em ?reas de baixa transmiss?o, este trabalho tem por objetivo estudar caracter?sticas f?sico-qu?micas da superf?cie dos ovos de S. mansoni e S. japonicum, afim de aprimorar a efici?ncia do m?todo Helmintex?. Ovos de S. mansoni e S. japonicum foram isolados de f?gados de camundongos experimentalmente infectados. Os ovos foram submetidos ? analise morfol?gica e estrutural utilizando Microscopia Eletr?nica de Varredura e Transmiss?o e an?lise elementar utilizando Espectroscopia por Dispers?o de Energia. A susceptibilidade magn?tica foi determinada utilizando-se o SQUID (Superconducting Quantum Interference Device) e a concentra??o dos elementos qu?micos foi determinada atrav?s de Espectroscopia por Emiss?o At?mica. Experimentos para elucidar as propriedades de intera??o dos ovos e das microesferas foram conduzidos incubando ovos de ambas as esp?cies com diferentes microesferas paramagn?ticas. Os resultados mostram que a superf?cie do ovo de ambas as esp?cies ? recoberta por uma camada densa de microespinhos, sendo estes mais curtos e menos espa?ados em S. mansoni. Os ovos espontaneamente ligam-se ?s part?culas, com maior prefer?ncia por material magn?tico. Os ovos de S. japonicum possuem maior afinidade pelas microsesferas paramagn?ticas do que os ovos de S. mansoni. A presen?a de estreptavidina na superf?cie das microesferas aumenta a afinidade de ambas as esp?cies por microesferas n?o-magn?ticas, por?m diminui a afinidade por microesferas paramagn?ticas. Apesar da presen?a de ferro na casca do ovo tanto de S. mansoni quanto de S. japonicum, a origem da intera??o n?o parece ser magn?tica, e sim, baseada na diferen?a de cargas eletrost?ticas presentes na superf?cie dos ovos e das microesferas. A continuidade deste estudo ? importante para determinar as caracter?sticas f?sico-qu?micas de ovos provenientes de fezes humanas, e pode levar ao aprimoramento e otimiza??o do m?todo Helmintex?. Estudos utilizando-se Microscopia de For?a At?mica encontram-se em andamento.

Made available in DSpace on 2015-04-14T13:09:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 448197.pdf: 1838361 bytes, checksum: 7924b0b15d7d6da94d6a3c9d188d1048 (MD5) Previous issue date: 2013-02-28 / Two species of parasites nematode of Angiostrongylidae family, genus Angiostrongylus intra-arterial localization are capable of human desease production: Angiostrongylus costaricensis and Angiostrongylus cantonensis. Both species are rodent s parasites and the human infection is considered incidental. On humans, A. cantonensis cause eosinophilic meningitis and A. costaricensis cause abdominal angiostrongiliase. Since there is no elimination of parasitic forms in human infection, diagnosis becomes difficult and molecular methods are necessary. After years of discovery of angiostrongil?ases, there are still many efforts in the study and development of a specific and sensitive diagnostic test capable of discriminating Angiostrongyliases of the other parasites. In this context, cross-reactivity becomes a problem in specificity of serologic tests. The main objective of this study was to analyze the sharing of antigens between Angiostrongylus spp. and parasites Strongyloides spp., Fasciola hepatica, Ascaris lumbricoides, Hymenolepis diminuta and Toxocara canis, and identify these molecules shared. To obtain antigens, some rats were captures and their feces analyzed by the method of Baerman addition to being seeded Agar Plates. Were obtained larvae of Strongyloides spp. and Angiostrongylus spp. In pulmonary arteries were found 11 female worms and 2 male worms of A. cantonensis, which led to the first report of the occurrence of this parasite in Rio Grande do Sul. In the small intestine was obtained a Strongyloides spp worm and analysis of small intestine were obtained Hymenolepis diminuta worms. From the adult worms of parasites were obtained antigens used in this study. Furthermore, we used antigens of allergens such as peanut, tomato, strawberry and pollen. To identify shared antigens, proteins were separated by one and two dimensional electrophoresis technique assayed by Western blot using sera of patients with angiostrongyliases. All antigens were recognized by sera from patients infected with angiostrongyliases, being a total of fourteen bands identified as being immunogenic. The fourteen bands were cut out of polyacrylamide gels and analyzed by mass spectrometry. The proteins identified were: Phosphoenolpyruvate carboxykinase, heat shock protein 70 (HSP70), DAPPUDRAFT hypothetical protein, 60 kDa Chaperonin 5, Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, sigma class GST Chain A, Glucose-6-phosphate isomerase, pyruvate dehydrogenase subunit E1, Glutamate dehydrogenase 2, arachin Ahy-1, Full = Allergen Ara h 1, clone P41B, Gly1. The data generated in this study show that there is sharing of antigens between organisms of different taxonomic groups, but also with allergens tested. Moreover, the description and analysis of shared molecular components can help in understanding the evolutionary history and phylogeny of these organisms. / Duas esp?cies de parasitos nemat?deos da fam?lia Angiostrongylidae, do g?nero Angiostrongylus de localiza??o intra-arterial s?o capazes de produzir doen?a em humanos: Angiostrongylus costaricensis e Angiostrongylus cantonensis. Ambas as esp?cies s?o parasitos pr?prios de roedores e a infec??o humana ? considerada acidental. No homem, A. cantonensis ? o causador da meningite eosinof?lica e A. costaricensis causador da angiostrongil?ase abdominal. Como n?o h? elimina??o de formas parasit?rias na infec??o humana, o diagn?stico se torna dif?cil e m?todos moleculares se tornam necess?rios. Depois de anos da descoberta das angiostrongil?ases, ainda h? muitos esfor?os no estudo e desenvolvimento de um teste de diagn?stico espec?fico e sens?vel capaz de discriminar as Angiostrongil?ases de outras parasitoses. Neste contexto, a reatividade cruzada se torna um problema na especificidade de testes sorol?gicos. O objetivo principal deste trabalho foi analisar o compartilhamento de ant?genos entre Angiostrongylus spp. e os parasitos Strongyloides spp., Fasciola hepatica, Ascaris lumbricoides, Hymenolepis diminuta e Toxocara canis, assim como identificar essas mol?culas compartilhadas. Para obten??o de ant?genos, algumas ratazanas foram capturas e suas fezes analisadas atrav?s do m?todo de Baerman al?m de terem sido semeadas em Placas de ?gar. Foram obtidas larvas de Strongyloides spp. e Angiostrongylus spp. Nas art?rias pulmonares de uma ratazana foram encontrados 11 vermes f?meas e 2 vermes machos de A. cantonensis, que deu origem ao primeiro relato da ocorr?ncia deste parasito no Rio Grande do Sul. No intestino delgado foi obtido um verme de Strongyloides spp e da an?lise do intestino delgado foram obtidos vermes de Hymenolepis diminuta. A partir dos vermes adultos dos parasitos, foram obtidos os ant?genos utilizados neste trabalho. Al?m disso, foram utilizados ant?genos de alergenos como o amendoim, tomate, p?len e morango. Para identifica??o dos ant?genos compartilhados, as prote?nas foram separadas por eletroforese uni e bidimensional ensaiadas pela t?cnica de Western-Blot utilizando-se soro de pacientes com angiostrongil?ases. Todos os ant?genos foram reconhecidos pelo soro de pacientes infectados com angiostrongil?ases, sendo um total de quatorze bandas identificadas como imunog?nicas. As quartorze bandas foram recortadas dos g?is de poliacrilamida e analisadas por espectrometria de massas. As prote?nas identificadas foram: Fosfoenolpiruvato carboxiquinase, Prote?na de choque t?rmico 70 (HSP70), Prote?na hipot?tica DAPPUDRAFT, 60 kDa Chaperonina 5, Gliceralde?do-3-fosfato-desidrogenase, Cadeia A sigma classe GST, Glucose-6-fosfato isomerase, Piruvato desidrogenase subunidade E1, Glutamato desidrogenase 2 , arachin Ahy-1, Full=Allergen Ara h 1, clone P41B , Gly1. Os dados gerados no presente trabalho demonstram que h? compartilhamento de ant?genos entre organismos de diferentes grupos taxon?micos, como tamb?m com os alergenos testados. Al?m disso, a descri??o e a an?lise de componentes moleculares compartilhados podem ajudar na compreens?o da hist?ria evolutiva e da filogenia destes organismos.

Made available in DSpace on 2015-04-14T13:09:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 459196.pdf: 1894686 bytes, checksum: 241ac90cbaf1917d1bf7a9c7970d7bb6 (MD5) Previous issue date: 2014-03-14 / Angiostrongylus cantonensis is a nematode of the Angiostrongylidae family. In humans, they can cause eosinophilic meningitis. Although the parasite have been described in 1935, little is known about the mechanisms of adaptation to its hosts. A. cantonensis owns molecules that help the parasite in the evasion of the host?s immune system, among these are SOD, catalase and HSP70. The main goal of this work was to study the profiles of HSP70, SOD and CAT of L5 produced in different hosts and analyze the diagnostic potential of the extracts. For the obtainment of fifth stage larvae (L5), rats and mice were infeceted with 104 and 50 third stage larvae, respectively, and euthanized after 21 days. The L5 were recovered from the brain of the animals and homogenized in different buffers to obtain the protein extracts. The quantification of the total protein suggests no significant difference between extracts. For the identification of HSP70, it was performed dot blot and Western blot, showing that in both samples HSP70 were present. ELISA assays were used for the quantification of HSP70 and analyze antigen-antibody binding with from individuals with confirmed diagnosis for angiostrongyliasis. L5 from usual hosts were recognized by the sera showing superior titles to the L5 from the accidental hosts. Levels of stress proteins HSP70, SOD (339U versus 0.08U of SOD/mg of protein) and catalase (184.4 versus 75.6 pmol of CAT mg-1 proteins) were higher p<0.05, in A. cantonensis larvae from usual hosts in comparison to the larvae obtained from accidental hosts. These data suggest that the levels of stress proteins may be associated to the adaptation of A. cantonensis to the usual hosts. / Angiostrongylus cantonensis ? um nemat?deo da fam?lia Angiostrongylidae. Em humanos, podem causar meningite eosinof?lica. Apesar de o parasito ter sido descrito em 1935, pouco se sabe dos mecanismos de adapta??o aos seus hospedeiros. A. cantonensis possui mol?culas que o auxilia na evas?o do sistema imune do hospedeiro, dentre estas est?o SOD, catalase e HSP70. O objetivo principal deste trabalho foi estudar o perfil de HSPs 70, SOD e CAT de L5 produzidas em diferentes hospedeiros e analisar o potencial diagn?stico dos extratos. Para a obten??o das larvas de quinto est?gio (L5), ratos e camundongos foram infectados com 104 e 50 larvas de terceiro est?gio, respectivamente, e eutanasiados ap?s 21 dias. As L5 foram recuperadas do c?rebro dos animais e homogeneizadas em diferentes tamp?es para obten??o dos extratos prot?icos. A quantifica??o de prote?nas totais sugere n?o haver diferen?as significativas entre os extratos. Para a identifica??o de HSP70 foram realizados dot blot e Western blot, mostrando que em ambas as amostras HSP70 estavam presentes. Ensaios de ELISA foram utilizados para a quantifica??o de HPS70 e para analisar a liga??o ant?geno anticorpo com soros de ind?viduos com diagn?stico confirmado para a angiostrongiliase, sendo que L5 provenientes de hospedeiros habituais apresentam reconhecimento pelos soros com t?tulos superiores ?s L5 provenientes de hospedeiros habituais. Os n?veis das prote?nas de estresse HSP70, SOD (339U versus 0,08U de SOD/mg de prote?na) e catalase (184,4 versus 75,6 pmole de CAT mg-1 prote?nas) foram superiores p<0,05, em larvas de A. cantonensis provenientes de hospedeiros habituais em compara??o com as larvas obtidas de hospedeiros acidentais. Estes dados sugerem que os n?veis de prote?nas de estresse podem estar associados a adapta??o do A. cantonensis aos hospedeiros habituais.