Dissertação (mestrado)-Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2011. / Submitted by claudia teixeira (claudiadtx@gmail.com) on 2011-06-22T01:12:53Z No. of bitstreams: 1 2011_BrunaCândidoGuido.pdf: 2583425 bytes, checksum: 6da0d341ca671f7a9832a6e4581fc86b (MD5) / Approved for entry into archive by Daniel Ribeiro(daniel@bce.unb.br) on 2011-06-22T15:03:06Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_BrunaCândidoGuido.pdf: 2583425 bytes, checksum: 6da0d341ca671f7a9832a6e4581fc86b (MD5) / Made available in DSpace on 2011-06-22T15:03:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_BrunaCândidoGuido.pdf: 2583425 bytes, checksum: 6da0d341ca671f7a9832a6e4581fc86b (MD5) / As leishmanioses, doenças infecciosas causadas por protozoários intracelulares do gênero Leishmania, apresentam manifestações clínicas diversas e tratamento de difícil administração com efeitos colaterais severos. Estas doenças ainda representam um relevante problema de saúde pública que somado a questão do tratamento, refletem a necessidade de se avançar na pesquisa e na busca por novos fármacos. As proteases, enzimas que catalisam a hidrólise de ligações peptídicas de proteínas e cadeias polipeptídicas, desempenham alguns papéis chaves nos parasitos protozoários como na transição do ciclo de vida, invasão do hospedeiro, evasão imune do parasito e na patogênese de doenças parasitárias. Neste contexto, este trabalho se focaliza no estudo da otubaína de Leishmania chagasi, uma cisteíno protease pertencente às enzimas deubiquitinantes (DUBs). Algumas DUBs são essenciais na imunomodulação e regulação da resposta inflamatória. A otubaína 1 de humanos, por exemplo, possui como substrato a proteína E3 GRAIL associada à anergia dos linfócitos. Este trabalho teve como objetivo a clonagem e expressão da otubaína recombinante de L. chagasi (rOtuLc) bem como sua citolocalização, caracterização de sua atividade e proposição da sua estrutura por modelagem e dinâmica molecular. O gene da OtucLc foi amplificado e seu produto clonado no vetor de expressão, pET-19b, expresso em E. coli BL21 (DE3). A rOtuLc foi induzida com 0,1 mM IPTG, a 16 ºC por 16 h. A proteína recombinante solúvel foi purificada em coluna de agarose-níquel. Anticorpos anti-OtuLc foram produzidos em camundongos e sua especificidade foi confirmada por immunoblot. A imunocitolocalização da OtuLc em promastigotas de L. chagasi revelou sua localização em vesículas e uma marcação pontual de forte intensidade na região anterior, próximo ao cinetoplasto. Testes de atividade da rOtuLc contra os substratos Ub-AMC e Z-LRGG-AMC foram realizados e a rOtuLc mostrou-se inativa. Finalmente, a modelagem molecular por homologia e os ensaios de dinâmica molecular de equilíbrio indicaram que a OtuLc é composta por 10 hélices ? e 1 folha ?, de 4 fitas, e mantém conservado o posicionamento dos resíduos da tríade catalítica, estando o resíduo Cys81 no início de uma hélice ? direita próxima à fita ? onde se encontram os resíduos His261 e Asn263. Estes resultados iniciais poderão servir como ferramentas de grande valia para uma avaliação futura do potencial quimioterápico da OtuLc. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Leishmaniasis are infectious diseases caused by intracellular protozoa of the genus Leishmania which have different clinical manifestations and treatment difficult to administer with serious secondary effects. These diseases still represent a significant public health problem and together with the difficulties encountered in the current treatment reflect the need to advance the search for new drugs. Proteases, enzymes that catalyze the hydrolysis of peptide bonds of proteins and polypeptide chains, play key roles in some protozoan parasites such as life cycle transition, host invasion, parasite immune evasion and parasitic diseases pathogenesis. In this context, this work focuses on studing Leishmania chagasi otubain, a cysteine protease belonging to deubiquitinating enzyme (DUBS). Some DUBs are essential in immunomodulation and regulation of the inflammatory response. The human otubain 1, for example, has the GRAIL E3 protein as substrate, associated with anergy in lymphocytes. The aim of this work was the cloning and expression of recombinant L. chagasi otubain (rOtuLc), the verification of its cytolocalization, the activity characterization and the structure proposition by molecular modeling and dynamics. The OtuLc gene was amplified and the product cloned into the expression vector pET-19b expressed in E. coli BL21 (DE3). Expression of recombinant protein condition was 0,1 mM IPTG, 16 °C for 16 h. The soluble recombinant protein was purified by nickel-agarose column. Anti-OtuLc antibodies were produced in mice and its specificity was confirmed by immunoblot. Cytolocalization of OtuLc in L. chagasi promastigotes revealed vesicular pattern localization and a high-intensity point labeled in the anterior region near the kinetoplast. rOtuLc activity tests against Ub-AMC and Z-LRGG-AMC substracts were performed and the recombinant protein was found to be inactive. Finally, homology molecular modeling and molecular dynamics assay indicated that OtuLc is composed of 10 α helices and 1 β sheet and retains the conserved residues of catalytic triad positioning with Cys81 residue at the beginning of a right handed α helix near to His261 and Asn263 at the β sheet. These initial results may serve as valuable tools for future assessement of the chemotherapeutic potential of OtuLc.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2011. / Submitted by Max Lee da Silva (bruce1415@hotmail.com) on 2011-06-28T13:30:52Z No. of bitstreams: 1 2011_LizMariaBatistaTeles.pdf: 2779966 bytes, checksum: 24f2d49d4772a40872853395bd4de504 (MD5) / Approved for entry into archive by Guilherme Lourenço Machado(gui.admin@gmail.com) on 2011-06-30T15:37:24Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_LizMariaBatistaTeles.pdf: 2779966 bytes, checksum: 24f2d49d4772a40872853395bd4de504 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-06-30T15:37:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_LizMariaBatistaTeles.pdf: 2779966 bytes, checksum: 24f2d49d4772a40872853395bd4de504 (MD5) / Os neutrófilos são os leucócitos mais abundantes no sangue periférico humano, representando a principal linha de defesa contra bactérias, vírus e protozoários. Durante o processo de ativação, essas células podem liberar ânion superóxido (O2 •-) e proteases oriundas de seus grânulos para o meio extracelular, promovendo dano tecidual. Em politraumatismo, o processo inflamatório pode tornar-se disseminado e resultar na síndrome da resposta inflamatória sistêmica (SIRS). O progresso dessa situação induz o desenvolvimento de síndrome da angústia respiratória aguda (ARDS) e falência de múltiplos órgãos (MOF). Devido à complexidade do sistema analisado, que envolve muitas e diferentes vias metabólicas de estimulação / ativação com diversos pontos de interação, a abordagem proteômica é considerada uma ferramenta apropriada para estudar as funções neutrofílicas. Este trabalho apresenta os resultados obtidos a partir da análise comparativa entre os mapas proteômicos de polimorfonucleares (PMN) humanos quiescentes e ativados por trauma grave. São pesquisados marcadores moleculares que possam estar envolvidos nos estados mórbidos observados após politraumatismo. Extratos proteicos de neutrófilos de 3 doadores hígidos e de 3 pacientes politraumatizados foram analisados, como triplicatas biológicas e experimentais, em dois intervalos de eletroforese bidimensional: pH 6-11 e 4-7. O processo comparativo da abordagem alcalina revelou 3 spots diferencialmente expressos, sendo que os três aumentaram sua expressão após ativação devido a trauma grave. Quanto ao perfil ácido, 114 spots foram diferencialmente expressos, onde 27 aumentaram e 87 diminuíram sua expressão devido à ativação por politraumatismo. Foram alcançadas identificações de algumas proteínas potencialmente relacionadas com quadros inflamatórios após trauma grave, como Zfyve19, MAOB e proteína semelhante à albumina, descritas pela primeira vez em polimorfonucleares. A partir do entendimento das funções bioquímicas dessas proteínas, espera-se que exames laboratoriais e terapias clínicas específicos possam ser desenvolvidos. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Polymorphonuclear leukocytes (PMN) or neutrophils are thought to play divergent roles in critically injured patients. In one fashion, they are the first line of defense against bacterial, viral and protozoan infections through phagocytosis and release of reactive oxygen species (ROS). However, it has become apparent that inappropriate activation of these cells and release of ROS and tissue degrading enzymes from their granules contributes to systemic inflammatory response syndrome (SIRS), acute respiratory distress syndrome (ARDS) and multiple organ failure (MOF). Neutrophil protein extracts from three volunteer normal donors and from three major torso trauma patients were submitted, as technical and biological triplicates, to two ranges of bidimensional electrophoresis: pH 6-11 and 4-7. Alkaline and acidic proteomic maps of quiescent human neutrophils were analyzed and compared to those of activated neutrophils from severe trauma patients. The alkaline proteomic comparison revealed 3 spots whose measured volumes differed between activated and quiescent neutrophils, with all of them upregulated in trauma setting. On the other hand, the acidic proteomic analysis revealed 114 spots whose measured volumes differed between activated and quiescent polymorphonuclear leukocytes, with 27 upregulated and 87 downregulated in trauma condition. This work achieved the identification of several proteins potentially involved in signaling after trauma, as exemplified by the proteins Zfyve19, MAOB and albumin-like protein, described for the first time in polymorphonuclear leukocytes. Understanding the role of some neutrophil proteins, which are involved in the leukocyte metabolical actions in inflammatory response, can contribute to the development of new therapeutic strategies to control the deleterious inflammatory process and its pathological sequelae.

Dissertação (mestrado)-Universidade de Brasília, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2011. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2011-11-29T13:29:54Z No. of bitstreams: 1 2011_DeniseTakamatsu.pdf: 9119373 bytes, checksum: 141b36ca97f1837de6484ae5ef965e47 (MD5) / Approved for entry into archive by Elzi Bittencourt(elzi@bce.unb.br) on 2011-11-29T13:46:50Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_DeniseTakamatsu.pdf: 9119373 bytes, checksum: 141b36ca97f1837de6484ae5ef965e47 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-11-29T13:46:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_DeniseTakamatsu.pdf: 9119373 bytes, checksum: 141b36ca97f1837de6484ae5ef965e47 (MD5) / A doença diarréica aguda, ou gastroenterite aguda, representa um grande problema de saúde pública no mundo, afetando mais de 1 bilhão de crianças e adultos a cada ano. A mortalidade associada a essa síndrome é estimada em 6 milhões de casos por ano. A etiologia das gastroenterites é bastante diversa, incluindo bactérias, parasitas e vírus. Os patógenos virais são os agentes mais comumente associados a essa patologia. Dentre os agentes virais, destacam-se os norovírus, considerados atualmente, os principais agentes causais de epidemias de gastroenterites virais no mundo. O gênero Norovirus é constituído por 5 genogrupos (GI, GII, GIII, GIV e GV), sendo o GII o que apresenta maior prevalência em humanos. Dentro deste genogrupo, destaca-se o genótipo 4 (GII/4), por ser o principal causador de gastroenterites em humanos. Recentes trabalhos indicam novas variantes de GII/4 disseminadas pelo mundo. Este trabalho teve como objetivo estudar a variação gênica de norovírus GII que ocorreu no Distrito Federal no período entre 2006-2008. Inicialmente, os isolados do DF foram detectados por meio de tiras imunocromatógráficas, utilizando um total de 182 amostras diarréicas cujos resultados para a presença de bactérias patogênicas, rotavírus e adenovírus foram negativos. A região N terminal do gene que codifica para a proteína do capsídeo foi amplificada por RT-PCR e seqüenciada. A análise filogenética dos 17 norovírus isolados juntamente com sequências referências mostrou que 16 isolados pertencem ao GII/4 e um ao GII/3. Uma amostra de GII/4 foi selecionada para sequenciamento de aproximadamente metade do genoma a partir da região 3’. A análise filogenética do gene que codifica para o capsídeo, de cerca de 1.5 kb, indicou que a estirpe brasileira pertence ao subtipo “2004” ou variante Hunter. Os dados mostraram a utilidade da tira imunocromatográfica para detecção dos norovírus e genótipo dos 17 isolados no Distrito Federal. Para subtipagem, mais estudos são necessários para elucidar a minuciosa circulação de NoV GII/4 no Brasil em relação com a disseminação global. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Acute diarrhea or acute gastroenteritis is a major problem in public health worldwide, affecting more than 1 billion of children and adults per year. The mortality associated with this syndrome is estimated to be 6 million cases a year. The etiology of gastroenteritis is diverse including bacteria, parasites and virus. Viruses are the most common casual agents for this syndrome. Among viruses, nowadays, norovirus is considered the major causative pathogen of epidemics gastroenteritis in the world. A Norwalk virus (Norovirus), the monotipic species of genus Norovirus consisted of 5 genotypes (GI, GII, GIII, GIV and GV), and GII is the most prevalent genotype in humans. Within genogroup II, genotype 4 (GII/4) is the major causative agent in the world. Recent works showed that new variants of GII/4 disseminate worldwide. This study is aimed to moleculary-characterize the norovirus GII isolated in the Federal District during years from 2006 to 2008. At first, norovirus isolates were identified by immunochromatografic strips using a total of 182 diarrheic samples which were negative for bacteria, Rotavirus and Adenovirus. The capsid gene region of Nterminal capsid protein was amplified by RT-PCR and sequenced. Phylogenetic analysis of 17 norovirus isolates with reference sequences showed that 16 isolates belonged to GII/4 and one to GII/3. One GII/4 isolate was selected to be sequenced almost half of its genome at 3’ region. Phylogenetic analysis of whole capsid gene of 1.5 kb showed that this Brazilian isolate belonged to subtype “2004” or Hunter variant. Our results showed that the usefulness of immunochromatografic stripe for norovirus detection and genotype of 17 noroviruses isolated in the Federal District. For subtyping, futher study will be necessary to elucidate the detailed circulation of norovirus GII/4 in Brazil in relation to the global dissemination.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2013. / Submitted by Alaíde Gonçalves dos Santos (alaide@unb.br) on 2014-04-08T14:45:04Z No. of bitstreams: 1 2013_PatriciadeSousaLima.pdf: 9860957 bytes, checksum: 310079c43625523f20cdf02c8b2ef356 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2014-04-08T15:21:44Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_PatriciadeSousaLima.pdf: 9860957 bytes, checksum: 310079c43625523f20cdf02c8b2ef356 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-04-08T15:21:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_PatriciadeSousaLima.pdf: 9860957 bytes, checksum: 310079c43625523f20cdf02c8b2ef356 (MD5) / Paracoccidioides spp. causa a paracoccidioidomicose, uma das micoses mais frequentes na América Latina. O fungo cresce como micélio no meio ambiente, e como levedura, no hospedeiro. A fim de sobreviver no corpo humano, patógenos devem se adaptar nos microambientes os quais são frequentemente caracterizados por baixas disponibilidades de nutrientes e oxigênio. Uma das primeiras linhas de defesa deste fungo durante invasão no hospedeiro são os macrófagos residentes nos pulmões, considerados pobres em aminoácidos e nutrientes. Durante a doença sistêmica, o fungo também pode atingir órgãos e tecidos onde o patógeno é exposto a variações nas concentrações de oxigênio. Neste estudo, as respostas de Paracoccidioides, Pb01, sob condições de privação de glicose e de oxigênio foram obtidas a partir de abordagens transcricionais (RNAseq), proteômicas (NanoUPLC-MSE e 2D-PAGE) e ensaio de complementação gênica. Os resultados revelaram que Pb01 muda seu metabolismo em resposta à privação de glicose. O fluxo de carbono é centrado na produção de etanol e gliconeogênese pela modulação de outras vias tais como β-oxidação e ciclos do glioxilato e ácido tricarboxílico. Mais ainda, as células privadas de glicose foram mais susceptíveis à morte por macrófagos indicando que a glicose proporciona vantagem na sobrevivência do fungo dentro dos macrófagos. Em relação à hipóxia, as respostas do Pb01 possivelmente são mediadas pelo fator de transcrição SrbA, uma proteína da família de ligação ao elemento regulatório esterol (SREBP). A PbsrbA é funcional no mutante nulo para o gene srbA, de A. fumigatus (ΔsrbA), e também restaura ambos, a susceptibilidade do ΔsrbA à classe de azóis de drogas antifúngicas e a produção de biomassa em resposta à condições de privação de ferro. Além disso, os níveis de transcritos e proteínas de células leveduriformes do Pb01 mostraram que, em hipóxia, o fungo aumenta a expressão de transcritos associados com a glicólise e biossínteses de ergosterol e ácidos graxos. Um aumento na abundância de proteínas envolvidas com o metabolismo de aminoácidos, carboidratos, lipídios/ ácidos graxos, produção de etanol e destino protéico foi detectado por análises em gel bi-dimensional além da redução daquelas relacionadas a processos oxidativos (de aminoácidos, ácidos graxos e acetaldeído), TCA e transporte de elétrons. Desde que estudos têm mostrado a importância do metabolismo de carbono e adaptação à hipóxia nos fungos, concluímos que a caracterização das respostas de Pb01 às condições de privação de glicose e de oxigênio é importante para elucidação de importantes moléculas e processos relevantes para o entendimento do estabelecimento fúngico no hospedeiro. ______________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Paracoccidioides spp. represent the causative agent of paracoccidioidomycosis, one of the most frequent systemic mycoses in Latin America. The fungus grows as mycelium in the environmental, and as yeast form, in the host tissue. To survive in the human body, pathogens must adapt to microenvironments which are often characterized by low nutrient and oxygen availability. One of the first lines of defense during Paracoccidioides spp. host invasion are the lung resident macrophages, considered a glucose- and amino acid-poor environment. During the systemic disease, it also can reach organs and tissues where the pathogen is exposed to variations in oxygen concentrations. In this study, a comprehensive response of Paracoccidioides, isolate Pb01, under glucose and oxygen deprivation was accessed by transcriptional (RNAseq), proteomic (NanoUPLC-MSE and 2D-PAGE) and genetic complementation approaches. The results revealed that Pb01 changes its metabolism to responds to glucose deprivation. The carbon flow is focused in gluconeogenesis and ethanol production through β-oxidation, glyoxylate and tricarboxylic acid cycles modulations. Moreover, the glucose deprived cells are more susceptible to macrophages killing indicating that the glucose provides a survival advantage to Pb01 inside macrophages. Regarding hypoxia, the responses of Pb01 showed that it is possibly mediated by a highly conserved transcription factor, SrbA, a protein of the sterol regulatory element binding protein family. Our results showed that the PbsrbA is functional in a null mutant of srbA of A. fumigatus (ΔsrbA) and also restore both, the susceptibility of ΔsrbA to the azole class of antifungal drugs and the biomass production in response to low iron conditions. Furthermore, the transcripts and proteins levels of the Pb01 yeast cells under hypoxia showed that Pb01increases the expression of transcripts associated with glycolysis and ergosterol/ fatty acid biosynthesis. In addition, as detected by 2D-PAGE, the fungus also increases the abundance of proteins involved in amino acid, carbohydrate and lipid/fatty acids metabolism, ethanol production and protein fate and reduce of those related to oxidative processes (amino acids, fatty acid and acetaldehyde), TCA and electron transport. Because studies have highlighted the importance of carbon metabolism and hypoxia adaptation in fungi, we conclude that the characterization of glucose and oxygen deprivation responses in Pb01 is important to elucidate molecules and processes relevant in the understanding of the fungal establishment in the host.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2008. / Submitted by Diogo Trindade Fóis (diogo_fois@hotmail.com) on 2009-09-10T11:36:03Z No. of bitstreams: 1 Dissert_DanielleLimaGuedesPeixoto.pdf: 1364870 bytes, checksum: 91207aa0f65190b6162922c07e85e9b7 (MD5) / Approved for entry into archive by Luanna Maia(luanna@bce.unb.br) on 2009-10-01T13:52:41Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissert_DanielleLimaGuedesPeixoto.pdf: 1364870 bytes, checksum: 91207aa0f65190b6162922c07e85e9b7 (MD5) / Made available in DSpace on 2009-10-01T13:52:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissert_DanielleLimaGuedesPeixoto.pdf: 1364870 bytes, checksum: 91207aa0f65190b6162922c07e85e9b7 (MD5) Previous issue date: 2008 / Os materiais magnéticos têm despertado crescente interesse na área biomédica. Dentre eles, fluidos magnéticos (FM) ou magnetolipossomas (ML) constituídos a partir de nanopartículas magnéticas (NPM) têm sido propostos como carreadores de drogas, para separação de células, diagnóstico in vitro ou in vivo e para o tratamento de diversas patologias, entre as quais a Pbmicose, doença com acometimento pulmonar grave. A anfotericina B é um antifúngico útil no tratamento da Pbmicose, mas gera nefrotoxicidade e requer longo período de tratamento, fatores que levam o paciente a interromper o tratamento. NPM recobertas com ácido dimercaptossuccínico (DMSA) tendem a se acumular no pulmão, e foram associadas com a Anfotericina B (FM-AnfoB), para constituir um sistema carreador do fármaco para o pulmão e tratamento da Pbmicose, minimizando os graves efeitos colaterais da Anfotericina B livre (AnfoB). FM-AnfoB apresenta também um sistema de liberação controlada para diminuir o número de injeções administradas no tratamento. Este trabalho teve como objetivo avaliar a bicompatibilidade/toxicidade da amostra FM-AnfoB e compará-la aos da AnfoB. O experimento foi realizado de 12 horas até 80 dias de tratamento com FM-AnfoB, AnfoB e tampão PBS, como controle. As amostras não induziram alterações no peso corpóreo. FM-AnfoB causou menos estresse, mas mudanças comportamentais e morte após 70 dias. A análise citométrica mostrou que ambas amostras induziram pequenas e temporárias alterações nas populações leucocitárias do sangue e do peritônio, mas FM-AnfoB causou leucopenia mais branda que AnfoB. As amostras não causaram alterações nos níveis enzimáticos que indiquem hepato ou nefrotoxicidade. No tratamento de maior duração, AnfoB gerou alterações nos níveis séricos da enzima alanina amino transferase, sugerindo que o tratamento mais longo pode ocasionar danos hepáticos. O teste de exclusão de nigrosina mostrou que a viabilidade das células peritoneais foi pouca afetada pelos tratamentos. O único valor menor que 90% foi visto no tratamento por 80 dias com FM-AnfoB. O teste de micronúcleo mostrou que AnfoB causou genotoxicidade tanto em EPC quanto em ENC, enquanto o mesmo não foi observado com FM-AnfoB e também que só FM-AnfoB causou citotoxicidade nas células da medula óssea, tanto no início quanto no final do experimento. A análise histológica mostrou aglomerados de nanopartículas no fígado, baço e pulmão, ausência de danos no baço, processos inflamatórios mais severos nos rins e fígado pela amostra AnfoB, espessamento maior das paredes alveolares pela amostra FM-AnfoB e direcionamento preferencial das NPM para os pulmões. Os resultados foram particularmente especiais porque mostraram ser plausível a aplicação de até 23 injeções de FM-AnfoB sem efeitos severos. Em conclusão, amostra FM-AnfoB é biocompatível, órgão específica pode ser usado como carreador da anfotericina B, visando o tratamento da Pbmicose diminuindo, em muitas circunstâncias, os efeitos colaterais da anfotericina B livre, evidenciando os benefícios dos fármacos nanoestruturados. __________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Magnetic materials present an increasing interest in the biomedical area. Among them, magnetic fluids (FM) and magnetoliposomes (ML) are constituted by magnetic nanoparticles (NPMs) and have been proposed as drug carriers, for cells separation process, in vitro and in vivo diagnosis, and also for the treatment of several pathologies, such as Paracoccidioidomycosis (PCM), a disease with severe pulmonary injuries. Amphotericin B is a useful drug for the treatment of PCM, but it induces nefrotoxicity and needs a very long time treatment. These facts are responsible for the patient treatment interruption. NPMs coated with dimercaptosuccinic acid (DMSA) tend to accumulate in the lungs. These NPM sample were associated with Amphotericin B (FM-AnfoB) to constitute a drug carrier system to the lungs able to treat PCM with less severe collateral effects than the free Amphotericin B (AnfoB). FM-AnfoB also presents a controlled liberation system that decreases the necessary number of injections administered in the treatment. This work had the aim of evaluating the biocompatibility/toxicity of the sample FM-AnfoB. Further, it also intended to compare the FM-AnfoB and AnfoB effects. Experiments were performed from 12 hours until 80 days after treatment with FM-AnfoB, AnfoB, or PBS, as control. Samples did not induce alterations in the body weight. FM-AnfoB caused less stress, but death after 70 days treatment. Cytometry analysis showed that both samples induced few and temporary alterations in both blood and peritoneum leucocyte populations. However, FM-AnfoB caused slighter leucopeny than AnfoB. Samples did not cause alterations in the blood enzyme levels that could indicate hepatotoxicity or nefrotoxicity. In the longer treatment, AnfoB induced changes in the serum levels of enzyme alanin amino transferase, suggestin that longer treatment may induce hepatic damage. The nigrosin exclusion test showed that the viability of peritoneal cells was slightly affected by the treatments. The only value less than 90% was seen in the 80 days treatment with FM-AnfoB. Micronucleus test showed that AnfoB caused genotoxicity in both polychromatic and normochromatic erytrocytes. However, FM-AnfoB did not present this effect. However FM-AnfoB was the only to induce cytotoxicity to bone marrow cells, at the beginning and at the end of the experiment. Histology analysis showed NPM clusters in the liver, spleen and lungs, no damage to the spleen, more severe inflammatory process in the livers and kidney of AnfoB treated animals, more enlargements of alveolar walls by the FM-AnfoB sample, and also preferencial target of NPM to the lungs. Results were particularly special because evidenced that is possible to administrate until 23 injections of FM-AnfoB without severe effects. In conclusion, the FM-AnfoB sample is biocompatible, organ-specific, and may be used as an Amphotericin B carrier. Further it can perform the PCM treatment decreasing the observed colateral effects of the free Amphotericin B, thus evidencing the great potencial of nanostructured drugs.

A adrenoleucodistrofia ligada ao X (X-ALD) é a doença peroxissomal mais freqüente, com uma incidência de 1:20.000 homens na população geral, sendo identificada em todos os grupos étnicos. O gene envolvido na X-ALD é o gene ABCD1 (ATP-Binding Cassette transporter subfamily D member 1), que codifica uma proteína de membrana peroxissomal, ALDP. Mutações nesse gene são relacionadas ao acúmulo de ácidos graxos de cadeia muito longa (very long chain fatty acids – VLCFA) em todos os tecidos e fluidos corporais, especialmente no sistema nervoso e glândulas adrenais. Até o momento, mais de 1200 mutações já foram descritas neste gene. Três fenótipos principais são claramente identificados entre homens afetados: a forma cerebral (CALD), caracterizada por resposta inflamatória no SNC, a forma não inflamatória, AMN e a insuficiência adrenal isolada, também chamada de Addison-only. Não há correlação entre o tipo de mutação e o fenótipo clínico e uma possível explicação para essa alta variabilidade fenotípica poderia ser a ação de fatores ambientais e genes modificadores. Nesta tese está descrita, provavelmente, a primeira série de casos de pacientes sul-americanos com X-ALD. Foram avaliados aspectos moleculares da X-ALD em uma série de 38 famílias procedentes desde a Argentina até o Amazonas, relacionando-os com dados epidemiológicos e com a avaliação da taxa de sensibilidade e especificidade da análise de VLCFA em mulheres; e foi realizada a busca por potenciais genes modificadores que atuem, por CNV, na variabilidade fenotípica da X-ALD. Encontraram-se 36 mutações diferentes: apenas uma delas recorreu em 3 famílias. Doze destas mutações foram novas: a sua morbidade foi sustentada principalmente pelos graves rearranjos ou códons de parada prematuros por elas produzidos (p.Pro623Leu, p.Glu577X, p.Tyr33_Pro34fsX34, p.Arg538fs, p.Ala232fsX64, p.Trp137fsX57, p.Leu628Glu, p.Ile481Phe, p.Ala95fsX11, p.Gln55X, p.Arg401Gly e p.Ser358fsX42). Quatro situações (ou 10% da série) foram documentadas como mutações de novo. Como era de se esperar, não foi possível determinar nenhuma correlação entre genótipos e fenótipos. Uma das famílias foi identificada a partir de uma menina com CALD e desvio completo da inativação do X. Através da curva de Kaplan-Meyer, descrevemos a idade média de início das três formas principais nos homens: o início do Addison–only foi em média (IC de 95%) aos 7,4 (5,4-9,4) anos, da CALD, aos 10,9 (9,1-12,7) anos, e da AMN, aos 26,4 (20,3-32,5) anos. Descrevemos também a sobrevida média da CALD como de 24,7 (19,8-29,6) anos. Na presente série, 54 dos 87 afetados (ou 62%) apresentavam o fenótipo CALD, uma taxa maior do que a descrita na literatura (de 45 a 57%). Procuramos alguma evidência que vinculasse esse aparente excesso de formas desmielinizantes com a latitude de origem dos casos, à semelhança da esclerose múltipla: nossos resultados foram negativos. Em um subgrupo de famílias foi possível comparar o status genético final de 50 mulheres (heterozigotas versus normais) decorrente da investigação molecular, com os diagnósticos prévios levantados pela investigação bioquímica dos VLCFA. Encontramos uma elevada taxa de casos VLCFA falso-negativos, de 72,5%, muito maior do que a descrita na literatura (20%) e encontramos também dois casos de mulheres com VLCFA falso-positivos. Concluímos que o uso dos VLCFA deve ser evitado no aconselhamento genético. Finalmente, voltamos aos hemizigotos, em busca de genes candidatos a modificadores de fenótipos, através da associação dos mesmos com específicas variações no número de cópias (copy number variation - CNV) em 29 genes selecionados por seu papel na inflamação, metabolismo dos lipídios ou regeneração do sistema nervoso. A estratégia foi investigar CNVs destes genes através da técnica da Multiple Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) em um grupo de 85 pacientes espanhóis e brasileiros: 39 com AMN e 46 com CALD. Conseguimos identificar CNVs em nove destes genes. Interações potenciais entre estes genes foram inferidas a partir da ferramenta da web Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins (STRING) versão 9. A análise das redes criadas identificou três nódulos principais, com a POMC (Proopiomelanocortina) sendo a proteína central. Nós então sugerimos estes genes e a própria POMC como genes candidatos a modificadores do fenótipo X-ALD. / The X-ALD is the most frequent peroxisomal disease with a pan-ethnic incidence of 1:20,000 males in the general population. The gene involved in X-ALD is the ABCD1, which encodes a protein of the peroxisomal membrane, ALDP. Mutations in this gene are related to the accumulation of VLCFA in all tissues and body fluids, especially in the nervous system and adrenal glands. To date, more than 1200 mutations have been described in the gene. Three phenotypes are clearly identified among affected men: the cerebral form (CALD), characterized by inflammation in the CNS, the non-inflammatory form, adrenomyeloneuropathy (AMN), and Addison-only. There is no genotype-phenotype correlation, in spite of the high phenotypic variability observed in affected relatives. This thesis probably describes the first case series of South American patients with X-ALD. We have evaluated the molecular features of X-ALD, correlating them with epidemiological data in a series of 38 South American families. We have also evaluated the sensitivity and specificity of VLCFA in women, and have searched potential modifier genes that may act by CNV in the male phenotypic variability of X-ALD. We found 36 different mutations, only one recurring in three families. Twelve were new mutations: its morbidity was sustained mainly by major rearrangements or stop codons produced by them (p.Pro623Leu, p.Glu577X, p.Tyr33_Pro34fsX34, p.Arg538fs, p.Ala232fsX64, p.Trp137fsX57, p.Leu628Glu, p.Ile481Phe, p.Ala95fsX11, p.Gln55X, p.Arg401Gly and p.Ser358fsX42). Four (or 10% of the series) were documented as de novo mutations. As was expected, no genotype-phenotype correlation was found. One family was identified from a girl with CALD and complete deviation of X inactivation. By Kaplan-Meyer analysis, we have described the onset of the three main forms in men: the mean (95% CI) age at onset of Addison-only was 7.4 (5.4 - 9.4) years, of CALD, 10.9 (9.1 - 12.7) years, and of AMN, 26.4 (20.3 - 32.5) years. We have also estimated the survival of CALD as 24.7 (19.8 to 29.6) years. In this series, 54 of the 87 affected male (or 62%) had the phenotype CALD, a rate higher than that described in the literature (45-57%). We look for any evidence that relates the apparent excess of demyelinating forms with latitude of origin of cases, like multiple sclerosis: the results were negative. In a subgroup of families, the molecular analyses allowed us to compare the genetic status of 50 women (heterozygous versus normal) with the previous biochemical diagnoses raised up by VLCFA. A high rate of false negative VLCFA was disclosed, of 72.5%, significantly greater than the 20% described in literature. We have also found two false positives VLCFA results in females. We conclude that the use of VLCFA should be avoided in genetic counseling. Finally, we turned to hemizygotes, in search of candidate genes that could modify the X-ALD phenotype, chosen by for their role in inflammation, lipid metabolism or in the regeneration of the nervous system. The strategy was to investigate CNVs of these genes through the technique of Multiple Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) in a group of 85 Spanish and Brazilian patients: 39 with AMN and 46 with CALD. We have identified nine CNVs in these genes. Potential interactions between these genes were inferred from the tool Web Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes / Proteins (STRING) version 9. The analysis of network nodes identified three key created, with POMC (proopiomelanocortin) being the core protein. We then suggested they own and POMC genes as candidate genes modifying the phenotype of X-ALD.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2012. / Submitted by Alaíde Gonçalves dos Santos (alaide@unb.br) on 2012-05-14T13:46:12Z No. of bitstreams: 1 2012_LorenaCarvalhodeSouzaChaves.pdf: 2104640 bytes, checksum: 8d444129ca0c1b47390b577e4c879cea (MD5) / Approved for entry into archive by Marília Freitas(marilia@bce.unb.br) on 2012-05-14T14:38:41Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_LorenaCarvalhodeSouzaChaves.pdf: 2104640 bytes, checksum: 8d444129ca0c1b47390b577e4c879cea (MD5) / Made available in DSpace on 2012-05-14T14:38:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_LorenaCarvalhodeSouzaChaves.pdf: 2104640 bytes, checksum: 8d444129ca0c1b47390b577e4c879cea (MD5) / Febre amarela é uma doença infecciosa, endêmica nas florestas tropicais da África, Américas Central e do Sul. O agente etiológico da febre amarela é o vírus da febre amarela pertencente ao gênero Flavivirus, e espécie-tipo da família Flaviviridae. O genoma contêm 10.233 pares de bases (bp) , que codifica as proteínas estruturais (Capsídeo – C, Membrana – Pré M/M, Envelope – E) e não estruturais (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, NS5). NS1 é um gene essencial requerido para replicação eficiente do RNA viral. O diagnóstico mais utilizado para febre amarela é o teste MAC-ELISA para a detecção de IgM (pesquisa de anticorpos recentes). As reações cruzadas entre o vírus amaralíco e outros flavivirus são fatores que dificultam o diagnóstico sorológico, principalmente em áreas endêmicas de múltiplos flavivirus. Desta forma, nesse trabalho, a proteína NS1 do vírus da febre amarela foi expressa em sistemas procariótico (Escherichia coli) e eucariótico (células de inseto) com o objetivo de utilizá-la no diagnóstico precoce de infecção pelo vírus da febre amarela. Para expressão da proteína NS1 de YFV em sistema procariótico, foi utilizado o sistema de recombinação sítio específica Gateway® (Invitrogen). A proteína recombinante expressa em E. coli foi purificada e inoculada em camundongos para produção do anti-soro policlonal anti-NS1. Para expressão da proteína NS1 em sistema eucariótico, foi utilizada a técnica de transposição sítio específica Bac-to-Bac® (Invitrogen). O gene NS1 foi fusionado ao gene da poliedrina do baculovírus AcMNPV e introduzido no genoma viral. O vírus recombinante foi usado para infectar células de inseto e a proteína recombinante foi detectada por Western blot. Ambos os sistemas de expressão foram utilizados com sucesso e as proteínas recombinantes serão testadas como antígenos para o desenvolvimento de novos métodos de diagnóstico de infecção pelo vírus da febre amarela. Palavras chaves: NS1; Baculovírus; Febre Amarela; Poliedrina; AcMNPV. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Yellow Fever is an infectious disease, endemic in African, Central and South American tropical forests. The etiologic agent of the yellow fever is the Yellow Fever Virus belonging to the genus Flavivirus, and the type-species of the family Flaviviridae. The genome has 10.233 base pairs (bp), which encodes structural (Capsid – C, Membrane – Pre M/M, Envelope – E) and non-structural (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, NS5) proteins. NS1 is an essential gene required for an efficient RNA viral replication. The most used diagnosis test to confirm yellow fever is the MAC-ELISA for the detection of IgM (survey about recent antibodies). The cross-reactivities between the amarilic virus and other flaviviruses are factors that hinder the serological diagnosis, especially in endemic areas with multiple flaviviruses. Hence, in this work, the NS1 protein of the yellow fever virus was expressed in prokaryotic (Escherichia coli) as well as in eucariotic systems (insect cells) with the aim of using this protein in the early diagnosis of yellow fever virus infection. For the expression of the YFV NS1 protein in a prokaryotic system it was used the site-specific recombinant system Gateway® (Invitrogen). The recombinant protein expressed in E. coli was purified and inoculated in mice for the production of polyclonal anti-serum anti-NS1. For the expression of the NS1 in a eukaryotic system, the Bac-to-Bac® (Invitrogen) site-specific transposition was used. The NS1 gene was fused to the polyhedrin gene of the baculovirus AcMNPV and introduced into the viral genome. The recombinant virus was used to infect insect cells and the recombinant protein detected by Western blot. Both expression systems were used with success and the recombinant proteins will be tested as antigens for the development of new diagnostic methods for yellow fever virus infection.

A adrenoleucodistrofia ligada ao X (X-ALD) é a doença peroxissomal mais freqüente, com uma incidência de 1:20.000 homens na população geral, sendo identificada em todos os grupos étnicos. O gene envolvido na X-ALD é o gene ABCD1 (ATP-Binding Cassette transporter subfamily D member 1), que codifica uma proteína de membrana peroxissomal, ALDP. Mutações nesse gene são relacionadas ao acúmulo de ácidos graxos de cadeia muito longa (very long chain fatty acids – VLCFA) em todos os tecidos e fluidos corporais, especialmente no sistema nervoso e glândulas adrenais. Até o momento, mais de 1200 mutações já foram descritas neste gene. Três fenótipos principais são claramente identificados entre homens afetados: a forma cerebral (CALD), caracterizada por resposta inflamatória no SNC, a forma não inflamatória, AMN e a insuficiência adrenal isolada, também chamada de Addison-only. Não há correlação entre o tipo de mutação e o fenótipo clínico e uma possível explicação para essa alta variabilidade fenotípica poderia ser a ação de fatores ambientais e genes modificadores. Nesta tese está descrita, provavelmente, a primeira série de casos de pacientes sul-americanos com X-ALD. Foram avaliados aspectos moleculares da X-ALD em uma série de 38 famílias procedentes desde a Argentina até o Amazonas, relacionando-os com dados epidemiológicos e com a avaliação da taxa de sensibilidade e especificidade da análise de VLCFA em mulheres; e foi realizada a busca por potenciais genes modificadores que atuem, por CNV, na variabilidade fenotípica da X-ALD. Encontraram-se 36 mutações diferentes: apenas uma delas recorreu em 3 famílias. Doze destas mutações foram novas: a sua morbidade foi sustentada principalmente pelos graves rearranjos ou códons de parada prematuros por elas produzidos (p.Pro623Leu, p.Glu577X, p.Tyr33_Pro34fsX34, p.Arg538fs, p.Ala232fsX64, p.Trp137fsX57, p.Leu628Glu, p.Ile481Phe, p.Ala95fsX11, p.Gln55X, p.Arg401Gly e p.Ser358fsX42). Quatro situações (ou 10% da série) foram documentadas como mutações de novo. Como era de se esperar, não foi possível determinar nenhuma correlação entre genótipos e fenótipos. Uma das famílias foi identificada a partir de uma menina com CALD e desvio completo da inativação do X. Através da curva de Kaplan-Meyer, descrevemos a idade média de início das três formas principais nos homens: o início do Addison–only foi em média (IC de 95%) aos 7,4 (5,4-9,4) anos, da CALD, aos 10,9 (9,1-12,7) anos, e da AMN, aos 26,4 (20,3-32,5) anos. Descrevemos também a sobrevida média da CALD como de 24,7 (19,8-29,6) anos. Na presente série, 54 dos 87 afetados (ou 62%) apresentavam o fenótipo CALD, uma taxa maior do que a descrita na literatura (de 45 a 57%). Procuramos alguma evidência que vinculasse esse aparente excesso de formas desmielinizantes com a latitude de origem dos casos, à semelhança da esclerose múltipla: nossos resultados foram negativos. Em um subgrupo de famílias foi possível comparar o status genético final de 50 mulheres (heterozigotas versus normais) decorrente da investigação molecular, com os diagnósticos prévios levantados pela investigação bioquímica dos VLCFA. Encontramos uma elevada taxa de casos VLCFA falso-negativos, de 72,5%, muito maior do que a descrita na literatura (20%) e encontramos também dois casos de mulheres com VLCFA falso-positivos. Concluímos que o uso dos VLCFA deve ser evitado no aconselhamento genético. Finalmente, voltamos aos hemizigotos, em busca de genes candidatos a modificadores de fenótipos, através da associação dos mesmos com específicas variações no número de cópias (copy number variation - CNV) em 29 genes selecionados por seu papel na inflamação, metabolismo dos lipídios ou regeneração do sistema nervoso. A estratégia foi investigar CNVs destes genes através da técnica da Multiple Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) em um grupo de 85 pacientes espanhóis e brasileiros: 39 com AMN e 46 com CALD. Conseguimos identificar CNVs em nove destes genes. Interações potenciais entre estes genes foram inferidas a partir da ferramenta da web Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins (STRING) versão 9. A análise das redes criadas identificou três nódulos principais, com a POMC (Proopiomelanocortina) sendo a proteína central. Nós então sugerimos estes genes e a própria POMC como genes candidatos a modificadores do fenótipo X-ALD. / The X-ALD is the most frequent peroxisomal disease with a pan-ethnic incidence of 1:20,000 males in the general population. The gene involved in X-ALD is the ABCD1, which encodes a protein of the peroxisomal membrane, ALDP. Mutations in this gene are related to the accumulation of VLCFA in all tissues and body fluids, especially in the nervous system and adrenal glands. To date, more than 1200 mutations have been described in the gene. Three phenotypes are clearly identified among affected men: the cerebral form (CALD), characterized by inflammation in the CNS, the non-inflammatory form, adrenomyeloneuropathy (AMN), and Addison-only. There is no genotype-phenotype correlation, in spite of the high phenotypic variability observed in affected relatives. This thesis probably describes the first case series of South American patients with X-ALD. We have evaluated the molecular features of X-ALD, correlating them with epidemiological data in a series of 38 South American families. We have also evaluated the sensitivity and specificity of VLCFA in women, and have searched potential modifier genes that may act by CNV in the male phenotypic variability of X-ALD. We found 36 different mutations, only one recurring in three families. Twelve were new mutations: its morbidity was sustained mainly by major rearrangements or stop codons produced by them (p.Pro623Leu, p.Glu577X, p.Tyr33_Pro34fsX34, p.Arg538fs, p.Ala232fsX64, p.Trp137fsX57, p.Leu628Glu, p.Ile481Phe, p.Ala95fsX11, p.Gln55X, p.Arg401Gly and p.Ser358fsX42). Four (or 10% of the series) were documented as de novo mutations. As was expected, no genotype-phenotype correlation was found. One family was identified from a girl with CALD and complete deviation of X inactivation. By Kaplan-Meyer analysis, we have described the onset of the three main forms in men: the mean (95% CI) age at onset of Addison-only was 7.4 (5.4 - 9.4) years, of CALD, 10.9 (9.1 - 12.7) years, and of AMN, 26.4 (20.3 - 32.5) years. We have also estimated the survival of CALD as 24.7 (19.8 to 29.6) years. In this series, 54 of the 87 affected male (or 62%) had the phenotype CALD, a rate higher than that described in the literature (45-57%). We look for any evidence that relates the apparent excess of demyelinating forms with latitude of origin of cases, like multiple sclerosis: the results were negative. In a subgroup of families, the molecular analyses allowed us to compare the genetic status of 50 women (heterozygous versus normal) with the previous biochemical diagnoses raised up by VLCFA. A high rate of false negative VLCFA was disclosed, of 72.5%, significantly greater than the 20% described in literature. We have also found two false positives VLCFA results in females. We conclude that the use of VLCFA should be avoided in genetic counseling. Finally, we turned to hemizygotes, in search of candidate genes that could modify the X-ALD phenotype, chosen by for their role in inflammation, lipid metabolism or in the regeneration of the nervous system. The strategy was to investigate CNVs of these genes through the technique of Multiple Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) in a group of 85 Spanish and Brazilian patients: 39 with AMN and 46 with CALD. We have identified nine CNVs in these genes. Potential interactions between these genes were inferred from the tool Web Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes / Proteins (STRING) version 9. The analysis of network nodes identified three key created, with POMC (proopiomelanocortin) being the core protein. We then suggested they own and POMC genes as candidate genes modifying the phenotype of X-ALD.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília,Faculdade de Medicina Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2012. / Submitted by Tania Milca Carvalho Malheiros (tania@bce.unb.br) on 2014-11-06T17:27:37Z No. of bitstreams: 1 2014_FlaviaFurtadoMulinari_Parcial.pdf: 2398295 bytes, checksum: bbfc6bb5d0bbd87e49bd247ade99ee4e (MD5) / Approved for entry into archive by Tania Milca Carvalho Malheiros(tania@bce.unb.br) on 2014-11-06T17:30:14Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_FlaviaFurtadoMulinari_Parcial.pdf: 2398295 bytes, checksum: bbfc6bb5d0bbd87e49bd247ade99ee4e (MD5) / Made available in DSpace on 2014-11-06T17:30:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_FlaviaFurtadoMulinari_Parcial.pdf: 2398295 bytes, checksum: bbfc6bb5d0bbd87e49bd247ade99ee4e (MD5) / O Fator Estimulador de Colônias de Granulócitos (G-CSF) é um fator de crescimento hematopoiético cuja função é estimular a proliferação, diferenciação e ativação de células precursoras de neutrófilos da medula óssea. É caracterizado como uma proteína de massa molecular de 18,8 KDa, constituída de 175 resíduos de aminoácidos. A proteína é estabilizada por duas pontes dissulfeto intramoleculares nas posições Cys(36)- Cys(42) e Cys(64)-Cys(74) e apresenta um resíduo de Cisteína (Cys) livre na posição 17. O hrG-CSF (Filgrastima) foi aprovado em 1991 pelo FDA para tratamento de neutropenia induzida por quimioterapia. Atualmente tem sido utilizado para tratamento de neutropenia oriunda de outras doenças como AIDS e Leucemia, com o objetivo de diminuir infecções oportunistas. O primeiro biofármaco recombinante do G-CSF foi produzido em Escherichia coli em 1986 pela empresa AMGEN, e teve sua patente expirada em 2006, tornando-se alvo de produção de biossimilares pelas indústrias farmacêuticas. Visto que o Brasil é um importador deste biofármaco, o que leva a gastos elevados para o Sistema Único de Saúde, o objetivo do trabalho foi desenvolver uma tecnologia de produção, com custos reduzidos, em âmbito nacional. Para tanto, a região codificadora da proteína foi sintetizado utilizando-se códons preferenciais para E. coli e clonado em vetor de expressão pET28a+ por empresa especializada. Foram realizados testes de expressão utilizando-se a cepa BL21(DE3), onde a proteína foi expressa em corpos de inclusão e a melhor condição estabelecida foi utilizando-se o meio LB contendo Canamicina 30 μg.mL-1, a 37 °C com agitação de 200 rpm por 4 horas. Na tentativa de solubilizar os corpos de inclusão e purificar a proteína, alguns protocolos foram testados, e neste trabalho foi desenvolvido um método inovador para lavagem e solubilização com solvente específico. A proteína foi purificada utilizando-se também um processo inovador, em apenas uma etapa. A identidade da proteína foi confirmada por western-blot e espectrometria de massa, e sua atividade foi confirmada por ensaio biológico in vivo, com diferentes concentrações do hrG-CSF purificado utilizado o medicamento comercial como referência. Neste trabalho foi estabelecido um processo simples e de baixo custo para produção e purificação de G-CSF humano recombinante ativo em células de E. coli, de extrema importância para o desenvolvimento da metodologia adequada visando o escalonamento para e produção do biossimilar em escala industrial. ___________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The human recombinant Granulocyte Colony-Stimulating Factor (hrG-CSF) is a hematopoietic growth factor whose function is to stimulate the proliferation, differentiation and activation of neutrophil precursor cells from bone marrow. It is characterized as a 18.8 kDa molecular mass protein composed of 175 amino acid residues. The protein is stabilized by two intramolecular disulfide bonds at Cys (36) - Cys (42) and Cys (64)-Cys (74) positions, with free Cysteine residue (Cys) at position 17. The hrG-CSF (Filgrastim) was approved by the FDA in 1991 for neutropenia treatment induced by chemotherapy. Actually it has been used to treat neutropenia arising from other diseases such as AIDS and leukemia, with the aim of reducing opportunistic infections. The first recombinant G-CSF biopharmaceutical of was produced in Escherichia coli in 1986 by the AMGEN company, which patent was expired in 2006, starting the production of filgrastim biosimilars by pharmaceutical companies. Since Brazil is an importer of biopharmaceuticals, which leads to high spending for the National Health System, the study aimed to develop a production technology with reduced costs, nationally. Therefore, the protein coding region was synthesized using E. coli preferential codons and cloned into the expression vector pET28a by a specialized company. Expression tests were performed using BL21 (DE3) strain. The protein was produced as inclusion bodies. The best expression condition was established using LB medium containing 30 μg.mL-1 of Kanamycin at 37 °C, 200 rpm for 4 hours. Aiming to solubilize the inclusion bodies and purifying the protein, some protocols were tested, and a novel method for washing and solubilization of includion bodies with specific solvent was developed. The protein was purified also with an innovative process, on just one step. The protein identity was confirmed by Western blot and mass spectrometry, and its activity was confirmed by in vivo bioassay with different concentrations of purified recombinant HRG-CSF using commercial drug as reference. In this study, we established a simple and low cost process for production and purification of recombinant active G-CSF in E. coli cells, extremely important for the development of an appropriate methodology for production on industrial scale biosimilar drug.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2006. / Submitted by Diogo Trindade Fóis (diogo_fois@hotmail.com) on 2009-11-10T10:48:48Z No. of bitstreams: 6 Dulcyane Neiva Mendes_parte6.pdf: 2216961 bytes, checksum: d73b059744afaa9ab6ba4add16a9bea3 (MD5) Dulcyane Neiva Mendes_parte5.pdf: 8933066 bytes, checksum: 8fdc7f1b5afebc6b5b9e8ac64925df9a (MD5) Dulcyane Neiva Mendes_parte4.pdf: 9356524 bytes, checksum: dc2eb26962ce971ba570126ab82baf5b (MD5) Dulcyane Neiva Mendes_parte3.pdf: 3258196 bytes, checksum: 806ee54d9db41724cdede7f8c24a3b32 (MD5) Dulcyane Neiva Mendes_parte2.pdf: 346419 bytes, checksum: 40831fbebfcfe3bb3719d6ed192a1d6e (MD5) Dulcyane Neiva Mendes_parte1.pdf: 1453437 bytes, checksum: 986969a01d929c7b2f1053edf8aa230d (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2009-12-11T15:23:47Z (GMT) No. of bitstreams: 6 Dulcyane Neiva Mendes_parte6.pdf: 2216961 bytes, checksum: d73b059744afaa9ab6ba4add16a9bea3 (MD5) Dulcyane Neiva Mendes_parte5.pdf: 8933066 bytes, checksum: 8fdc7f1b5afebc6b5b9e8ac64925df9a (MD5) Dulcyane Neiva Mendes_parte4.pdf: 9356524 bytes, checksum: dc2eb26962ce971ba570126ab82baf5b (MD5) Dulcyane Neiva Mendes_parte3.pdf: 3258196 bytes, checksum: 806ee54d9db41724cdede7f8c24a3b32 (MD5) Dulcyane Neiva Mendes_parte2.pdf: 346419 bytes, checksum: 40831fbebfcfe3bb3719d6ed192a1d6e (MD5) Dulcyane Neiva Mendes_parte1.pdf: 1453437 bytes, checksum: 986969a01d929c7b2f1053edf8aa230d (MD5) / Made available in DSpace on 2009-12-11T15:23:47Z (GMT). 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A renina humana, uma proteína produzida principalmente pelos rins e responsável pelo controle da pressão sangüínea e do balanço salino, é a chave principal para o desencadeamento do sistema renina-angiotensina-aldosterona que culmina no aumento da pressão sangüínea. Neste trabalho é proposta a produção da renina, com base na construção de baculovírus recombinantes, visando o estudo mais aprofundado tanto de suas propriedades quanto de inibidores que possam ser empregados na indústria farmacêutica. Inicialmente dois baculovírus recombinantes contendo o gene da pré-pró-renina humana foram construídos. No sistema vSyn VI-gal o fragmento da pré-pró-renina (~1,4 Kb) foi inserido no vetor de expressão pSynXIV VI+X3 e por recombinação homóloga com DNA viral levou a formação de vírus recombinante ocluso positivo. No sistema Bac-to-Bac (Invitrogen) o fragmento da pré-pró-renina foi inserido em bacmídeo, por transposição, e levou a formação de vírus recombinante ocluso negativo. A presença do gene da pré-pró-renina nos vírus recombinantes foi confirmada após amplificação do gene por reação em cadeia da polimerase (PCR) com os primers específicos da pró-renina. Para identificação das proteínas virais produzidas durante a infecção foi feita cinética da síntese de proteínas por marcação radioativa (35S-metionina), em células de inseto High five e Sf21, em diferentes tempos pós-infecção (0, 24, 48 e 72 h). Na fase muito tardia da infecção foi observada a síntese de duas proteínas de cerca de 40 kDa e 47 kDa, que correspondem ao peso molecular esperado para a pró-renina e a renina, ou formas glicosiladas da mesma. Como esperado, a análise das proteínas por ensaio imunológico, utilizando anticorpo policlonal contra a renina, mostrou sinal de hibridização nas amostras das células infectadas com os vírus recombinantes contendo o gene da pré-pró-renina (Sf21 e High five). Embora nas células High five não infectadas (mock infected) não tenha havido marcação com o anticorpo, foi, entretanto, detectado sinal de hibridização não esperado em células Sf21 não infectadas (mock infected), o que deve ser devido à hibridização inespecífica. A análise ultraestrutural das células infectadas com vírus recombinante revelou que houve indução de efeitos citopáticos típicos por infecção com baculovírus. Entretanto, no vírus recombinante ocluso positivo parece não ter havido a correta inclusão dos vírions na matriz protéica resultando na formação de poliedros com pouco ou nenhum vírion em seu interior. Finalmente, larvas de Anticarsia gemmatalis e de Spodoptera frugiperda foram infectadas para investigar as alterações morfológicas causadas pelos vírus. Sinais claros de que houve mudanças na fisiologia larval foram observados quando, além dos sintomas da doença, a lagarta infectada apresentou mudança de coloração do tegumento para cor rosa. Essa coloração não é observada na lagarta infectada com o vírus selvagem AcMNPV. As alterações ultraestruturais apresentadas pelas células e as mudanças na coloração da cutícula das larvas infectadas mostram que está havendo diferença na expressão protéica entre o vírus selvagem e os vírus recombinantes. Os resultados obtidos até o momento indicam ter havido a expressão de uma proteína com peso molecular esperado para a renina e que estaria interferindo, de alguma forma, no processo de oclusão da partícula viral bem como na fisiologia do inseto. __________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Baculovirus are insect viruses being used as bioinsecticides for agricultural pest control as well as an important tool in Biotechnology as gene expression vector. The baculovirus expression system in insect cells gives an appropriate environment for eukaryotic proteins synthesis. The human renin is a protein produced mainly in the kidney and responsible for blood pressure and salt balance controls and is the principal key to the role of reninangiotensin- aldosteron system that culminates in the blood pressure rise. In this work the renin production is proposed, based on the construction of recombinant baculoviruses, aiming the studies development of the protein properties as well as the inhibitors that may be used in the pharmaceutical industry. Initially, two recombinant baculoviruses containing the preprorenin gene were constructed. In the vSyn VI-gal system the preprorenin fragment (~1.4 Kb) was inserted in the pSynXIV VI+X3 vector, homologous recombined with the viral DNA, leading to an occluded virus assembly. In the Bac-to-Bac system (Invitrogen) the preprorenin fragment was inserted in the bacmid, by transposition, leading to a negative occluded virus assembly. The presence of the preprorenin gene in the recombinant viruses was confirmed by its amplification by Polymerase Chain Reaction (PCR) technique with specific primers for prorenin. For identification of the viral proteins produced during infection, the kinetics of protein synthesis was done by radioactive labeling (35S-metionin), in High five and Sf21 insect cells, at different times post infection (0, 24, 48 and 72h). In the very late phase of infection the synthesis of two proteins about 40 kDa and 47 kDa was observed. These polypeptides correspond to the molecular weight expected for prorenin and renin, or any of their corresponding glycosilated forms. Protein analysis by immunological assay, using polyclonal antibodies against renin, showed a hybridization signal in infected cells samples with the recombinant viruses containing the preprorenin gene (Sf21 and High five). Although there was no hybridization signal in mock infected High five cells, there was an unexpected signal detected in mock infected Sf21 cells, which could be somehow due to unspecific labeling of the antibody. Ultrastructural analyses of infected cells showed that there was induction of typical cytophatic effects with baculovirus infection. However, with the occluded recombinant virus it seemed that there was no correct virion inclusion in the protein matrix resulting in polyhedra formation with few or none virions inside. Finally, Anticarsia gemmatalis and Spodoptera frugiperda larva were infected to further investigate the morphological alterations caused by the viruses. Clear signs of larval physiology change were observed when in addition to the common symptoms of the disease the infected larvae presented a tegument change to a pinkish color. This color is not observed in larvae infected with the wild type AcMNPV. The ultrastructural alterations in infected cells and the change in the color cuticle of infected larvae show that there is a protein expression difference between the wild type and the preprorenin recombinant viruses. The data obtained until now indicate that there is a protein being expressed with the expected molecular weight for renin and that it is somehow interfering with the occlusion process of the viral particle as well as with the insect physiology.