Made available in DSpace on 2016-04-15T12:56:13Z (GMT). No. of bitstreams: 2 andreza_lemos_ioc_mest_2015.pdf: 1714555 bytes, checksum: a683996b02f1dbaeeafe27e913348f54 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / O vírus da hepatite E (HEV) é responsável por infecções, em geral, agudas e autolimitantes. No entanto, quando se trata de pacientes imunossuprimidos, a infecção por este vírus pode levar a quadros crônicos e persistentes. Entre os pacientes imunossuprimidos, destacam-se os pacientes HIV positivos \2013 uma população consideravelmente grande, sobre a qual há poucos estudos relacionando a coinfecção HEV/HIV. A hepatite E pode ser causada pelos genótipos 1, 2, 3 e 4 em humanos. O genótipo 3 (HEV-GT3) deve ser destacado por ser tanto o único genótipo circulante relatado no Brasil quanto por ser o que acomete pacientes HIV positivos, levando à cronicidade da doença. Portanto, devido à carência de informações e dados sobre estes pacientes coinfectados e sobre o perfil da hepatite E no Brasil, principalmente devido às dificuldades no diagnóstico, o trabalho buscou aperfeiçoar a técnica de detecção de RT-qPCR e determinar a prevalência da coinfecção HEV/HIV em pacientes do Hospital Universitário Gaffre e Guinle, no Rio de Janeiro para melhor compreensão da coinfecção nesta população Para tanto, 280 amostras de soro sabidamente positivas para HIV foram coletadas entre os anos de 2012 e 2014, extraídas e testadas por RT-qPCR aperfeiçoado com curva sintética de dsDNA e, posteriormente, com curva sintética de ssRNA, para detecção da ORF3, e controle interno (IPC) para confirmação da coinfecção. As 10 amostras positivas na PCR em tempo real foram testadas em triplicata e por PCR convencional para sequenciamento das regiões das ORFs 1 e 2 e para detecção sorológica de anticorpos anti-HEV IgM e IgG. Porém nenhuma foi positiva para detecção por PCR convencional nem por sorologia, devido a baixa carga viral e ausência de anticorpos anti=HEV IgG e IgM. Nos pacientes em que foi detectado o HEV-RNA, foi observada uma taxa de CD4 e CD8 menores que 1038 e 1254, respectivamente, porém, ainda consideradas normais para indivíduos infectados pelo HIV. A PCR em tempo real foi útil para a detecção de coinfecção HEV/HIV em pacientes com baixa carga viral / The hepatitis E virus (HEV) is generally responsible for acute self - limiting infections. However, when it comes to immunocompromised patients the HEV infecti on may lead to chronic and persistent diseases. Among immunosuppressed patients, the HIV positive patients are highlighted – a considerably large population, on which there are few studies relating to H EV/HIV coinfection. Hepatitis E can be caused by genot ypes 1, 2, 3 and 4 in humans. The genotype 3 of HEV (HEV - G T 3) must be emphasized by being both the only reported circulating genotype in Brazil and the responsible for chronic disease in HIV positive patients. Therefore, due to lack of information and data on these co - infected patients and the profile of hepatitis E in Brazil, mainly due to difficulties in diagnosis of hepatitis E, the study aimed at the optimization of RT - qPCR detection technique and the determination of HEV/HIV co - infection prevalence on patients from the Gaffrée & Guinle Hospital, in Rio de Janeiro, for a better comprehension of this coinfection in this population in Rio de Janeiro city. For that, 280 known HIV positive serum samples were collected between 2012 and 2014, the nucleic acid was purified and tested by RT - qPCR technique which was optimized with a synthetic dsDNA standard curve and, later a synthetic ssRNA standard curve, for detection of HEV - RNA ORF3, and internal positive control (IPC) for the co - infection confirmation. The 10 HEV/HIV positive samples for RT - qPCR were tested in triplicate and for qualitative PCR for ORFs 1 and 2 regions detection and to antibodies anti - HEV IgM and IgG serological detection, but none was positive for either qualitative PCR or serological tests d ue to low viral titers in serum and lack of antibodies anti - HEV IgM and IgG . In patients which were positive for HEV - RNA detection, it was observed a CD4 and CD8 rates lower than 1038 and 1254, respectively , but still considered normal foi HIV positive peo ple . The real time PCR was useful for HEV/HIV coinfection detection in patients with low viral rates. / The hepatitis E virus (HEV) is generally responsible for acute self-limiting infections. However, when it comes to immunocompromised patients the HEV infection may lead to chronic and persistent diseases. Among immunosuppressed patients, the HIV positive patients are highlighted \2013 a considerably large population, on which there are few studies relating to HEV/HIV coinfection. Hepatitis E can be caused by genotypes 1, 2, 3 and 4 in humans. The genotype 3 of HEV (HEV-GT3) must be emphasized by being both the only reported circulating genotype in Brazil and the responsible for chronic disease in HIV positive patients. Therefore, due to lack of information and data on these co-infected patients and the profile of hepatitis E in Brazil, mainly due to difficulties in diagnosis of hepatitis E, the study aimed at the optimization of RT-qPCR detection technique and the determination of HEV/HIV co-infection prevalence on patients from the Gaffrée & Guinle Hospital, in Rio de Janeiro, for a better comprehension of this coinfection in this population in Rio de Janeiro city For that, 280 known HIV positive serum samples were collected between 2012 and 2014, the nucleic acid was purified and tested by RT-qPCR technique which was optimized with a synthetic dsDNA standard curve and, later a synthetic ssRNA standard curve, for detection of HEV-RNA ORF3, and internal positive control (IPC) for the co-infection confirmation. The 10 HEV/HIV positive samples for RT-qPCR were tested in triplicate and for qualitative PCR for ORFs 1 and 2 regions detection and to antibodies anti-HEV IgM and IgG serological detection, but none was positive for either qualitative PCR or serological tests due to low viral titers in serum and lack of antibodies anti-HEV IgM and IgG. In patients which were positive for HEV-RNA detection, it was observed a CD4 and CD8 rates lower than 1038 and 1254, respectively, but still considered normal foi HIV positive people. The real time PCR was useful for HEV/HIV coinfection detection in patients with low viral rates

O cão (Canis familiaris) é o principal reservatório de Leishmania (Leishmania) infantum. Sua alta competência em transmitir o parasito para o inseto vetor contribui para a manutenção do ciclo e aumento do risco para os humanos em áreas endêmicas. O amplo espectro de manifestações clínicas da leishmaniose visceral canina (LVC) torna seu diagnóstico bastante complexo, já que essas manifestações podem se sobrepor àquelas causadas por outros agentes infecciosos. Fator agravante é que a infecção, na maior parte das vezes, tem caráter subclínico, podendo passar despercebida. Diante disto, um diagnóstico confiável se faz necessário para confirmar uma suspeita clínica ou infecção inaparente. A reação em cadeia da polimerase (PCR) tem contribuído em muito para o aumento da sensibilidade do diagnóstico, e seu uso mostra que a prevalência da infecção canina por L. (L.) infantum em áreas endêmicas pode ser bem maior do que a apontada pela sorologia. É sabido que um dos fatores limitantes do emprego de uma técnica diagnóstica em larga escala refere-se à coleta do material clínico que, idealmente, deve ser simples, rápida e indolor. Assim, entende-se que a associação da PCR com amostras não invasivas, de fácil coleta, poderia representar uma contribuição importante para o diagnóstico da LVC. Dessa forma, a proposta do presente projeto foi investigar o valor do swab oral (SO) na detecção de L. (L.) infantum em cães oriundos de áreas onde ocorre transmissão do parasito, através do uso da PCR em tempo real, considerada a mais sensível dentre as técnicas moleculares. Para tanto, comparamos sua positividade com a encontrada em outra amostra não invasiva (swab conjuntival= SC), pouco invasiva (sangue periférico= SG) e invasiva (aspirado de linfonodo=LN) e com a sorologia, considerando grupos clínicos, carga parasitária, índice de concordância entre os resultados, e a combinação dos resultados das diferentes amostras e a sorologia com aqueles obtidos no SO. Noventa e dois cães com comprovada infecção participaram do estudo. Os animais foram classificados em sintomáticos (n=63) e assintomáticos (n=29), de acordo com o exame físico e provas laboratoriais. No presente estudo a positividade do SO (67,4%) foi equivalente a do SC (68,5 %), maior do que a encontrada no SG (52,2%), e menor quando comparada ao LN (84,8%). Considerando os grupos clínicos, o SO foi positivo em 81 % dos cães sintomáticos e em 37,9 % dos assintomáticos. A positividade encontrada no SC também foi maior no grupo sintomático em relação ao assintomático (82,5 % x 37,9 %), assim como no LN (93,7 % x 65,5 %), mas não no SG (62,1 % x 47,6 %) e na sorologia (77,8 % x 79,3 %). Salienta-se que o SO foi positivo em 35 % dos cães com sorologia negativa (n=20), o SC em 35%, o SG em 40 %, o LN em 70 %, e OS+CS em 60% deles. A concordância dos resultados do SO foi moderada em relação à conjuntiva (k= 0,3) e fraca em relação às demais amostras e a sorologia (0.2 < k < 0.3). A carga parasitária do SO, por sua vez, não se diferiu da conjuntival, ambas foram maiores do que a encontrada no SG, e o LN apresentou a maior carga, mostrando uma clara correlação da intensidade do parasitismo com os índices de positividade obtidos. O LN mostrou o maior parasitismo entre as amostras analisadas. A combinação dos resultados do SO e SC atingiram 84 % de positividade nos 92 cães estudados, 92,1 % no grupo sintomático e 65,5 % no assintomático. Em suma, o presente estudo mostrou a presença do DNA de L. (L.) infantum no swab oral de cães infectados através da PCR em tempo real, revelando seu potencial uso no diagnóstico da LVC em cães com suspeita clínica dada a sua alta positividade nos animais com sintomatologia, equivalente à encontrada na amostra invasiva, o aspirado de linfonodo. Em oposição, encontrou-se baixa positividade nos cães assintomáticos, mas seu uso combinado com outra amostra não invasiva, a conjuntiva, atingiu patamares satisfatórios. O fato do SO ter sido positivo em parte dos animais soronegativos aponta vantagem adicional do seu uso na investigação de infecção por L. (L.) infantum em inquéritos epidemiológicos ou mesmo na rotina clínica. Por fim, os nossos resultados mostraram que a combinação de testes e amostras é necessária para a identificação de cães infectados por L. (L.) infantum, e que a PCR com o swab oral, especialmente associado ao swab conjuntival, pode contribuir de forma significativa para o diagnóstico da infecção canina, seja ela sintomática ou assintomática / Dog (Canis familiaris) is the major reservoir of Leishmania (L.) infantum. Its high competence for transmitting the parasite to the vector contributes to the maintenance of the cycle and for increasing risk to humans in endemic areas. The wide spectrum of clinical manifestations of canine visceral leishmaniasis (CVL) makes the diagnosis quite complex, since the symptoms can overlap those caused by other infectious agents. Of note, the infection is mostly subclinical, making the diagnosis even more difficult. Therefore, an accurate diagnosis is necessary to confirm a clinical suspicion or the silent infection. The polymerase chain reaction (PCR) has greatly contributed for increasing the diagnostic sensitivity, and its use shows that L. (L.) infantum canine infection in endemic areas may be much higher than that pointed by serology. It is known that one limiting factor of using a diagnostic method in large scale refers to the collection of clinical samples which should be ideally simple, quick, and painless. Thus, it is understood that the association of PCR with non-invasive samples could represent an important contribution to the diagnosis of CVL. Therefore, the purpose of this study was to investigate the value of the oral swab (OS) in detecting L. (L.) infantum in dogs from areas of parasite transmission through the use of real-time PCR that is considered the most sensitive among the molecular techniques. To this end, we compared the OS positivity with that found in other non-invasive (conjunctival swab = CS), minimally invasive (blood = BL) and invasive (lymph node aspirate = LN) samples and serology, considering clinical groups, parasite load, agreement among results, and the combination of results from different samples and serology with those obtained with OS. Ninety-two dogs with proven infection were selected for this present study. The animals were divided into symptomatic (n = 63) and asymptomatic (n = 29) dogs, according to the physical examination and laboratory tests. Here, the positivity in OS (67.4%) was equivalent to the CS (68.5%), higher than that found in BL (52.2%), and lower when compared to LN (84.8%). Regarding clinical groups, OS was positive in 81% of the symptomatic dogs and in 37.9% of asymptomatic ones. The positivity in CS was also higher in the symptomatic compared to the asymptomatic group (82.5% x 37.9%) and in LN (93.7% x 65.5%), but not in BL (62.1% x 47.6%) and serology (77.8% x 79.3%). Noteworthy, the OS was positive in 35% of dogs with negative serology (n = 20), CS in 35%, BL in 40% and LN in 70%. Moderate agreement was found between OS results and CS results (k = 0.3) and weak in comparison to other samples and serology (0.2 < k < 0.3). The parasite load was equivalent between OS and CS, both were higher than that found in BL, and LN presented the highest burden, showing that parasitism intensity and the positivity rates are correlated. The combination of OS and CS results reached 84% positivity in 92 dogs studied, 92.1% for symptomatic dogs and 65.5% for asymptomatic ones. In summary, the present study showed the presence of L. (L.) infantum DNA in oral swab of infected dogs by real-time PCR, revealing its potential use for diagnosing CVL in animals with clinical suspicion due to its high positivity in dogs with symptoms, equivalent to that found in invasive sample, the lymph node aspirate. In contrast, low positivity was found in asymptomatic dogs, but the combined use with other non-invasive sample, the conjunctiva, reached satisfactory levels. OS positivity found in part of the seronegative animals points additional advantage of using OS in the investigation of L. (L.) infantum infection in epidemiological surveys or in clinical practice. Finally, our findings pointed that combination of tests and samples is required for identifying dogs infected with L. (L.) infantum, and that the PCR with oral swab, especially associated with the conjunctival swab, can contribute for diagnosing both asymptomatic and symptomatic dogs

Introdução: O gênero Acinetobacter sp apresenta considerável heterogeneidade possuindo inúmeras espécies. Atualmente, 23 espécies já foram nomeadas e nove outras espécies já foram descritas. Quatro destas espécies possuem contextos clínicos e epidemiológicos diferentes, no entanto são agrupadas em um complexo denominado Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumannii (ABC) devido à sua similaridade genética e fenotípica. Diversos testes para diferenciação do complexo já foram descritos, porém a maioria não pode ser realizado na rotina laboratorial, pois são caros e laboriosos. Objetivos: Avaliar um método rápido e viável na rotina laboratorial, capaz de diferenciar as espécies do complexo ABC; Determinar a prevalência das diferentes espécies do complexo ABC; Avaliar o perfil de suscetibilidade aos antimicrobianos nas diferentes espécies. Métodos: Foram analisadas 118 amostras de dois hospitais de Porto Alegre-RS através do método Multiplex PCR para o gene gyrB e posteriormente confirmadas pelo padrão-ouro: sequenciamento do 16S-23S ITS. O perfil de suscetibilidade foi realizado através de microdiluição em caldo. Resultados: Das 118 amostras identificadas inicialmente como Acinetobacter sp., a grande maioria dos isolados (106 -89.9%) foram identificados como A. baumannii; mas doze isolados foram identificados como sendo das demais espécies do complexo ABC: 6 (5.1%) A. nosocomialis, 5 (4.2%) A. pittii, e 1 (0.8%) A. genoespécie 10, através da técnica de Multiplex PCR. Todos os resultados foram confirmados por sequenciamento. A. baumannii apresentou um elevado nível (72,6%) de resistência ao imipenem em comparação com as outras espécies seguido da espécie A. nosocomialis que apresentou metade de seus isolados resistentes. Todas as espécies apresentaram baixos índices (inferior a 7,5%) de resistência à Polimixina B e Tigeciclina. Conclusão: O Multiplex PCR para o gene gyrB apresentou resultados fidedignos quando comparados ao padrão-ouro, demonstrando, assim, ser um método confiável para a identificação das espécies do complexo ABC. Outras espécies, além de A. baumannii, ABC podem apresentar percentuais significativos de resistência ao imipenem. / Background: Introduction: The genus Acinetobacter sp presents considerable heterogeneity possessing numerous species. Currently, 23 species have been named and nine other species have been described. Four of these species have different clinical and epidemiological contexts, but are grouped in a complex called Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumannii (ABC) due to their genetic and phenotypic similarity. Several tests for differentiation of the complex have been described, but most can not be performed routinely in the laboratory, they are expensive and laborious. Objectives: To evaluate a fast and feasible in routine laboratory able to differentiate the species of the complex ABC; determine the prevalence of different species of the complex ABC; evaluate the antimicrobial susceptibility profile of the different species. Methods: We analyzed 118 samples from two hospitals in Porto Alegre-RS by the method of Multiplex PCR for gene gyrB and subsequently confirmed by the gold standard: sequencing the 16S-23S ITS. The susceptibility profile was performed by microdilution. Results: Of the 118 samples initially identified as Acinetobacter sp. The great majority of isolates (106 -89.9%) were identified as A. baumannii, but twelve isolates were identified as being from other species of the complex ABC: 6 (5.1%) A. nosocomialis, 5 (4.2%) A. pittii, and 1 (0.8%) A. genospécie 10 by Multiplex PCR technique. All results were confirmed by sequencing. A. baumannii showed a high level (72.6%) of imipenem resistance in comparison with the other species followed by the species A. nosocomialis showed that half of his resistant isolates. All species showed low levels (less than 7.5%) of resistance to Polymyxin B and Tigecycline. Conclusion: Multiplex PCR for gene gyrB results presented totally reliable when compared to the gold standard, demonstrating thus be a safe method for the laboratory. Other species besides A. baumannii, ABC may have significant percentages of resistance to imipenem.

Introdução: O gênero Acinetobacter sp apresenta considerável heterogeneidade possuindo inúmeras espécies. Atualmente, 23 espécies já foram nomeadas e nove outras espécies já foram descritas. Quatro destas espécies possuem contextos clínicos e epidemiológicos diferentes, no entanto são agrupadas em um complexo denominado Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumannii (ABC) devido à sua similaridade genética e fenotípica. Diversos testes para diferenciação do complexo já foram descritos, porém a maioria não pode ser realizado na rotina laboratorial, pois são caros e laboriosos. Objetivos: Avaliar um método rápido e viável na rotina laboratorial, capaz de diferenciar as espécies do complexo ABC; Determinar a prevalência das diferentes espécies do complexo ABC; Avaliar o perfil de suscetibilidade aos antimicrobianos nas diferentes espécies. Métodos: Foram analisadas 118 amostras de dois hospitais de Porto Alegre-RS através do método Multiplex PCR para o gene gyrB e posteriormente confirmadas pelo padrão-ouro: sequenciamento do 16S-23S ITS. O perfil de suscetibilidade foi realizado através de microdiluição em caldo. Resultados: Das 118 amostras identificadas inicialmente como Acinetobacter sp., a grande maioria dos isolados (106 -89.9%) foram identificados como A. baumannii; mas doze isolados foram identificados como sendo das demais espécies do complexo ABC: 6 (5.1%) A. nosocomialis, 5 (4.2%) A. pittii, e 1 (0.8%) A. genoespécie 10, através da técnica de Multiplex PCR. Todos os resultados foram confirmados por sequenciamento. A. baumannii apresentou um elevado nível (72,6%) de resistência ao imipenem em comparação com as outras espécies seguido da espécie A. nosocomialis que apresentou metade de seus isolados resistentes. Todas as espécies apresentaram baixos índices (inferior a 7,5%) de resistência à Polimixina B e Tigeciclina. Conclusão: O Multiplex PCR para o gene gyrB apresentou resultados fidedignos quando comparados ao padrão-ouro, demonstrando, assim, ser um método confiável para a identificação das espécies do complexo ABC. Outras espécies, além de A. baumannii, ABC podem apresentar percentuais significativos de resistência ao imipenem. / Background: Introduction: The genus Acinetobacter sp presents considerable heterogeneity possessing numerous species. Currently, 23 species have been named and nine other species have been described. Four of these species have different clinical and epidemiological contexts, but are grouped in a complex called Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumannii (ABC) due to their genetic and phenotypic similarity. Several tests for differentiation of the complex have been described, but most can not be performed routinely in the laboratory, they are expensive and laborious. Objectives: To evaluate a fast and feasible in routine laboratory able to differentiate the species of the complex ABC; determine the prevalence of different species of the complex ABC; evaluate the antimicrobial susceptibility profile of the different species. Methods: We analyzed 118 samples from two hospitals in Porto Alegre-RS by the method of Multiplex PCR for gene gyrB and subsequently confirmed by the gold standard: sequencing the 16S-23S ITS. The susceptibility profile was performed by microdilution. Results: Of the 118 samples initially identified as Acinetobacter sp. The great majority of isolates (106 -89.9%) were identified as A. baumannii, but twelve isolates were identified as being from other species of the complex ABC: 6 (5.1%) A. nosocomialis, 5 (4.2%) A. pittii, and 1 (0.8%) A. genospécie 10 by Multiplex PCR technique. All results were confirmed by sequencing. A. baumannii showed a high level (72.6%) of imipenem resistance in comparison with the other species followed by the species A. nosocomialis showed that half of his resistant isolates. All species showed low levels (less than 7.5%) of resistance to Polymyxin B and Tigecycline. Conclusion: Multiplex PCR for gene gyrB results presented totally reliable when compared to the gold standard, demonstrating thus be a safe method for the laboratory. Other species besides A. baumannii, ABC may have significant percentages of resistance to imipenem.

Introdução: O gênero Acinetobacter sp apresenta considerável heterogeneidade possuindo inúmeras espécies. Atualmente, 23 espécies já foram nomeadas e nove outras espécies já foram descritas. Quatro destas espécies possuem contextos clínicos e epidemiológicos diferentes, no entanto são agrupadas em um complexo denominado Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumannii (ABC) devido à sua similaridade genética e fenotípica. Diversos testes para diferenciação do complexo já foram descritos, porém a maioria não pode ser realizado na rotina laboratorial, pois são caros e laboriosos. Objetivos: Avaliar um método rápido e viável na rotina laboratorial, capaz de diferenciar as espécies do complexo ABC; Determinar a prevalência das diferentes espécies do complexo ABC; Avaliar o perfil de suscetibilidade aos antimicrobianos nas diferentes espécies. Métodos: Foram analisadas 118 amostras de dois hospitais de Porto Alegre-RS através do método Multiplex PCR para o gene gyrB e posteriormente confirmadas pelo padrão-ouro: sequenciamento do 16S-23S ITS. O perfil de suscetibilidade foi realizado através de microdiluição em caldo. Resultados: Das 118 amostras identificadas inicialmente como Acinetobacter sp., a grande maioria dos isolados (106 -89.9%) foram identificados como A. baumannii; mas doze isolados foram identificados como sendo das demais espécies do complexo ABC: 6 (5.1%) A. nosocomialis, 5 (4.2%) A. pittii, e 1 (0.8%) A. genoespécie 10, através da técnica de Multiplex PCR. Todos os resultados foram confirmados por sequenciamento. A. baumannii apresentou um elevado nível (72,6%) de resistência ao imipenem em comparação com as outras espécies seguido da espécie A. nosocomialis que apresentou metade de seus isolados resistentes. Todas as espécies apresentaram baixos índices (inferior a 7,5%) de resistência à Polimixina B e Tigeciclina. Conclusão: O Multiplex PCR para o gene gyrB apresentou resultados fidedignos quando comparados ao padrão-ouro, demonstrando, assim, ser um método confiável para a identificação das espécies do complexo ABC. Outras espécies, além de A. baumannii, ABC podem apresentar percentuais significativos de resistência ao imipenem. / Background: Introduction: The genus Acinetobacter sp presents considerable heterogeneity possessing numerous species. Currently, 23 species have been named and nine other species have been described. Four of these species have different clinical and epidemiological contexts, but are grouped in a complex called Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumannii (ABC) due to their genetic and phenotypic similarity. Several tests for differentiation of the complex have been described, but most can not be performed routinely in the laboratory, they are expensive and laborious. Objectives: To evaluate a fast and feasible in routine laboratory able to differentiate the species of the complex ABC; determine the prevalence of different species of the complex ABC; evaluate the antimicrobial susceptibility profile of the different species. Methods: We analyzed 118 samples from two hospitals in Porto Alegre-RS by the method of Multiplex PCR for gene gyrB and subsequently confirmed by the gold standard: sequencing the 16S-23S ITS. The susceptibility profile was performed by microdilution. Results: Of the 118 samples initially identified as Acinetobacter sp. The great majority of isolates (106 -89.9%) were identified as A. baumannii, but twelve isolates were identified as being from other species of the complex ABC: 6 (5.1%) A. nosocomialis, 5 (4.2%) A. pittii, and 1 (0.8%) A. genospécie 10 by Multiplex PCR technique. All results were confirmed by sequencing. A. baumannii showed a high level (72.6%) of imipenem resistance in comparison with the other species followed by the species A. nosocomialis showed that half of his resistant isolates. All species showed low levels (less than 7.5%) of resistance to Polymyxin B and Tigecycline. Conclusion: Multiplex PCR for gene gyrB results presented totally reliable when compared to the gold standard, demonstrating thus be a safe method for the laboratory. Other species besides A. baumannii, ABC may have significant percentages of resistance to imipenem.

O cão (Canis familiaris) é o principal reservatório de Leishmania (Leishmania) infantum. Sua alta competência em transmitir o parasito para o inseto vetor contribui para a manutenção do ciclo e aumento do risco para os humanos em áreas endêmicas. O amplo espectro de manifestações clínicas da leishmaniose visceral canina (LVC) torna seu diagnóstico bastante complexo, já que essas manifestações podem se sobrepor àquelas causadas por outros agentes infecciosos. Fator agravante é que a infecção, na maior parte das vezes, tem caráter subclínico, podendo passar despercebida. Diante disto, um diagnóstico confiável se faz necessário para confirmar uma suspeita clínica ou infecção inaparente. A reação em cadeia da polimerase (PCR) tem contribuído em muito para o aumento da sensibilidade do diagnóstico, e seu uso mostra que a prevalência da infecção canina por L. (L.) infantum em áreas endêmicas pode ser bem maior do que a apontada pela sorologia. É sabido que um dos fatores limitantes do emprego de uma técnica diagnóstica em larga escala refere-se à coleta do material clínico que, idealmente, deve ser simples, rápida e indolor. Assim, entende-se que a associação da PCR com amostras não invasivas, de fácil coleta, poderia representar uma contribuição importante para o diagnóstico da LVC. Dessa forma, a proposta do presente projeto foi investigar o valor do swab oral (SO) na detecção de L. (L.) infantum em cães oriundos de áreas onde ocorre transmissão do parasito, através do uso da PCR em tempo real, considerada a mais sensível dentre as técnicas moleculares. Para tanto, comparamos sua positividade com a encontrada em outra amostra não invasiva (swab conjuntival= SC), pouco invasiva (sangue periférico= SG) e invasiva (aspirado de linfonodo=LN) e com a sorologia, considerando grupos clínicos, carga parasitária, índice de concordância entre os resultados, e a combinação dos resultados das diferentes amostras e a sorologia com aqueles obtidos no SO. Noventa e dois cães com comprovada infecção participaram do estudo. Os animais foram classificados em sintomáticos (n=63) e assintomáticos (n=29), de acordo com o exame físico e provas laboratoriais. No presente estudo a positividade do SO (67,4%) foi equivalente a do SC (68,5 %), maior do que a encontrada no SG (52,2%), e menor quando comparada ao LN (84,8%). Considerando os grupos clínicos, o SO foi positivo em 81 % dos cães sintomáticos e em 37,9 % dos assintomáticos. A positividade encontrada no SC também foi maior no grupo sintomático em relação ao assintomático (82,5 % x 37,9 %), assim como no LN (93,7 % x 65,5 %), mas não no SG (62,1 % x 47,6 %) e na sorologia (77,8 % x 79,3 %). Salienta-se que o SO foi positivo em 35 % dos cães com sorologia negativa (n=20), o SC em 35%, o SG em 40 %, o LN em 70 %, e OS+CS em 60% deles. A concordância dos resultados do SO foi moderada em relação à conjuntiva (k= 0,3) e fraca em relação às demais amostras e a sorologia (0.2 < k < 0.3). A carga parasitária do SO, por sua vez, não se diferiu da conjuntival, ambas foram maiores do que a encontrada no SG, e o LN apresentou a maior carga, mostrando uma clara correlação da intensidade do parasitismo com os índices de positividade obtidos. O LN mostrou o maior parasitismo entre as amostras analisadas. A combinação dos resultados do SO e SC atingiram 84 % de positividade nos 92 cães estudados, 92,1 % no grupo sintomático e 65,5 % no assintomático. Em suma, o presente estudo mostrou a presença do DNA de L. (L.) infantum no swab oral de cães infectados através da PCR em tempo real, revelando seu potencial uso no diagnóstico da LVC em cães com suspeita clínica dada a sua alta positividade nos animais com sintomatologia, equivalente à encontrada na amostra invasiva, o aspirado de linfonodo. Em oposição, encontrou-se baixa positividade nos cães assintomáticos, mas seu uso combinado com outra amostra não invasiva, a conjuntiva, atingiu patamares satisfatórios. O fato do SO ter sido positivo em parte dos animais soronegativos aponta vantagem adicional do seu uso na investigação de infecção por L. (L.) infantum em inquéritos epidemiológicos ou mesmo na rotina clínica. Por fim, os nossos resultados mostraram que a combinação de testes e amostras é necessária para a identificação de cães infectados por L. (L.) infantum, e que a PCR com o swab oral, especialmente associado ao swab conjuntival, pode contribuir de forma significativa para o diagnóstico da infecção canina, seja ela sintomática ou assintomática / Dog (Canis familiaris) is the major reservoir of Leishmania (L.) infantum. Its high competence for transmitting the parasite to the vector contributes to the maintenance of the cycle and for increasing risk to humans in endemic areas. The wide spectrum of clinical manifestations of canine visceral leishmaniasis (CVL) makes the diagnosis quite complex, since the symptoms can overlap those caused by other infectious agents. Of note, the infection is mostly subclinical, making the diagnosis even more difficult. Therefore, an accurate diagnosis is necessary to confirm a clinical suspicion or the silent infection. The polymerase chain reaction (PCR) has greatly contributed for increasing the diagnostic sensitivity, and its use shows that L. (L.) infantum canine infection in endemic areas may be much higher than that pointed by serology. It is known that one limiting factor of using a diagnostic method in large scale refers to the collection of clinical samples which should be ideally simple, quick, and painless. Thus, it is understood that the association of PCR with non-invasive samples could represent an important contribution to the diagnosis of CVL. Therefore, the purpose of this study was to investigate the value of the oral swab (OS) in detecting L. (L.) infantum in dogs from areas of parasite transmission through the use of real-time PCR that is considered the most sensitive among the molecular techniques. To this end, we compared the OS positivity with that found in other non-invasive (conjunctival swab = CS), minimally invasive (blood = BL) and invasive (lymph node aspirate = LN) samples and serology, considering clinical groups, parasite load, agreement among results, and the combination of results from different samples and serology with those obtained with OS. Ninety-two dogs with proven infection were selected for this present study. The animals were divided into symptomatic (n = 63) and asymptomatic (n = 29) dogs, according to the physical examination and laboratory tests. Here, the positivity in OS (67.4%) was equivalent to the CS (68.5%), higher than that found in BL (52.2%), and lower when compared to LN (84.8%). Regarding clinical groups, OS was positive in 81% of the symptomatic dogs and in 37.9% of asymptomatic ones. The positivity in CS was also higher in the symptomatic compared to the asymptomatic group (82.5% x 37.9%) and in LN (93.7% x 65.5%), but not in BL (62.1% x 47.6%) and serology (77.8% x 79.3%). Noteworthy, the OS was positive in 35% of dogs with negative serology (n = 20), CS in 35%, BL in 40% and LN in 70%. Moderate agreement was found between OS results and CS results (k = 0.3) and weak in comparison to other samples and serology (0.2 < k < 0.3). The parasite load was equivalent between OS and CS, both were higher than that found in BL, and LN presented the highest burden, showing that parasitism intensity and the positivity rates are correlated. The combination of OS and CS results reached 84% positivity in 92 dogs studied, 92.1% for symptomatic dogs and 65.5% for asymptomatic ones. In summary, the present study showed the presence of L. (L.) infantum DNA in oral swab of infected dogs by real-time PCR, revealing its potential use for diagnosing CVL in animals with clinical suspicion due to its high positivity in dogs with symptoms, equivalent to that found in invasive sample, the lymph node aspirate. In contrast, low positivity was found in asymptomatic dogs, but the combined use with other non-invasive sample, the conjunctiva, reached satisfactory levels. OS positivity found in part of the seronegative animals points additional advantage of using OS in the investigation of L. (L.) infantum infection in epidemiological surveys or in clinical practice. Finally, our findings pointed that combination of tests and samples is required for identifying dogs infected with L. (L.) infantum, and that the PCR with oral swab, especially associated with the conjunctival swab, can contribute for diagnosing both asymptomatic and symptomatic dogs

Introdução: As malformações congênitas (MCs) são a segunda causa de mortes fetais e infantis no Brasil e, em grande parte dos casos, a sua etiologia não é bem definida. Devido às consequências clínicas das MCs, alguns pacientes falecem sem tempo hábil para uma investigação etiológica acurada. Dessa forma, a maioria dos casos permanece sem uma confirmação molecular das suspeitas clínicas, dificultando o aconselhamento genético para as famílias. Objetivos: O presente trabalho utilizou técnicas citogenômicas para caracterizar molecularmente a presença de anormalidades no DNA, desde aneuploidias até a variação do número de cópias gênicas (CNVs) em diferentes tecidos de pacientes falecidos portadores de MC encaminhados ao Serviço de Verificação de Óbitos para avaliação anatomopatológica. Casuística e Métodos: Foram avaliadas amostras de 30 pacientes portadores de MC submetidos à necropsia. O DNA foi extraido de diferentes tecidos (cérebro, coração, fígado, pele e diafragma) previamente conservados em RNA later, formol ou emblocados em parafina. Foram utilizadas as técnicas de Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) com os kits P095, P064 e P070 (MRC-Holland®), Marcadores Microssatélites (MMS) com o kit MiniFiler (Life Technologies®), a Fluorescence in Situ Hybridization (FISH), a técnica de array (Infinium® CytoSNP-850K BeadChip - Illumina) e o Sequenciamento Bidirecional por Sanger. A interpretação dos resultados foi realizada utilizando os softwares GeneMarker, Coffalyser, BlueFuse Multi, Sequencher e com os bancos de dados Database of Genomic Variants (DGV - http://projects.tcag.ca/variation/), Database of Chromosomal Imbalance and Phenotype in Humans Using Ensembl Resources (DECIPHER - http://decipher.sanger.ac.uk/), UCSC Genome Bioinformatics (http://genome.ucsc.edu) e Mutation Taster. Resultados: Dos 30 pacientes avaliados, 13 apresentaram alterações patogênicas. Entre eles, oito apresentaram aneuploidias envolvendo os cromossomos 13, 18, 21, X e Y, sendo dois deles com mosaicismo intratecidual. Quatro pacientes apresentaram microdeleções ou microduplicações envolvendo diferentes genes, sendo um paciente com duplicação do gene TYMS em 18p11.32; um com deleção do gene CHL1 em 3p26.3; um com deleção para o gene HIC1 em 17p13.3 e um paciente com deleção do gene TOM1L2 em 17p11.2; um paciente apresentou mutação de base única, patogênica, g.8535C > G (c.746C > G) no éxon 7 do gene FGFR3 compatível com Displasia Tanatofórica tipo I. Por fim, dois pacientes com doenças do desenvolvimento sexual apresentaram resultados dos testes citogenômicos normais. Discussão: Sugere-se que todas as alterações encontradas estão relacionadas ao fenótipo clínico ou participam na via de sinalização de genes correlatos. As técnicas de MLPA e MMS mostraram viabilidade e eficiência para a detecção de alterações genômicas em tecidos de pacientes falecidos, contudo são dependentes da integridade e quantidade do DNA obtido. Conclusão: O estudo citogenômico post-mortem é importante para a elucidação diagnóstica de casos sem etiologia definida, para o aconselhamento genético familiar, para a caracterização de mosaicismo inter e intratecidual e para a compreensão da patogênese das MCs / Introduction: Congenital malformations (CMs) are the second leading cause of fetal and infant deaths in Brazil and in most cases the etiology is not well defined. Also, the patients remain without a conclusive diagnostic making difficult the genetic counseling. Objectives: This study applied cytogenomics techniques in order to characterize the presence of DNA abnormalities, as well as, aneuploidies and genomic copy number variations (CNVs) in different tissues from deceased patients with CM from \"Serviço de Verificação de Óbitos\". Patients and Methods: We evaluated samples from 30 patients undergoing necropsy. The DNA was extracted from different tissues (brain, heart, liver, skin and diaphragm) stored in RNA later, formaldehyde and embedded in paraffin. We performed Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) with P095 kits, P064 and P070 (MRC-Holland®), microsatellite markers (MMS) with MiniFiler kit (Life Technologies), Fluorescence In Situ Hybridization (FISH), array technique (Infinium® CytoSNP-850K BeadChip - Illumina) and bidirectional sequencing by Sanger. The results was analyzed using different softwares: GeneMarker, Coffalyser, BlueFuse Multi Sequencher and databases Database of Genomic Variants (DGV - http://projects.tcag.ca/variation/) Database of Chromosomal Imbalance and Phenotype in Humans Using Ensembl Resources (Decipher - http://decipher.sanger.ac.uk/), UCSC Genome Bioinformatics (http://genome.ucsc.edu) and Mutation Taster. Results: The results showed 13 patients with pathogenic CNVs, and among them, eight presented aneuploidies involving chromosomes 13, 18, 21, X and Y. Two of them presented intra-tissue mosaicism. Also four patients showed several different microdeletions or microduplications: duplication of TYMS gene (18p11.32); deletion of CHL1 gene (3p26.3); deletion of HIC1 gene (17p13.3); deletion of TOM1L2 gene (17p11.2 ). One patient showed a pathogenic missense mutation of g.8535C>G (c.746C > G) in exon 7 from FGFR3 gene compatible with Thanatophoric Dysplasia type I. And two patients presented sexual development disorders and normal molecular results. Discussion: We conclude that the genomic abnormalities found in different tissues are pathogenic and associated to clinic manifestations in all patients studied. Besides, the cytogenomic techniques applied were efficient to help in the conclusive diagnostic; however, there are dependent of integrity and quality of DNA. Conclusion: Indeed the post-mortem cytogenomic study is crucial to genetic counseling, to characterize the presence of intra-tissue mosaicism and also to better understand the pathogenesis of congenital malformations

Introdução: As malformações congênitas (MCs) são a segunda causa de mortes fetais e infantis no Brasil e, em grande parte dos casos, a sua etiologia não é bem definida. Devido às consequências clínicas das MCs, alguns pacientes falecem sem tempo hábil para uma investigação etiológica acurada. Dessa forma, a maioria dos casos permanece sem uma confirmação molecular das suspeitas clínicas, dificultando o aconselhamento genético para as famílias. Objetivos: O presente trabalho utilizou técnicas citogenômicas para caracterizar molecularmente a presença de anormalidades no DNA, desde aneuploidias até a variação do número de cópias gênicas (CNVs) em diferentes tecidos de pacientes falecidos portadores de MC encaminhados ao Serviço de Verificação de Óbitos para avaliação anatomopatológica. Casuística e Métodos: Foram avaliadas amostras de 30 pacientes portadores de MC submetidos à necropsia. O DNA foi extraido de diferentes tecidos (cérebro, coração, fígado, pele e diafragma) previamente conservados em RNA later, formol ou emblocados em parafina. Foram utilizadas as técnicas de Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) com os kits P095, P064 e P070 (MRC-Holland®), Marcadores Microssatélites (MMS) com o kit MiniFiler (Life Technologies®), a Fluorescence in Situ Hybridization (FISH), a técnica de array (Infinium® CytoSNP-850K BeadChip - Illumina) e o Sequenciamento Bidirecional por Sanger. A interpretação dos resultados foi realizada utilizando os softwares GeneMarker, Coffalyser, BlueFuse Multi, Sequencher e com os bancos de dados Database of Genomic Variants (DGV - http://projects.tcag.ca/variation/), Database of Chromosomal Imbalance and Phenotype in Humans Using Ensembl Resources (DECIPHER - http://decipher.sanger.ac.uk/), UCSC Genome Bioinformatics (http://genome.ucsc.edu) e Mutation Taster. Resultados: Dos 30 pacientes avaliados, 13 apresentaram alterações patogênicas. Entre eles, oito apresentaram aneuploidias envolvendo os cromossomos 13, 18, 21, X e Y, sendo dois deles com mosaicismo intratecidual. Quatro pacientes apresentaram microdeleções ou microduplicações envolvendo diferentes genes, sendo um paciente com duplicação do gene TYMS em 18p11.32; um com deleção do gene CHL1 em 3p26.3; um com deleção para o gene HIC1 em 17p13.3 e um paciente com deleção do gene TOM1L2 em 17p11.2; um paciente apresentou mutação de base única, patogênica, g.8535C > G (c.746C > G) no éxon 7 do gene FGFR3 compatível com Displasia Tanatofórica tipo I. Por fim, dois pacientes com doenças do desenvolvimento sexual apresentaram resultados dos testes citogenômicos normais. Discussão: Sugere-se que todas as alterações encontradas estão relacionadas ao fenótipo clínico ou participam na via de sinalização de genes correlatos. As técnicas de MLPA e MMS mostraram viabilidade e eficiência para a detecção de alterações genômicas em tecidos de pacientes falecidos, contudo são dependentes da integridade e quantidade do DNA obtido. Conclusão: O estudo citogenômico post-mortem é importante para a elucidação diagnóstica de casos sem etiologia definida, para o aconselhamento genético familiar, para a caracterização de mosaicismo inter e intratecidual e para a compreensão da patogênese das MCs / Introduction: Congenital malformations (CMs) are the second leading cause of fetal and infant deaths in Brazil and in most cases the etiology is not well defined. Also, the patients remain without a conclusive diagnostic making difficult the genetic counseling. Objectives: This study applied cytogenomics techniques in order to characterize the presence of DNA abnormalities, as well as, aneuploidies and genomic copy number variations (CNVs) in different tissues from deceased patients with CM from \"Serviço de Verificação de Óbitos\". Patients and Methods: We evaluated samples from 30 patients undergoing necropsy. The DNA was extracted from different tissues (brain, heart, liver, skin and diaphragm) stored in RNA later, formaldehyde and embedded in paraffin. We performed Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) with P095 kits, P064 and P070 (MRC-Holland®), microsatellite markers (MMS) with MiniFiler kit (Life Technologies), Fluorescence In Situ Hybridization (FISH), array technique (Infinium® CytoSNP-850K BeadChip - Illumina) and bidirectional sequencing by Sanger. The results was analyzed using different softwares: GeneMarker, Coffalyser, BlueFuse Multi Sequencher and databases Database of Genomic Variants (DGV - http://projects.tcag.ca/variation/) Database of Chromosomal Imbalance and Phenotype in Humans Using Ensembl Resources (Decipher - http://decipher.sanger.ac.uk/), UCSC Genome Bioinformatics (http://genome.ucsc.edu) and Mutation Taster. Results: The results showed 13 patients with pathogenic CNVs, and among them, eight presented aneuploidies involving chromosomes 13, 18, 21, X and Y. Two of them presented intra-tissue mosaicism. Also four patients showed several different microdeletions or microduplications: duplication of TYMS gene (18p11.32); deletion of CHL1 gene (3p26.3); deletion of HIC1 gene (17p13.3); deletion of TOM1L2 gene (17p11.2 ). One patient showed a pathogenic missense mutation of g.8535C>G (c.746C > G) in exon 7 from FGFR3 gene compatible with Thanatophoric Dysplasia type I. 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Made available in DSpace on 2016-06-17T14:12:52Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license.txt: 1914 bytes, checksum: 7d48279ffeed55da8dfe2f8e81f3b81f (MD5) 2015araujo-ta.pdf: 1322210 bytes, checksum: 5513ddf163f4688be5cc2a44a0c09dfc (MD5) Previous issue date: 2015 / Made available in DSpace on 2016-07-05T22:00:04Z (GMT). No. of bitstreams: 3 2015araujo-ta.pdf.txt: 137695 bytes, checksum: 1560d320cc20fe3f8d42b53c85681e8f (MD5) 2015araujo-ta.pdf: 1322210 bytes, checksum: 5513ddf163f4688be5cc2a44a0c09dfc (MD5) license.txt: 1914 bytes, checksum: 7d48279ffeed55da8dfe2f8e81f3b81f (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães. Recife, PE, Brasil / A filariose linfática (FL) ou bancroftiana é uma doença parasitária causada por Wuchereria bancrofti, um verme filarial transmitido no Brasil pelo mosquito Culex quinquefasciatus. De acordo com a Organização Mundial de Saúde (OMS) esta doença afeta 120 milhões de pessoas em 58 países. Portanto, para enfrentar a FL, a OMS lançou um programa global para eliminá-la até 2020 e o Brasil tornou signatário dessa proposta criando o Plano Nacional de Eliminação da Filariose Linfática (PNEFL). Atualmente, a Região Metropolitana do Recife (RMR) é uma área de importante transmissibilidade e, assim, foi preconizado o Tratamento Coletivo (TC) da população com o medicamento Dietilcarbamazina (DEC) e o controle vetorial para reduzir a transmissão da doença. Como ferramenta complementar, desde a vigilância até a verificação da eliminação, o xenomonitoramento molecular (baseado na PCR para detecção de W. bancrofti em mosquitos) é um importante método não invasivo para monitorar indiretamente se a transmissão de larvas de W. bancrofti está ocorrendo na população humana. A fim de verificar a taxa de infecção vetorial no mosquito C. quinquefasciatus pela W. bancrofti foram coletadas 43.981 fêmeas do mosquito em doze localidades na RMR. Além disso, foi desenvolvido um novo protocolo (PCR duplex) para o diagnóstico de infecção vetorial e o número ideal de fêmeas por pools foi estabelecido. Os resultados mostraram que Linha do Tiro (Recife), uma área com alto índice de microfilaremia na população humana, apresentou status de transmissão durante o TC com uma taxa de infecção vetorial de 0,80%, diferente das outras localidades com transmissão reduzida não foram detectados pools positivos. Portanto, observa-se que onde o TC é conduzido a taxa de infecção vetorial tende a ser reduzida. O xenomonitoramento molecular é um indicador importante para avaliação da eficiência das estratégias do PGEFL implantado em áreas endêmicas, até que ocorra a certificação da interrupção do ciclo de transmissão da filariose