Hipopituitarismo congênito é caracterizado por deficiência hormonal múltipla devido a mutações de fatores de transcrição envolvidos na embriogênese hipofisária. As células-tronco estão presentes na hipófise e são caracterizadas por dar origem a uma célula progenitora e uma célula indiferenciada por divisão assimétrica. Estão envolvidas na hipófise em processos de alta demanda metabólica em diferentes fases da vida. Em estudos prévios, observou-se o acúmulo dos marcadores de células-tronco Sox2 e Nr2e1 no camundongo Ames, que apresenta mutação no gene Prop1. O Sox2 é o marcador consenso de células-tronco na hipófise enquanto que o Nr2e1, nunca antes caracterizado na hipófise, é essencial para a manutenção de células-tronco e neogenese no cérebro. A perda de função deste gene pode causar agressão e falta de instinto materno em camundongos. Com isso, o objetivo desse projeto foi utilizar o animal modelo zebrafish para avaliar o papel repressor do gene prop1 e caracterizar o gene nr2e1 bem como, confirmar se o mesmo está envolvido com a diferenciação terminal na hipófise, e sua interferência no comportamento do animal mutado. O zebrafish se encaixa adequadamente nesse projeto pois é de fácil manutenção, econômico e com rápido desenvolvimento. No presente estudo criou-se 2 modelos de zebrafish utilizando-se a técnica de edição genômica conhecida como CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) para nocautear os genes prop1 e nr2e1. Esta técnica permite uma interrupção específica e substituição de bases no genoma, resultando em uma alta especificidade, baixa toxicidade celular e é herdável. O zebrafish homozigoto com mutação no gene nr2e1 se desenvolve e reproduz como o animal controle, porém apresenta um comportamento mais exploratório quando comparado com o animal selvagem e o heterozigoto. A imunofluorescência para o anticorpo Sox2 no animal mutado mostrou se diferente do selvagem, pois apresenta um aumento da expressão temporal e o mesmo não se colocaliza com o Nr2e1. A imunofluorescência feita com os hormônios não se mostrou diferente entre o mutado e o selvagem. Conclui-se diante dos achados de normalidade do desenvolvimento, fertilidade, ausência de co-localização com o gene Sox2 e presença de hormônios como Tsh, Fsh e Gh, que o gene nr2e1 não é crucial na diferenciação terminal na hipófise porém o animal mutado apresenta um comportamento diferente do animal selvagem. Os resultados da caracterização do zebrafish com mutação no gene prop1 ainda estão em andamento devido a dificuldade de se estabelecer essa linhagem / Congenital hypopituitarism is characterized by multiple hormone deficiencies due to mutations in transcription factors involved in pituitary embryogenesis. Stem cells, which by definition can each give rise to a progenitor and an undifferentiated cell by asymmetric division, are present in the pituitary gland and are important during periods of high metabolic demand in different phases of life. In previous studies, the accumulation of the stem cell markers Sox2 and Nr2e1 was observed in the Ames mouse, which harbors a mutation in Prop1. Sox2 is the consensus stem cell marker in the pituitary gland, while the role of Nr2e1 in the pituitary development has not been characterized although it is essential for neural stem cell maintenance and neogenesis in the brain and its loss of function causes pathological aggression and lack of maternal instinct in mice. In this project, the zebrafish animal model was used to characterize the role of nr2e1, to confirm whether this gene can be involved in the pituitary terminal differentiation, and to determine the effects of this gene on animal behavior. The zebrafish is a particularly appropriate model for use in this project because it is easy to maintain, is economical, and has a rapid metabolism and growth rate. In the present study, we created 2 zebrafish models by knocking out prop1 and nr2e1 using the CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) genome-editing technique. This technique enables highly specific gene/reading frame interruption and/or base substitution in the genome, with low cellular toxicity and high heritability. Zebrafish with homozygous nr2e1 mutations develop and reproduce similarly to wild-type zebrafish, but present a more exploratory behavioral pattern compared to wild-type and heterozygous zebrafish. Based on immunofluorescence, Sox2 expression was higher in the mutant zebrafish than in the wild type and was not co-localized with Nr2e1 expression. Hormone expression did not differ between wild-type and mutant zebrafish. We conclude that nr2e1 is not crucial in the terminal differentiation of the hormone-forming pituitary gland; however, it induces a distinct behavioral phenotype at the larval stage. Analyses of zebrafish harboring a prop1 mutation are ongoing owing to issues with the establishment of the lineage

Hipopituitarismo congênito é caracterizado por deficiência hormonal múltipla devido a mutações de fatores de transcrição envolvidos na embriogênese hipofisária. As células-tronco estão presentes na hipófise e são caracterizadas por dar origem a uma célula progenitora e uma célula indiferenciada por divisão assimétrica. Estão envolvidas na hipófise em processos de alta demanda metabólica em diferentes fases da vida. Em estudos prévios, observou-se o acúmulo dos marcadores de células-tronco Sox2 e Nr2e1 no camundongo Ames, que apresenta mutação no gene Prop1. O Sox2 é o marcador consenso de células-tronco na hipófise enquanto que o Nr2e1, nunca antes caracterizado na hipófise, é essencial para a manutenção de células-tronco e neogenese no cérebro. A perda de função deste gene pode causar agressão e falta de instinto materno em camundongos. Com isso, o objetivo desse projeto foi utilizar o animal modelo zebrafish para avaliar o papel repressor do gene prop1 e caracterizar o gene nr2e1 bem como, confirmar se o mesmo está envolvido com a diferenciação terminal na hipófise, e sua interferência no comportamento do animal mutado. O zebrafish se encaixa adequadamente nesse projeto pois é de fácil manutenção, econômico e com rápido desenvolvimento. No presente estudo criou-se 2 modelos de zebrafish utilizando-se a técnica de edição genômica conhecida como CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) para nocautear os genes prop1 e nr2e1. Esta técnica permite uma interrupção específica e substituição de bases no genoma, resultando em uma alta especificidade, baixa toxicidade celular e é herdável. O zebrafish homozigoto com mutação no gene nr2e1 se desenvolve e reproduz como o animal controle, porém apresenta um comportamento mais exploratório quando comparado com o animal selvagem e o heterozigoto. A imunofluorescência para o anticorpo Sox2 no animal mutado mostrou se diferente do selvagem, pois apresenta um aumento da expressão temporal e o mesmo não se colocaliza com o Nr2e1. A imunofluorescência feita com os hormônios não se mostrou diferente entre o mutado e o selvagem. Conclui-se diante dos achados de normalidade do desenvolvimento, fertilidade, ausência de co-localização com o gene Sox2 e presença de hormônios como Tsh, Fsh e Gh, que o gene nr2e1 não é crucial na diferenciação terminal na hipófise porém o animal mutado apresenta um comportamento diferente do animal selvagem. Os resultados da caracterização do zebrafish com mutação no gene prop1 ainda estão em andamento devido a dificuldade de se estabelecer essa linhagem / Congenital hypopituitarism is characterized by multiple hormone deficiencies due to mutations in transcription factors involved in pituitary embryogenesis. Stem cells, which by definition can each give rise to a progenitor and an undifferentiated cell by asymmetric division, are present in the pituitary gland and are important during periods of high metabolic demand in different phases of life. In previous studies, the accumulation of the stem cell markers Sox2 and Nr2e1 was observed in the Ames mouse, which harbors a mutation in Prop1. Sox2 is the consensus stem cell marker in the pituitary gland, while the role of Nr2e1 in the pituitary development has not been characterized although it is essential for neural stem cell maintenance and neogenesis in the brain and its loss of function causes pathological aggression and lack of maternal instinct in mice. In this project, the zebrafish animal model was used to characterize the role of nr2e1, to confirm whether this gene can be involved in the pituitary terminal differentiation, and to determine the effects of this gene on animal behavior. The zebrafish is a particularly appropriate model for use in this project because it is easy to maintain, is economical, and has a rapid metabolism and growth rate. In the present study, we created 2 zebrafish models by knocking out prop1 and nr2e1 using the CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) genome-editing technique. This technique enables highly specific gene/reading frame interruption and/or base substitution in the genome, with low cellular toxicity and high heritability. Zebrafish with homozygous nr2e1 mutations develop and reproduce similarly to wild-type zebrafish, but present a more exploratory behavioral pattern compared to wild-type and heterozygous zebrafish. Based on immunofluorescence, Sox2 expression was higher in the mutant zebrafish than in the wild type and was not co-localized with Nr2e1 expression. Hormone expression did not differ between wild-type and mutant zebrafish. We conclude that nr2e1 is not crucial in the terminal differentiation of the hormone-forming pituitary gland; however, it induces a distinct behavioral phenotype at the larval stage. Analyses of zebrafish harboring a prop1 mutation are ongoing owing to issues with the establishment of the lineage

A nutrição tem sido identificada como um fator chave que afeta diretamente o crescimento e o bom desempenho reprodutivo do animal quando utilizado como modelo experimental. Desta forma, é essencial uma dieta ideal acessível através da qual o zebrafish possa suprir todas suas necessidades nutricionais desde a fase larval até a sua fase adulta sem que haja necessidade de complementá-la com outros tipos de dietas, simplificando o cultivo destes animais. A dieta recomendada nos guidelines para a alimentação do Zebrafish criado em laboratório é composta por náuplios de Artemias (crustáceo rico em proteínas) em conjunto com uma ração seca rica em proteínas e sais minerais fundamentais para o bom desenvolvimento e reprodução desses animais. Este estudo teve como objetivo desenvolver e padronizar uma dieta ideal de alimentação simples, eficaz, saudável e de baixo custo a fim de obter o melhor desempenho possível nos experimentos desenvolvidos com o zebrafish. Foram utilizadas 4 diferentes modelos de dietas preparadas a partir de 3 formas de alimentação que consistiram em náuplios de Artemias, a ração padrão-ouro disponível no mercado europeu denominada Gemma Micro® desenvolvida pela Skretting e a ração elaborada para este estudo identificada como Ração Ideal. Os animais foram divididos em 4 grupos de acordo com a dieta recebida: Grupo1- alimentados com Ração Gemma(G), Grupo 2- alimentados com Ração Gemma + Artemia (G+A), Grupo 3- alimentados com Ração Ideal (I) e Grupo 4- alimentados com Ração Ideal+Artemia (I+A). Para avaliar o desempenho da Ração Ideal, foram analisados comparativamente entre os grupos os parâmetros de sobrevivência, crescimento, maturação sexual e fertilidade em duas gerações de animais (Geração 0 Geração 1). Após a análise e vários testes realizados dentro de um modelo de ração que se ajustasse ao perfil de referência, Gemma Micro® e que atendesse as necessidades do zebrafish passamos a dar início aos experimentos utilizando a ração que apresentou melhor desempenho que passou a ser denominada Ração Ideal. Em relação a sobrevivência dos animais, observamos que, na Geração 0 os animais dos grupos 3 e 4 apresentaram maiores taxas de sobrevivência em relação aos outros grupos, no entanto na geração 1 todos os grupos apresentaram taxas de sobrevivência semelhantes. Analisando o crescimento dos animais, na geração 0 os animais dos grupos 2 e 4 apresentaram crescimento semelhante e foram maiores que os animais dos grupos 1 e 3. Na geração 1, os animais do grupo 2 foram os que mais cresceram e o grupo 4 cresceu mais em relação ao grupo 3. Todos os animais estavam maduros sexualmente aos 90dpf e quantidade de ovos viáveis foram maior nos grupos 1 e 2 em ambas as gerações. A Ração Ideal forneceu um aporte calórico suficiente e semelhante á ração Gemma para a sobrevivência dos animais nas fases iniciais do desenvolvimento, apresentando taxas de sobrevivência semelhantes entre os grupos. O acréscimo da artêmia á ração ideal foi fundamental para que o crescimento dos animais alimentados com essa ração demonstrassem um crescimento semelhante á ração referência, demonstrando a deficiência proteica da ração ideal. Todas as dietas promoveram maturidade sexual na faixa etária esperada (a partir de 90dpf) no entanto parece que a fertilidade foi maior nos grupos 1 e 2, possivelmente pelo maior aporte proteico que esses animais receberam. Este estudo conseguiu desenvolver e padronizar uma dieta ideal de alimentação, eficaz, saudável e de baixo custo semelhante ao padrão-ouro utilizado em laboratórios europeus e americanos que, após alguns ajustes em sua formulação poderá ser comercializada e utilizada pelos laboratórios de pesquisa ao redor do país / Nutrition has been identified as a key factor that directly affects the growth and good reproductive performance of the animal when used as an experimental model. In this way, an ideal diet should be accessible through which the zebrafish can meet all their nutritional needs from the larval phase to adulthood without any complement with other types of diets, simplifying the management of these animals. The diet recommended in the Zebrafish feeding guidelines is composed of Artemias nauplii (crustacean rich in proteins) together with a dry diet rich in proteins and minerals that are essential for the proper development and reproduction of these animals. This study aimed to develop and standardize an ideal diet for simple, effective, healthy and low-cost feeding in order to obtain the best possible performance in the experiments developed with zebrafish. Four different diets were prepared from 3 feeding forms consisting of Artemias nauplii, the gold-standard feed available in the Europe, the Gemma Micro® developed by Skretting and the dry feed elaborated in this study identified as Ideal . The animals were divided into 4 groups according to the diet received: Group 1 fed with Gemma (G), Group 2 fed with Gemma + Artemia (G + A), Group 3 fed with Ideal dry feed (I) and Group 4- fed with Ideal dry feed+ Artemia (I + A). To evaluate the performance of the Ideal dry feed, the parameters of survival, growth, sexual maturation and fertility in two generations of animals (Generation 0 Generation 1) were comparatively analyzed between the groups. After several tests performed within a feed model that fits the reference profile, Gemma Micro® and meets the zebrafish needs, we initiated the experiments using the feed that presented the best performance, named Ideal. Regarding the animals survival, we observed that in the Generation 0 animals of groups 3 and 4 presented higher survival rates in relation to the other groups, however in generation 1 all groups had similar survival rates. Analyzing the growth of the animals, in generation 0 the animals of groups 2 and 4 presented similar growth and were larger than the animals of groups 1 and 3. In generation 1, the animals of group 2 were the ones that were bigger than other ones. Animals of group 4 were bigger than group 3. All animals were sexually mature at 90dpf and fertility was evaluated by viable egg count. The number of viable egg were higher in groups 1 and 2 in both generations. The Ideal feed provided a sufficient caloric intake similar to the Gemma for the survival of the animals in the early stages of development, once survival rates were similar between the groups. Adding artemia to the ideal feed was fundamental for animal development, once the growth of the animals fed with ideal plus artemia demonstrated a similar growth to the reference feed, demonstrating the protein deficiency of the ideal feed. All diets promoted sexual maturity at the expected age range (from 90dpf), however it appears that fertility was higher in groups 1 and 2, possibly due to the higher protein intake of these animals. This study was able to develop and standardize an ideal, effective, healthy and low-cost diet similar to the gold standard feed used in laboratories around the world. After some adjustments in its formulation, the ideal feed should be marketed and used in the research laboratories in the country

A descoberta de fármacos a partir de produtos isolados de organismos marinhos tem apresentado um grande crescimento nos últimos anos, principalmente devido aos avanços tecnológicos analíticos, síntese química e biotecnologia. Dentre estes, as esponjas representam uma das principais fontes de metabólitos protótipos para diversas atividades, destacando-se os efeitos antitumorais. Neste contexto, este trabalho teve como objetivo a investigação química e biológica de três esponjas coletadas na costa sul-brasileira: Haliclona tubifera, Polymastia janeirensis e Scopalina ruetzleri. Considerando a correlação entre câncer, distúrbios da coagulação e desbalanço de espécies reativas de oxigênio (EROs), foram realizados ensaios visando a aquisição destas atividades e a identificação de substâncias bioativas. Para a esponja H. tubifera foram observados interessantes efeitos antitumorais em células de glioma e neuroblastoma humano (IC50 < 20 μg/ml), além das atividades antioxidante e anticoagulante para a fração acetato de etila. O composto majoritário desta fração foi isolado como um derivado N-Boc e sua configuração foi estabelecida utilizando um novo protocolo de dicroísmo circular e semissíntese de derivados. Assim, este esfingosídeo de cadeia longa isolado (2R,3R,6R,7Z)-2-amino-7-octadecene-1,3,6-triol, foi denominado halisphingosine A. Um novo composto minoritário, halisphingosine B foi obtido usando técnicas de isolamento em escala nanomolar. Sua configuração absoluta foi estabelecida por comparação com o composto A. Da mesma forma, para a esponja S. ruetzleri, a fração acetato de etila demonstrou os resultados mais promissores. Um potencial efeito anticâncer e de inibição dos radicais peroxila foi observado. Além disso, um efeito modulador da peroxidação lipídica foi evidenciado em ensaio ex vivo de dienos conjugados. Através da análise por RMN de 1H, verificou-se que a fração era majoritariamente constituída por ácidos graxos, os quais foram derivatizados para caracterização por Cromatografia Gasosa (GC/FID). Foram identificados 32 ácidos graxos principalmente poli-insaturados (53%). Ácidos graxos minoritários não usuais para o ambiente marinho também foram caracterizados. A esponja P. janeirensis apresentou os efeitos citotóxicos mais promissores em células de glioma e neuroblastoma humano, com um IC50 < 1,0 μg/ml para o extrato aquoso (pH 6,8), sendo este efeito pH-dependente, uma vez que o extrato (pH 5,8) não alterou a viabilidade celular. Para P. janeirensis, foi também investigado seu potencial de defesa química em modelo de Zebrafish. Foi observado que o extrato aquoso desencadeia um efeito de fuga, alterando significativamente o comportamento espaço-temporal de peixes Danio rerio. Analisando em conjunto, os dados do presente trabalho representam uma nova contribuição para o estudo químico e biológico de espécies de esponjas marinhas da costa sul-brasileira e apontam as potencialidades destas esponjas na busca de moléculas protótipos para fármacos, especialmente relacionados à terapia do câncer. / Drug discovery from marine natural products has increased in the past few years, mainly due to technological advances in spectroscopy, chemical synthesis and biotechnology. Among all marine animals, sponges represent one of the major sources of prototype metabolites for several biological activities, highlighting the antitumor effects. In this context, this study carried out chemical and biological investigation of three sponges collected on the South Brazilian coastline: Haliclona tubifera, Polymastia janeirensis and Scopalina ruetzleri. Considering the correlation between cancer, clotting disorders and imbalance of reactive oxygen species (ROS), experiments were conducted for acquisition of these activities and identification of bioactive compounds. H. tubifera showed an interesting cytotoxic effect in human neuroblastoma and glioma cell lines (IC50 <20 μg/ml), antioxidant and anticoagulant effect for ethyl acetate (EtOAc) fraction. The major compound of EtOAc fraction was isolated as an N-Boc derivative and its configuration was established using a new circular dichroism protocol with the production of semi-synthetic derivatives. This long chain sphingoid base (2R,3R,6R,Z)-2-aminooctadec-7-ene-1,3,6-triol was named as halisphingosine A. A new minor compound, halisphingosine B was obtained using nanomol scale techniques and their absolute configuration was established by comparison with compound A. Likewise, for the sponge S. ruetzleri, the EtOAc fraction showed the most promising results. A potential anticancer effect, inhibition of peroxyl radicals and modulation effect of lipid peroxidation was observed. Fingerprint 1H NMR analysis showed that this fraction is mainly constituted of fatty acids. Through Fatty Acid Methyl Ester (FAMEs) analysis by GC/FID, it was possible to identify 32 fatty acids, of which around 50% were Polyunsaturated Fatty Acids (PUFAs). In addition, some minor unusual fatty acids for the marine biosphere were identified. It was observed for P. janeirensis the most promising cytotoxic effects on human glioma and neuroblastoma cells, with an IC50 <1.0 μg/ml to aqueous extract (pH 6.8), being this effect pH-dependent, since the extract (pH 5.8) did not affect the cell viability. Moreover, P. janeirensis was investigated along their potential chemical defense in Zebrafish model. Aqueous extract trigged an escape effect, significantly altering the spatio-temporal swimming activity of animals. Taken together, the data presented from this study represent a new contribution to chemical and biological research of marine sponge species from South Brazilian coastline, and point the potentialities of sponges to search chemical prototypes for drugs, especially related to cancer therapy.

A qualidade do ar nas áreas urbanas tende a apresentar concentrações indesejáveis de contaminantes provenientes da queima de biomassa, não havendo um sistema abrangente de monitoramento. Achados in vivo mostram que o diesel pode conter compostos que modulam a atividade do estrógeno. Estudos in vitro apoiam essa ideia, como o estudo realizado com cloreto de metileno extraído do diesel que comprova atuar como ativadores de ligação para os receptores de estrógeno. Esse trabalho tem por objetivo avaliar o efeito da exposição à metais presentes nas partículas de exaustao de diesel (PED) na morfologia do ovaário através da histologia, e análise do padrão de expressão dos receptores de estrógeno (ERs) no ovário de zebrafish (Danio rerio) usando a metodologia de PCR em tempo real. Fêmeas adultas de zebrafish foram expostas à concentrações ambientais de combinado de metais (Ni = 0,181 mg/L ; Fe = 0,07455 mg/L ; Pb= 0,05 mg/ L; Cd = 0,029 mg/ L; Cr = 0,161 mg/L ; Cu = 0,017 mg / L) por 3 dias. Em relação a contagem de ovócitos atrésicos a média observada nos animais expostos foi de 1,5 ± 0,4 e nos controles foi de 1,34 ± 0,3. Contudo, não houve diferença significativa entre os grupos (p > 0,05). Na expressão dos três genes receptores de estrógeno (esr1, esr2a, esr2b) as médias foram: 0,68; 1,32; 0,54; respectivamente. No entanto, não houve alteração significativa na expressão desses genes em relação aos controles. Os elementos traços presentes nas PED em concentração ambiental e em exposição aguda na fase adulta não alteram a expressão dos ERs o também não afetam o número de folículos atrésicos nos ovários / The air quality in urban areas tends to have undesirable concentrations of contaminants from biomass combustion, without a monitoring system. In vivo findings show that diesel may contain compounds that modulate the activity of estrogen. In vitro studies support this idea, as the study with methylene chloride extract from diesel proves that this substance act as activators binding to the estrogen receptors (ERs). This study aims to evaluate the effect of exposure to metals present in diesel exhaust particles (PED) in ovary morphology through histology, and analysis of expression pattern of ERs in ovary of zebrafish (Danio rerio) using real time PCR metodology. Adult females were exposed to ambient concentrations of combined metals (Ni = 0.181 mg / L, Fe = 0.07455 mg / L Pb = 0,05 mg / L; Cd = 0.029 mg / L; = 0.161 mg Cr / L, Cu = 0.017 mg / L) for 3 days. The mean of atretic oocytes counting observed in animals exposed was 1.5 ± 0.4 and the controls was 1.34 ± 0.3. However, no significant difference between groups was observed (p> 0.05). The expression of the three genes estrogen receptor (esr1, esr2a, esr2b) mean were: 0.68, 1.32, 0.54, respectively. However, no significant change in the expression of these genes in relation to controls was observed. In conclusion, the trace elements present in the PED concentration in environmental and acute exposure in adulthood not alter the expression of ERs and does not affect the number of atretic follicles in the ovary

A descoberta de fármacos a partir de produtos isolados de organismos marinhos tem apresentado um grande crescimento nos últimos anos, principalmente devido aos avanços tecnológicos analíticos, síntese química e biotecnologia. Dentre estes, as esponjas representam uma das principais fontes de metabólitos protótipos para diversas atividades, destacando-se os efeitos antitumorais. Neste contexto, este trabalho teve como objetivo a investigação química e biológica de três esponjas coletadas na costa sul-brasileira: Haliclona tubifera, Polymastia janeirensis e Scopalina ruetzleri. Considerando a correlação entre câncer, distúrbios da coagulação e desbalanço de espécies reativas de oxigênio (EROs), foram realizados ensaios visando a aquisição destas atividades e a identificação de substâncias bioativas. Para a esponja H. tubifera foram observados interessantes efeitos antitumorais em células de glioma e neuroblastoma humano (IC50 < 20 μg/ml), além das atividades antioxidante e anticoagulante para a fração acetato de etila. O composto majoritário desta fração foi isolado como um derivado N-Boc e sua configuração foi estabelecida utilizando um novo protocolo de dicroísmo circular e semissíntese de derivados. Assim, este esfingosídeo de cadeia longa isolado (2R,3R,6R,7Z)-2-amino-7-octadecene-1,3,6-triol, foi denominado halisphingosine A. Um novo composto minoritário, halisphingosine B foi obtido usando técnicas de isolamento em escala nanomolar. Sua configuração absoluta foi estabelecida por comparação com o composto A. Da mesma forma, para a esponja S. ruetzleri, a fração acetato de etila demonstrou os resultados mais promissores. Um potencial efeito anticâncer e de inibição dos radicais peroxila foi observado. Além disso, um efeito modulador da peroxidação lipídica foi evidenciado em ensaio ex vivo de dienos conjugados. Através da análise por RMN de 1H, verificou-se que a fração era majoritariamente constituída por ácidos graxos, os quais foram derivatizados para caracterização por Cromatografia Gasosa (GC/FID). Foram identificados 32 ácidos graxos principalmente poli-insaturados (53%). Ácidos graxos minoritários não usuais para o ambiente marinho também foram caracterizados. A esponja P. janeirensis apresentou os efeitos citotóxicos mais promissores em células de glioma e neuroblastoma humano, com um IC50 < 1,0 μg/ml para o extrato aquoso (pH 6,8), sendo este efeito pH-dependente, uma vez que o extrato (pH 5,8) não alterou a viabilidade celular. Para P. janeirensis, foi também investigado seu potencial de defesa química em modelo de Zebrafish. Foi observado que o extrato aquoso desencadeia um efeito de fuga, alterando significativamente o comportamento espaço-temporal de peixes Danio rerio. Analisando em conjunto, os dados do presente trabalho representam uma nova contribuição para o estudo químico e biológico de espécies de esponjas marinhas da costa sul-brasileira e apontam as potencialidades destas esponjas na busca de moléculas protótipos para fármacos, especialmente relacionados à terapia do câncer. / Drug discovery from marine natural products has increased in the past few years, mainly due to technological advances in spectroscopy, chemical synthesis and biotechnology. Among all marine animals, sponges represent one of the major sources of prototype metabolites for several biological activities, highlighting the antitumor effects. In this context, this study carried out chemical and biological investigation of three sponges collected on the South Brazilian coastline: Haliclona tubifera, Polymastia janeirensis and Scopalina ruetzleri. Considering the correlation between cancer, clotting disorders and imbalance of reactive oxygen species (ROS), experiments were conducted for acquisition of these activities and identification of bioactive compounds. H. tubifera showed an interesting cytotoxic effect in human neuroblastoma and glioma cell lines (IC50 <20 μg/ml), antioxidant and anticoagulant effect for ethyl acetate (EtOAc) fraction. The major compound of EtOAc fraction was isolated as an N-Boc derivative and its configuration was established using a new circular dichroism protocol with the production of semi-synthetic derivatives. This long chain sphingoid base (2R,3R,6R,Z)-2-aminooctadec-7-ene-1,3,6-triol was named as halisphingosine A. A new minor compound, halisphingosine B was obtained using nanomol scale techniques and their absolute configuration was established by comparison with compound A. Likewise, for the sponge S. ruetzleri, the EtOAc fraction showed the most promising results. A potential anticancer effect, inhibition of peroxyl radicals and modulation effect of lipid peroxidation was observed. Fingerprint 1H NMR analysis showed that this fraction is mainly constituted of fatty acids. Through Fatty Acid Methyl Ester (FAMEs) analysis by GC/FID, it was possible to identify 32 fatty acids, of which around 50% were Polyunsaturated Fatty Acids (PUFAs). In addition, some minor unusual fatty acids for the marine biosphere were identified. It was observed for P. janeirensis the most promising cytotoxic effects on human glioma and neuroblastoma cells, with an IC50 <1.0 μg/ml to aqueous extract (pH 6.8), being this effect pH-dependent, since the extract (pH 5.8) did not affect the cell viability. Moreover, P. janeirensis was investigated along their potential chemical defense in Zebrafish model. Aqueous extract trigged an escape effect, significantly altering the spatio-temporal swimming activity of animals. Taken together, the data presented from this study represent a new contribution to chemical and biological research of marine sponge species from South Brazilian coastline, and point the potentialities of sponges to search chemical prototypes for drugs, especially related to cancer therapy.

Submitted by JULIANA POLLONI SILVA null (ju_polloni@yahoo.com.br) on 2017-05-05T15:55:40Z No. of bitstreams: 1 Tese_UNESPSorocaba_JulianaPolloniSilva_2017.pdf: 5158035 bytes, checksum: 4293a506e5ebdca8245dde20cdbecec4 (MD5) / Approved for entry into archive by Luiz Galeffi (luizgaleffi@gmail.com) on 2017-05-05T16:08:14Z (GMT) No. of bitstreams: 1 silva_jp_dr_soro.pdf: 5158035 bytes, checksum: 4293a506e5ebdca8245dde20cdbecec4 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-05T16:08:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 silva_jp_dr_soro.pdf: 5158035 bytes, checksum: 4293a506e5ebdca8245dde20cdbecec4 (MD5) Previous issue date: 2017-03-07 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Produtos químicos capazes de causar desregulação endócrina em vertebrados e invertebrados têm sido detectados a baixas concentrações em ambientes aquáticos do mundo. Desta maneira, tornou-se de interesse mundial a busca por metodologias de remoção mesmos nos ambientes aquáticos. Por isso pesquisa teve como objetivo investigar três materiais (carvão ativado em pós – PAC, zeólitas naturais em pó – ZP e substâncias húmicas aquáticas – AHS) na remediação química e ecotoxicológica de 17ß-estradiol (E2) e 17α-etinilestradiol (EE2) em água mediante ensaios químicos e biológicos in vitro e in vivo. Uma concentração ambientalmente relevante de hormônios (30 ng.L-1) foi utilizada durante os ensaios em laboratório. Os resultados obtidos por meio de uma extensa relação de parâmetros morfológicos, reprodutivos e histológicos adotados permitiram concluir o significativo impacto dos HSFs sobre o desenvolvimento e manutenção de peixes expostos. Comprovou-se a superior eficiência do PAC em relação aos demais substratos na remoção de interferentes endócrinos (IEs) em água. Não obstante, suas propriedades não garantiram o mesmo desempenho com relação a amostras ambientais e, tampouco possibilitou a recuperação das injurias biológicas monitoradas após período de depuração investigado. Um estudo adicional também permitiu a elaboração de um protocolo histoquímico capaz de identificar a produção de vitelogenina (VTG) incitada pela exposição ao esteróide sintético EE2. / Chemicals with potential to cause endocrine disruption in vertebrates and invertebrates have been detected at low concentrations in the world's aquatic environments. Therefore, the search for removal methodologies in aquatic environments became a worldwide interest. The aim of this research was to investigate three materials (powered activated carbon - PAC, powered natural zeolites - ZP and aquatic humic substances - AHS) in chemical and ecotoxicological remediation of 17ß-estradiol (E2) and 17α-ethinylestradiol (EE2) in water through chemical and biological tests in vitro and in vivo. An environmentally relevant concentration of hormones (30 ng.L-1) was used during laboratory tests. The results obtained through an extensive list of morphological, reproductive and histological parameters showed the significant impact of HSFs on the development and maintenance of exposed fish. The superior efficiency of PAC was verified in relation to the other substrates in the endocrine disrupting chemicals (EDCs) removal in water. Nevertheless, their properties did not guarantee the same performance to the environmental samples, neither allow biological injuries monitored to be recovered after the period of depuration investigated. An additional study also allowed the development of a histochemical protocol capable of identifying the production of vitellogenin (VTG) prompted by exposure to the synthetic steroid EE2. / FAPESP: 2012/24495-6 / FAPESP: 2014/22733-2

A descoberta de fármacos a partir de produtos isolados de organismos marinhos tem apresentado um grande crescimento nos últimos anos, principalmente devido aos avanços tecnológicos analíticos, síntese química e biotecnologia. Dentre estes, as esponjas representam uma das principais fontes de metabólitos protótipos para diversas atividades, destacando-se os efeitos antitumorais. Neste contexto, este trabalho teve como objetivo a investigação química e biológica de três esponjas coletadas na costa sul-brasileira: Haliclona tubifera, Polymastia janeirensis e Scopalina ruetzleri. Considerando a correlação entre câncer, distúrbios da coagulação e desbalanço de espécies reativas de oxigênio (EROs), foram realizados ensaios visando a aquisição destas atividades e a identificação de substâncias bioativas. Para a esponja H. tubifera foram observados interessantes efeitos antitumorais em células de glioma e neuroblastoma humano (IC50 < 20 μg/ml), além das atividades antioxidante e anticoagulante para a fração acetato de etila. O composto majoritário desta fração foi isolado como um derivado N-Boc e sua configuração foi estabelecida utilizando um novo protocolo de dicroísmo circular e semissíntese de derivados. Assim, este esfingosídeo de cadeia longa isolado (2R,3R,6R,7Z)-2-amino-7-octadecene-1,3,6-triol, foi denominado halisphingosine A. Um novo composto minoritário, halisphingosine B foi obtido usando técnicas de isolamento em escala nanomolar. Sua configuração absoluta foi estabelecida por comparação com o composto A. Da mesma forma, para a esponja S. ruetzleri, a fração acetato de etila demonstrou os resultados mais promissores. Um potencial efeito anticâncer e de inibição dos radicais peroxila foi observado. Além disso, um efeito modulador da peroxidação lipídica foi evidenciado em ensaio ex vivo de dienos conjugados. Através da análise por RMN de 1H, verificou-se que a fração era majoritariamente constituída por ácidos graxos, os quais foram derivatizados para caracterização por Cromatografia Gasosa (GC/FID). Foram identificados 32 ácidos graxos principalmente poli-insaturados (53%). Ácidos graxos minoritários não usuais para o ambiente marinho também foram caracterizados. A esponja P. janeirensis apresentou os efeitos citotóxicos mais promissores em células de glioma e neuroblastoma humano, com um IC50 < 1,0 μg/ml para o extrato aquoso (pH 6,8), sendo este efeito pH-dependente, uma vez que o extrato (pH 5,8) não alterou a viabilidade celular. Para P. janeirensis, foi também investigado seu potencial de defesa química em modelo de Zebrafish. Foi observado que o extrato aquoso desencadeia um efeito de fuga, alterando significativamente o comportamento espaço-temporal de peixes Danio rerio. Analisando em conjunto, os dados do presente trabalho representam uma nova contribuição para o estudo químico e biológico de espécies de esponjas marinhas da costa sul-brasileira e apontam as potencialidades destas esponjas na busca de moléculas protótipos para fármacos, especialmente relacionados à terapia do câncer. / Drug discovery from marine natural products has increased in the past few years, mainly due to technological advances in spectroscopy, chemical synthesis and biotechnology. Among all marine animals, sponges represent one of the major sources of prototype metabolites for several biological activities, highlighting the antitumor effects. In this context, this study carried out chemical and biological investigation of three sponges collected on the South Brazilian coastline: Haliclona tubifera, Polymastia janeirensis and Scopalina ruetzleri. Considering the correlation between cancer, clotting disorders and imbalance of reactive oxygen species (ROS), experiments were conducted for acquisition of these activities and identification of bioactive compounds. H. tubifera showed an interesting cytotoxic effect in human neuroblastoma and glioma cell lines (IC50 <20 μg/ml), antioxidant and anticoagulant effect for ethyl acetate (EtOAc) fraction. The major compound of EtOAc fraction was isolated as an N-Boc derivative and its configuration was established using a new circular dichroism protocol with the production of semi-synthetic derivatives. This long chain sphingoid base (2R,3R,6R,Z)-2-aminooctadec-7-ene-1,3,6-triol was named as halisphingosine A. A new minor compound, halisphingosine B was obtained using nanomol scale techniques and their absolute configuration was established by comparison with compound A. Likewise, for the sponge S. ruetzleri, the EtOAc fraction showed the most promising results. A potential anticancer effect, inhibition of peroxyl radicals and modulation effect of lipid peroxidation was observed. Fingerprint 1H NMR analysis showed that this fraction is mainly constituted of fatty acids. Through Fatty Acid Methyl Ester (FAMEs) analysis by GC/FID, it was possible to identify 32 fatty acids, of which around 50% were Polyunsaturated Fatty Acids (PUFAs). In addition, some minor unusual fatty acids for the marine biosphere were identified. It was observed for P. janeirensis the most promising cytotoxic effects on human glioma and neuroblastoma cells, with an IC50 <1.0 μg/ml to aqueous extract (pH 6.8), being this effect pH-dependent, since the extract (pH 5.8) did not affect the cell viability. Moreover, P. janeirensis was investigated along their potential chemical defense in Zebrafish model. Aqueous extract trigged an escape effect, significantly altering the spatio-temporal swimming activity of animals. Taken together, the data presented from this study represent a new contribution to chemical and biological research of marine sponge species from South Brazilian coastline, and point the potentialities of sponges to search chemical prototypes for drugs, especially related to cancer therapy.

A qualidade do ar nas áreas urbanas tende a apresentar concentrações indesejáveis de contaminantes provenientes da queima de biomassa, não havendo um sistema abrangente de monitoramento. Achados in vivo mostram que o diesel pode conter compostos que modulam a atividade do estrógeno. Estudos in vitro apoiam essa ideia, como o estudo realizado com cloreto de metileno extraído do diesel que comprova atuar como ativadores de ligação para os receptores de estrógeno. Esse trabalho tem por objetivo avaliar o efeito da exposição à metais presentes nas partículas de exaustao de diesel (PED) na morfologia do ovaário através da histologia, e análise do padrão de expressão dos receptores de estrógeno (ERs) no ovário de zebrafish (Danio rerio) usando a metodologia de PCR em tempo real. Fêmeas adultas de zebrafish foram expostas à concentrações ambientais de combinado de metais (Ni = 0,181 mg/L ; Fe = 0,07455 mg/L ; Pb= 0,05 mg/ L; Cd = 0,029 mg/ L; Cr = 0,161 mg/L ; Cu = 0,017 mg / L) por 3 dias. Em relação a contagem de ovócitos atrésicos a média observada nos animais expostos foi de 1,5 ± 0,4 e nos controles foi de 1,34 ± 0,3. Contudo, não houve diferença significativa entre os grupos (p > 0,05). Na expressão dos três genes receptores de estrógeno (esr1, esr2a, esr2b) as médias foram: 0,68; 1,32; 0,54; respectivamente. No entanto, não houve alteração significativa na expressão desses genes em relação aos controles. Os elementos traços presentes nas PED em concentração ambiental e em exposição aguda na fase adulta não alteram a expressão dos ERs o também não afetam o número de folículos atrésicos nos ovários / The air quality in urban areas tends to have undesirable concentrations of contaminants from biomass combustion, without a monitoring system. In vivo findings show that diesel may contain compounds that modulate the activity of estrogen. In vitro studies support this idea, as the study with methylene chloride extract from diesel proves that this substance act as activators binding to the estrogen receptors (ERs). This study aims to evaluate the effect of exposure to metals present in diesel exhaust particles (PED) in ovary morphology through histology, and analysis of expression pattern of ERs in ovary of zebrafish (Danio rerio) using real time PCR metodology. Adult females were exposed to ambient concentrations of combined metals (Ni = 0.181 mg / L, Fe = 0.07455 mg / L Pb = 0,05 mg / L; Cd = 0.029 mg / L; = 0.161 mg Cr / L, Cu = 0.017 mg / L) for 3 days. The mean of atretic oocytes counting observed in animals exposed was 1.5 ± 0.4 and the controls was 1.34 ± 0.3. However, no significant difference between groups was observed (p> 0.05). The expression of the three genes estrogen receptor (esr1, esr2a, esr2b) mean were: 0.68, 1.32, 0.54, respectively. However, no significant change in the expression of these genes in relation to controls was observed. In conclusion, the trace elements present in the PED concentration in environmental and acute exposure in adulthood not alter the expression of ERs and does not affect the number of atretic follicles in the ovary