Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2013-10-18T18:53:21Z No. of bitstreams: 1 Vivian Galvão. Caracterizaçao de cepas...2012.pdf: 1132531 bytes, checksum: c5a7374a74f6f74d8bd7cc7573c224f5 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-10-18T18:53:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Vivian Galvão. Caracterizaçao de cepas...2012.pdf: 1132531 bytes, checksum: c5a7374a74f6f74d8bd7cc7573c224f5 (MD5) Previous issue date: 2012 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil / A doença pneumocócica invasiva (DPI) continua sendo uma das principais causas de morbidade e mortalidade no mundo, mesmo com a disponibilidade atual de terapias antimicrobianas e vacinas conjugadas. O objetivo desse estudo foi caracterizar o perfil fenotípico e genotípico das cepas invasivas de Streptococcus pneumoniae isoladas de diferentes sítos de infecção que circulam em hospitais públicos e privados da cidade de Salvador-Brasil no período de janeiro de 2008 a julho de 2011. Os isolados de S. pneumoniae de doença invasiva foram identificados por métodos microbiológicos clássicos e submetidos à determinação capsular através da técnica de Multiplex-PCR. A sensibilidade aos antimicrobianos foi determinada pela técnica de microdiluição em caldo. A caracterização genotípica foi realizada por PFGE e MLST. No período do estudo foram identificados 75 casos de DPI com cultura positiva, sendo 82,7% provenientes de hemocultura, 9,3% de líquido pleural e 8,0% de líquor. As crianças representaram 37,9% e os idosos 24,0% da população em estudo. Os sorotipos mais prevalentes foram o 14 (14,7%), 19F (13,3%), 6B (10,7%), 23F (9,3%), 3 (9,3%) e 19A (6,7%). Um total de 57,3% dos sorotipos identificados estão representados na vacina PCV10. Não-susceptibilidade à penicilina (CIM ≥ 4μg/mL) foi observada em 5,3% dos isolados. Para o SMX-TMP, tetraciclina e eritromicina, os índices de não-susceptibilidade foram de 55%, 15% e 11%, respectivamente. A tipagem por PFGE classificou 61,3% dos isolados de DPI como não-clonais e 29 (38,7%) em 10 perfis clonais. Quando comparados aos isolados de meningite isolados no Hospital Couto Maia, 22,7% apresentaram perfis semelhantes, que foram distribuídos em seis grupos clonais (quatro grupos clonais com isolados não-susceptíveis à penicilina e dois sensíveis). Foram encontrados 22 STs diferentes entre as 26 amostras caracterizadas por MLST. Quando comparado aos clones já caracterizados pelo PMEN, verificou-se que na cidade de Salvador circulam clones já identificados em outros países, a exemplo dos clones: Colombia23F-26 (SLV 338), Portugal19F-21 (ST 177), Spain9V-3 (SLV 156) e Netherlands3-31 (ST 180). Os isolados de pneumococos deste estudo apresentam maior taxa de resistência, incluindo resistência a múltiplas drogas quando comparados aos dos casos de meningite identificados em casos de meningite, com exceção da penicilina. Embora os clones mais frequentemente associados aos casos de meningite pneumocócia em Salvador tenham sido identificados nesta casuistica, os isolados de pneumococos provenientes de outras formas de doença invasiva apresentaram uma maior diversidade fenotípica e genotípica, ressaltando a importância do monitoramento contínuo das cepas invasivas nas diferentes manifestações da doença pneumocócica no tempo das vacinas conjugadas. / Invasive pneumococcal disease (IPD) remains one of the major causes of morbidity and mortality worldwide, even with the current availability of antimicrobial therapies and conjugate vaccines. The objective of the present study was to characterize the phenotypic and genotypic profiles of invasive pneumococcal isolates obtained from patients admitted to public and private hospitals in Salvador, from the period of Jan/2008 to Jul/2011. The pneumococcal isolates from invasive disease were identified by classical microbiological methods and submitted to capsular deduction by multiplex-PCR. The antimicrobial susceptibility was performed by broth microdilution method. The genotypic profile was accessing by PFGE and MLST. During the study period, 75 consecutive culture-positive cases of IPD were characterized, being 82.7% from blood, 9.3% from pleural fluid and 8.0% from CSF. The study population comprised of 37.9% of children (under 5 years old) and 24.0% of elderly (upper 64 years old). The most prevalent serotypes were: 14 (14.7%), 19F (13.3%), 6B (10.7%), 23F (9.3%), 3 (9.3%) and 19A (6.7%). A total of 57.3% of the serotypes identified are represented in the vaccine PCV10. Non-susceptibility to penicillin (MIC ≥ 4μg/mL) was observed in 5.3% of the isolates. The non-susceptibility rate for SMX-TMP, tetracycline and erythromycin was found in 55%, 15% and 11% of the isolates, respectively. The PFGE pattern analysis classified 61.3% of IPD isolates as non-clonal and 29 (38.7%) isolates were clustered in ten PFGE profiles. When the clonal strains were compared with pneumococcal meningitis isolates from Hospital Couto Maia, 22.7% showed similar profiles by PFGE, being distributed into six clonal groups (four clonal groups of penicillin non-susceptible and two of penicillin susceptible). Twenty-two STs were observed among the 26 samples characterized by MLST. When compared to already characterized PMEN clones, it was found that some circulating clones in the city of Salvador have been identified in other countries, such as: Colombia23F-26 (SLV 338), Portugal19F-21 (ST 177), Spain9V-3 (SLV 156) and Netherlands3-31 (ST 180). The pneumococcal strains in the study have a higher rate of resistance, including multidrug resistance when compared to cases of meningitis identified in the HCM, except for penicillin. Although the clones most frequently associated with cases of meningitis in Salvador have been identified in this study, isolates of pneumococci from other forms of IPD had a higher phenotypic and genotypic diversity, highlighting the importance of continuous monitoring of invasive strains in different manifestations of pneumococcal infection in the time of conjugate vaccines.

Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2015-01-27T13:46:56Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Tese - Yves Mauro Fernandes Ternes - 2014.pdf: 5561765 bytes, checksum: 46838b1cfdd58678c8db3a46e445ce06 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2015-01-28T11:32:01Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Tese - Yves Mauro Fernandes Ternes - 2014.pdf: 5561765 bytes, checksum: 46838b1cfdd58678c8db3a46e445ce06 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-01-28T11:32:01Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Tese - Yves Mauro Fernandes Ternes - 2014.pdf: 5561765 bytes, checksum: 46838b1cfdd58678c8db3a46e445ce06 (MD5) Previous issue date: 2014-04-28 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / Fundação de Apoio à Pesquisa - FUNAPE / 10-valent conjugate pneumococcal vaccine (PCV10) was introduced in the routine immunization at Goiania in June, 2010. The aims of this study were: (i) to evaluate the direct effect of PCV10 in preventing vaccine types nasopharyngeal/NP pneumococcal carriage in younger children according to different schedules; (ii) to investigate possible genetic changes that could interfere in the pneumococcal capsular typing. Methods: A cross-sectional population-based household survey was conducted in Goiania, Brazil, from December/2010-February/2011, targeting children aged 7-18 months. To evaluate PPCV10 effectiveness/VE, NP swabs, clinical and demographic data, and vaccination dates were collected from 1,287 children during home visits. Main outcome and exposure of interest were PCV10 vaccine-type (VT) carriage and dosing schedules (3p+0, 2p+0, and one catch-up dose), respectively. Pneumococcal carriage was defined by positivity in culture after of NP secretions in enrichment broth and isolates serotyping was performed by Quellung reaction. The nontypeable isolates were processed by conventional multiplex PCR (cmPCR). Rate ratio/RR was calculated as the ratio between the prevalence of VTs carriage in children vaccinated with different schedules (exposed) and not vaccinated to PCV10 (non-exposed). Adjusted RR was estimated using Poisson regression. VE on VT carriage was calculated as 1-RR*100. Results: The prevalence of pneumococcal carriage in a total of 1,287 children was 41.0% (95%CI: 38.4%-43.7%). Serotypes covered by PCV10 and PCV13 were 35.2% and 53.0%, respectively. Serotypes 6B (11.6%), 6A (9,8%), 23F (7.8%), 14 (6.8%), 19F (6.6%), and 19A (6,3%) were the most frequently observed. After adjusted for confounders, children who had received 2p+0 or 3p+0 dosing schedule presented a significant reduction on pneumococcal VT carriage, with PCV10 VE equal to 35.9% (95%CI: 4.2%-57.1%; p=0.030) and 44.0% (95%CI: 14.2%-63.5%; p=0.008), respectively, when compared with unvaccinated children. For children who received one catch-up dose, no significant VE was detected (p=0.905). We identified 13 samples with a genetic variation that underestimated the capsular typing for 19F by cmPCR. Conclusion: PCV10 was associated with high protection against vaccine-type carriage for children vaccinated before the second year of life, for 2p+0 and 3p+0 schedules. The identification of genetic variations (19Fv) allowed adapt the molecular technique (cmPCR) for capsular typing samples from Latin America. The continuous evaluation of carriage serotype is mandatory to evaluate the long-term effectiveness and impact of pneumococcal vaccine on serotypes reduction. / A vacina pneumocócica conjugada 10-valente (PCV10) foi introduzida no calendário básico de imunização em Goiânia em junho de 2010. Este estudo teve como objetivos: (i) Avaliar o efeito direto da PCV10 na redução de sorotipos vacinais de Streptococcus pneumoniae (pneumococo) na nasofaringe (NP) de crianças, de acordo com diferentes esquemas vacinais; (ii) investigar possíveis alterações genéticas que possam interferir na tipagem capsular dos pneumococos isolados. Métodos: Um estudo de corte transversal aninhado a um inquérito domiciliar de base populacional foi conduzido em Goiânia, de dezembro/2010 a fevereiro/2011, em crianças de 7-18 meses. Para avaliar a efetividade da PCV10 (VE), swabs de NP, dados clínicos e demográficos e datas da administração da vacina foram obtidos de 1.287 crianças durante as visitas domiciliares. As variáveis de desfecho e de exposição foram portador (colonização) por tipos vacinais (VTs) da PCV10 e esquemas vacinais (3p+0, 2p+0 e dose única – catch-up), respectivamente. A colonização pelo pneumococo foi definida pela positividade à cultura das secreções de NP em caldo enriquecido, e a sorotipagem dos isolados foi realizada pela reação de Quellung. Os isolados não tipáveis foram submetidos à PCR multiplex convencional (cmPCR). A razão de prevalência (rate ratio/RR) foi calculada como a razão entre a prevalência de VTs em crianças vacinadas com diferentes esquemas vacinais (expostas) e não vacinadas pela PCV10 (não expostas). A RR ajustada foi estimada utilizando a regressão de Poisson. A VE no estado de portador por VTs foi calculada como (1-RR) x 100. Resultados: A prevalência de portador pelo pneumococo no total de 1.287 crianças foi 41,0% (IC95%; 38,4-43,7). Os sorotipos presentes na PCV10 e PCV13 foram 35,2% e 53,0%, respectivamente. Os sorotipos mais frequentes foram 6B (11,6%), 6A (9,8%), 23F (7,8%), 14 (6,8%), 19F (6,6%) e 19A (6,3%). Após ajustar pelas variáveis de confusão, crianças que receberam os esquemas 2p+0 ou 3p+0 apresentaram uma redução significativa dos VTs, com VE igual a 35,9% (IC95%: 4,2-57,1; p=0,030) e 44,0% (IC95%: 14,2-63,5; p=0,008), respectivamente, quando comparado com crianças não vacinadas. Crianças que receberam dose única catch-up não apresentaram VE significante (p=0.905). Foram identificadas 13 amostras que apresentaram uma variação gênica que subestimava a tipagem capsular do 19F pela técnica cmPCR. Conclusões: a PCV10 foi associada a uma proteção significativa contra colonização nasofaringeana de VTs crianças menores de um ano, quando utilizados os esquemas vacinais 3p+0 ou 2p+0. A identificação de variações genéticas do sorogrupo 19 (19Fv) permitiu adequar a técnica de cmPCR para tipagem de amostras da América Latina. O monitoramento contínuo de sorotipos no portador é fundamental na avaliação da efetividade a longo prazo e o impacto da vacinação na redução dos sorotipos vacinais.

Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2015-03-24T13:09:38Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Fabricia Oliveira Saraiva - 2014.pdf: 5793430 bytes, checksum: 3be7faa66b91207424f429a13894dddc (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2015-03-24T14:16:10Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Fabricia Oliveira Saraiva - 2014.pdf: 5793430 bytes, checksum: 3be7faa66b91207424f429a13894dddc (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-24T14:16:10Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Fabricia Oliveira Saraiva - 2014.pdf: 5793430 bytes, checksum: 3be7faa66b91207424f429a13894dddc (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2014-11-03 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / Fundação de Apoio à Pesquisa - FUNAPE / Background: Pneumococcal 10-valent conjugate vaccine (PCV10) was introduced to the routine immunization in Brazil in 2010. During PCV10 introduction year three schedules were used: (i) children aged ≤6 months: 3 doses + 1 booster; (ii) children aged 7-11 months: 2 doses + 1 booster (2p + 1), and (iii) children 12-15 months: single dose. The aim of this study was to assess vaccination coverage and compliance with recommended schedules after the introduction of PCV10 and to identify the factors associated with greater coverage and compliance. Methods: A household survey was conducted between December 2010 and February 2011 in Goiania, GO, where the PCV10 vaccination started on June, 2010. Systematic sampling was used to recruit 1,237 children. A sociodemographic questionnaire was applied during the home visits; dates of vaccination were obtained from the vaccination card. The child's age at vaccine introduction was calculated for July 14th, 2010 (30 days after the introduction of the vaccine on routine immunization) and the child was retrospectively classified into one of three age groups: ≤6 months, 7-11 months; 12-15 months. Vaccination coverage (percentage of children who received the number of recommended doses) and compliance with schedules (percentage of children who received all valid doses at the recommended time interval) were calculated for all children and for each of the three age groups; prevalence ratios were compared by chi-square test. Log binomial regression (prevalence ratio / PR) was used to identify variables independently associated with vaccination coverage and compliance with recommended schedules. Results: The overall vaccination coverage was 53.4% (95% CI: 50.8-56.2%), varying from 88.3% (12-15 months / single dose) to 39.3% (7-11 months / 2 doses). Compliance to vaccination schedules was 16.6% (95% CI: 14.5 to 18.7%), ranging from 35.6% (≥12 months / single dose) to 6.0% (7-11 months / 2 doses). Having a private health insurance was independently associated with both vaccination coverage (PR = 1.22; 95% CI: 1.04-1.43, p=0.013) and compliance with the vaccination schedule (PR = 1.08; 95% CI: 1.01-1.15, p=0.019). Conclusions: Vaccination coverage achieved high percentages before the first year of introduction of PCV10 on routine immunization. Compliance with PCV10 recommended schedules was low, being important gap in the program. Having private health insurance was associated with compliance and vaccination coverage, which may reflect an attitude of seeking health care frequently and not only on emergencies. Initiatives to increase rates of vaccination coverage and compliance should be pursued targeting children aged 7-11 months, who are under the highest risk of acquiring pneumococcal disease. / Contexto: A vacina pneumocócica conjugada 10-valente (PCV10) foi introduzida no calendário básico de vacinação do Brasil em 2010. No ano da introdução, três esquemas vacinais foram utilizados: (i) crianças ≤6 meses: 3 doses + 1 reforço; (ii) crianças entre 7-11 meses: 2 doses + 1 reforço (2p+1), e (iii) crianças 12-15 meses: dose única (sem reforço). O objetivo deste estudo foi avaliar a cobertura vacinal e a adesão aos referidos esquemas logo após a introdução da PCV10 e identificar os fatores associados à maior cobertura e adesão. Métodos: Um inquérito domiciliar foi realizado entre dezembro de 2010 e fevereiro de 2011 em Goiânia, GO. Uma amostragem sistemática foi utilizada para recrutar 1.237 crianças. Um questionário sociodemográfico foi aplicado; as datas de vacinação foram obtidas da caderneta de vacina. A idade da criança no momento da introdução da vacina foi calculada em relação à data de 14 de julho de 2010 (30 dias após a introdução da vacina no calendário básico local) e a criança foi classificada em uma das três faixas etárias (≤6 meses; 7-11 meses; 12-15 meses). A cobertura vacinal (porcentagem de crianças que receberam o número de doses recomendadas) e a adesão aos esquemas vacinais (porcentagem de crianças que receberam todas as doses válidas e no intervalo recomendado) foram calculadas para todas as crianças e para cada uma das três faixas etárias. As razões das prevalências de cobertura e adesão foram comparadas pelo teste do qui-quadrado. Regressão log foi utilizada para a análise de regressão múltipla, a fim de identificar as variáveis independentemente associadas à cobertura vacinal e à adesão aos esquemas vacinais. Resultados: A cobertura vacinal foi de 53,4% (IC 95%: 50,8-56,2%), variando de 88,3% (12-15 meses / dose única) a 39,3% (7-11 meses / 2 doses). A adesão aos esquemas vacinais foi de 16,6% (IC 95%: 14,5-18,7%), variando de 35,6% (12-15 meses / dose única) a 6,0% (7-11 meses / 2 doses). Ter um plano de saúde privado apresentou associação independente tanto com a cobertura vacinal (RP = 1,22; IC 95%: 1,04-1,43; p = 0,013) quanto com a adesão aos esquemas vacinais (RP = 1,08; IC 95%: 1,01-1,15; p = 0,019). Conclusões Durante o primeiro ano de introdução da PCV10 no calendário básico, a cobertura vacinal alcançou porcentagens expressivas. A adesão aos esquemas recomendados para PCV10 foi baixa, sendo importante lacuna no programa. Ter plano de saúde privado esteve associado à adesão e à cobertura vacinal, o que pode refletir uma atitude de procurar assistência à saúde com maior frequência e não apenas em situações de emergência. Iniciativas para aumentar as taxas de cobertura vacinal e de adesão devem ser implantadas, especialmente entre crianças no segundo semestre de vida, as quais estão no grupo de maior risco para doenças pneumocócicas.

INTRODUÇÃO: A doença pneumocócica invasiva (DPI) tem alta mortalidade sendo o pulmão órgão de intenso acometimento. Na DPI caracterizou-se localmente importante processo inflamatório agudo com expressivo aumento de macrófagos, polimorfonucleares e fenômenos exsudativos como edema e hemorragia intra-alveolar. Concretizou-se uma resposta inflamatória proeminente com redução dos fenômenos de apoptose que se traduziu por aumento significativo de citocinas pró-inflamatórias, exceto IL-6 e IL-8, aumento de Toll-2, ativação do complemento, aumento de expressão de ICAM- 1 e CD 14 que em conjunto favorecem o estabelecimento dos fenômenos inflamatórios. A diminuição significativa das células NK e das células de Langherhans, IL-6 e IL-8 reflete comprometimento da imunidade inata. Tal comprometimento poderia ser responsável pela diminuição dos linfócitos TCD4+ e TCD8+ com consequente baixa produção de IFN. Em resumo, as lesões teciduais graves na DPI seriam decorrentes do comprometimento parcial da imunidade inata, em especial das células NK e das células de Langherhans, do prejuízo da imunidade adaptativa e da redução da apoptose como possível estratégia defensiva do pneumococo / INTRODUCTION: Invasive pneumococcal disease (IPD) is a condition with high mortality rates, the lungs being intensely attacked. The in situ immune response was determined, in blocks recovered from 22 necropsies of adults who died from IPD in the lungs, by quantitative immune cell phenotype (CD57-NK, CD1a, CD68, antigen S-100, TCD4, TCD8, CD20), Complement-C3, ICAM-1, CD14, Caspase-3 and cytokine (interferon , TNF, TGF, interleukin - IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL- 10), Toll-2 and SP-A (surfactant). A locally important acute inflammation process was characterized in IPD, with significant rise in macrophages, neutrophils and exsudative phenomena such as edema and intra-alveolar hemorrhage. Compared with the lungs from age-matched controls, results from patients with IPD showed significant depletion of NK, CD1a,CD4+, CD8+, CD20+ cells, interferon , IL-4, IL- 6 , IL-8, TGF and Caspase-3 (apoptosis). On the other hand, S-100, Toll-2, IL-1, IL-2R, IL-10, ICAM-1, CD14 and SP-A were more frequently seen in the alveoli of patients with IPD than in controls. A pronounced inflammatory response was detected, with decrease in apoptosis phenomena that translated into significant increase of pro-inflammatory cytokines, except for IL-6 and IL-8, increase in Toll-2, complement activation, increased ICAM-1 and CD-14 expression, which altogether favored installation of the inflammatory processes. A significant decrease in NK and Langherhans cells, IL-6 and IL-8 reflect the harm to the innate immune system. This could respond for the decrease in TCD4+ and TCD8+ lymphocytes, with a consequent low IFNy output. Briefly, the severe tissue lesions in IPD could be a consequence of the partial damage to the innate immunity, particularly of NK and Langherhans cells, of adaptive immune dysfunction, and of apoptosis reduction possibly as a defense strategy of the pneumococcus

C-reactive protein (CRP) is a part of the innate immune system, is synthesized in the liver, its blood level increases in inflammatory states, and it binds to Streptococcus pneumoniae. The conformation of CRP is altered under conditions mimicking an inflammatory milieu and this non-native CRP also binds to immobilized/aggregated/pathogenic proteins. Experiments in mice have revealed that one of the functions of CRP is to protect against pneumococcal infection. For protection, CRP must be injected into mice within two hours of administering pneumococci, thus, CRP is protective against early-stage infection but not against late-stage infection. It is unknown how CRP protects or why CRP does not protect against late-stage infection. The hypotheses are that the protection requires complement activation by CRP-pneumococci complexes and that CRP cannot protect if pneumococci have time to recruit complement inhibitor factor H on their surface to become complement attack-resistant. To test these hypotheses, we generated CRP mutants by site-directed mutagenesis: a mutant that binds to pneumococci but does not activate complement and a mutant that binds to immobilized factor H. We found that mutant CRP incapable of activating complement was not protective against infection and that mutant CRP capable of binding to factor H was protective against both early and late stage infections. Additional experiments showed that CRP enhances the effects of the antibiotic clarithromycin in reducing bacteremia in infected mice. Moreover, we observed that mutant CRP capable of binding to factor H bound to several proteins immobilized on plastic, suggesting that CRP recognizes a pattern, probably an amyloid-like structure, on immobilized proteins. Indeed, mutant CRP, after binding to amyloid b peptides, prevented the formation of pathogenic amyloid fibrils. Lastly, employing a hepatic cell line, we investigated the mechanism of CRP expression in response to pro-inflammatory cytokines. We found that the transcription factor C/EBPb and two C/EBP-binding sites on the CRP promoter were critical for inducing CRP expression. We conclude that complement activation is necessary for CRP-mediated protection against infection, that CRP functions in two structural conformations, that CRP and clarithromycin act synergistically, that CRP has anti-amyloidogenic properties, and the increased CRP expression requires C/EBPb.

Background: The 5 subunits of native pentameric C-reactive protein (CRP) are dissociated to generate the monomeric form of CRP (mCRP) in some in vitro conditions, both physiological and non-physiological, and also in vivo. Many bioactivities of mCRP generated by urea-treatment of CRP and of mCRP generated by mutating the primary structure of CRP have been reported. The bioactivities of mCRP generated by spontaneous dissociation of CRP are largely unexplored. Methods: We purified mCRP generated by spontaneous dissociation of CRP and investigated the binding of mCRP to enzymatically-modified low-density lipoprotein (E-LDL). Results: mCRP was approximately 60 times more potent than CRP in binding to E-LDL. In the presence of the small-molecule compound phosphoethanolamine (PEt), at 37 °C, the binding of mCRP to E-LDL was enhanced <2-fold, while the binding of CRP to E-LDL was enhanced >10-fold. In contrast, PEt inhibited the binding of both CRP and mCRP to pneumococcal C-polysaccharide, another phosphocholine-containing ligand to which CRP and mCRP were found to bind. We have not investigated yet whether PEt alters the structure of CRP at 37 °C. Conclusions: Combined data suggest that the targeting of CRP with the aim to monomerize CRP in vivo may be an effective approach to capture modified forms of LDL.

Pneumonia is one of the leading causes of death worldwide. The course of the disease is often highly dynamic with unforeseen critical deterioration within hours in a relevant proportion of patients. Besides antibiotic treatment, novel adjunctive therapies are under development. Their additive value needs to be explored in preclinical and clinical studies and corresponding therapy schedules require optimization prior to introduction into clinical practice. Biomathematical modeling of the underlying disease and therapy processes might be a useful aid to support these processes. We here propose a biomathematical model of murine immune response during infection with Streptococcus pneumoniae aiming at predicting the outcome of different treatment schedules. The model consists of a number of non-linear ordinary differential equations describing the dynamics and interactions of the pulmonal pneumococcal population and relevant cells of the innate immune response, namely alveolar- and inflammatory macrophages and neutrophils. The cytokines IL-6 and IL-10 and the chemokines CCL2, CXCL1 and CXCL5 are considered as major mediators of the immune response. We also model the invasion of peripheral blood monocytes, their differentiation into macrophages and bacterial penetration through the epithelial barrier causing blood stream infections. We impose therapy effects on this system by modelling antibiotic therapy and treatment with the novel C5a-inactivator NOX-D19. All equations are derived by translating known biological mechanisms into equations and assuming appropriate response kinetics. Unknown model parameters were determined by fitting the predictions of the model to time series data derived from mice experiments with close-meshed time series of state parameters. Parameter fittings resulted in a good agreement of model and data for the experimental scenarios. The model can be used to predict the performance of alternative schedules of combined antibiotic and NOX-D19 treatment. We conclude that we established a comprehensive biomathematical model of pneumococcal lung infection, immune response and barrier function in mice allowing simulations of new treatment schedules. We aim to validate the model on the basis of further experimental data. We also plan the inclusion of further novel therapy principles and the translation of the model to the human situation in the near future.

Streptococcus pneumoniae é causa de doenças como pneumonia, otite, meningite e sepse. As vacinas hoje disponíveis têm cobertura limitada porque são baseadas no polissacarídeo capsular, que varia com os mais de 90 sorotipos da bactéria, além de levarem à substituição de sorotipos na população por outros não presentes nas formulações. Visando reduzir o custo e aumentar a cobertura, têm-se estudado vacinas baseadas em proteínas que ofereceriam proteção independente de sorotipo. Este trabalho teve por objetivo a obtenção, avaliação da estabilidade e da resposta imune em camundongos de híbridos de duas proteínas de S. pneumoniae: a proteína de superfície do pneumococo (PspA) e a pneumolisina geneticamente detoxificada (PdT), sem ou com espaçadores moleculares, rígido ou flexível, entre as moléculas. Os genes dos híbridos com espaçadores foram clonados através da técnica de overlap extension PCR. O gene das proteínas foi expresso em E. coli e as proteínas obtidas foram reconhecidas por anticorpos produzidos contra a célula inteira de pneumococo através de Western Blot. A purificação dos híbridos foi feita utilizando homogeneizador de alta pressão, precipitação de impurezas com detergente catiônico CTAB e diferentes etapas cromatográficas. A estabilidade foi analisada periodicamente através de SDS-PAGE e Western Blot. O híbrido sem espaçador mostrou-se instável, por isso a presença de atividade proteolítica foi investigada através de diversos ensaios para detecção dessas enzimas, mostrando que a instabilidade não decorreu de hidrólise por proteases. Os fragmentos resultantes da quebra tiveram a porção N-terminal sequenciada para identificar o sítio de clivagem, que estava localizado na junção das duas proteínas. Esse sítio foi retirado das construções seguintes e espaçadores moleculares foram incluídos entre os dois antígenos. A molécula com espaçador flexível foi obtida na forma solúvel durante o cultivo, porém durante a purificação ocorreu precipitação irreversível. O clone para produção do híbrido com espaçador rígido permitiu a obtenção da proteína, que foi purificada e teve a estabilidade avaliada periodicamente à 4&deg; C e -20&deg; C por Western Blot empregando anticorpos contra célula inteira de pneumococo, indicando que a introdução do espaçador rígido aumentou a estabilidade do híbrido em relação à molécula sem espaçador. Além disso, diferentes concentrações de estabilizantes foram avaliadas, mostrando que em presença de trealose 1M ou glicerol 50&#37; o híbrido com linker rígido permaneceu estável por pelo menos 4 meses a 4&deg; C. A molécula com espaçador rígido produziu níveis de anticorpos em camundongos comparáveis aos níveis obtidos com a molécula sem espaçador, que foram capazes de proteger 100&#37; dos animais em ensaio de desafio letal intranasal e inibir a atividade hemolítica da pneumolisina. O aumento de estabilidade do híbrido alcançado com a inserção do linker rígido juntamente com a retirada do sítio de clivagem e com a presença de estabilizantes permitem que esta molécula seja utilizada numa vacina pneumocócica proteica. Como estudos vêm demonstrando que seria necessário mais de uma proteína para formular esta nova vacina, a produção deste híbrido traz a grande vantagem de obtenção de dois antígenos em um único processo de produção, o que pode resultar em uma diminuição do custo da dose. / Streptococcus pneumoniae is cause of diseases like pneumonia, otitis, menngitis and sepsis. The vaccines available nowadays has limited coverage because they are based on the capsular polysaccharyde, which varies among the more than 90 bacteria serotypes and they lead to serotype substitution on the population for others not present on the vaccine formulations. In order to reduce the cost and increase the coverage, vaccines based on pneumococcal proteins that would offer serotype independent protection have been studied. The objective of this thesis was the obtainment, stability evaluation and immune response evaluation in mice of hybrids composed of two proteins of S. pneumoniae: pneumococcal surface protein A (PspA) and genetically detoxified pneumolysin (PdT), with or without molecular linkers, rigid and flexible, between the molecules. The genes with molecular linkers were cloned using the overlap extension PCR technique. The genes were expressed in E. coli and the proteins were recognized by anti pneumococcal whole cell in Western Blot. The hybrids were purified using high pressure homogeneizer, precipitation of impurities using cationic detergent CTAB and different chromatography steps. The stability was periodically analyzed through SDS-PAGE and Western Blot. The hybrid without linker was unstable and the presence of proteolytic activity was investigated through several methods for protease activity detection, showing that instability was not due to protease hydrolysis. The N-terminal portion of the degraded protein fragments was sequenced in order to identify the cleavage site, which was localized exactly between the two proteins. This site was removed from the other hybrids and molecular linkers were included between the two antigens. The molecule with flexible linker was obtained on the soluble form during expression, but during purification it precipitated irreversibly. The molecule with rigid linker were expressed, purified and had its stability analyzed periodically at 4&deg; C and -20&deg; C by Western Blot using anti pneumococcal whole cell, indicating that the insertion of the rigid linker increased the hybrid stability when compared with the hybrid without linker. Besides that, different stabilizers in different concentrations were evaluated and it was found that the presence of trehalose 1 M or 50&#37; glycerol stabilized the hybrid with rigid linker for at least 4 months at 4 &deg; C. The molecule with rigid linker produced levels of antibodies in mice comparable to the hybrid without linker. These antibodies were able to protect 100&#37; of animals from lethal intranasal challenge and inhibit the haemolytic activity of pneumolysin. The stability increase due to the rigid linker together with the removal of the cleavage site and the stabilizers presence allow this hybrid molecule to be used on a novel pneumococcal vaccine. Since studies have shown that it would be necessary more than one protein to formulate this new vaccine, the production of this hybrid brings the great advantage of producing two antigens in one single process, which can decrease the dosage cost.

O Streptococcus pneumoniae (pneumococo) constitui um dos mais importantes patógenos bacterianos do trato respiratório, podendo causar infecções invasivas e não invasivas, levando a altas taxas de morbimortalidade, particularmente em crianças menores de cinco anos de idade. A bactéria ganha acesso ao hospedeiro através da colonização da nasofaringe, que representa um importante reservatório para a transmissão deste patógeno na comunidade, contribuindo para a disseminação horizontal de pneumococo entre os indivíduos de uma população. As doenças respiratórias causadas por pneumococo constituem em uma das prioridades atuais em Saúde Pública, recebendo atenção destacada das organizações internacionais da área da saúde, como a Organização Mundial da Saúde. No presente trabalho procura-se conhecer e avaliar a ocorrência da pneumonia adquirida na comunidade (PAC) antes e após a implantação no Calendário Vacinal da Vacina Pneumocócica-10 Valente Conjugada em 2010, na área de abrangência da Superintendência Regional de Saúde (SRS) de Alfenas/MG. Foi realizado um estudo ecológico com componente temporal que incluiu registros de crianças menores que um ano de idade, vacinadas e não vacinadas com a vacina antipneumocócica 10-valente conjugada, no período pré e pós inclusão da vacina no PNI nos municípios da Superintendência Regional de Saúde (SRS) de Alfenas/MG, sendo a vacinação o fator de exposição e a ocorrência de PAC o desfecho, utilizando dados anuais secundários por município para cálculo da cobertura vacinal e das taxas de morbidade por pneumonia em menores de um ano no período de 2007 a 2013. Considerando se os 26 municípios da SRS de Alfenas, houve redução significativa do número de casos de PAC em crianças abaixo de um ano de idade, cuja Razão de Prevalência foi de 0,81 (IC95%: 0,74 0,89; p<0,05). Mesmo com um tempo reduzido de uso, a vacina pneumocócica conjugada 10 valente apresentou um impacto relevante na redução de PAC em crianças, ajustada por cobertura vacinal no período pós vacinação (2011-2013), sendo estatisticamente significativa na maioria dos municípios, o que sugere a efetividade da vacina PCV-10 na prevenção de casos da doença em crianças menores de um ano de idade. / The Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) is one of the most important bacterial pathogens of the respiratory tract, may cause invasive and non-invasive infections, leading to high morbidity and mortality rates, particularly in children under five years of age. The bacteria gain access to the host through the nasopharyngeal colonization, which is an important reservoir for the transmission of this pathogen in the community, contributing to the horizontal spread among individuals in a population. Respiratory diseases caused by pneumococcus are in one of the current priorities in Public Health, receiving outstanding attention of international organizations in the health field, such as the World Health Organization. In the present study we aimed to understand and evaluate the occurrence of community acquired pneumonia (CAP) before and after implantation in 10- valent pneumococcal conjugate vaccine in 2010, on the coverage area of the Regional Health Service (SRS) of Alfenas / MG. An ecological study with temporal component was conducted which included records of children under one year old, vaccinated and not vaccinated with 10-valent pneumococcal conjugate vaccine, before and after period inclusion of the vaccine in PNI, in the municipalities of SRS of Alfenas / MG, with vaccination the exposure factor and the occurrence of CAP the outcome, using annual data side by municipality to calculate vaccination coverage and pneumonia morbidity in children under one year old, in the period 2007 to 2013. Considering the 26 municipalities of SRS Alfenas, there was a significant reduction in the number of CAP cases in children under one year old. The prevalence ratio was 0.81 (95%CI: 0.74 - 0.89; p<0.05). Even with a short period of use, the 10-valent pneumococcal conjugate vaccine had a significant impact on the reduction of CAP in children, adjusted for immunization coverage in the post vaccination period (2011-2013) and was statistically significant in most municipalities, which suggests the effectiveness of PCV-10 vaccine in preventing cases of the disease in children under one year of age.

Estudos recentes têm apresentado resultados in vitro satisfatórios em pacientes com Imunodeficiência Comum Variável (ICV) que receberam vacinas contra tétano, influenza e meningococo. No entanto, existem poucos ensaios clínicos que avaliem a resposta clínica e laboratorial após a exposição a antígenos específicos. O presente estudo tem como objetivo avaliar a resposta clínica à imunização contra antígenos protéicos e polissacarídicos (influenza, H1N1 e pneumococo) em pacientes com diagnóstico de ICV seguidos no ambulatório de Imunodeficiências Primárias do Serviço de Imunologia Clínica e Alergia do HC-FMUSP. O diagnóstico dos pacientes foi estabelecido de acordo com os critérios da OMS / PAGID / ESID. Um grupo de 37 pacientes foi vacinado contra a influenza A (H2N3), gripe H1N1 e pneumococo e outro grupo com 16 pacientes, não foi vacinado. A avaliação clínica foi realizada através da aplicação de um score com avaliação dos seguintes parâmetros clínicos: pneumonia, sinusite, otite média, infecções de vias aéreas superiores (IVAS), amigdalites, diarréia, bronquiectasias, hospitalizações, uso de antibióticos, uso de antibióticos profiláticos, sepse e meningite. O score foi aplicado durante os 12 meses que precederam a vacinação e 12 meses posteriores à administração das vacinas. O mesmo score foi aplicado ao grupo controle, com os pacientes que não foram vacinados. A determinação da IgG contra os sorotipos do pneumococo foi feita por ELISA. A determinação da IgG específica H1N1 foi feita por hemaglutinação indireta, enquanto que a dosagem da IgG específica para influenza, por ELISA, utilizando o kit comercial RIDASCREEN ® Influenza. O grupo de pacientes vacinados incluiu 37 pacientes (51% mulheres), com idade entre 20 e 78 anos (mediana= 33 anos). Observou-se uma mediana de 7 anos de atraso no diagnóstico de ICV. A mediana de idade do grupo de pacientes (n=16, 37,5% mulheres) que não receberam a vacina foi de 41 anos e a mediana de atraso no diagnóstico foi de 8 anos. Observamos que as infecções de vias aéreas superiores (IVAS), sinusites e pneumonias foram as manifestações mais freqüentes no grupo controle. IVAS seguida por pneumonia e sinusite foram as manifestações infecciosas mais freqüentes em mulheres (80%, 78% e 55%, respectivamente). Entretanto, em homens observamos IVAS seguido por sinusite e pneumonia (78%, 65% e 35%, respectivamente). Observou-se redução significativa no score relativo ao número de infecções respiratórias superiores, sinusites e pneumonias um ano após a administração das vacinas (p <0,001). Os dados foram comparados com pacientes ICV não vacinados e neste grupo não houve diferença entre os scores dos dois períodos de 12 meses . Após a vacinação, observou-se uma tendência a aumento no título de anticorpos específicos para a H2N3, mas sem resultado significativo. Em relação aos resultados obtidos com as sorologias para o H1N1 e o pneumococo, não se observou resposta após a vacinação. Concluindo, houve redução do número de infecções, principalmente das IVAS, sinusites e pneumonias em pacientes com ICV após a vacinação contra a influenza, H1N1 e pneumococo. Embora não tenhamos encontrado correlação entre a redução do número de infecções e os títulos de anticorpos específicos para as vacinas testadas, a melhora clínica observada nos pacientes com ICV reforça o benefício da vacinação / Recent studies have shown satisfactory in vitro results in patients with CVID who received immunization against tetanus, influenza and meningococcus. However, there are only a few studies that evaluate the clinical and laboratory response after exposure to specific antigens in these patients. This study aims to evaluate the clinical response to immunization with protein and polysaccharide antigens (influenza, H1N1 and pneumococcus) in CVID patients followed at the Primary Immunodeficiency outpatient clinic of the Division of Clinical Immunology and Allergy, Hospital das Clínicas, FMUSP. CVID patients were diagnosed according the WHO/PAGID/ ESID criteria. Thirty-seven patients were immunized against influenza (H2N3), H1N1 and pneumococcal polysaccharide vaccine while another group with 16 CVID patients were not vaccinated. Clinical evaluation was performed through a score with assessment of the following parameters: pneumonia, sinusitis, otitis media, upper respiratory infections (URI), tonsillitis, diarrhea, bronchiectasis, hospitalizations, use of antibiotic therapy, and use of prophylactic antibiotics, sepsis and meningitis. The score was applied during the 12 months prior to immunization and one year after the administration of vaccines. The same score was applied to the group of CVID patients who weren´t immunized. Determination of IgG antibodies to pneumococcal serotypes was made by ELISA. H1N1-specific IgG was detected by indirect hemagglutination while the determination of influenzaspecific IgG was performed by ELISA, using the RIDASCREEN ® Influenza kit. The group of patients who were vaccinated included 37 patients (51% women), aged 20 to 78 years (mean 33 years). This group presented a median delay in the diagnosis of 7 years. The control group consisted of 16 patients (37.5% females) who were not immunized. Their median age was 41 years and the median delay in the diagnosis was 8 years. URI followed by pneumonia and sinusitis were the most frequent infections in women (80%, 78% and 55% respectively). However in men, URI followed by sinusitis and pneumonia were the most frequent (78%, 65% and 35% respectively). We observed a significant reduction in the score of URI, sinusitis and pneumonias in the year post administration of the vaccines (p <0.001). Conversely, there was no difference in the infections pre and post supposed vaccination scores in the group of CVID patients who were not immunized. There was no significant change in specific antibody titers to influenza and pneumococcus after vaccination. Regarding H1N1, there was no statistically significant production of antibodies to H1N1, although we observed a slight non-durable increase in antibody titers. In conclusion, there was a reduction in the number of infections, mainly sinusitis, URIs and pneumonias in patients with CVID vaccinated against influenza, H1N1 and pneumococcus. While we found no correlation between the reduction in the number of infections and specific antibody titers for the vaccines administered, the clinical improvement observed in CVID patients reinforces the benefit of vaccination