CAPES / Polissacarídeos são muito estudados e aplicados a processos industriais e biotecnológicos, devido à grande variedade e versatilidade. As β-glucanas, polissacarídeos à base de glicose, por sua vez podem apresentar diversas aplicações biológicas interessantes tais como, atividade antitumoral, antioxidante e imonomoduladora e têm sido obtidas em vários estudos, por meio de fungos na forma de exopolissacarídeos. Todavia algumas β-glucanas fúngicas apresentam limitações nas aplicações biológicas devido à baixa solubilidade em água. Para melhorar este aspecto e ainda possibilitar aumento das atividades biológicas são sugeridas derivatizações químicas, a exemplo da fosforilação, que possibilitam obtenção de materiais mais solúveis em água e com aumento das atividades e do potencial tecnológico. Assim, este trabalho teve como objetivo a obtenção e caracterização de derivados fosforilados da (1→6)-β-D-glucana (lasiodiplodana) produzida pelo fungo Lasiodiplodia theobromae MMPI, visando macromoléculas mais solúveis em relação à lasiodiplodana nativa e ainda apontar outras modificações passíveis de ampliação de potenciais tecnológicos. A determinação da modificação estrutural por fosforilação foi obtida por meio das técnicas espectroscópicas FTIR e RMN (¹³C e ³¹P) sobretudo ³¹P RMN que possibilitou identificar sinais atribuídos a ésteres de fosfato. As amostras fosforiladas apresentaram DS baixos entre 0,0251 e 0,0499, com indicação de relação inversa entre DS e concentração dos derivatizantes TMFS e TPFS utilizados para fosforilação. Com processo de fosforilação foram alcançados aumentos na solubilidade em água para todas amostras em relação a lasiodiplodana nativa. Também foram alcançados maiores valores de potencial zeta relacionados ao caráter mais aniônico dos derivados fosforilados, bem como redução dos tamanhos médios de partícula, de 1002 para até 252,5 nm. Os padrões de difração das amostras de lasiodiplodana nativa e das fosforiladas evidenciaram característica de materiais parcialmente cristalinos. A macroestrutura das amostras fosforiladas, apresentou formações de fibrilas como resultado da inserção dos grupamentos fosfato. Tanto a lasiodiplodana nativa, quanto as amostras fosforiladas, apresentaram boa estabilidade térmica, com etapas de perda de massa associadas à perda de água, degradação térmica e carbonização, com pequenas diferenças entre as amostras. De acordo com os resultados, a fosforilação da lasiodiplodana contribuiu para ampliação dos potenciais de aplicação biológica e tecnológica. / Polysaccharides have been extensively studied and applied to industrial and biotechnological processes, due to the great variety and versatility. β-glucans, glucose-based polysaccharides, in turn may present several interesting biological applications such as antitumor, antioxidant and imonomodulatory activity and have been obtained in several studies, through fungi in the form of exopolysaccharides. However, some fungal β-glucans have limitations in biological applications due to the low solubility in water. In order to improve this aspect and to increase the biological activities, chemical derivations are suggested, such as phosphorylation, which make it possible to obtain more soluble materials in water and with increased activities and technological potential. Thus, this work had the objective of obtaining and characterizing phosphorylated derivatives of (1→6)-β-D-glucan (lasiodiplodan) produced by the fungus Lasiodiplodia theobromae MMPI, aiming at more soluble macromolecules in relation to the native lasiodiplodana and to point out other modifications technological potential. The determination of the structural modification by phosphorylation was obtained by FTIR and RMN (¹³C and ³¹P) spectroscopic techniques, especially ³¹P RMN, which enabled the identification of signals attributed to phosphate esters. Phosphorylated samples showed low DS between 0.0251 and 0.0499, indicating the inverse relationship between DS and concentration of the derivatives TMFS and TPFS used for phosphorylation. Phosphorylation process increased the water solubility for all samples compared to native lasiodiplodana. Higher zeta potential values related to the more anionic character of the phosphorylated derivatives were also achieved, as well as reduction of the average particle sizes from 1002 to 252,8 nm. The diffraction patterns of native and phosphorylated lasiodiplodana samples showed the characteristic of partially crystalline materials. The macrostructure of the phosphorylated samples presented fibril formations as a result of the insertion of the phosphate groups. Both the native lasiodiplodana and the phosphorylated samples presented good thermal stability, with mass loss stages associated with loss of water, thermal degradation and carbonization, with small differences between the samples. According to the results, the phosphorylation of lasiodiplodana contributed to the amplification of biological and technological application potentials.

CAPES / Polissacarídeos são muito estudados e aplicados a processos industriais e biotecnológicos, devido à grande variedade e versatilidade. As β-glucanas, polissacarídeos à base de glicose, por sua vez podem apresentar diversas aplicações biológicas interessantes tais como, atividade antitumoral, antioxidante e imonomoduladora e têm sido obtidas em vários estudos, por meio de fungos na forma de exopolissacarídeos. Todavia algumas β-glucanas fúngicas apresentam limitações nas aplicações biológicas devido à baixa solubilidade em água. Para melhorar este aspecto e ainda possibilitar aumento das atividades biológicas são sugeridas derivatizações químicas, a exemplo da fosforilação, que possibilitam obtenção de materiais mais solúveis em água e com aumento das atividades e do potencial tecnológico. Assim, este trabalho teve como objetivo a obtenção e caracterização de derivados fosforilados da (1→6)-β-D-glucana (lasiodiplodana) produzida pelo fungo Lasiodiplodia theobromae MMPI, visando macromoléculas mais solúveis em relação à lasiodiplodana nativa e ainda apontar outras modificações passíveis de ampliação de potenciais tecnológicos. A determinação da modificação estrutural por fosforilação foi obtida por meio das técnicas espectroscópicas FTIR e RMN (¹³C e ³¹P) sobretudo ³¹P RMN que possibilitou identificar sinais atribuídos a ésteres de fosfato. As amostras fosforiladas apresentaram DS baixos entre 0,0251 e 0,0499, com indicação de relação inversa entre DS e concentração dos derivatizantes TMFS e TPFS utilizados para fosforilação. Com processo de fosforilação foram alcançados aumentos na solubilidade em água para todas amostras em relação a lasiodiplodana nativa. Também foram alcançados maiores valores de potencial zeta relacionados ao caráter mais aniônico dos derivados fosforilados, bem como redução dos tamanhos médios de partícula, de 1002 para até 252,5 nm. Os padrões de difração das amostras de lasiodiplodana nativa e das fosforiladas evidenciaram característica de materiais parcialmente cristalinos. A macroestrutura das amostras fosforiladas, apresentou formações de fibrilas como resultado da inserção dos grupamentos fosfato. Tanto a lasiodiplodana nativa, quanto as amostras fosforiladas, apresentaram boa estabilidade térmica, com etapas de perda de massa associadas à perda de água, degradação térmica e carbonização, com pequenas diferenças entre as amostras. De acordo com os resultados, a fosforilação da lasiodiplodana contribuiu para ampliação dos potenciais de aplicação biológica e tecnológica. / Polysaccharides have been extensively studied and applied to industrial and biotechnological processes, due to the great variety and versatility. β-glucans, glucose-based polysaccharides, in turn may present several interesting biological applications such as antitumor, antioxidant and imonomodulatory activity and have been obtained in several studies, through fungi in the form of exopolysaccharides. However, some fungal β-glucans have limitations in biological applications due to the low solubility in water. In order to improve this aspect and to increase the biological activities, chemical derivations are suggested, such as phosphorylation, which make it possible to obtain more soluble materials in water and with increased activities and technological potential. Thus, this work had the objective of obtaining and characterizing phosphorylated derivatives of (1→6)-β-D-glucan (lasiodiplodan) produced by the fungus Lasiodiplodia theobromae MMPI, aiming at more soluble macromolecules in relation to the native lasiodiplodana and to point out other modifications technological potential. The determination of the structural modification by phosphorylation was obtained by FTIR and RMN (¹³C and ³¹P) spectroscopic techniques, especially ³¹P RMN, which enabled the identification of signals attributed to phosphate esters. Phosphorylated samples showed low DS between 0.0251 and 0.0499, indicating the inverse relationship between DS and concentration of the derivatives TMFS and TPFS used for phosphorylation. Phosphorylation process increased the water solubility for all samples compared to native lasiodiplodana. Higher zeta potential values related to the more anionic character of the phosphorylated derivatives were also achieved, as well as reduction of the average particle sizes from 1002 to 252,8 nm. The diffraction patterns of native and phosphorylated lasiodiplodana samples showed the characteristic of partially crystalline materials. The macrostructure of the phosphorylated samples presented fibril formations as a result of the insertion of the phosphate groups. Both the native lasiodiplodana and the phosphorylated samples presented good thermal stability, with mass loss stages associated with loss of water, thermal degradation and carbonization, with small differences between the samples. According to the results, the phosphorylation of lasiodiplodana contributed to the amplification of biological and technological application potentials.

Realizamos estudos, por espectroscopia de fluorescência de estado estacionário e resolvida no tempo, de dinâmica conformacional de três famílias de peptídeos: o terminal carboxílico do peptídeo neuroendócrino (7B2CT); o peptídeo estimulador do melanócito (alfa-MSH); e os peptídeos derivados da seqüência consensual de peptídeos que se ligam a heparina (peptídeo Cardin). Utilizamos os métodos de fluorescência baseados na supressão da emissão do fluoróforo presente no peptídeo, tanto por interação colisional com um supressor como por transferência de energia para um grupo aceitador presente no peptídeo. No segundo caso, dentro da hipótese de que diferentes conformações do peptídeo estão presentes durante o decaimento da fluorescência, supusemos que o decaimento da intensidade era modulado por uma função de distribuição de distâncias doador-aceitador, f(r). Foi desenvolvido um procedimento computacional usando o programa CONTIN, para recuperar, a partir dos dados de fluorescência resolvida no tempo, a distribuição de distância entre o doador e o aceitador presentes nos peptídeos. A metodologia se mostrou útil para obter informações quantitativas sobre a dinâmica conformacional dos peptídeos, sua dependência com o solvente e sua interação com outras moléculas presentes no meio. O peptídeo 7B2CT e seus análogos A12 e A18 foram estudados pela fluorescência da tirosina, presente na posição cinco na seqüência de aminoácidos. Não houve diferenças significativas no decaimento da intensidade, no decaimento da anisotropia e na supressão por iodeto entre os três peptídeos, que pudessem ser correlacionados com as diferenças observadas na inibição da pro-hormone convertase 2 (PC2). O peptídeo alfa-MSH e seu análogo mais potente [Nle(4),0-Phe(7)] alfa-MSH (NDP-alfa-MSH), que contém o resíduo fluorescente triptofano, foram modificados no seu terminal amino com o grupo ácido amino benzóico (Abz), e foram estudados por métodos de fluorescência. Observamos transferência de energia entre o resíduo triptofano, atuando como doador, e o aceitador o-Abz. Verificamos a uma ampla distribuição de distâncias Trp-o-Abz para o alfa-MSH em água, enquanto três populações de distâncias foram observadas para o análogo modificado NDP-alfa-MSH em água, indicando estados com conformações distintas para o petídeo sintético, comparado com o hormônio nativo. Medidas em trifluoroetanol resultaram em duas populações de distâncias, tanto para o hormônio nativo como para o hormônio análogo, refletindo a diminuição, induzida pelo solvente, das conformações disponíveis para os peptídeos. Os peptídeos Cardin foram estudados na presença de heprarina, de micelas de SDS e na mistura TFE/água. O grupo fluorescente Abz foi incorporado no terminal amino e o grupo aceitador etilenodiamina-N-[2,4- dinitrofenil] (Eddnp) foi incorporado ao terminal carboxílico dos peptídeos. A distribuição de distâncias entre as extremidades, recuperadas dos dados de fluorescência resolvida no tempo, indicaram a presença de conformações estendidas em solução aquosa e a ocorrência de conformações compactas na interação com heparina e SDS ou em soluções com TFE. As distâncias entre as extremidades recuperadas foram maiores que aquelas esperadas para osI peptídeos na conformação hélice alfa, sugerindo a ocorrência de estruturas dobradas além da hélice alfa. A metodologia da transferência de energia se mostrou útil para os estudos de dinâmica de peptídeos em solução. / Steady state and time-resolved fluorescence spectroscopy were used to study the conformational dynamics of three families of peptides: the carboxyl terminal of the neuroendocrine peptide (782Cl), the alpha melanocytestimulating hormone (alpha-MSH) and heparin-binding consensus sequence peptides (Cardin motif peptides). The fluorescence methods were based on quenching of the emission of a fluorophore present in the peptide, either by collisional interaction with a quencher, as by energy transfer to an acceptor group. In the second case, within the hypothesis that different peptide conformations are in equilibrium during the fluorescence decay, we supposed that the intensity decay was modulated by an acceptor-donor distance distribution function, f(r). A computational procedure was developed using the CONTIN program, to recover, from the time-resolved fluorescence data, the distance distribution between donor and acceptor groups attached to the peptides. The methodology proved to be useful to provide quantitative information about conformational dynamics of peptides, its dependency on the solvent and its interaction with other molecules present in the medium. The peptide 782CT and its analogs A12 and A18 were studied by examination of fluorescence from the tyrosine residue present in the position five of the amino acid sequence. There were no appreciable differences in the intensity decay, anisotropy decay and iodide quenching between the three peptides, that could be correlated to observed differences in the inhibition of the pro-hormane convertase 2 (PC2). The peptide hormone alpha-MSH and its more potent analog [Nle(4),0- Phe(7)]alpha-MSH (NDP-alpha-MSH), containing the fluorescent residue tryptophan, were labeled at the amino terminal with the amino benzoic acid (Abz) group, and were also examined by fluorescence methods. We observed energy transfer between the tryptophan residue acting as donor and Abz as acceptor, and verified a broad Trp-o-Abz distance distribution for alpha-MSH in aqueous medium, while three different distance populations could be identified for the labeled analog NDP-alpha-MSH in water, indicating distinct conformational states for the synthetic peptide, compared with the native hormone. Measurements in trifluoroethanol resulted in the recovery of two Abzlrp distance populations, both for the native and the analog hormones, reflecting the decrease, induced by the solvent, of the conformational states available to the peptides. The Cardin motif peptides were examined in the presence of heparin, SDS micelles and in TFE/water mixtures. The fluorescent group Abz was attached to the amino terminal and the acceptor group N-(2,4 dinitrophenyl)ethylenediamine (Eddnp) was bound to the carboxyl terminal of the peptides. The end-to-end distance distribution recovered from time-resolved fluorescence data indicated extend conformation in aqueous medium and the occurrence of compact conformations under interaction with heparin and SDS or in the medium containing TFE. The end-to-end distances recovered were lower than those expected for the peptides in alpha helix conformation, suggesting the occurrence of turned structures beyond the alpha helix. The energy transfer methodology shows to be useful to study conformational dynamics of peptides in solution.

O presente trabalho avaliou crescimento, atividade da nitrato redutase (NR), composição química e captação de nitrato e fosfato em Gracilariopsis tenuifrons cultivada em laboratório em meio com adição de 0, 50, 150, 250, 500 ou 750 μM de nitrato. Em algas cultivadas na proporção de 1 g de massa fresca por 1 L de meio de cultivo, a taxa de crescimento aumentou de acordo com a disponibilidade de nitrato, atingindo um patamar na concentração de 150 μM. Isto indicaria limitação de outro nutriente ou luz ao crescimento da espécie. O conteúdo tecidual de nitrogênio aumentou conforme o incremento de nitrato, devido ao acúmulo de pigmentos fotossintetizantes (ficobiliproteínas e clorofila a) e proteínas solúveis. O conteúdo tecidual de carbono e a razão C:N diminuíram com a maior disponibilidade de nitrato no meio de cultivo, provavelmente em resposta à assimilação deste nutriente, que estimularia o fluxo de carbono através das rotas glicolíticas e respiratórias, evitando seu acúmulo como amido das florídeas ou floridosídeo. A atividade da NR foi maior nas algas mantidas em meio com 50 μM de nitrato. Nos tratamentos sem nitrato ou com acréscimo de 250, 500 ou 750 μM de nitrato, os valores de atividade da NR foram baixos e semelhantes entre si. Estes resultados não foram condizentes com os dados de crescimento e nitrogênio tecidual, os quais refletiriam o metabolismo de nitrogênio. Foi sugerida a hipótese de que o acúmulo de compostos nitrogenados pelas algas submetidas aos tratamentos com maior disponibilidade de nitrato poderia desencadear um mecanismo de feedback negativo sobre a atividade da NR, inativando-a temporariamente e fazendo com que as algas apresentassem uma baixa atividade enzimática. Submetendo-se as algas cultivadas em meio com adição de 250 μM de nitrato a uma elevada irradiância, foi observado aumento da atividade da NR após 10 min, corroborando a hipótese sugerida. A taxa de captação de nitrato aumentou de acordo com a disponibilidade deste nutriente no meio, sendo que a taxa de captação de fosfato não estava correlacionada à de nitrato. Quando as algas foram cultivadas na proporção de 10 g de massa fresca por 1 L de meio de cultivo, o conteúdo de nitrogênio foi maior naquelas mantidas em meio com adição de 50 μM de nitrato. Foi observada correlação negativa entre conteúdo tecidual de nitrogênio e razão amido:(3,6-anidro- α-L-galactopiranose + α-L-galactopiranose-6-sulfato). Uma vez que não houve diferença significativa entre os tratamentos com relação ao rendimento de polissacarídeos, aqueles com adição de 50 ou 150 μM de nitrato seriam mais interessantes para a produção de ágar em Gp. tenuifrons, nas condições de experimentação empregadas neste trabalho / This study evaluated growth, nitrate reductase (NR) activity, chemical composition and nitrate and phosphate uptake in Gracilariopsis tenuifrons grown in vitro in medium with addition of 0, 50, 150, 250, 500 or 750 μM of nitrate. In algae maintained at 1 g of fresh weight per litre of culture medium, growth rate increased according to the availability of nitrate, reaching a plateau at the concentration of 150 μM. This indicates limitation of other nutrient or light to the growth of the species. Tissue nitrogen content increased with the increment of nitrate, due to accumulation of photosynthetic pigments (phycobiliproteins and chlorophyll a) and soluble proteins. Tissue carbon content and C:N ratio reduced with higher availability of nitrate in the culture medium, probably in response to the assimilation of this nutrient, which stimulates the carbon flux through the glycolytic and respiratory pathways, avoiding its accumulation as floridean starch or floridoside. NR activity was higher in algae kept in medium with 50 μM of nitrate. In treatments without nitrate or with 250, 500 or 750 μM of nitrate, NR activities were low and similar to each other. These results were not consistent with the observed growth rate and nitrogen content, which reflect the nitrogen metabolism. It was suggested that the accumulation of nitrogenous compounds by the algae grown under a higher availability of nitrate could trigger a negative feedback on NR activity, inactivating it temporally, resulting in a low enzymatic activity. When algae grown in medium with 250 μM of nitrate were submitted to a higher irradiance, NR activity increased after 10 min, supporting the suggested hypothesis. Nitrate uptake rate increased according to the availability of this nutrient in the medium, and phosphate uptake rate was not correlated with it. When algae were grown at of 10 g of fresh weight per litre of culture medium, nitrogen content was higher in the algae kept in the medium with 50 μM of nitrate. A negative correlation between nitrogen content and starch:(3,6-anhydro- α-L-galactopyranose + α-L-galactopyranose-6-sulfate) ratio was observed. As there was no significant difference between the treatments in relation to polysaccharides yield, the ones with 50 or 150 μM of nitrate would be more interesting to the production of agar in Gp. tenuifrons, in the experimental conditions employed in this study.

O polissacarídeo capsular (PS) é o principal fator de virulência do S. pneumoniae e é a base para sua classificação em sorotipos. O objetivo deste trabalho foi estudar o metabolismo de S. pneumoniae sorotipo 14 em cultivo contínuo e, para tanto, foi desenvolvido um ELISA de captura para quantificação do PS produzido (PS14) e a melhor cepa produtora foi escolhida. Em cultivos descontínuos em biorreator foram observados rendimentos semelhantes para crescimento e PS14 entre meio complexo e meio quimicamente definido. No entanto, diferenças no requerimento de vitaminas foram verificadas entre cultivos em frasco e biorreator, relacionadas à disponibilidade de O2. Em cultivos contínuos observou-se que: a produção de PS14 foi associada ao crescimento celular, a glicose foi o substrato com maior impacto sobre a produção de PS14 e os fatores de conversão sobre glicose e biomassa foram maiores sob limitação de glicose/colina/glutamina; o que permite concluir que estratégias de produção de PS14 devem focar na alta densidade celular e na condição de limitação de nutrientes. / The capsular polysaccharide (PS) is the most important virulence factor of S. pneumoniae and is also the basis for its classification in serotypes. This study aimed to evaluate the metabolism of S. pneumoniae serotype 14 in continuous cultivation. In order to do this, a Sandwich ELISA was developed to quantify the PS (PS14) produced and the best producer strain was selected. Similar growth and PS14 yields were observed in batch cultures conducted with complex and chemically defined media. Differences in vitamin requirements were verified in flask and batch cultivation, associated to O2 availability. In continuous cultivation, the PS14 production was associated to cell growth, the glucose was the substrate with more impact on PS14 production and in limitation of glucose/choline/glutamine the yield factors per glucose consumed and per biomass produced increased. These results showed that to improve PS14 production is necessary to adopt strategies that focuses in high cell density in addition to conditions of substrate limitation.

Orientador: Telma Teixeira Franco / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-10T23:17:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Delgado_PaulaAparecida_D.pdf: 2150542 bytes, checksum: 6d1fcc0446226d64e7f55a55da813d57 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: Polissacarídeos são os principais constituintes do café verde, torrado e solúvel, sendo principalmente galactomananos e arabinogalactanos. Um aspecto importante em relação a estes polissacarídeos é a insolubilidade, umas das possíveis razões para a formação de sedimentos na produção de café solúvel, reduzindo o rendimento do processo. Em face disto, o objetivo deste trabalho foi investigar a redução de sedimentos em extrato de café pela ação de enzimas. Diversas preparações comerciais de pectinases foram selecionadas e suas diferentes atividades determinadas. Rohapect B1L apresentou a maior atividade de mananase. Adicionalmente, a maioria das preparações estudadas apresentou outras atividades enzimáticas, tais como mananase, endoglucanase, xilanase, além da atividade atestada pelos fabricantes. Frações solúveis e insolúveis do extrato de café e sedimento foram preparadas e suas composições determinadas. Os principais componentes do extrato de café e sua fração insolúvel foram carboidratos e proteínas, enquanto que a fração insolúvel do sedimento apresentou também uma fração significativa de lignina. Pela análise dos carboidratos, galactose, arabinose e manose foram os principais monossacarídeos obtidos após hidrólise ácida, confirmando a presença de galactomananos e arabinogalactanos. Galactomanano com baixo grau de ramificação foi o principal polissacarídeo encontrado nas frações insolúveis. Biopectinase CCM, Rohapect B1L, Pectinase 444L e Galactomananase ACH foram as preparações enzimáticas mais eficientes na redução de sedimento do extrato de café, sendo Rohapect B1L e Galactomananase ACH as mais viáveis, cujas concentrações ótimas foram 0,3 e 0,1 mgproteína/gsubstrato, respectivamente. A massa molecular média dos components do extrato de café foi 18 kDa, a qual decresceu 6,6% após hidrólise com Rohapect B1L. O principal açúcar liberado por esta enzima foi a manose, sugerindo sua ação sobre as cadeias de mananos do café, devido a alta atividade de mananase. Os extratos hidrolisados pelas preparações enzimáticas Rohapect B1L e Galactomananase ACH foram avaliados sensorialmente. Provadores treinados verificaram uma pequena a moderada diferença entre os extratos hidrolisados e o controle; entretanto, o tratamento enzimático não alterou a aceitação das amostras por parte dos consumidores. Os resultados mostraram boas perspectivas para a utilização de enzimas no processo de redução de sedimentos em extratos de café solúvel / Abstract: Polysaccharides are the main components of green, roasted and soluble coffee, and they are mainly galactomannans and arabinogalactans. An important aspect about these polysaccharides is the insolubility, possibly one of the reasons for the sediments formation in the production of instant coffee, reducing the yield of the process. Thus, the aim of this work was to investigate the reduction of sediments in coffee extract by the action of enzymes. Several commercial preparations of pectinases were selected and their different activities were determined. Rohapect B1L presented the highest mannanase activity. Most of the commercial pectinases assayed presented other enzyme activities, like mannanase, endoglucanase, xylanase, besides the activity stated by the manufacturers. Soluble and insoluble fractions from coffee extract and sediment were prepared and their chemical composition determined. The main components of extract and its insoluble fraction were carbohydrates and proteins, while the insoluble fraction of sediment presented also a significant amount of lignin. Based on the carbohydrate analysis, galactose, arabinose and mannose were the main monosaccharides obtained after acid hydrolysis, confirming the presence of galactomannans and arabinogalactans. Galactomannan with low degree of branching was found to be the main polysaccharide of the insoluble fractions. Biopectinase CCM, Rohapect B1L, Pectinase 444L and Galactomannanase ACH were found to be themost effective enzyme preparations on the sediment reduction of coffee extract, being Rohapect B1L and Galactomannanase ACH the more viable ones, which optimumconcentrations were 0.3 and 0.1 mgprotein/gsubstrate, respectively. The average molecular weight of the coffee extract components was 18 kDa, which decreased 6.6% after hydrolysis with Rohapect B1L. The main sugar released by this enzyme preparation was mannose, suggesting its action on coffee mannans, due to the high activity of mannanase. The extracts hydrolyzed by Rohapect B1L and Galactomannanase ACH were evaluated for the sensory quality. Trained panelists indicated a small to moderate difference between the hydrolyzed extracts and the control; however, the enzymatic treatment did not alter the consumers¿ acceptance of the coffee extract. The results showed good perspectives for the use of enzymes in reducing sediments in coffee extracts / Doutorado / Desenvolvimento de Processos Químicos / Doutor em Engenharia Química

O feijão é considerado uma fonte importantes de nutrientes, para toda a população mundial, principalmente para os países em desenvolvimento. Porém, os feijões também possuem fatores antinutricionais e facilidade para adquirir defeitos texturais quando submetidos a condições inadequadas de armazenamento. Temperatura e umidade de armazenamento elevadas, desencadeiam o aparecimento do defeito textural conhecido como hard-to-cook, que provoca o endurecimento das sementes e inúmeras perdas econômicas e nutricionais. Para estudar este fenômeno, isolou-se a parede celular solúvel (PCS-Co) e insolúvel (PCl-Co) do cotilédone de feijões armazenados a 4°C, temperatura ambiente (TA) e 37°Cn5% umidade relativa (U.R.) e analisou-se a sua composição em açúcares. A PCl-Co foi fracionada com solução quelante de cálcio e com gradiente de hidróxido e analisadas quanto ao conteúdo de açúcares. A PCl-Co compõem 12,3% do cotilédone dos feijões controle e é formada principalmente de polissacarídeos solubilizados com NaOH 4N (29,4%), composto por arabinose (55,0%), xilose (10,3%) e ácidos urônicos (18,9%) e de polissacarídeos solubilizados com NaOH 0,5N (16,8%) e 1,0 N (17,2%), composto na sua maioria por glicose (92,1% e 90,7%). A PCS-CO compõem 9,0% do cotilédone em feijões controle e é constituída por arabinose (38,6%), ácidos urônicos (23,4%), galactose (12,7%) e xilose (11,2%). Esta composição apresentou alterações com o envelhecimento em feijões armazenados a TA e 37°C. A PCI-Co de feijões armazenados a TA e 37°C apresentaram aumento no conteúdo de arabinose (44,8% e 31,7%), ácidos urônicos (54,3% e 42,9%) e xilose (38,6% e 27,2%), provenientes de pectinas, e diminuição de glicose (64,0% e 48,6%), proveniente de hemicelulose. A PCS apresentaram redução, principalmente no conteúdo de arabinose (40,2% e 15,9%). Além disso, os feijões armazenados a TA e 37°C apresentaram aumento no tempo de cocção (2,3 e 8 vezes superior ao controle) e redução na germinação (17% e 100%). Isto pode significar que, com o envelhecimento, ocorreria insolubilização das pectinas, devido a formação de ligações cruzadas, contribuindo com o endurecimento dos feijões. Os feijões armazenados a 4°C apresentaram alterações na germinação e no perfil de fracionamento, mas não apresentaram alterações consideráveis na composição de açúcares da PCI-Co e PCS-Co. / Common beans is one of the most important source of nutrients for the world population, mainly in developing countries. Nevertheless, they have severaI undesirable characteristics, such as antinutrients components and facility to acquire textural defects when stored under inadequate conditions. High temperature and humidity of storage cause the development of hard-to-cook phenomenon, characterized by extended cooking time for cotyledon softening and responsible for economic and nutritional losses. In order to study this phenomenon, soluble cell wall material (SCWM) and insoluble cell wall material (ICWM) were isolated from cotyledons of beans stored at 4°C, room temperature (RT) and 37°C/75% relative humidity (RH) and analysed about their sugar composition. ICWM was fractionated with aqueous solutions of chelating agents and hidroxide solutions gradient. Each fractions were analysed about their sugar composition. Control beans cotyledon contained 12.3% of ICWM, composed mainly for polysaccharides solubilized by NaOH 4.0N (29.4%), composed in its majority of arabinose (55.0%), xylose (10.3%), uronic acid (18.9%) and polysaccharides solubilized by NaOH 0.5N (16.8%) and NaOH 1.0N (17.2%), composed in most part of glucose (92.1% and 90.7% respectively). About 9.0% of cell wall of control beans is composed by SCWM, that contain arabinose (38.6%), uronic acids (23.4%), galactose (12.7%) and xylose (11.2%). The cell wall composition showed alterations with aging in beans stored at RT and 37°C. Cotyledon ICWM of beans stored at RT and 37°C showed a increase in arabinose (44.8% and 31.7%), uronic acid (54.3% and 42.9%) and xylose contents (38.6% and 27.2%), originating of pectins and decrease of glucose contents (64.0% and 48.6%), probably originating by hemicellulose. SCWM showed reduction mainly in arabinose contents (40.2% and 15.9%). Besides, beans stored at RT and 37°C, showed increase in cooking time (2.3 and 8 times higher than control) and decrease in germinability (17% and 100%). It could be a indication of cross-linking formation and pectins insolubilization during aging, contributing with bean hardening. Beans stored at 4°C showed alterations in germinability and fractionation profile, but didn\'t show considerably alterations in cotyledon ICWM and SCWM sugar composition.

A indústria cosmética tem se dedicado a desenvolver produtos com apelo antienvelhecimento no intuito de prevenir, retardar e amenizar rugas, englobando assim diversos benefícios para pele em um único produto. Dessa forma, é de fundamental importância avaliar a influência da associação de diferentes ativos cosméticos em uma mesma formulação no que se refere à eficácia da mesma. Nesse contexto, o presente estudo teve como objetivo desenvolver formulações cosméticas contendo oligossacarídeos da alfafa, polissacarídeos da mandioca e filtros solares, bem como a analisar a influência desses componentes no sensorial, textura e eficácia clínica de tais formulações após uma única aplicação (efeitos imediatos) e com o uso prolongado (efeitos em longo prazo). Para tal, formulações cosméticas, contendo ou não filtros solares e ativos objeto de estudo, isolados ou em associação, foram desenvolvidas e submetidas a estudo de estabilidade. As formulações estáveis foram analisadas quanto à textura, espalhabilidade e sensorial. Foram avaliados os efeitos imediatos das formulações com relação a hidratação, função barreira e microrrelevo da pele. Ademais, foi realizada a eficácia clínica das formulações após 45 dias de aplicação na hidratação, função barreira, controle da oleosidade, propriedades mecânicas e microrrelevo da pele. Além disso, foi avaliada a quantidade e largura de poros, padrão de coloração de manchas na pele, ecogeneicidade e espessura da derme. De acordo com os resultados as formulações desenvolvidas foram estáveis e a formulação que contendo filtros e ativos obteve melhores resultados em relação a textura, espalhabilidade e sensorial. No estudo de eficácia clínica, a formulação multifuncional contendo filtros solares e os ativos mostrou efeitos mais pronunciados na melhora da hidratação, microrrelevo e viscoelasticidade da pele. Com relação à influência dos componentes da formulação, a presença de filtros solares na formulação interferiu negativamente nos efeitos imediatos na hidratação e função barreira da pele e positivamente nos parâmetros relacionados ao microrrelevo cutâneo. Os oligossacarídeos de alfafa e polissacarídeos da mandioca mostraram influência positiva e sinergismo na melhora das propriedades mecânicas da pele. Em síntese, a formulação contendo a associação de ativos e filtros solares mostrou eficácia na melhora imediata e em longo prazo das condições gerais da pele envelhecida, além de possuir características sensoriais que atenderam às expectativas das voluntárias, mostrando a importância. Por fim, este estudo mostrou a importância do conhecimento dos componentes das formulações cosméticas e da combinação de substâncias ativas e filtros solares para a elaboração de protocolos de Pesquisa & Desenvolvimento para a obtenção de cosméticos multifuncionais eficazes / The cosmetic industry has been dedicated to develop products with anti-aging appeal in order to prevent, delay and soften wrinkles, combining many benefits for the skin in a single product. Thus, it is crucial to evaluate the influence of the association of different cosmetic actives in the same formulation as regards the effectiveness thereof. In this context, the present study aimed to develop cosmetic formulations containing oligosaccharides alfalfa, polysaccharides cassava and sunscreens, as well as to analyze the influence of these components in the sensory, texture and clinical efficacy of such formulations after a single application (immediate effect) and prolonged use (long-term effects). The cosmetic formulations, with or without sunscreens and active ingredients studied, alone or in combination, were developed and undergone to stability studies. The stable formulations were analyzed regarding texture, spreadability and sensory. The immediate effects of the formulations were evaluated in relation to moisture, barrier function and skin microrelief. Furthermore, the clinical efficacy of the formulations were performed after 45 days of application and were observed the hydration, barrier function, control of sebum, mechanical properties and the skin microrelief. In addition, the number and width of pores staining pattern of spots, echogenicity and thickness of the dermis was evaluated. According to the results the developed formulations were stable and the formulation containing filters and actives showed better results in relation to texture, spreadability and sensory. In the study of clinical efficacy, multifunctional formulation containing sunscreens and actives showed more pronounced effects in improving hydration, micro relief and skin viscoelasticity. Regarding the influence of the formulation components, the presence of sunscreens in the formulation had a negative influence on the immediate effects on the skin hydration and barrier function and positive influence in the parameters related to the skin microrelief. The oligosaccharides and polysaccharides alfalfa cassava showed positive influence and synergism in improving the mechanical properties of the skin. In summary, the correlation of the techniques used were essential to the establishment of a stable multi-functional formulation, with sensory characteristics that met to the expectations of the volunteers and with proven clinical efficacy improving immediate and long-term effects of the general conditions of aging skin. Finally, this study showed the importance of knowledge of cosmetic formulations components for directing the Research & Development of effective multifunctional cosmetics.

Porphyromonas gingivalis é um dos principais organismos associados à periodontite crônica e apresenta intensa diversidade, que poderia refletir em sua virulência. A maioria dos estudos sobre a virulência de P. gingivalis foi realizada com cepas de referência, e pouco se conhece sobre este aspecto em isolados clínicos. A capacidade de indução de abscessos difusos em modelos animais experimentais parece estar associada a cepas capsuladas, enquanto a expressão de fímbrias e a capacidade de internalização em células epiteliais não fagocíticas, foram relacionadas à cepa não capsulada. Em P. gingivalis, o lócus de biossíntese do polissacarídeo capsular (BPC) apresenta características de ter sido adquirido por transferência horizontal de genes. O objetivo do presente estudo foi testar a hipótese de que a estrutura populacional de P. gingivalis relaciona-se com a variabilidade do lócus BPC e características fenotípicas como produção de cápsula e hidrofobicidade. Foram analisadas 28 cepas de P. gingivalis pertencentes aos 5 genótipos fimA quanto a, presença da cápsula por microscopia óptica, hidrofobicidade e detecção de genes do lócus BPC por PCR. A análise filogenética foi realizada por tipagem através de seqüenciamento de genes housekeeping (multilocus sequence typing, MLST). Dezesseis entre 28 amostras estudadas apresentaram cápsula, e não foram detectadas diferenças na hidrofobicidade dos isolados clínicos capsulados e não capsulados. O gene pg0106 foi detectado por PCR em 78% das amostras capsuladas e em 80% das amostras não capsuladas, enquanto pg0111 foi detectado em apenas 25% de amostras capsuladas. Apenas um isolado clínico e a amostra padrão W83 foram classificados como K1, por apresentarem o gene pg0118. Através do MLST foi possível identificar grande variabilidade entre as amostras de P.gingivalis. Foi observada relação entre STs e o tipo fimA ou hidrofobicidade, mas nenhum cluster foi associado à presença da cápsula ou aos genes do lócus de biossíntese do polissacarídeo capsular. Os dados indicam associação entre o lócus BPC e produção de cápsula, porém a diversidade deste lócus parece ser maior do que a relatada na literatura. O lócus BPC e a produção de cápsula não se relacionam com a origem filogenética da cepa, indicando a intensa recombinação que ocorre em P. gingivalis. / Porphyromonas gingivalis is one of main organisms associated with chronic periodontitis and is largely diverse, which could reflect in its virulence. Most studies on the virulence of P.gingivalis were performed with reference strains, and little is known about this aspect in clinical isolates. The ability to induce diffuse abscesses in experimental animal models seems to be associated with encapsulated strains, while expression of fimbriae and the ability to internalize into non phagocytic epithelial cells were related to noncapsulated strains. In P.gingivalis, the locus of biosynthesis of the capsular polysaccharide (GP) has characteristics of having been acquired by horizontal gene transfer. This study aimed to test the hypothesis that the structure population of P.gingivalis is related to the variability of the GPC locus and phenotypic characteristics such as capsule production and hydrophobicity. 28 P.gingivalis isolates representing fimA genotypes were screened for presence of capsule by light microscopy, hydrophobic properties and detection of genes in the GPC locus by PCR. The phylogenetic analysis was performed by sequencing of housekeeping genes typing (multilocus sequence typing, MLST). Sixteen of 28 studied samples had capsule, and there were no differences in the hydrophobic properties of capsulated and non capsulated clinical isolates. The pg0106 gene was detected by PCR in 78% of capsulated isolates and in 80% of not capsulated while pg011 was detected in only 25% of encapsulated isolates. One clinical isolate and reference strain W83 were classified as K1, due to the presence of pg0118 gene. MLST detected large variations within the P.gingivalis population. MLST clustering analysis revealed a relation between sequence type (STs) and fimA genotype or hydrophobic property, but there was no association of STs with the presence of capsule or the genes encoding for the biosynthesis of capsular polysaccharide. The data indicated an association between GPC locus and capsule production but the diversity of this locus appeared to be greater than that reported in the literature. The GPC locus and capsule production were not related to the phylogenetic origin of the strain, indicating intense recombination in P. gingivalis.

A associação de tecnologias como transgenia, genômica e proteômica aos programas de melhoramento convencional de árvores, pode acelerar o processo de obtenção de exemplares com características específicas da madeira para a indústria de papel e celulose. A parede celular vegetal é extremamente importante para este setor industrial, pois fornece polissacarídeos como celulose e hemiceluloses. A UDP-glucose pirofosforilase (UGPase, EC 2.7.7.9) é uma enzima chave na produção de UDP-glucose, precursor relevante na interconversão de nucleotídeoaçúcares que constituem os monômeros desses polissacarídeos. O objetivo deste trabalho foi clonar os cDNAs que codificam a UGPase, extraídos do tubérculo de batata (Solanum tuberosum L.) e da raiz de eucalipto (Eucalyptus grandis), e inseri-los por meio de transformação genética via Agrobacterium tumefaciens, respectivamente, no genoma de plantas de fumo (Nicotiana tabacum) e de eucalipto, para alterar o fluxo de carbono de modo a aumentar o conteúdo de pentosanas (xilose e arabinose). O maior teor de pentosanas é benéfico economicamente para a indústria de papel e celulose, pois diminui a energia consumida no refino da polpa além de benificiar a qualidade do papel que se torna mais resitente ao rasgo. O impacto da superexpressão do gene ugp nas plantas de tabaco e de eucalipto obtidas da transformação genética, foi avaliado por meio de análises bioquímicas e morfológicas. A análise de Southern blot indicou uma a quatro cópias do transgene no DNA genômico de dez linhagens T2 de tabaco, e uma cópia em uma linhagem T0 de eucalipto. A análise de qPCR mostrou que todas as linhagens T2 de tabaco apresentaram expressão do gene ugp exógeno, sendo que em quatro o nível de expressão foi maior que nas demais. As linhagens com menor expressão do gene ugp exógeno, com exceção de uma delas, também expressaram menos o gene ugp endógeno, sugerindo que nessas linhagens algum mecanismo de regulação atuou alterando a expressão desse gene, tanto endógeno, quanto exógeno. As linhagens transgênicas de tabaco foram morfologicamente semelhantes às plantas controle quando comparadas quanto à altura da planta, comprimento de internós, área foliar total, diâmetro do caule e massa seca da raiz. As alterações nos tabacos transgênicos, em relação aos controles, verificadas através das análises químicas, foram estatisticamente mais significativas na medula caulinar, onde houve aumento no conteúdo dos monossacarídeos e dos ácidos urônicos. As poucas diferenças encontradas no tecido xilemático sugerem que a planta, de alguma forma, tende a alterar menos a composição da parede celular secundária, do que da parede primária. Também sugerem que o metabolismo dos carboidratos pode afetar o conteúdo de lignina, embora seja sintetizada por outra rota metabólica. A parede celular primária, analizada utilizando a medula das plantas de tabaco e folhas de eucalipto, mostrou um aumento no conteúdo de pentosanas, o que não foi observado na análise de plântulas de tabaco. / Assossiating technologies like transgenesis, genomics and proteomics with conventional forestry breeding can accelerate the process of obtaining new trees with specific wood properties for the paper and pulp industry. Plant cell wall is extremely important for this industry, providing polysaccharides like cellulose and hemicelluloses. UDP-glucose pyrophosphorylase (UGPase, EC 2.7.7.9) is a key enzyme producing UDP-glucose, an important forerunner for nucleotide sugars that constitute the monomers of these polysaccharides. The goal in this work was to clone the cDNAs that encode UGPase, extracted from potato (Solanum tuberosum L.) tuber, and eucalypt (Eucalyptus grandis) root, and transfer through genetic transformation via Agrobacterium tumefaciens, respectively, in tobacco (Nicotiana tabacum) plants and eucalypts, in order to change the carbon flux, increasing the pentosans (arabinose and xylose) content. Higher pentosans content is economicaly important for the paper and pulp industry, as decreases energy consumption at pulp refining and also can benefit paper quality that becomes more resistant to rip. The impact of the ugp gene overexpression over tobacco and eucalypt plants obtained through genetic transformation were morphological and biochemicaly evaluated. Southern blot analysis showed one to four copies of the transgene in the genomic DNA of ten tobacco T2 lines, and one copy in one eucalypt T0 line. The qPCR analysis showed that all tobacco T2 lines expressed exogenous ugp gene, being the expression level in four of them biger than the others. Lines that expressed less exogenous ugp gene, with exception of one of them, equally had less endogenous ugp gene expression level, suggesting that in these lines, some kind of regulation acted changing the gene expression. The transgenic tobacco lines were morphologicaly similar to the control plants when compared for total height, internode lenght, total leaf area, stem diameter and root dry mass. Alterations in transgenics tobacco plants, in relation to controls, checked by chemical analysis, were statisticaly more significants in the pith, where the monosaccharides and uronic acids contents increased. The few diferences founded in the xilematic tissue sugest that the plant, somehow, tends to change less the secondary cell wall composition than the primary wall. They also suggest that the carbohydrate metabolism can affect lignin content, thought it\'s sintetizaded in another metabolic pathway. The primary cell wall, evaluated using tobbaco plants pith and eucalypt leaves, showed an increase in pentosanas content, that wasn\'t observed analising tobacco seedlings.