CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Moringa oleifera (moringa) à uma espÃcie pertencente à famÃlia Moringaceae que se caracteriza por ser muito resistente a insetos e fungos. Trabalhos prÃvios realizados por nosso grupo de pesquisa revelaram a presenÃa de proteÃnas ligantes à quitina em sementes de moringa, dentre elas a Mo-CBP3, sugerindo uma correlaÃÃo positiva entre essa proteÃna e a resistÃncia da planta. No inÃcio do desenvolvimento da planta, para que ocorra a germinaÃÃo, deve haver a embebiÃÃo da semente, um processo seguido pela exsudaÃÃo. Na exsudaÃÃo, compostos do metabolismo primÃrio e secundÃrio sÃo externalizados da semente, alguns deles exercendo aÃÃo de defesa da nova planta ao impedirem o ataque de herbÃvoros e/ou patÃgenos. O presente trabalho teve como objetivos caracterizar o exsudato de sementes de moringa quanto à composiÃÃo bioquÃmica e atividade biolÃgica e investigar a presenÃa de Mo-CBP3 no exsudato, visando contribuir para o estabelecimento de seu papel fisiolÃgico. Inicialmente, foram estabelecidas as condiÃÃes de exsudaÃÃo, dando Ãnfase ao tempo e solvente. Uma maior exsudaÃÃo de proteÃnas foi observada em sementes embebidas com Ãgua destilada por 24 horas. Esse exsudato mostrou a presenÃa de atividades inerentes a metabÃlitos primÃrios (protease, β-1,3-glucanase, quitinase, inibidor de tripsina e inibidor de papaÃna) e secundÃrios (saponinas e esteroides). Mo-CBP3 foi tambÃm detectada no exsudato, usando anticorpos policlonais anti-Mo-CBP3. A presenÃa de Mo-CBP3 no exsudato de sementes de moringa foi confirmada apÃs este ter sido submetido à cromatografia em matriz de quitina, procedida pela anÃlise atravÃs de dot bloting e eletroforese em gel de poliacrilamida. Os dados obtidos mostraram que o material retido na matriz de quitina corresponde a 0,26% do total de proteÃnas exsudadas, à reconhecido pelo anticorpo anti-Mo-CBP3 e apresenta perfil eletroforÃtico similar ao da Mo-CBP3 purificada de sementes de moringa. Na avaliaÃÃo da atividade deste exsudato frente à fitopatÃgenos, aÃÃo contra fungos nÃo foi detectada, nas condiÃÃes de ensaio empregadas, exceto para Candida parapsilosis que mostrou uma discreta reduÃÃo na taxa de crescimento. Contrariamente, uma potente atividade contra nematoide foi verificada, tendo sido o exsudato de sementes capaz de causar atà 100% de mortalidade para indivÃduos de Meloidogyne incognita em estÃgio de J2. Quando investigada a presenÃa de Mo-CBP3 em raiz, um ÃrgÃo vegetal que apresenta o fenÃmeno de exsudaÃÃo e, tambÃm, à capaz de interagir diretamente com o nematoide, resultados positivos foram encontrados. De fato, Mo- CBP3 està presente em raÃzes de moringa, jà nos estÃgios iniciais do desenvolvimento, conforme resultados mostrados por ELISA e atravÃs da tÃcnica de RT-PCR. Os dados, em conjunto, sugerem que no fenÃmeno da exsudaÃÃo, proteÃnas devem desempenhar funÃÃes essenciais e que, no caso da moringa, Mo- CBP3 jà participa nos estÃgios iniciais do desenvolvimento dessa planta arbÃrea, papel este que pode estar relacionado com a proteÃÃo contra patÃgenos. / Moringa oleifera (moringa) is a species belonging to the family Moringaceae which is characterized as having high resistance to insects and fungi. Previous work carried out by our research group revealed the presence of chitin-binding proteins in moringa seeds, among them Mo-CBP3, suggesting a positive correlation between this protein and the plant resistance. At the onset of the new plant development, for germination to occur, seed imbibition is required, a process followed by exudation. In exudation process, primary and secondary metabolites are released in the medium outside the seeds, some of them protecting the new plant against herbivores and/or pathogens. This study aimed to characterize the chemical composition and biological activities of moringa seed exudate and to investigate the presence of Mo-CBP3 in the exudate, in order to contribute to the establishment of its physiological role. Initially, the best conditions for exudation were established, emphasizing the time and solvent. A higher exudation of seed proteins was observed in distilled water after 24 hours. This exudate showed the presence of activities related to primary (protease, β-1,3- glucanase, chitinase, trypsin inhibitor and papain inhibitor) and secondary (steroid and saponins) metabolites. Mo-CBP3 was also detected in the exudate, using polyclonal antibodies anti-Mo-CBP3. The presence of Mo-CBP3 in the moringa seed exudate was confirmed after chromatography on chitin matrix and analyses by dot blotting and polyacrylamide gel electrophoresis. The data obtained showed that the retained material on the chitin matrix corresponds to 0.26% of the total protein, it is recognized by anti-Mo-CBP3 and has electrophoretic profile similar to that of Mo- CBP3 which was purified from moringa seeds. In the activity tests to pathogens, the seed exudate showed no antifungal activity, under the conditions used, except for Candida parapsilosis which had a slight reduction in its growth rate. In contrast, a potent activity against nematode was found as the seed exudate was able to cause a mortality rate up to 100% of Meloidogyne incognita in J2 stage. When investigated the presence of Mo-CBP3 in moringa hoots, a plant organ that shows the exudation phenomen and is also able to interact directly with the nematode, positive results were found. In fact, Mo-CBP3 is present in moringa hoots, in the initial stages of the plant development, according to the results shown by ELISA and RT-PCR. The data, taken together, suggest that in the exudation phenomen, proteins must play essential roles. In the case of moringa, Mo-CBP3 already participates in the initial stages of development of this tree species, playing a role that must be related to protection against pathogens.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / MoÂ-CBP3 à uma proteÃna ligante à quitina, purificada de sementes de Moringa oleifera, com massa molecular aparente de 18,0 kDa, consistindo de mÃltiplas isoformas heterodimÃricas. Mo-CBP3 à uma proteÃna altamente estÃvel, que possui amplo espectro de aÃÃo contra fungos fitopatogÃnicos e mantÃm sua estrutura secundÃria e atividade antifÃngica em extremos de temperaturas e diferentes valores de pH. Dessa forma, a proteÃna Mo-CBP3 se apresenta como uma ferramenta promissora para o desenvolvimento de plantas transgÃnicas resistentes ao ataque de fungos. Para tanto, Mo-CBP3 foi submetida a testes de biosseguranÃa alimentar, visando garantir sua utilizaÃÃo atravÃs da expressÃo em plantas, minimizando, assim, os riscos para animais nÃo alvo, incluindo o homem. A avaliaÃÃo de biosseguranÃa alimentar da proteÃna seguiu o teste de duas etapas, baseado em pesos de evidÃncia, proposto pelo Instituto Internacional de CiÃncias da Vida (ILSI). A pesquisa evidenciou o longo histÃrico de uso seguro, fundamentado em dados cientÃficos, da espÃcie M. oleifera, fonte da proteÃna Mo-CBP3. AnÃlises in silico mostraram que Mo-CBP3 nÃo possui qualquer identidade com proteÃnas alergÃnicas, tÃxicas e/ou antinutricionais. Adicionalmente, nÃo foram encontrados na proteÃna epÃtopos potencialmente capazes de promover reaÃÃo cruzada e desencadear uma resposta alergÃnica. Identidade com proteÃnas alergÃnicas (> 35%) foi encontrada apenas quando uma janela de 80 aminoÃcidos foi utilizada. SÃtios potenciais de N-glicosilaÃÃo nÃo foram encontrados na proteÃna madura. A proteÃna mostrou resistÃncia ao tratamento tÃrmico e à digestibilidade por fluido gÃstrico simulado, mas foi completamente susceptÃvel à digestÃo em fluido intestinal simulado. Em adiÃÃo, Mo-CBP3 nÃo causou efeitos adversos relevantes em camundongos submetidos a doses elevadas de 5 a 2000 mg/kg, via oral, evidenciando seu carÃter inÃcuo. A partir da avaliaÃÃo de biosseguranÃa alimentar proposta pelo ILSI nÃo à esperado qualquer risco associado ao consumo da proteÃna Mo-CBP3 pelo homem e demais animais monogÃstricos. / Mo-CBP3 is a chitin binding protein purified from Moringa oleifera seeds which has an apparent molecular mass of 18.0 kDa and consists of multiple heterodimeric isoforms. Mo-CBP3 is a highly stable protein that has a broad spectrum of activity against phytopathogenic fungi and maintains its secondary structure and antifungal activity at extreme temperatures and different pH values. Thus, the Mo-CBP3 protein presents itself as a promising tool for the development of transgenic plants resistant to fungi attack. For such purpose, the Mo-CBP3 protein was subjected to food safety tests to ensure the safety of its expression in plants, minimizing the risk to non-target animals, which include human beings. The food safety assessment of the protein followed the two-tiered approach, based on weight of evidences, proposed by International Life Sciences Institute (ILSI). The research evidenced the long history of safe use, supported by scientific literature, of the M. oleifera species, source of Mo-CBP3 protein. In silico analysis did not reveal any identity of Mo-CBP3 with allergenic, toxic and/or antinutritional proteins. Additionally, were not found in the protein potential epitopes able to lead to cross reaction and unleash an allergic response. Identity with allergenic proteins was found only when a window of 80 amino acids was used. Potential sites of N-glycosylation were not found in the mature protein. The protein showed resistance to thermal treatment and digestibility by simulated gastric fluid, but was completely susceptible to digestion in simulated intestinal fluid. In addition, Mo-CBP3 caused no relevant adverse effects to mice subjected to high oral doses from 5 to 2000 mg/kg, showing its innocuous nature. Based on the food safety approach proposed by ILSI is not expected any risk associated to use of Mo-CBP3 protein for humans and other monogastric animals.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Mo-CBP3 à uma proteÃna ligante à quitina, purificada de sementes de Moringa oleifera, com amplo espectro de aÃÃo contra fungos fitopatogÃnicos. No presente trabalho, novas propriedades estruturais da Mo-CBP3 sÃo descritas, revelando correlaÃÃo entre sua estabilidade estrutural e atividade antifÃngica. Em adiÃÃo, para melhor compreensÃo dos mecanismos pelos quais essa proteÃna exerce aÃÃo antifÃngica, sua habilidade de induzir a produÃÃo endÃgena de espÃcies reativas de oxigÃnio e de causar alteraÃÃes morfolÃgicas e ultraestruturais foi analisada, usando Fusarium solani como modelo. F. solani à uma espÃcie de fÃcil manuseio e desenvolvimento rÃpido, ideal para ensaios in vitro, e de relevÃncia, por se tratar de um fungo que ataca culturas economicamente importantes. Com foco na utilizaÃÃo segura da Mo-CBP3 como agente quÃmico contra fungos, seus efeitos citotÃxicos sobre cÃlulas eucariÃticas tambÃm foram investigados. Mo-CBP3 à uma proteÃna ligante à quitina de 18,0 kDa, de acordo com PAGE-SDS. Todavia, anÃlise por espectrometria de massas revelou que essa proteÃna consiste de mÃltiplas isoformas com massas moleculares variando entre 12,2 e 12,3 kDa. Mo-CBP3 à composta por duas cadeias polipeptÃdicas de 5,0 e 9,0 kDa, denominadas de cadeia A e cadeia B, respectivamente. A cadeia B contÃm a sequÃncia NH2-terminal representada por CPAIQRCCQQLRNIQPPCRCCQ, enquanto que a cadeia A tem o resÃduo NH2-terminal bloqueado. cDNA codificador da cadeia B foi obtido com iniciadores sintetizados a partir de sua sequÃncia NH2-terminal. AnÃlises in silico das sequÃncias de nucleotÃdeos e de aminoÃcidos deduzida confirmaram a presenÃa de isoformas e massa molecular da Mo-CBP3 e identificaram sÃtios potenciais de O-glicosilaÃÃo e fosforilaÃÃo. AlÃm disso, similaridades entre Mo-CBP3 e outras proteÃnas de M. oleifera, bem como com albuminas 2S, foram detectadas. A estrutura secundaria da Mo-CBP3 à composta por 30,3% α-hÃlices, 16,3% folhas β, 22,3% voltas e 30,4% estruturas ao acaso. Na espectroscopia de fluorescÃncia, excitaÃÃes de uma soluÃÃo da Mo-CBP3 a 280 nm e 295 nm produziram emissÃo mÃxima a 303 e 309 nm, respectivamente. A estrutura da Mo-CBP3 à altamente estÃvel, se apresentando indiferente Ãs mudanÃas de temperatura e pH. Mo-CBP3 (0,05-0,1 mg/mL) se mostrou capaz de inibir a germinaÃÃo de conÃdios de vÃrios fungos fitopatogÃnicos, incluindo F. solani, F. oxysporum, Colletotrichum musae e C. gloeosporioides. Similarmente, Mo-CBP3 (0,05 mg/mL) foi capaz de inibir o crescimento micelial de F. solani e apresentou tanto efeito fungistÃtico como fungicida, dependendo da concentraÃÃo usada. LigaÃÃo da Mo-CBP3 à superfÃcie de cÃlulas fÃngicas ocorre, pelo menos em parte, via interaÃÃo eletrostÃtica, jà que NaCl 0,15 M aboliu seu efeito inibitÃrio. Mo-CBP3 induziu a produÃÃo de espÃcies reativas de oxigÃnio e causou perda de assimetria e deformaÃÃes em cÃlulas de F. solani. DesorganizaÃÃo do sistema de endomembranas, condensaÃÃo do citosol e aumento de vacuolizaÃÃo tambÃm foram observados. Mo-CBP3 nÃo mostrou atividade hemolÃtica e nem foi capaz de alterar a viabilidade das cÃlulas MCF-7 e Caco-2, sugerindo que essa proteÃna nÃo à tÃxica para cÃlulas humanas. Com base na alta estabilidade e no amplo espectro de aÃÃo contra fungos fitopatogÃnicos em baixas concentraÃÃes e, tambÃm, na ausÃncia de citotoxicidade para cÃlulas humanas testadas, Mo-CBP3 tem grande potencial para desenvolvimento de novas drogas antifÃngicas ou na produÃÃo de plantas transgÃnicas mais resistentes a fungos. / Mo-CBP3 is a chitin-binding protein purified from Moringa oleifera seeds that displays broad inhibitory activity against phytopathogenic fungi. In this work, we report new structural features of Mo-CBP3 that reveal a correlation between its structural stability and antifungal activity. In addition, to gain better insights into the mechanisms by which this protein acts as an antifungal agent, its ability to induce the endogenous production of reactive oxygen species and to trigger morphologic and ultrastructural alterations were analysed using Fusarium solani as a model. F. solani is an easy-to-handle and fast-developing species, making it ideal for in vitro assays, and it holds relevance as a phytopathogenic fungus that attacks economically important crop plants. To fully explore the biosafety of Mo-CBP3 as a chemical agent against fungi, its cytotoxic effects on eukaryotic cells were also investigated. Mo-CBP3 is a chitin-binding protein of 18.0 kDa, according to SDS-PAGE. However, by mass spectrometry analysis, it was observed that this protein consists of multiple isoforms with molecular masses ranging between 12.2 and 12.3 kDa. Mo-CBP3 is composed by two polypeptide chains of 5.0 and 9.0 kDa, named A and B chain, respectively. The B chain contains the following NH2-terminal sequence CPAIQRCCQQLRNIQPPCRCCQ while the A chain has a blocked NH2-terminal residue. cDNA encoding the B chain was obtained with primers of its NH2-terminal sequence. In silico analyses of nucleotide and deduced amino acid sequences confirmed the presence of isoforms and molecular mass of Mo-CBP3 and identified potential sites of O-glicosylation and phosphorilation. Moreover, similarities between Mo-CBP3 and other M. oleifera proteins as well as 2S albumins were detected. The secondary structure of Mo-CBP3 showed 30.3% α-helices, 16.3% β-sheets, 22.3% turns and 30.4% unordered forms. In the fluorescence spectroscopy, excitation of Mo-CBP3 solution at 280 nm and 295 nm gave emission maxima at 303 and 309 nm, respectively. The Mo-CBP3 structure is highly stable and retains its antifungal activity regardless of temperature and pH. Mo-CBP3 (0.05-0.1 mg/mL) was able to inhibit the conidia germination of several phytopathogenic fungi, including F. solani, F. oxysporum, Colletotrichum musae and C. gloeosporioides. Similarly, Mo-CBP3 was inhibitory to the mycelial mass development of F. solani at 0.05 mg/mL and has both fungistatic and fungicidal effects, depending on the concentration used. Binding of Mo-CBP3 to the fungal cell surface is achieved, at least in part, via electrostatic interactions, as 150 mM NaCl abolished its inhibitory effect. Mo-CBP3 induced the production of reactive oxygen species and caused in F. solani cells a marked loss of asymmetry, deformations and deep wrinkles in comparison to control cells. Disorganisation of the endomembrane system and condensation and shrinkage of cytosol with increased vacuolation and the loss of normal structure and content were also observed. Mo-CBP3 did not show haemolytic activity and it was not capable to alter de viability of both MCF-7 and Caco-2 cells, suggesting that this protein is not toxic for human cells. Based on its high stability and broad-spectrum efficacy against important phytopathogenic fungi at low inhibitory concentrations and absence of cytotoxicity to human cells, Mo-CBP3 has great potential in the development of new antifungal drugs or in transgenic crops with enhanced resistance to fungi.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior