Des résultats d’expériences cliniques de reconstruction de l’os maxillaire faites à partir de la greffe d’une "pâte osseuse" gélifiée par l’ajout de facteur tissulaire ont été le primum movens de ce travail. Cette "pâte osseuse", faite d’os en poudre et de plasma enrichi en plaquette (PRP) à laquelle on ajoute du facteur tissulaire, est un modèle à la fois de la coagulation et de la régénération osseuse.<p>Pour analyser des effets de la coagulation, nous avons utilisé un modèle connu :la culture primaire de cellules endothéliales (HUVEC). Les effets in vitro des facteurs de coagulation, dénommés protéases de la coagulation, pris séparément, ont été bien étudiés dans ces cellules, néanmoins aucune information sur l’effet combiné de ces protéases ou du plasma en coagulation n’était connue. Nous avons mesuré la "signalisation calcium" comme réponse cellulaire aux différents agents et ces mesures de la signalisation calcium ont été complétées par la mesure d’une autre réponse biologique, à savoir la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires (IL-6 et IL-8). Pour l’étude de la régénération osseuse, la signalisation calcium a été mesurée sur une lignée d’ostéosarcomes humains (SaOS-2), stimulée par des protéases de la voie extrinsèque de la coagulation (facteur VIIa, facteur Xa et thrombine). Comme réponse biologique complémentaire, nous avons évalué l’effet des protéases d’intérêt sur l’apoptose induite par l’absence de sérum dans le milieu de culture.<p>\ / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Connue pour son rôle dans la cascade de coagulation, la thrombine, une protéase à sérine, peut également agir par l’intermédiaire de PAR1, un récepteur activé par protéase et couplé aux protéines G liant le GTP (GPCR). La thrombine se lie et clive l’extrémité N-terminale du PAR1 entre l’Arg41 et la Ser42, exposant une nouvelle extrémité terminale qui agit elle-même comme un ligand. La thrombine et une séquence peptidique de cinq acides aminés, composée des résidus Ser42 à Arg46, nommée PAR1-AP, déclenchent dans diverses cellules de mammifères une réponse intracellulaire comportant une composante calcique. Dans cette étude, le système d’expression par baculovirus dans les cellules Sf9 d'insecte nous a permis d'exprimer le récepteur PAR1 du rat à la surface de ces cellules et de réaliser son couplage fonctionnel à leur signalisation intracellulaire (modèle rPAR1-Sf9). La composante calcique de celle-ci, en réponse au PAR1-AP, a ensuite été étudiée en détail à l’aide de la sonde fluorescente Fura-2 et de plusieurs inhibiteurs agissant sur les canaux calciques ou d'autres éléments de la cascade de signalisation du calcium intracellulaire. Lorsque le milieu extracellulaire contient du calcium (Ca2+), la thrombine ou PAR1-AP déclenchent un signal calcique qui consiste en une augmentation rapide de [Ca2+]i suivi d’un plateau relativement soutenu, puis d'un retour lent vers le niveau de base initial. En l'absence de Ca2+ dans le milieu extracellulaire, l'augmentation initiale rapide de [Ca2+]i est suivie d'un retour rapide vers le [Ca2+]i de base. À l’aide d’inhibiteurs de canaux calciques, tels que le lanthane, la nifédipine et le D-600, l'entrée du calcium du milieu extracellulaire dans les cellules est inhibée, abolissant le plateau soutenu de [Ca2+]i. L’inhibition de la pompe Ca2+-ATPase par la thapsigargine supprime la réponse au PAR1-AP après épuisement des sites de stockage de Ca2+intracellulaire. Le TMB-8 agit de façon discordante quant à l’inhibition de la libération de Ca2+ des sites de stockage intracellulaires. La réponse à PAR1-AP n’est pas affectée par le D-609, un inhibiteur de la phospholipase β. L’inhibition de la protéine kinase C (PKC) par le bisindolylmaléimide induit des oscillations en présence de Ca2+ extracellulaire et atténue fortement le signal calcique en absence de Ca2+ extracellulaire. En présence de Ca2+ extracellulaire, l’activation de la PKC par le PBDu tronque le flux de [Ca2+]i tandis que la réponse calcique est abolie en absence de Ca2+ dans le milieu extracellulaire. Le H-89, un inhibiteur de la protéine kinase A (PKA), cause une prolongation de la durée du plateau de [Ca2+]i dans un milieu riche en calcium et la suppression de la réponse à PAR1-AP lorsque le milieu extracellulaire est dépourvu de Ca2+. Les résultats obtenus nous permettent de conclure que la PKC et possiblement la PKA jouent un rôle critique dans la mobilisation du Ca2+ induite par le PAR1-AP dans le modèle rPAR1-Sf9. / Thrombin’s serine protease activity allows for it to have a role in both the coagulation cascade as well as through a GTP- binding protein coupled receptor (GPCR) known as the protease-activated receptor-1 (PAR1). Thrombin binds to PAR1 at the N-terminal, cleaving between Arg41 and Ser42, and unmasking a new N-terminal which acts as a tethered ligand. Thrombin and a five amino acid peptide composed of the sequence of residues Ser42 to Arg46, known as PAR 1-AP, has been shown to mediate a number of signalling mechanisms in mammalian cells, including a calcium signalling pathway. In the present study, the Sf9-baculovirus system allowed us to express the rat PAR1 (rPAR1-Sf9) on the cell surface and study its intracellular signalling. The calcium (Ca2+) signal was studied using the fluorescent probe Fura-2, and several Ca2+ channel inhibitors and calcium signal modulators were used to study the signal induced by PAR1-AP. In the presence of extracellular calcium [Ca2+]e, thrombin and PAR1-AP produced a Ca2+ signal which consisted of an initial spike in [Ca2+]i followed by a relatively maintained plateau and a slow return towards baseline. In the absence of Ca2+ in the extracellular space, the initial Ca2+ increase is followed by a quick return to baseline [Ca2+]i. Ca2+ channel inhibitors, lanthanum, nifedipine and D-600, inhibited the entry of Ca2+ from the extracellular space and abolished the plateau phase of the response to PAR1-AP. Inhibition of the Ca2+-ATPase with thapsigargin abolished the response to PAR1-AP after having depleted the Ca2+ stores involved in the initial spike in [Ca2+]i. TMB-8, expected to inhibit the release of Ca2+ from internal stores, inconsistently inhibited the [Ca2+]i response to PAR1-AP. The response elicited by PAR1-AP was not affected by D-609, an inhibitor of phospholipase Cβ. Inhibition of protein kinase C (PKC) with bisindolylmaleimide induced oscillations in the [Ca2+]i levels in the presence of extracellular Ca2+ while it significantly blunted the response in the absence of extracellular Ca2+. PDBu activation of PKC truncated the [Ca2+]i surge in Ca2+-rich conditions while abolishing it altogether in the absence of extracellular Ca2+. H-89 inhibition of protein kinase A (PKA) prolonged the plateau duration in Ca2+-rich medium while inhibiting the response to PAR1-AP in a Ca2+-deficient environment. Taken together, our results suggest that PKC and possibly PKA play a critical role in the mobilisation of Ca2+ in rPAR1-Sf9 by PAR1-AP.

A asma ocupacional é a forma mais comum de doença pulmonar relacionada ao trabalho e vários dos casos reportados estão correlacionados à exposição de proteases. A serino protease subtilisina foi bastante utilizada na década de 60 e foi a principal responsável pela alta incidência de asma na indústria de detergente. Este projeto visou a desenvolver um modelo murino de inflamação alérgica pulmonar à subtilisina e caracterizar os mecanismos principais envolvidos nessa resposta. A sensibilização e desafio com subtilisina induziu doença alérgica pulmonar, verificada pela eosinofilia às vias aéreas, produção de muco, IgE total, hiper reatividade brônquica e produção de citocinas tipo II no pulmão. Estas respostas foram dependentes da atividade enzimática da subtilisina, PAR-2, receptor de IL-33 ST2, IL-1R e da sinalização via MyD88. Em conjunto, nossos resultados estabelecem um novo modelo experimental de asma ocupacional induzida por subtilisina e fornece os principais mecanismos moleculares responsáveis pela inflamação alérgica. / Occupational asthma is the most common form of pulmonary disease related to work. Most of occupational asthma cases reported are strictly correlated with proteases exposure. Serine protease subtilisin was widely used in the detergent industry during the 60s, which resulted in increased incidence of occupational asthma. We aimed to develop and characterize a murine model of occupational asthma using subtilisin as allergen. Briefly, sensitization and challenge with subtilisin triggered lung allergic inflammation, as accessed by eosinophilic influx to the airways, mucus production, and increased levels of type II cytokines. Subtilisin induced total IgE and airway hyperactivity. Allergic responses to subtilisin were dependent on its serine protease activity, protease-activated receptor (PAR)-2, IL-33 receptor ST2, IL-1R, and Myd88 signaling. Together, these data establish a new murine model of occupational asthma induced by subtilisin and provide the main molecular mechanisms responsible for allergic inflammation.

La Fibrose Pulmonaire Idiopathique (FPI) est une pathologie pulmonaire chronique, progressive, irréversible et mortelle, dont les thérapeutiques sont insuffisantes à ce jour. L'activation de la cascade de la coagulation et des protéases à sérine, délétère dans la progression des maladies pulmonaires chroniques, est une caractéristique de la pathologie. Récemment, un lien a été démontré entre Protease-Activated Receptor-2 (PAR-2), un récepteur cellulaire ubiquitaire, et la progression de la fibrose pulmonaire chez l'homme et la souris. Outre certains facteurs de la coagulation, PAR-2 semble aussi pouvoir être activé par des protéases appartenant à la famille récemment identifiée des Type II Transmembrane Serine Proteases (TTSPs), dont la matriptase et la Human Airway Trypsin-like protease (HAT). Leur rôle dans la fibrogénèse pulmonaire humaine et expérimentale est cependant encore inconnu.Nos travaux montrent pour la première fois qu'il existe une dérégulation de l'expression et de l'activité de ces protéases de la famille des TTSPs chez le patient FPI. In vitro, la matriptase induit des réponses pro-fibrosantes dans les fibroblastes pulmonaires primaires humains via l'activation de PAR-2, tandis que la HAT induit des réponses anti-fibrosantes dans ces cellules et une activation de la voie de la prostaglandine E2. Ces deux TTSPs sont ainsi différemment impliquées dans la fibrogénèse pulmonaire : in vivo, l'inhibition génétique et pharmacologique de la matriptase atténue la fibrose dans le modèle murin de fibrose pulmonaire induite par la bléomycine, et des résultats similaires sont observés suite à la surexpression de la HAT médiée par adénovirus dans ce modèle animal. L'ensemble des résultats obtenus dans ce travail de thèse permet de documenter l'implication de deux protéases à sérine, la matriptase et la HAT, dans la pathogénèse de la FPI et de définir des axes de recherche thérapeutique potentiels / Idiopathie Pulmonary Fibrosis (IPF) is a chronic, progressive, irreversible and mortal disease. Therapeutics options that improve the clinical outcome of IPF are limited. Coagulation proteinases and coagulation signaling deregulation, which influences several key inflammatory and fibroproliferative responses, is essential in IPF. Recently, Protease-Activated Receptor-2 (PAR-2) was shown to be involved in pulmonary fibrogenesis, both in Human and in mice. In addition to coagulation factors, PAR-2 can be activated by serine proteases of the emerging Type II Transmembrane Serine Proteases (TTSPs) family, including matriptase and the Human Airway Trypsin-like protease (HAT). Herein we explored the role of matriptase and HAT in the progression of human and experimental pulmonary fibrosis.Our data show that TTSPs matriptase and HAT pulmonary expression and activity are deregulated in patients with IPF. In vitro, matriptase induces PAR-2 dependent pro-fibrotic responses in primary human lung fibroblasts, whereas HAT induces anti-fibrotic effects in these cells, through the activation of prostaglandin E2 pathway. These TTSPs are differently involved in pulmonary fibrogenesis: in vivo, genetic and pharmacological inhibition of matriptase reduces fibrosis in the bleomycin induced lung fibrosis model, while an adenovirus-mediated HAT overexpression in the murine model leads also to a limited lung fibrosis. Here, we highlight the involvement of matriptase and HAT in the pathogenesis of IPF and explore potential therapeutics for lung fibrosis

A asma ocupacional é a forma mais comum de doença pulmonar relacionada ao trabalho e vários dos casos reportados estão correlacionados à exposição de proteases. A serino protease subtilisina foi bastante utilizada na década de 60 e foi a principal responsável pela alta incidência de asma na indústria de detergente. Este projeto visou a desenvolver um modelo murino de inflamação alérgica pulmonar à subtilisina e caracterizar os mecanismos principais envolvidos nessa resposta. A sensibilização e desafio com subtilisina induziu doença alérgica pulmonar, verificada pela eosinofilia às vias aéreas, produção de muco, IgE total, hiper reatividade brônquica e produção de citocinas tipo II no pulmão. Estas respostas foram dependentes da atividade enzimática da subtilisina, PAR-2, receptor de IL-33 ST2, IL-1R e da sinalização via MyD88. Em conjunto, nossos resultados estabelecem um novo modelo experimental de asma ocupacional induzida por subtilisina e fornece os principais mecanismos moleculares responsáveis pela inflamação alérgica. / Occupational asthma is the most common form of pulmonary disease related to work. Most of occupational asthma cases reported are strictly correlated with proteases exposure. Serine protease subtilisin was widely used in the detergent industry during the 60s, which resulted in increased incidence of occupational asthma. We aimed to develop and characterize a murine model of occupational asthma using subtilisin as allergen. Briefly, sensitization and challenge with subtilisin triggered lung allergic inflammation, as accessed by eosinophilic influx to the airways, mucus production, and increased levels of type II cytokines. Subtilisin induced total IgE and airway hyperactivity. Allergic responses to subtilisin were dependent on its serine protease activity, protease-activated receptor (PAR)-2, IL-33 receptor ST2, IL-1R, and Myd88 signaling. Together, these data establish a new murine model of occupational asthma induced by subtilisin and provide the main molecular mechanisms responsible for allergic inflammation.

Les rétinopathies ischémiques (RI) sont la cause majeure de cécité chez les personnes âgées de moins de 65 ans. Il existe deux types de RIs soit la rétinopathie du prématuré (ROP) ainsi que la rétinopathie diabétique (RD). Les RIs sont décrites en deux phases soit la phase de vasooblitération, marquée par une perte importante de vaisseaux sanguins, et une phase de néovascularisation secondaire à lʼischémie menant à une croissance pathologique de vaisseaux. Cette seconde phase peut générer des complications cliniques telles quʼun oedème dans lʼhumeur vitré ainsi que le détachement de la rétine chez les patients déjà atteints dʼune RI. Les traitements approuvés pour les RIs visent à réduire la formation des vaisseaux pathologiques ou lʼoedème; mais ceux-ci malheureusement ne règlent pas les problèmes sous-jacents tels que la perte vasculaire et lʼischémie. La rétine est un tissu hautement vascularisé qui contribue à lʼirrigation et à lʼhoméostasie des neurones. Lʼinteraction neurovasculaire, comprenant de neurones, vaisseaux et cellules gliales, contribue au maintien de cette homéostasie. Durant le développement, les neurones et les cellules gliales jouent un rôle important dans la vascularisation de la rétine en sécrétant des facteurs qui stimulent l'angiogenèse. Cependant, nos connaissances sur lʼinteraction neurovasculaire dans les RIs sont limitées. En identifiant les interactions importantes entre les cellules composant cette unité neurovasculaire dans la rétine, nous pourrons viser des cibles qui engendreront une revascularisation seine afin de diminuer les signes pathologiques chez les patients atteints dʼune RI. Les travaux présentés dans cette thèse visent à mieux expliquer cette interaction neurovasculaire en soulignant des concepts importants propres aux RIs. En utilisant un modèle de rétinopathie induite par lʼoxygène chez la souris, qui reproduit les caractéristiques importantes de la ROP (et en certaines instances, la RD), nous identifions quelques molécules clés jouant un rôle significatif dans les RIs soit la sémaphorine 3A (sema3A), lʼIL-1β, ainsi que le récepteur PAR2. Nos résultats démontrent que Sema3A, sécrétée par les cellules ganglionnaires rétiniennes (CGRs) durant une ischémie, empêche la revascularisation normale et que cette expression est induite par lʼIL-1β provenant des microglies activées. En bloquant Sema3A directement ou via lʼinhibition de lʼIL- 1β, nous remarquons une revascularisation seine ainsi quʼune diminution importante des vaisseaux pathologiques. Cela nous indique que Sema3A est impliquée dans la guidance vasculaire et quʼelle contribue à la pathogenèse des RIs. Lʼactivation de façon exogène de PAR2, identifié aussi comme régulateur du récepteur de lʼIL-1β (IL- 1RI) sur les CGRs, se traduit par une diminution séquentielle de lʼIL-1RI et de Sema3A ce qui mène également à une revascularisation seine. En conclusion, ces travaux soulignent lʼimportance de lʼinteraction neurovasculaire ainsi que la guidance vasculaire dans les RIs. Ils renforcent lʼimportance de la communication entre neurone, vaisseau et microglie dans la pathogenèse des RIs. Finalement, nous identifions quelques molécules clés qui pourront servir comme cibles afin de lutter contre lʼischémie qui cause des problèmes vasculaires chez les patients atteints dʼune RI. / Ischemic retinopathies (IRs), namely, retinopathy of prematurity (ROP) and diabetic retinopathy (DR), are the major cause of blindness in persons under the age of 65. IRs are biphasic disorders described by an initial vasoobliterative phase marked by a persistent microvascular degeneration, which leads to ischemia. Retinal ischemia, secondary to vessel loss, incites a second neovascularization phase represented by an aberrant, misdirected neovessel formation into the vitreous, which can cause adverse clinical complications including vitreous hemorrhaging and tractional retinal detachment. While current treatments aim at reducing vitreous/retinal hemorrhaging and/or pathological pre-retinal neovascularization, these regimens fail to address the underlying problem; that is, microvascular decay and retinal ischemia. The retina is a highly metabolic tissue that requires a significant amount of nutrients and oxygen. This is supplied by an intricate and highly regulated vascular network required to maintain homeostasis and proper function. The intricate cellular interactions in the neurovascular unit – the consortium of vessel, neurons and support glia – are required for regulating and maintaining homeostasis under normal conditions. However, the understanding of how this unit functions under ischemic stress, that which is seen in patients suffering from IRs, is not well defined. The present work underlines several important concepts of neurovascular coupling in IRs in efforts to identify potential therapeutic agents that may help curb retinal ischemia by stimulating normal revascularization. Using a mouse model of oxygen-induced retinopathy (OIR), which reproduces the salient features of ROP (and in some instances DR), we identified key players involved in generating the pathophysiological signatures associated with IRs; namely, semaphorin3A (Sema3A), interleukin-1β (IL-1β) and protease-activated receptor 2 (PAR2). Our results show that neuronal-derived Sema3A, secreted by ischemic retinal ganglion cells (RGCs), acts as a potent vaso-repulsive molecules that impedes normal revascularization. Activated microglia contribute to this process by secreting IL-1β, which induces paracrine release of Sema3A expression contributing to microvascular decay as well as pathological pre-retinal neovascularization. Inhibition of Sema3A or IL-1β translates to rapid revascularization and, as a result, a significant reduction in pathological neovessel formation. These results demonstrate that Sema3A is directly involved in vascular guidance and precipitates the pathophysiological features associated with IRs. PAR2, found on RGCs, was also identified as a key regulatory mechanism involved in dampening IL-1β induced Sema3A mediated vascular decay by reducing IL-1 receptor (IL-1RI). Exogenous activation of neuronal PAR2 translates to a sequential reduction of both IL-1RI and Sema3A resulting in accelerated revascularization and consequentially pre-retinal neovascularization. In conclusion, these studies highlight the importance of neurovascular coupling associated with IRs. Herein, we demonstrate the consorted interaction between neuron, vessel and glia and its impact on shaping the retinal vasculature during disease. Moreover, we underscore the significant impact of neuronal guidance cues in manifesting the salient vascular features of IRs. Finally, we identify key players that may serve as potential therapeutic avenues in curbing retinal ischemia in efforts to reduce vascular complications associated with IRs.

Orientador: Marcos Hikary Toyama / Resumo: A giroxina é a principal serino protease encontrada no veneno total de Crotalus durissus terrificus. As serino proteases de veneno de serpentes são proteínas que apresentam uma grande similaridade estrutural com a trombina humana incluindo a alta conservação do sitio catalítico. Os resμltados já obtidos pelo nosso grupo revelaram a capacidade dos flavonoides glicosilados de Laguncularia racemosa em reduzir de forma significativa a atividade enzimática das trombinas humanas. A identificação destas molécμlas revelou que dois flavonoides glicosilados (quercetina-3-O-arabinosidio (QAra) e quercetina-3-O-ramnosidio (QRham)) respondem pela inibição da trombina (Rodrigues et al., 2015). Sabe-se que a soroterapia antiveneno não consegue neutralizar de forma eficiente a ação farmacológica das serino proteases e consequentemente não é capaz de neutralizar os danos homeostáticos e teciduais. Neste trabalho, uma nova serino protease foi isolada do veneno total de Crotalus durissus terrificus (cdtsp-2) através de quatro estapas de separação, usando a superdex 75 com uma fase móvel de bicarbonato de amônia pH 8, a cdtsp-2 Estas duas frações foram então fracionadas em coluna de troca iônica em DEAE para separação das principais frações e posteriormente fracionadas em CLAE de fase reversa para confirmar o grau de homologia molecular e em todas as etapas cromatográfica foram acompanhadas pelos ensaios enzimáticos em BApNA. A nova serino protease denominada como Cdtsp-2 (Crotalus durissus terr... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Gyroxin is the major serine protease present in Crotalusdurissusterrificus venom. Serine proteases from snake venom are proteins, which exhibit a great structural similarity to hμMan thrombin including the catalytic site conservation. The resμlts already obtained by our group revealed the glycosylated flavonoidsability of Laguncμlariaracemosato significantly reduce the enzymatic activity of hμMan thrombins. The molecμles identification reveals two glycosylated flavonoids (quercetin-3-O-arabinosidiμM (QAra) and quercetin-3-O-rhamnosidiμM(QRham)), which inhibit thrombin (Rodrigues et al., 2015). Antivenomserotherapycan not efficiently neutralize the serine proteases pharmacological action and is not able to neutralize homeostatic and tissue damage. In this work, a new serine protease was isolated from Crotalusdurissusterrificusvenom (cdtsp-2) by throμgh four separation stages , using superdex 75 with a mobile phase of ammoniμM bicarbonate pH 8. These two fractions were fractionated on ion exchange colμMn in DEAE for separation of the major fractions and subsequently fractionated in reverse phase CLAE to confirm the degree of molecμlar homology.All chromatographic steps were monitored by the enzymatic assays in BApNA. The new serine protease called cdtsp-2 (Crotalusdurissusterrificus serine protease 2) is an unpublished protein, with a molecμlar mass of 27 kDa and its N-terminal sequence showed structural differences when compared to the gyroxin of Crotalusdurissusterrificus. Re... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre