Coacervation between the milk proteins β-lactoglobulin (BLG) and Lactoferrin (LF) was studied as a model system for hetero-protein coacervation (HPC). Equilibria among BLG/LF complexes and the corresponding speciation were found to control coacervation, which can be quantitatively monitored by turbidimetry. Several methods were used to assess complexation as a function of LF : BLG (mol/mol) mixing ratio (r). Proton release, calculated from a shift in pH when LF is added to BLG, was used to identify regions of complexation. Dynamic light scattering (DLS) was used to determine regions of complexation by relating complex size to stoichiometry. Isothermal titration calorimetry (ITC) was used to measure enthalpies of binding upon addition of LF to BLG. These results are used to show that coacervation is related to speciation, with the LF(BLG2)2 complex as the coacervating species.

No description available.

Tuberculosis (TB) is a respiratory disease caused by Mycobacterium tuberculosis (Mtb) that kills around 1.3 million people annually. Multi-drug resistant TB (MDR-TB) strains are increasingly encountered, in part resulting from shortcomings of current TB drug regimens that last between six to nine months. Patients may stop taking the antibiotics during their allotted regimen, leading to drug resistant TB strains. Novel drug screening platforms are therefore necessary to find drugs effective against MDR-TB. In order to discover compounds that target under-exploited pathways that may be essential only in vivo, the proposed screening platform will use a novel approach to drug discovery by blocking essential protein-protein interactions (PPI). In Mtb, PPI can be monitored by mycobacterial protein fragment complementation (M-PFC). This project will re-engineer the M-PFC assay to include the red fluorescent mCherry reporter for increased efficiency and sensitivity in high-throughput screening applications. To optimize the mCherry assay, we have developed fluorescent M-PFC reporter strains to monitor distinct PPI required for Mtb virulence: homodimerization of the dormancy regulator DosR. A drug screen will then identify novel compounds that inhibit this essential PPI. The screen will involve positional-scanning combinatorial synthetic libraries, which are made up of chemical compounds with varying side chains. This work will develop novel tools for TB drug discovery that could identify new treatments for the emerging world threat of MDR-TB.

No description available.

No description available.

No description available.

No description available.

No description available.

Neurodegenerative Erkrankungen (NDs) wie Alzheimer (AD), Parkinson (PD), und amyotrophe lateral Sklerose (ALS) sind Hirnerkrankungen, die durch unlösliche Proteinaggregate in Neuronen oder im Extrazellularraum charakterisiert sind. In dieser Arbeit habe ich für verschiede bekannte und vorhergesagte neurodegenerative Krankheitsproteine (NDPs) Proteininteraktionsnetzwerke erstellt, um mögliche gemeinsame Krankheitsmechanismen genauer zu studieren. Mit Hilfe eines automatisierten Hefe-Zwei-Hybrid-Systems (Y2H) konnte ich 18.663 Protein-Protein-Interaktionen (PPIs) für 449 wildtyp und 22 mutierte Proteine identifizieren. Eine genaue funktionelle Analyse der Interaktionspartner von korrespondierenden wildtyp und mutierten Proteinen ergab deutliche Unterschiede zum einen im Fall von allen untersuchten Proteinen und insbesondere im Fall vom ALS Krankheitsprotein TDP-43. Die identifizierten PPIs wurden außerdem verwendet um krankheitsspezifische Netzwerke zu erstellen und um Proteine zu identifizieren, die mit mehreren NDPs verbunden sind. Ich habe auf diese Weise vier Proteine (APP, IQSEC1, ZNF179 und ZMAT2) gefunden, die mit bekannten NDPs with Huntingtin, TDP-43, Parkin und Ataxin-1 interagieren und so fünf verschiedene NDs miteinander verbinden. Die Reduktion der mRNA Expression von IQSEC1, ZNF179 oder ZMAT2 mit Hilfe von siRNA führte zu einer Verstärkung von pathogenen Mechanismen wie der Aggregation von mutiertem Huntingtin und TDP-43 sowie der Hyperphosphorylierung des Proteins Tau. Außerdem habe ich 22 Proteine entdeckt, die die Aggregation von TDP-43 deutlich verändern und außerdem Mitglieder in sieben vorhergesagten Proteinkomplexen sind. Die Proteinkomplexe habe ich durch Kombination von Interaktionsdaten und Daten eines siRNA Screenings vorhergesagt. Zusätzlich habe ich herausgefunden, dass die Proteine eines vorhergesagten Komplexes, nämlich HDAC1, pRB, HP1, BRG1 und c-MYC, die Aggregation von TDP-43 durch Veränderung von dessen Genexpression beeinflussen. / Neurodegenerative diseases (NDs) such as Alzheimer’s disease (AD), Parkinson’s disease (PD) or amyotrophic lateral sclerosis (ALS) are progressive brain disorders characterized by the accumulation of insoluble protein aggregates in neuronal cells or the extracellular space of patient brains. To elucidate potential common pathological mechanisms in different NDs, I created comprehensive interaction networks for various known and predicted neurodegenerative disease proteins (NDPs). I identified 18,663 protein-protein interactions (PPIs) for 449 bioinformatically selected wild-type target proteins and 22 mutant variants of 11 known NDPs by using an automated yeast two-hybrid (Y2H) system. The functional analysis of the interaction partners of corresponding wild-type and mutant NDPs revealed strong differences in the case of all 11 NDPs and especially for the ALS protein TDP-43. The identified PPIs were used to generate networks for individual NDs such as AD or PD and to identify proteins that are connected to multiple NDPs. For example, I found that five neurodegenerative diseases are connected by four proteins (APP, ZMAT2, ZNF179 and IQSEC1) that link known NDPs such as huntingtin, TDP-43, parkin, ataxin-1 and SOD1. Analysis of publicly available gene expression data suggested that the mRNA expression of the four proteins is abnormally altered in brains of ND patients. Moreover, the knock-down of IQSEC1, ZNF179 or ZMAT2 aggravates pathogenic disease mechanisms such as aggregation of mutant huntingtin or TDP-43 as well as hyperphosphorylation of tau. Additionally, I identified 22 modifiers of TDP-43 aggregation, which are members in 7 protein complexes. These complexes were predicted based on combined data from PPI as well as siRNA screenings. Finally, I found that the proteins HDAC1, pRB, HP1, BRG1 and c-MYC, which form one of the predicted complexes, influence TDP-43 aggregation by altering its mRNA expression.

Mit der Entwicklung und der Anwendung moderner Genomsequenzierungstechnologien können weitere Genmutationen identifiziert werden. Nach jetzigem Stand sind etwa 20% dieser Mutationen in Bereichen von Proteinen vorzufinden, die keine eindeutige 3D-Struktur haben. Diese werden intrinsisch ungeordnete Regionen genannt (intrinsic disordered regions, IDRs). Die IDRs sind für die Steuerung biologischer Prozesse wichtig. Sie enthalten kurze, lineare Abschnitte (SLiMs), die bei der Interaktion von Proteinen eine Rolle spielen und mittels Phosphorylierung reguliert werden können. Um Krankheiten besser zu verstehen, ist es entscheidend zu erforschen, wie diese IDR-Mutationen die Interaktionen von Proteinen beeinflussen. In dieser Doktorarbeit wird eine Methode verwendet, bei der synthetische Peptide, die den mutierten Proteinsequenzregionen entsprechen, auf eine Membran aufgebracht werden, um die Wechselwirkungen dieser Peptidsequenzen mit zellulären Proteinen systematisch zu untersuchen. Zusätzlich werden Änderungen dieser Interaktionen zwischen normalen, phosphorylierten oder zusätzlich sequenzveränderten Peptidvarianten untersucht, um die Auswirkungen der Genmutationen besser zu verstehen. Diese Arbeit zeigt deutliche Unterschiede in den Wechselwirkungen zwischen phosphorylierten und nicht-phosphorylierten Peptiden auf. Sie sind größtenteils auf die Störung der phosphorylierungsabhängigen SLiMs zurückzuführen. Unter den Proteinen sticht insbesondere die S102P Mutation im Transkriptionsfaktor GATAD1 heraus, die mit einer Herzmuskelerkrankung in Verbindung steht. Wir haben festgestellt, dass diese Mutation eine Phosphorylierungsstelle stört, die für die Bindung an 14-3-3-Proteine verantwortlich ist. Wir haben weitere Untersuchungen durchgeführt, um diese Interaktion besser nachvollziehen zu können. Diese Arbeit trägt dazu bei, die molekularen Mechanismen von Krankheiten besser zu verstehen und bietet Möglichkeiten für weiterführende Untersuchungen und Therapieansätze auf. / Approximately 20% of disease-linked point mutations are situated within protein regions devoid of 3D structure, known as intrinsically disordered regions (IDRs). IDRs harbour short linear motifs (SLiMs) that mediate protein-protein interactions (PPIs), often through post-translational modifications such as phosphorylation. Investigating the impact of these IDR mutations on protein-protein interactions is essential to comprehend human diseases. In this doctoral thesis, I present a comprehensive exploration of a peptide-based proteomics screen, employed to study 36 disease-associated mutations that impair phosphorylation sites within IDRs. This approach, uses immobilized synthetic peptides, corresponding to the mutated regions, to capture interacting proteins from cellular extracts. This method facilitated the simultaneous comparison of interaction partners among wild-type, phosphorylated, and mutated peptide forms, enabling the functional assessment of individual mutations. Our analysis uncovered significant disparities between the interactomes of phosphorylated and non-phosphorylated peptides. Building on our findings, we placed particular emphasis on the S102P mutation within the transcription factor GATAD1, a mutation associated with dilated cardiomyopathy. Our screening demonstrated that this mutation disrupts a phosphorylation site responsible for 14-3-3 protein binding. To delve deeper into this interaction, we conducted a thorough investigation, employing techniques such as isothermal titration calorimetry, X-ray crystallography, and alanine scanning coupled with mass spectrometry. Our analyses hinted at the regulatory role of 14-3-3 binding in GATAD1's nucleocytoplasmic transport, achieved by masking its nuclear localization signal. The insights from our research shed fresh light on potential molecular mechanisms underpinning the development of various human diseases, offering a promising avenue for further investigation and therapeutic exploration.