Autorizada por el autor para ser publicada a texto completo a contar de noviembre de 2011 / La producción de proteínas recombinantes utilizando células animales es un proceso clave en la elaboración de productos terapéuticos de uso mundial. Para optimizar este proceso se debe tomar en cuenta una serie de factores como la línea celular utilizada, los vectores de expresión de la proteína recombinante y el medio de cultivo. Este Trabajo de Memoria de Título tiene como objetivo la optimización del medio de cultivo de células embrionarias de riñón humano (HEK-293) para la producción de un anticuerpo monoclonal anti-factor de necrosis tumoral (TNF-α). La estrategia general de trabajo consistió en transfectar células HEK-293 con un vector de expresión, que codifica para las cadenas liviana y pesada de un anticuerpo anti-TNF-α. Utilizando diluciones al límite de las células transfectadas, se seleccionaron seis clones productores del anticuerpo. Estos clones fueron caracterizados durante 7 días de cultivo en un medio DMEM/F12 y posteriormente en un medio mejorado, ambos con 10% de suero fetal bovino (SFB). La velocidad máxima de crecimiento en el medio mejorado fue de 0,033 hrs-1 con una máxima densidad celular de 19x106 cel/ml, siendo ésta siete veces mayor que la alcanzada en el medio DMEM/F12. Además, la producción de anticuerpo en este medio fue 1,07 unidades de absorbancia [405 nm], un 200% mayor que en el medio DMEM/F12. Utilizando un análisis factorial se obtuvo un clon capaz de crecer en estas condiciones usando una concentración de 3 mg/l de dexametasona. Este cultivo tuvo una máxima densidad celular de 2,8x106 cel/ml, una velocidad máxima de crecimiento de 0,018 hrs-1 y una producción de anticuerpo de 0,33 unidades de absorbancia. Para este clon, se obtuvieron disminuciones de un 38 y 70% en la densidad celular y producción de anticuerpo respectivamente, comparados con el medio con 10% de SFB. Finalmente se obtuvo una adaptación parcial a un crecimiento en suspensión. Este cultivo tuvo una máxima densidad celular de 0,48x106 cel/ml, una velocidad máxima de crecimiento de 0,01 hrs-1 y una producción de anticuerpo de 0,166 unidades de absorbancia. Se calcularon las tasas específicas de consumo de glucosa y producción de lactato para los crecimientos antes descritos. Se observó que las células en presencia de suero utilizan menos glucosa como fuente de energía, generando menos lactato en el medio de cultivo. Además, las células en suspensión tienen mayores tasas específicas de consumo de glucosa y producción de lactato, comparado con células en adherencia en un medio libre de suero y son capaces de utilizar lactato como fuente de carbono. Con el propósito de aumentar la producción del anticuerpo recombinante se utilizaron distintos suplementos en el medio de cultivo como ácido linoleico, insulina, extractos de levadura, sulfato de zinc, butirato de sodio y ácido valproico. Este último resultó fundamental para la producción del anticuerpo, aumentando en alrededor de un 90% la expresión en células adheridas. En conclusión, se obtuvo información del estado de las células en distintas fases de cultivo, generando una mayor comprensión del estado metabólico de células HEK-293 al generar un anticuerpo recombinante.

El Presente Trabajo de Título se enmarca dentro del proyecto de investigación Fondecyt Nº1080143 denominado “Effects of hydrophobic polypeptide tag fusion on protein purification by Hydrophobic Interaction Chromatography”, cuyo objetivo es determinar, cuantitativa y cualitativamente, el efecto de la fusión de polipéptidos hidrofóbicos en diferentes etapas del proceso de producción de proteínas recombinantes. Una de las etapas del proyecto, consiste en la optimización de las condiciones y el modo de operación del cultivo de Escherichia coli, que maximicen la productividad de cutinasas recombinantes. El microorganismo hospedero corresponde a Escherichia coliBL21 (DE3), cepa en la que se ha introducido el vector de expresión pET11a, el cual, bajo inducción, permite la producción de la proteína recombinante cutinasa a la que se han adicionado los aminoácidos triptófano(W), prolina(P) y tirosina(Y). Los polipéptidos hidrofóbicos adicionados son WPWP(Cutinasa-(WP)2) e YYY(Cutinasa-(Y)3). Las condiciones de cultivo en estudio, variables de entrada, corresponden a: temperatura de crecimiento y temperatura de inducción (25/18°C y 37/25°C), densidad celular en el punto de inducción (0,8 y 1,5 U Abs600nm ), concentración de inductor (0,1 y 0,5 mM IPTG); concentración de extracto de levadura (5 y 20 g/L), concentración de triptona (10 y 15 g/L) y concentración de glicerol (0 y 0,3 % v/v), en el medio de cultivo. Para realizar el estudio, se desarrolló un diseño experimental factorial fraccionario (26-2IV) que permite obtener información contundente respecto de los efectos principales de los factores (condiciones de cultivo) y sus interacciones (interacciones entre 2 factores) en cultivos batch en matraces. Se llevó a cabo la totalidad de experimentos establecidos en la malla de tratamientos, para las variantesCutinasa-(WP)2 y Cutinasa-(Y)3. Mediante un análisis estadístico de los resultados obtenidos se determinó la significancia de los factores y sus interacciones sobre la productividad y rendimiento (test ANOVA 95% nivel de significancia), se elaboró un modelo matemático lineal para estas variables en función de los factores e interacciones significativas y se determinaron las condiciones óptimas que maximizan la productividad y rendimiento para cada variante en particular, utilizando el modelo anteriormente nombrado. Los resultados obtenidos permitieron optimizar la producción de Cutinasa-(WP)2, sin inconvenientes, alcanzando una producción total de 28.870 [U Cutinasa-(WP)2/L] lo que equivale a 5,3 veces lo producido bajo las condiciones del caso base. El rendimiento optimizado fue 6,5 veces el rendimiento del caso base. Las condiciones óptimas de cultivo son: temperatura de crecimiento y temperatura de inducción, 37oC/25oC (Alto); densidad celular en el punto de inducción, 1,5 U Abs600nm(Alto); concentración de inductor, 0,1 mM IPTG (Bajo); concentración de extracto de levadura, 20 g/L (Alto); Concentración de triptona, 10 g/L (Bajo) y concentración de glicerol nula. El comportamiento errático de la variante Cutinasa-(Y)3 generó dificultades para modelar, predecir y optimizar la productividad y rendimiento de los cultivos. Se propone que las problemáticas de esta variante provienen de la cepa electrocompetente transfomada productora de Cutinasa-(Y)3. La comparación de los modos de operación en el fermentador Biostat B entregaron como resultado que el modo batch, para la variante Cutinasa-(WP)2, presentó mayor productividad específica total y rendimiento equivalentes a 2,5 y 1,4 veces la producción de fermentador operando en modo fed-batch con alimentación constante de nutrientes. En el caso de la variante Cutinasa-(Y)3, el modo de fermentación batch también fue el más favorable. Se concluye que todos los factores analizados tienen efectos significativos sobre la productividad y/o rendimiento de cutinasa recombinante en cultivos de E. coli BL21(DE3). Los factores e interacciones que poseen un efecto positivo y significativo sobre la productividad y/o rendimiento de ambas variantes corresponden a: densidad celular y sus interacciones con los factores temperatura de crecimiento e inducción y concentración de extracto de levadura. Los factores e interacciones que presentan efectos negativos y significativos sobre la productividad y/o rendimiento de ambas variantes son la concentración de inductor, concentración de triptona y la interacción concentración de glicerol-concentración extracto de levadura.

Orientador: Fernanda Klein Marcondes / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-07T23:50:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Calil_CarolineMorini_D.pdf: 1987640 bytes, checksum: 39cab7ddd21afb917b161e3e495138ce (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: Alterações emocionais têm sido relacionadas à ocorrência da halitose que é caracterizada pelo aumento na produção de compostos sulfurados voláteis (CSV) no arbucal exalado. Além disso, oscilações hormonais do ciclo menstrual também têm sido relacionadas a alterações na homeostasia bucal. Porém, ainda não está esclarecida a relação entre halitose, alterações emocionais e ciclo menstrual. O objetivo desse estudo foi avaliar a influência da ansiedade e do ciclo menstrual sobre a produção de CSV em homens (n=17) e em mulheres (n=14) nas fases pré-menstrual, menstrual e folicular, determinadas pelo método do calendário. A ansiedade foi induzida pelo "Video-Recorded Stroop Color-Word Test" (VRSCWT), que consiste na leitura, em 2 min, das cores em que 100 palavras designativas de cores estão pintadas, sendo que cada palavra apresentada encontra-se em cor diferente de seu significado. Por meio do questionário "Beck Anxiety Inventory" (BAI), foi avaliado o nível basal de ansiedade. A concentração bucal de CSV (halímetro), pressão arterial sistólica, diastólica, freqüência cardíaca, cortisol salivar, fluxo salivar e concentração total de proteínas salivares foram avaliados antes e apos o VRSCWT. Os resultados foram analisados utilizando-se análise de variância (p<0,05). De acordo com o BAI, os voluntários não apresentaram alterações nos níveis basais de ansiedade. Na condição basal, as concentrações de CSV foram maiores durante as fases menstrual (131 ± 14) e pré-menstrual (124± 15) em relação à fase folicular (123± 15) e homens (85± 15 ppb; p<0,05). Mulheres na fase pré-menstrual (0,26 ± 0,04) apresentaram menor fluxo salivar do que as mulheres nas fases menstrual (0,31 ± 0,04), folicular (0,33 ± 0,05) e homens (0,40±0,04 mL/min; p<0,05). A concentração total de proteínas salivares foi maior em homens (1,OO± 0,06, p<0,05) em comparação as fases do ciclo reprodutivo (menstrual = 0,77 ± 0,12; pré-menstrual = 0,70± 0,06; folicular =0,78 ± 0,10 mg/mL). Em homens, a pressão sistólica (125± 2; p<0,05) foi maior em relação às mulheres (prémenstrual = 108±2; menstrual = 110± 2; folicular = 110±2 rnrnHg). Ao contrário, homens apresentaram menor freqüência cardíaca (69± 1 bpm; p<0,05) em relação às mulheres (pré-menstrual = 80 ± 2; menstrual = 77 ± 3; folicular = 79±3 bpm). Foi observada maior concentração salivar de cortisol na fase menstrual (1,7 ±0,2; p<0,05) em comparação com as fases pré-menstrual (1,3± 0,13), folicular (1,4± 0,19) e homens (1,4 ± 0,07 /lg/dL). Nos homens, o VRSCWT induziu aumento na concentração bucal de CSV (97 ±11 ppb), pressão arterial sistólica (128 ±2 mmHg) e frequência cardíaca (74 ± 1 bpm), sem alteração na pressão arterial diastólica, fluxo salivar, concentrações salivares de proteínas e de cortisol salivar. Ao contrário, nenhuma diferença nas variáveis de resposta foi observada nas mulheres, após o VRSCWT (p>0,05). Os resultados demonstraram que a ansiedade pode contribuir para o aumento da produção de CSV em homens, e que o status hormonal de homens e mulheres pode participar deste processo / Abstract: Psychological symptoms have been pointed out as a factor, which induces halitosis, which is characterized by the increased production of volatile sulfur compounds (VSC) presented in the oral breathing. ln addition, hormonal fluctuation of the menstrual cycle has been show to affect oral homeostasis. However, the relationship among menstrual cycle, emotional factors and halitosis is not clarified. The aim of this study was to evaluate the influence of anxiety and menstrual cycle on the production of VSC in women (n=14) and in men (n=17). After approval by the ethics committee, volunteers with good oral and general health were submitted to the Video-Recorded Stroop Color-Word Test (VRSCWT) used to elicit anxiety. ln women, the test was performed on the pre-menstrual, menstrual and follicular phases of their regular reproductive cycles. The menstrual phases were determined by the calendar method. The baseline level of anxiety was measured through the "Beck Anxiety Inventory:' (BAl) before the VRSCWT. The VSC (ppb-halimeter), salivary flow (mL/min), total salivary protein concentration (mg/mL), systolic and diastolic blood pressure (SBP, DBP, mmHg), heart rate (HR, bpm) and salivary cortisol (ug/dL) measurements were performed before and after the application of the VRSCWT. Data were compared by Analysis of Variance (p<0.05). According to BAl, none of the volunteers presented any anxiety disorder diagnosis. During basal situation, VSC was higher during the menstrual (131 ± 14) and pre-menstrual (124± 15) phases when compared to men (85± 15) and women in follicular (123 ±15) phase (p<0.05). Salivary flow was lower duting pre-menstrual phase (0.26 ± 0.04; p<0.05) than menstrual (0.31 ± 0.04), follicular (0.33 ±0.05) phases and also compared to men (0.40 ± 0.04). Total salivary protein concentration was higher in men (1.00 ± 0.18, p>0.05) as compared to women in any menstrual phase (menstrual = 0.77 ± 0.12; pre-menstrual = 0.71 ±0.06; follicular = 0.78 ±0.18). SBP was higher in men (125 ± 2) as compared to women (pre-menstrual = 108 ± 2; menstrual = 110 ± 2; follicular = 111 ± 2). Heart rate was lower in men (69 ± 1) as compared to women in any phase of the menstrual cyc1e (pre-menstrual = 80 ± 2; menstrual = 77 ± 3; follicular =80 ± 3). Salivary cortisol was higher in women during menstrual phase (1.7 ± 0.2) in comparison with men (1.3 ± 0.07) and women in pre-menstrual (1.3±0.13) and follicular (1.4 ±0.19) phases. In men, the VRSCWT induced an increase in oral concentration of VSC (97 ±11, p<0.05) without changes in salivary flow (0.40 ±0.03) and protein concentration (1.00 ± 0.06) (p>0.05). These changes were associated with increases of SBP (128±1) and heart rate (74± 1) (p<0.05). Gn the contrary, in women, no differences in any parameter were observed after the VRSCWT (p>0.05). The results of the present study showed that, in men, the anxiety might contribute to production of VSC. Also, the hormonal status of men and women might be involved in this process / Doutorado / Fisiologia Oral / Doutor em Odontologia

Orientadores: Siome Klein Goldenstein, Carlile Campos Lavor / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Computação / Made available in DSpace on 2018-08-22T06:27:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Sendin_IvandaSilva_D.pdf: 14139008 bytes, checksum: d64497ed260da601f2dde025683df0d0 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: A determinação da estrutura de uma proteína usando dados de Ressonância Magnética Nuclear precisa lidar com incertezas provenientes do experimento laboratorial. Neste trabalho, apresentamos um método híbrido utilizando aritmética afim e propagação de incerteza por partículas para o tratamento e o controle de incertezas. Aplicado no cálculo da estrutura de proteínas, o método proposto é capaz de gerar estruturas de proteínas que atendem satisfatoriamente as restrições do problema / Abstract: The protein structure determination using Nuclear Magnetic Resonance data uses imprecise information from laboratorial experiments. In this work we introduce a new hybrid method that combines affine arithmetic and particles to uncertainty propagation and control. Applied to protein structure determination this new method was able to determine protein structures that satisfy most of problem constraints / Doutorado / Ciência da Computação / Doutor em Ciência da Computação

Orientadores: Eduardo Cardoso de Abreu, Carlile Campos Lavor / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Matemática Estatística e Computação Científica / Made available in DSpace on 2018-08-22T08:30:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Maioli_DouglasSilva_M.pdf: 4390735 bytes, checksum: 3008997a23c0723a152e019324a6f6a2 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: No presente trabalho é abordado um Problema de Geometria de Distâncias Moleculares (PGDM) que consiste na determinação de estruturas tridimensionais de moléculas a partir de distâncias entre pares de seus átomos. Inicialmente, apresentamos métodos da literatura utilizados para tentar resolver tal problema, como o Updated Geometric Build-Up (UGB) de Wu e Wu (2007) e o Algoritmo T (AT) de Fidalgo (2011). O novo método introduzido nesta dissertação de mestrado é baseado no AT e foi denominado de Algoritmo T Atualizado (ATA). Esta nova proposta utiliza a mesma estratégia desenvolvida no UGB, que busca obter uma maior estabilidade, com respeito ao número de condição, dos sistemas lineares resolvidos na execução do ATA. Por fim, um estudo baseado em experimentos numéricos foi feito para a verificação da qualidade das soluções obtidas pelo ATA, levando em conta o custo computacional, e em comparação com o método UGB / Abstract: The present work approaches the Molecular Distance Geometry Problem (MDGP) which consists on determining three-dimensional molecular structures from distance values between pairs of its atoms. Initially, we present methods from the literature which have been used in order to solve this problem, such as the Updated Geometric Build-Up (UGB) algorithm, from Wu and Wu (2007), and the T Algorithm (TA), from Fidalgo (2011). The new method, introduced in this master dissertation, is based on the TA and was named Updated T Algorithm (UTA). This new approach uses the same strategy developed in the UGB, which looks for obtaining a better numerical stability, with respect to the condition number of the coefficient matrices of the linear systems which are solved in UTA. Finally, a study based on numerical experiments was done for verifying the quality of the solutions obtained from UTA, considering the computational cost and comparing with the UGB / Mestrado / Matematica Aplicada / Mestre em Matemática Aplicada

Orientador: Jörg Kobarg / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-18T13:52:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Alborghetti_MarcosRodrigo_D.pdf: 16630969 bytes, checksum: 42e040f25194010a25828aeaa31ac3c2 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: As proteínas humanas FEZ1 e FEZ2 (fasciculation and elongation protein zeta) são ortólogas da proteína UNC-76 de C. elegans e estão envolvidas no crescimento e na fasciculação dos axônios através de interações que envolvem kinesinas, mitocôndrias e vesículas sinápticas. Além disso, algumas evidências sugerem a participação de FEZ1 na etiologia da esquizofrenia, no ciclo viral, além da resistência à quimioterápicos. Sua estrutura intrinsecamente desordenada, com coiled-coil ao longo da sequência, pode contribuir para sua função. Nós exploramos a evolução molecular da família de proteínas FEZ com ênfase no ramo dos vertebrados. Através do perfil do interactoma comparado entre FEZ1 e FEZ2 de Homo sapiens e UNC-76 de C. elegans foi observado um padrão de conservação das interações proteínaproteína entre FEZ1 e UNC-76, que explicam a capacidade de FEZ1 resgatar os defeitos causados por mutações em unc-76 em nematoides, de acordo com o descrito por Bloom e colaboradores em 1997. Além disso, caracterizamos a interação entre FEZ1 e SCOCO (short coil-coiled) por SAXS (Small Angle X-ray Scattering). Essa interação já foi descrita previamente entre os seus ortólogos UNC-76 e UNC-69, que cooperam no crescimento axonal. Um estado de heterotetramérico foi observado, consistindo de duas moléculas GST-SCOCO interagindo com duas moléculas de 6xHis-FEZ1 dimerizadas. Por PAGE (Polyacrylamide Gel Electrophoresis, eletroforese em gel de poli-acrilamida), SAXS, Espectrometria de Massas e Ressonância Magnética Nuclear, constatamos que FEZ1 dimeriza envolvendo a formação de ponte dissulfeto. In vivo, este estado dimérico de forma covalente pode ser importante para o transporte mediado por kinesinas de proteínas ao longo dos microtúbulos. Assim, FEZ1 pode ser classificada como uma proteína adaptadora do transporte, dimérica e bivalente, essencial para o crescimento axonal e organização pré-sináptica normal e transporte de cargas. A agregação de novos parceiros de interação encontrada para a proteína FEZ2 poderia ser interpretada como aquisição de novas funções moleculares e pode ter ocorrido nos primeiros estágios da evolução dos cordados / Abstract: The human proteins FEZ1 and FEZ2 (fasciculation and elongation protein zeta 1) are orthologs of the protein UNC-76 from C. elegans, involved in growth and fasciculation of axons, through interactions that involve kinesins, mitochondria and synaptic vesicles. Moreover, some evidence suggests involvement of FEZ1 in the etiology of schizophrenia, in addition to the viral cycle and resistance to chemotherapy. Its structure intrinsically disordered, with coiled-coil along the sequence, can contribute to its function. We have explored the molecular evolution of the FEZ protein family with emphasis on the vertebrata branch. Analyzing the interactome profile of the FEZ1 and FEZ2 from Homo sapiens and UNC-76 from C. elegans we observed a conserved pattern of protein-protein interactions among FEZ1 and UNC-76 that explain the ability of FEZ1 to rescue the defects caused by unc-76 mutations in nematodes, according to Bloom and co-workers in 1997. Furthermore, we characterized the interaction between FEZ1 and SCOCO (short coiled-coil protein) by SAXS (Small Angle X-ray Scattering). This interaction has been previously reported between their orthologs UNC-76 and UNC-69 that cooperate in axonal outgrowth. A heterotetrameric state was observed, which consists of two GST-SCOCO molecules attached to two FEZ1 molecules. By PAGE (Polyacrylamide Gel Electrophoresis), SAXS, Mass Spectrometry and Nuclear Magnetic Resonance we defined that FEZ1 dimerizes involving formation of disulfide bond. In vivo this covalent mediated dimeric state could be important for kinesin mediated protein transport along the microtubule. Thereby, FEZ1 may be classified as a dimeric and bivalent transport adaptor, essential to axon outgrowth and normal pre-synaptic organization and transport of cargoes. The aggregation of new interaction partners found for the FEZ2 protein could be interpreted as the acquisition of new molecular functions and may have occurred in the early stages of chordate evolution / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Everson Alves Miranda / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-14T10:04:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Robic_Goran_D.pdf: 5874566 bytes, checksum: 5a69e6daebf342bd09772a2c02c0c766 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: A técnica de eletrocoagulação tem sido usada basicamente em tratamento de água potável e águas residuais. Neste trabalho propusemos o uso desta técnica na recuperação e purificação (RPB) de proteínas recombinantes produzidas em plantas geneticamente modificadas. O desafio principal da RPB de uso de plantas como biorreatores é a presença de clorofila e polifenóis nos seus extratos, que causam precipitação e desnaturação das proteínas de interesse, além de danificarem membranas e géis de separação. Portanto, a remoção destes compostos é essencial. No presente trabalho estudou-se a aplicação de eletrocoagulação para clarificar extratos de folhas de Nicotiana benthamiana transgênica removendo a clorofila e polifenóis, sem remover a proteína recombinante sGFP (proteína verde fluorescente sintética). Primeiramente foi necessário desenvolver um método de determinação e quantificação de sGFP baseado na fluorescência intrínseca desta proteína. Os problemas com a fluorescência de fundo presente nos extratos de folhas de N. benthamiana e o aumento de intensidade da fluorescência da sGFP nestes extratos - provavelmente o resultado de dimerização de moléculas de sGFP promovida por composto(s) do extrato - por nós observados, tinham que ser resolvidos. Diluição de 20 vezes dos extratos contendo sGFP com solução de uréia 6 mol/L em fosfato de sódio 50 mmol/L pH 7,00 eliminou completamente estas duas interferências. Os estudos da eletrocoagulação foram iniciados desenvolvendo-se dois modelos de remoção de compostos biológicos de soluções aquosas por esta técnica. Os modelos desenvolvidos são baseados na formação de complexos entre o composto e o gel de hidróxido de alumínio ou a partição do composto entre a fase aquosa e fase do gel de hidróxido de alumínio. Análises teóricas e experimentais revelaram que os parâmetros relevantes na remoção destes compostos são a corrente utilizada - que afeta a taxa de formação de hidróxido de alumínio - e o pH da eletrocoagulação - que afeta a carga tanto do gel formado como dos compostos a serem removidos. Gel de hidróxido de alumínio produzido a pH 8,0 apresentou alta eficiência em remover clorofila e polifenóis dos extratos de folhas de N. benthamiana não-transgênica, ao passo que somente uma pequena porção de proteínas nativas foi removida. Portanto, o gel de hidróxido de alumínio produzido nesta condição foi adicionado a extratos de N. benthamiana transgênica contendo sGFP. A remoção de 99,7% clorofila, de 88,5% dos polifenóis e de 38,4% de proteína total do extrato foi observada sem remoção da sGFP (fator de purificação de 1,6). Portanto, a eletrocoagulação pode também ser usada como técnica de pré-purificação de proteínas recombinantes e ao mesmo tempo como método de clarificação de extratos de folhas. / Abstract: Electrocoagulation is a technique that has been basically applied to water and wastewater treatment. We propose here the extension of this relatively cheap technique to the field of downstream processing (DSP) of plant-derived proteins, in which plants are used as a bioreactor for recombinant protein production. The main problem in the DSP of this plant-based technology is the presence of chlorophyll and phenolic compounds in plant extracts, which tend to precipitate and denature the proteins besides damaging separation membranes and gels. Therefore their removal from the extracts is essential. In the present work we studied the application of a electrocoagulation based technique as a prepurification technique to clarify transgenic Nicotiana benthamiana leaf extracts by removing chlorophyll and phenolic compounds without removing the recombinant protein sGFP (synthetic green fluorescent protein). First, a method for fluorescence-based quantification of sGFP had to be developed. The background fluorescence of plant extracts and the increased level of sGFP fluorescence in N. benthamiana leaves extracts - probably the result of dimerization of sGFP molecules promoted by interaction with some component(s) of tobacco extract - observed by us had to be overcome. Diluting the tobacco extract spiked with sGFP by 20 times with 6 mol/L urea solution in 50 mmol/L sodium phosphate buffer pH 7.00 completely eliminated the two mentioned interferences. The electrocoagulation studies started with the development of simple timedependent models for electrocoagulation of biological compounds from solutions. These models are based on either stoichiometric complex formation between aluminium hydroxide gel and the compound or the partition of the compound between the aqueous and the aluminium hydroxide gel phase. Theoretical and experimental analysis demonstrated that a relevant parameters in the process of electrocoagulation of biological materials are the current applied - since it affects the rate of aluminium hydroxide formation - and the pH of electrocoagulation - since it affects the charges of the aluminium hydroxide gel formed and the components to be removed. Aluminium hydroxide gel produced at pH 8.0 demonstrated a high efficiency of clorophyll and phenolic compounds removal from non-transgenic N. benthamiana leafs extracts, while removing only relative small portion of the native proteins. Therefore, the aluminum hydroxide gel produced at this pH was added to transgenic N. benthamiana leaf extracts containing recombinant sGFP. Removal of 99.7% of chlorophyll and 88.5% of phenolic compounds were observed. Also at this conditions 38.4% of total protein was removed, which resulted in a purification factor of 1.6 with 100% of the sGFP recovered. Therefore the method proposed could also be used as a strategy of pre-purification of recombinant proteins besides at the same time clarifying the tobacco leaf extracts. / Doutorado / Desenvolvimento de Processos Biotecnologicos / Doutor em Engenharia Química

Orientador: Jaime Amaya-Farfan / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-14T12:35:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Zaffani_VivianeCostaSilva_M.pdf: 1237742 bytes, checksum: 013e4cb87532470b0d0ebff8e7ade481 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: A ocorrência de desvios no metabolismo protéico durante o exercício depende tanto da intensidade, duração e freqüência do exercício, como também da ingestão alimentar, especialmente da qualidade da dieta consumida. Neste contexto, proteína do soro do leite (PSL) destaca-se pelo seu alto valor nutritivo, devido tanto à composição de aminoácidos, quanto à rápida digestão, além de outras funcionalidades relacionadas com a saúde. O objetivo deste estudo foi avaliar em ratos os efeitos da ingestão da proteína do soro do leite, na sua forma intacta e hidrolisada (~12,5% de hidrólise), em associação à atividade física de endurance, sobre os níveis séricos de aminoácidos, evolução ponderal, conteúdo protéico em gastrocnêmio e sóleo, conteúdo de DNA no gastrocnêmio, níveis séricos de IGF1, síntese e degradação protéica no grastrocnêmio e síntese no sóleo. Ratos Wistar foram distribuídos em 6 grupos, de acordo com a proteína consumida (12%): caseína (CAS), isolado protéico do soro do leite (IPSL) ou hidrolisado protéico do soro do leite (HPSL)) e submetidos a um protocolo de atividade física (sedentários (S) e treinados (T)). Os ratos treinados correram em esteira, durante 9 semanas, e foram sacrificados após 48 horas de repouso e 12 horas de jejum. As três dietas utilizadas apresentaram conteúdos semelhantes de aminoácidos totais, mas as dietas IPSL e HPSL destacaram-se apresentando maiores valores absolutos de leucina, isoleucina, lisina, treonina, cistina, alanina e ácido aspártico, em relação a CAS. No geral, os níveis séricos de aminoácidos indispensáveis foram semelhantes para os grupos IS e HS, em comparação com os ratos controle sedentários (CS), enquanto o grupo HT apresentou o maior nível destes aminoácidos, em relação ao CT. A evolução ponderal foi semelhante para todos os grupos de ratos até o final da oitava semana de treinamento. Na nona semana, os grupos treinados apresentaram peso significativamente menor que o CS. Não houve diferença estatística para o peso, conteúdo protéico dos músculos gastrocnêmio e sóleo, níveis séricos de IGF1 e taxas de degradação protéica muscular do gastrocnêmio, entre todos os grupos experimentais. O conteúdo e concentração de DNA no gastrocnêmio foi significativamente menor em ambos os grupos que consumiam a HPSL (HS e HT), independente da atividade física, comparado aos grupos que consumiam as proteínas intactas (CS, IS, CT e IT). As taxas de síntese protéica nos músculos gastrocnêmio e sóleo também foram menores para o grupo HT, comparado aos sedentários (CS, IS e HS), mas sem mostrar diferença com os grupos CT e IT. Os ratos do grupo HT destacaram-se por apresentar diminuição da demanda por nova síntese protéica, e da necessidade de utilização de aminoácidos do pool sérico diminuindo, consequentemente, a necessidade de aumentar a quantidade de DNA celular no músculo gastrocnêmio e ainda assim, manteve o peso, a concentração e o conteúdo protéico muscular sem diferença em relação aos demais grupos. Estes resultados, considerados em conjunto, sugerem que o consumo da proteína hidrolisada do soro do leite pode contribuir para a preservação da massa muscular no gastrocnêmio, quando associado à atividade física de endurance. / Abstract: Physical exercise promotes protein metabolic alterations depending not only on its intensity, duration and frequency, but also on food intake and especially on the quality of the diet. In this context, the milk whey proteins (PSL) stand out because of their high quality, meeting both amino-acid profile and digestibility requirements, besides other functional properties. The aim of this study was to assess the effects of milk whey protein intake in rats, in both the intact and hydrolyzed forms (~12,5% of hydrolysis), associated with physical activity of endurance, on serum amino acids levels, body weight, protein content in both the gastrocnemius and soleus muscles, total DNA content in the gastrocnemius, serum IGF1 levels, protein degradation rate in the gastrocnemius, and of protein synthesis in the soleus and gastrocnemius. Male Wistar rats were divided into six groups as follows: protein consumed (12%), casein - CAS, milk whey protein isolate - IPSL, or milk whey protein hydrolyzate -HPSL) and physical activity protocol (sedentary, S, and trained, T). The trained rats were exercised on the treadmill during nine weeks and sacrificed following 48 hours of rest; the last 12 hours being fasted. The three diets tested produced similar contents of total amino acids, although the IPSL and HPSL diets stood out because of the higher absolute values of leucine, isoleucine, lysine, threonine, cysteine, alanine and aspartate than those of CAS. As a whole, the serum indispensable amino acid levels were similar when comparing both IS and HS groups with the control group (CS). However, the HT group showed higher levels of these amino acids than the CT group. No difference in body weight evolution was apparent among the groups until the end of the eighth week of training. Nevertheless, on the ninth week the trained groups showed significantly lower weights than group CS. There were no significant differences, among all groups studied, in the weight, the content and concentration of both gastrocnemius and soleus muscles, and serum IGF1 levels, as well as the degradation rate of proteins in the gastrocnemius muscle. The content and concentration of DNA in the gastrocnemius were significantly lower in both groups fed HPSL (HS and HT), regardless of physical activity, than in the groups fed intact protein (CS, IS, CT and IT). The rate of protein synthesis in both gastrocnemius and soleus muscles were also lower in the HT group than those found in the CS, IS and HS groups. However, there was no difference when compared to those of the IT and CT groups. Summarizing, the HT group stood out because of its lower demand for new protein synthesis and amino acid utilization from the serum pool, consequently decreasing the need for higher amount of cellular DNA in the gastrocnemius muscle. Even so, this group kept the same muscle mass, protein content and concentration, as those of the other groups. These results suggest that the consumption of hydrolyzed milk whey protein may contribute to the preservation of the gastrocnemius muscle when associated with physical activity of endurance. / Mestrado / Nutrição Experimental e Aplicada à Tecnologia de Alimentos / Mestre em Alimentos e Nutrição

Orientador: Sara Teresinha Olalla Saad / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-27T14:01:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dantas_LarissaElizabethCordeiro_M.pdf: 38127772 bytes, checksum: f284c501fcf1d07b55c32c7da40e08c1 (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: A sinalização celular é o mecanismo que as células possuem para se comunicar com suas vizinhas, tecidos distantes ou mesmo em processos internos. Portanto, entender como a sinalização está organizada em uma célula sadia é de extrema importância para o entendimento de processos vitais normais. Desta forma, ter suporte para avaliar as bases moleculares das doenças, uma vez que muitas delas originam-se de disfunções na transmissão de sinais celulares. A proteína SIVA1, superexpressa em neoplasias de células do sangue, interage com a proteína p53, com membros da superfamília dos receptores de necrose tumoral, estatimina, dentre outros. Estas proteínas estão relacionadas com diversas vias de sinalização em câncer e, portanto, SIVA1 faz-se um forte candidato para estudos de desenho racional de novos fármacos. O objetivo deste estudo foi caracterizar as propriedades biofísicas do domínio C-terminal de SIVA1 a fim de contribuir futuramente com o descobrimento de novos alvos para drogas alvo-dirigidas. O domínio C-Terminal (resíduos de 84 a 175), fusionados à Glutationa-S-Transferase (GST) e expressos em um sistema de expressão heteróloga de E.coli, produziu um recombinante GST-SIVA-C-Terminal, que foi em seguida purificado por colunas de afinidade a proteínas fusionada à GST (GSH sefarose) e por filtração em fel. A capacidade biológica de ligar-se a outras proteínas, das famílias supramencionadas, foi testada em extrato de células da linhagem Jurkat. Ensaios bioquímicos e biofísicos mostraram que a proteína apresentava-se monodispersa em solução com um formato predominante não enovelado e alongado. No entanto, em altas concentrações, a proteína apresenta tendência de formar agregados solúveis. Espera-se que estes resultados possam levar a um melhor entendimento das propriedades de SIVA1, possibilitando o desenho de compostos químicos alvo-específicos. As coletas de dados para o estudo foram feitas no Laboratório de Bioquímica de Proteínas do Instituto de Química (IQ-Unicamp), no Laboratório Nacional de Luz Síncrotron (LNLS) e no Laboratório Nacional de Biociências (LNBio-LEC) / Abstract: Siva1 protein interacts with tumor protein p53 and with the member of the tumor necrosis factor receptor superfamily, stathmin, among others. These proteins are related to several pathways involved in cancer and are therefore, strong targets for drug design. Thus, the aim of this study was to characterize the biophysical properties of Siva 1 C-terminal domain in order to contribute to the discovery of new target directed drugs. The C-terminus Siva1 domain (residues 84-175) was fused to gluthatione S-transferase (GST) and expressed in an E coli system and the recombinant GST-Siva C-terminus was purified using GST-Tagged Protein affinity and gel filtration chromatography. We tested the biological activity of the purified Siva C-terminus domain in an extract of the Jurkat cell line that contained natural SIVA binders. Biophysical and biochemical assays showed that the protein was monodisperse in solution with a predominant unfolded and elongated shape. However, at high concentrations, the protein showed a tendency to form soluble aggregates. These results are expected to lead to further progress in better understanding of SIVA1 properties and target-directed drug design. Experiments took place at "Laboratório de Bioquímica de Proteínas" at Institute of Chemistry (IQ-Unicamp), "Laboratório Nacional de Luz Síncrotron" (LNLS) and "Laboratório Nacional de Biociências" (LNBio-LEC) / Mestrado / Fisiopatologia Médica / Mestra em Ciências

Orientador: José Paschoal Batistuti / Banca: Rubens Monti / Banca: Alice Yoshiko Tanaka / Resumo: As proteínas são de fundamental importância nos processos biológicos atuando como enzimas, hormônios, neurotransmissores, transportadores através de membranas entre outros, pois são essenciais sob os aspectos da estrutura e função celular. Tem se tornado cada vez mais relevante o estudo de metodologias para determinar proteínas em várias áreas como em tecnologia e ciência de alimentos, laboratórios de análises clínicas, nutrição animal e humana. Antes de iniciar qualquer tipo de análise de proteínas, o método utilizado deve ser validado, pois a validação de métodos é um aspecto vital da garantia da qualidade analítica. A validação é um processo dinâmico e constante que começa na fase de seleção, desenvolvimento e otimização do método e na qualificação dos instrumentos, materiais e analistas continuando na fase de experimentos. Um processo de validação bem definido e documentado oferece as agências reguladoras evidências de que o método é adequado. As características investigadas no processo de validação a fim de demonstrar o desempenho do método são: Linearidade, Faixa linear de trabalho, Limite de detecção, Limite de quantificação, Precisão, Exatidão, Precisão intermediária, Robustez, Especificidade, Incerteza de medição e Recuperação. Os métodos mais utilizados para quantificar proteínas são Biureto, Bradford, BCA, Kjeldahl e de Lowry, sendo o método de Lowry o mais utilizado. Devido aos interferentes e a incerteza do método em relação aos parâmetros analisados, este trabalho teve o propósito de realizar a validação do método de Lowry modificado quanto aos parâmetros preconizados pela NATA. A proteína utilizada em todo o experimento foi a albumina bovina sérica - BSA e a metodologia foi a original com algumas modificações... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The proteins are of fundamental importance in biological processes acting as enzymes, hormones, neurotransmitters, transporters across membranes among others, as they are essential aspects in the structure and cellular function. It has become increasingly relevant the study of methodologies for determining proteins in various areas such as technology and food science, clinical laboratories, animal and human nutrition. Before starting any type of protein analysis, the method used must be validated because the method validation is a vital aspect of analytical quality assurance. Validation is a constant and dynamic process that begins at the stage of selection, development and optimization of the method and the qualification of tools, materials, analysts and continuing in the experimental phase. A validation process well defined and documented regulatory agencies provides evidence that the method is appropriate. The characteristics investigated in the validation process to demonstrate the performance of the method are: linearity, linear working range, limit of detection, limit of quantification, precision, accuracy, precision intermediate, robustness, specificity, uncertainty of measurement and recovery. The methods used to quantify proteins are Biuret, Bradford, BCA, Kjeldahl, and Lowry, the method of Lowry the most used. Due to interferences and uncertainty regarding the method parameters, this study aimed to perform the validation Lowry's method modified the parameters recommended by NATA. The protein used throughout the experiment was to bovine serum albumin - BSA and was the original method with some modifications. Despite the existence of many modern techniques, the spectrophotometric method has been shown to be effective, in addition to lower cost and easy handling. The method was developed and validated / Mestre