published_or_final_version / Biological Sciences / Master / Master of Philosophy

There is no abstract available for this thesis. / Department of Chemistry

Proteins play an important role in cells, as the morphology, function and activities of the cell depend on the proteins they express. The key to understanding how different proteins function lies in an understanding of the molecular structure. The overall aim of this thesis was the determination of the structure of DWNN domains. This thesis described the preparation of samples of human DWNN suitable for structural analysis by nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR), as well as NMR analysis.

Bibliography: leaves 138-158. / x, 158 leaves : ill. ; 30 cm. / Title page, contents and abstract only. The complete thesis in print form is available from the University Library. / This study identified and investigated the properties, functions and patterns of accumulation of prominent berry proteins associated with white wine haze. Detailed analysis was conducted on two PR-like proteins of V. vinifera, VVPR-4a and VVTL1. In vitro fungal growth inhibition assays suggested that berry PR-like proteins may play an important role in plant defence, particularly against fungal attack. Results of this study also have future implications for controlling the ripening process of grapes. / Thesis (Ph.D.)--University of Adelaide, Dept. of Horticulture, Viticulture and Oenology, 1999

Made available in DSpace on 2014-08-13T14:50:40Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-02-28Bitstream added on 2014-08-13T18:01:28Z : No. of bitstreams: 1 000747172.pdf: 1681381 bytes, checksum: 9f87febf4316cf995b9569ba52b73b6b (MD5) / A osteopontina (OPN) é uma glicofosfoproteína secretável que tem sido relacionada com diferentes processos fisiológicos e de doença nos seres humanos. Sabe-se que a OPN está relacionada com a progressão neoplásica e metástase em diversos cânceres humanos, porém esta relação ainda é pouco explorada na literatura veterinária. O objetivo do presente estudo foi avaliar a expressão de osteopontina nos carcinomas mamários caninos e sua relação com biomarcadores tumorais bem estabelecidos nessas neoplasias. Para isso, a expressão de OPN, EGFR, HER2 e c-Kit foi avaliada em conjunto com a análise da taxa de Ki67 em 43 carcinomas mamários provenientes de cadelas diferentes. Demonstrou-se que a expressão acentuada de OPN está relacionada com a expressão de EGFR (P < 0.001) e com a superexpressão de HER2 (P = 0.012). Em conclusão, a osteopontina aparenta estar relacionada com prognóstico ruim e ativação da via MAPK, este ultimo fato podendo implicar na futura utilização de tratamentos baseados em drogas direcionadas para esta via de sinalização particular nas neoplasias mamárias de cadelas com expressão acentuada de osteopontina / Osteopontin (OPN) is a secreted glycophosphoprotein that has been implicated in a number of different normal physiologic and pathologic processes in humans. OPN is known to be involved in the progression and metastasis of various humans cancers, but this relation is still little explored in the veterinary literature. The aim of this study was to evaluate the expression of osteopontin in canine mammary carcinomas and its relation with well established canine mammary tumor biomarkers. For that, the expression of OPN, EGFR, HER2, and c-Kit were evaluated along with Ki67 rate in 43 mammary carcinomas from different female dogs. OPN was demonstrated to be expressed by neoplastic epithelial cells in all carcinomas as well as in stromal cells from the tumor microenvironment. Relation between OPN high expression and EGFR positivity (P < 0.001) and high HER2 expression (P = 0.012) was demonstrated. In conclusion, osteopontin seems to be related to poor prognosis and MAPK pathway activation, the latter a feature that could imply in the future use of treatments with drugs directed against this particular signaling pathway in highly OPN expressing canine mammary tumors

Orientador: Noeme Sousa Rocha / Coorientador: Deilson Elgui de Oliveira / Banca: Rafael Malagoli Rocha / Banca: Renée Lufer Amorim / Resumo: A osteopontina (OPN) é uma glicofosfoproteína secretável que tem sido relacionada com diferentes processos fisiológicos e de doença nos seres humanos. Sabe-se que a OPN está relacionada com a progressão neoplásica e metástase em diversos cânceres humanos, porém esta relação ainda é pouco explorada na literatura veterinária. O objetivo do presente estudo foi avaliar a expressão de osteopontina nos carcinomas mamários caninos e sua relação com biomarcadores tumorais bem estabelecidos nessas neoplasias. Para isso, a expressão de OPN, EGFR, HER2 e c-Kit foi avaliada em conjunto com a análise da taxa de Ki67 em 43 carcinomas mamários provenientes de cadelas diferentes. Demonstrou-se que a expressão acentuada de OPN está relacionada com a expressão de EGFR (P < 0.001) e com a superexpressão de HER2 (P = 0.012). Em conclusão, a osteopontina aparenta estar relacionada com prognóstico ruim e ativação da via MAPK, este ultimo fato podendo implicar na futura utilização de tratamentos baseados em drogas direcionadas para esta via de sinalização particular nas neoplasias mamárias de cadelas com expressão acentuada de osteopontina / Abstract: Osteopontin (OPN) is a secreted glycophosphoprotein that has been implicated in a number of different normal physiologic and pathologic processes in humans. OPN is known to be involved in the progression and metastasis of various humans cancers, but this relation is still little explored in the veterinary literature. The aim of this study was to evaluate the expression of osteopontin in canine mammary carcinomas and its relation with well established canine mammary tumor biomarkers. For that, the expression of OPN, EGFR, HER2, and c-Kit were evaluated along with Ki67 rate in 43 mammary carcinomas from different female dogs. OPN was demonstrated to be expressed by neoplastic epithelial cells in all carcinomas as well as in stromal cells from the tumor microenvironment. Relation between OPN high expression and EGFR positivity (P < 0.001) and high HER2 expression (P = 0.012) was demonstrated. In conclusion, osteopontin seems to be related to poor prognosis and MAPK pathway activation, the latter a feature that could imply in the future use of treatments with drugs directed against this particular signaling pathway in highly OPN expressing canine mammary tumors / Mestre

Typescript. Includes vita and abstract. Bibliography: Includes bibliographical references (leaves 93-101). Description: xi, 101 leaves : ill. ; 29 cm.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:25Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-12-06Bitstream added on 2014-06-13T19:29:22Z : No. of bitstreams: 1 santos_fr_me_arafcf.pdf: 517837 bytes, checksum: 1c8c3fe118a03a4ef52272b2302c512b (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / As proteínas são de fundamental importância nos processos biológicos atuando como enzimas, hormônios, neurotransmissores, transportadores através de membranas entre outros, pois são essenciais sob os aspectos da estrutura e função celular. Tem se tornado cada vez mais relevante o estudo de metodologias para determinar proteínas em várias áreas como em tecnologia e ciência de alimentos, laboratórios de análises clínicas, nutrição animal e humana. Antes de iniciar qualquer tipo de análise de proteínas, o método utilizado deve ser validado, pois a validação de métodos é um aspecto vital da garantia da qualidade analítica. A validação é um processo dinâmico e constante que começa na fase de seleção, desenvolvimento e otimização do método e na qualificação dos instrumentos, materiais e analistas continuando na fase de experimentos. Um processo de validação bem definido e documentado oferece as agências reguladoras evidências de que o método é adequado. As características investigadas no processo de validação a fim de demonstrar o desempenho do método são: Linearidade, Faixa linear de trabalho, Limite de detecção, Limite de quantificação, Precisão, Exatidão, Precisão intermediária, Robustez, Especificidade, Incerteza de medição e Recuperação. Os métodos mais utilizados para quantificar proteínas são Biureto, Bradford, BCA, Kjeldahl e de Lowry, sendo o método de Lowry o mais utilizado. Devido aos interferentes e a incerteza do método em relação aos parâmetros analisados, este trabalho teve o propósito de realizar a validação do método de Lowry modificado quanto aos parâmetros preconizados pela NATA. A proteína utilizada em todo o experimento foi a albumina bovina sérica – BSA e a metodologia foi a original com algumas modificações... / The proteins are of fundamental importance in biological processes acting as enzymes, hormones, neurotransmitters, transporters across membranes among others, as they are essential aspects in the structure and cellular function. It has become increasingly relevant the study of methodologies for determining proteins in various areas such as technology and food science, clinical laboratories, animal and human nutrition. Before starting any type of protein analysis, the method used must be validated because the method validation is a vital aspect of analytical quality assurance. Validation is a constant and dynamic process that begins at the stage of selection, development and optimization of the method and the qualification of tools, materials, analysts and continuing in the experimental phase. A validation process well defined and documented regulatory agencies provides evidence that the method is appropriate. The characteristics investigated in the validation process to demonstrate the performance of the method are: linearity, linear working range, limit of detection, limit of quantification, precision, accuracy, precision intermediate, robustness, specificity, uncertainty of measurement and recovery. The methods used to quantify proteins are Biuret, Bradford, BCA, Kjeldahl, and Lowry, the method of Lowry the most used. Due to interferences and uncertainty regarding the method parameters, this study aimed to perform the validation Lowry´s method modified the parameters recommended by NATA. The protein used throughout the experiment was to bovine serum albumin - BSA and was the original method with some modifications. Despite the existence of many modern techniques, the spectrophotometric method has been shown to be effective, in addition to lower cost and easy handling. The method was developed and validated

Orientador: Jose Camillo Novello / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-12T20:39:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Caetano_HugoTakeda_M.pdf: 2768082 bytes, checksum: 642bc9cfafd5a35858bee1896b5da5df (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: A proteômica tem-se tomado ao longo dos últimos anos uma área de estudo cada vez mais essencial para o melhor entendimento dos mecanismos efetores e regulatórios das células e suas interações em sistemas biológicos. Patologias de origem genética como a hipertrigliceridemia, que geralmente modificam o perfil lipídico com o aumento dos níveis de triglicérides e colesterol, estão fortemente relacionadas com diversas doenças cardiovasculares. Estudos com animais e humanos têm sido realizados em busca do entendimento dos mecanismos celulares e moleculares implicados nestas patologias para potenciais intervenções terapêuticas e preventivas. Estudos em camundongos geneticamente hipertrigliceridêmicos para super expressarem a apolipoproteína C-III humana demonstraram que elevadas concentrações plasmáticas de triglicérides e ácidos graxas livres constituem uma condição metabólica que altera a funcionalidade mitocondrial. Essas mudanças no controle respiratório das mitocôndrias transgênicas representam uma adaptação atribuída a diferenças estruturais ou funcionais das membranas internas da mitocôndria transgênica. Assim, foi feito o estudo comparativo do proteoma de mitocôndria obtido destes animais transgênicos hipertrigliceridêmicos com o proteoma de camundongos controles não transgênicos. Para tanto, após o isolamento das mitocôndrias normais e transgênicas, foram utilizadas técnicas de eletroforese bidimensional (2DE) e espectrometria de massas do tipo MALDI-ToF e Q-ToF para a identificação das proteínas diferencialmente expressas. Dentre elas foram identificadas as proteínas Hidroximetilglutaril-CoA sintase, Carbamoil-fosfato sintetase e Flavoproteína transferidora de elétrons. Estas e outras proteínas podem representar interessantes alvos moleculares para o estudo da funcionalidade mitocondrial, visando futuras aplicações clínicas para o tratamento de determinadas condições patológicas como a hipertrigliceridemia. / Abstract: Along the last years, Proteomics has become an area of study each more essential to the better understanding of the effective and regulatory mechanisms of the cells and their interactions inside biological systems. Pathologies of genetic origin like the hypertriglyceridemia, that usually modify the lipid profile with the increase in the triglycerides and cholesterol levels, are strongly related to various cardiovascular diseases. Studies with animals and humans have been made in search of the understanding of 0011 and molecular mechanisms implied in these pathologies for potential therapeutic and preventive interventions. Studies in genetically hypertriglyceridemic mice to over expressing the human apolipoprotein C-III showed that high plasmatic concentrations of triglycerides and free fatty acids constitute a metabolic condition that changes the mitochondrial functionality. These changes in the breathing control of the transgenic mitochondria represent an adaptation attributed to structural or functional differences on the inner membrane of transgenic mitochondria. This way, we made the comparative study of the mitochondrial proteome obtained from these hypertriglyceridemic transgenic animals with the proteome from non transgenic control mice. For such, after the isolation of the normal and transgenic mitochondria, we used two-dimensional gel electrophoresis (2DE) and MALDI-ToF and Q-ToF mass spectrometry techniques to identify the differentially expressed proteins. Among them we identified the proteins Hydroxymethylglutaryl-CoA synthase, Carbamoyl-phosphate synthase and Electron transfer flavoprotein. These and other proteins can represent interesting molecular targets for the study of the mitochondrial functionality, aiming future clinical applications for the treatment of certain pathological conditions like hypertriglyceridemia. / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Jorg Kobarg / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-11T07:55:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Quaresma_AlexandreJoseChristino_D.pdf: 9068041 bytes, checksum: 9661a43a5c28440721d55ca90f6c94ac (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: Os membros da família de proteínas chamada hnRNPs (heterogenous nuclear ribonuclein proteins) apresentam importantes papeis no controle da expressão gênica e no metabolismo dos mRNAs. Os membros hnRNPD (AUF1) e hnRNPQ (NSAP1) foram alvos deste estudo. AUF1 apresenta dois domínios de ligação à RNA do tipo RRM (RNA recognition motif) e participa ativamente no processo de desestabilização de uma classe de mRNAs que apresentam um motivo rico em AU na região 3' não traduzida. Demonstramos, através do sistema de duplo híbrido em levedura, que a isoforma p37 de AUF1 interagiu com as proteínas hnRNPQ, IMP-2, NSEP1 (YB-1) e UBC9. Além disso, a proteína hnRNPQ também foi pescada num outro ensaio de duplo híbrido em levedura, que utilizou como isca a proteína humana arginina metiltransferase (PRMT1). hnRNPQ apresenta, na sua região Cterminal, um ¿motivo rico em argininas e glicinas¿ (RGG box). Demonstramos que ela é alvo de metilação pela PRMT1 in vitro e in vivo. Funcionalmente, sua metilação é importante para sua localização nuclear. NSAP1 têm uma constituição modular com um domínio ácido (AcD) no seu Nterminal, seguido por três domínios de ligação à RNA do tipo RRM e o já mencionado RGG box no seu C-terminal. Funcionalmente hnRNPQ está envolvido em vários aspectos do etabolismo de RNA, incluindo a edição do mRNA da proteína humana ApoB. Para isso, ela interage não somente com o mRNA de ApoB, mas com a enzima efetora da edição Apobec1 e com a proteína que ativadora do Apobec1 (ACF1). Mostramos que o domínio ácido, de NSAP1 é capaz de interagir com Apobec1 e que sua fosforilação in vitro pela PKC inibe esta interação. Ainda identificamos que hnRNPQ interage com proteínas da família heat shock (incluindo HSP70 e BiP), e vimos que hnRNPQ é um alvo de fosforilação principalmente pela PKCd, in vitro. A localização sub-celular de hnRNPQ é modificada pela ativação in vivo das PKCs. Em conseqüência desta ativação ou da aplicação de estresse oxidativo, térmico ou indução de estresse do reticulo endoplasmático (tratamento com tapsigargina) hnRNPQ se desloca do núcleo para o citoplasma aonde se encontra em vesículas/corpúsculos definidas. Em resumo, nossos dados sugerem que as diversas funções da hnRNPQ relacionadas ao metabolismo de mRNAs, sofrem diferentes regulações, mediadas por modificações pós-traducionais (fosforilação e metilação), que interferem tanto na sua localização celular quanto na sua afinidade por determinados proteínas parceiras / Abstract: The members of the hnRNPs family (heterogenous nuclear ribonuclein proteins) play important roles in gene expression control and mRNAs metabolism. The proteins hnRNPD (AUF1) and hnRNPQ (NSAP1) were the main targets of this study. AUF1 has two RNA recognition motifs (RRM) and participates in the process of destabilization of a class of mRNAs that contain AU-rich sequences in their 3' untranslated regions (3'-UTR). We found, using the ¿yeast two-hybrid system¿ (Y2HS), that the isoform p37 of AUF1 (AUF1p37) interacts with the proteins: hnRNPQ, IMP-2, NSEP1 (YB-1) and UBC9. Moreover, the protein hnRNPQ was also identified as a prey protein in another Y2HS screen, which used as bait the human protein Arginine methyltransferase (PRMT1). HnRNPQ presents, in its C-terminal region, an "Arginine/Glicine-rich sequence" (RGG box). We are able to show that this RGG box is a target for methylation by PRMT1 in vitro and is methylated in vivo. Functionally, this methylation is important for its nuclear localization. hnRNPQ has a modular organization with an acid domain (AcD) in its N-terminal, followed by three RNA-binding domains (RRM) and the previously mentioned RGG box in its C-terminal. Functionally, hnRNPQ is involved in diverse aspects of RNA metabolism, including editing of the mRNA encoding the human protein ApoB. It has been shown previously to interact with the mRNA of ApoB, and also with the editing enzyme Apobec1 and the Apobec1 activation protein (ACF1). Here we show that the acid domain of hnRNPQ mediates the interaction with Apobec1 and that its in vitro phosphorylation (by PKC) inhibits this interaction. Furthermore, we found that hnRNPQ interacts with members the heat shock family of proteins (including HSP70 and BiP), and demonstrated that hnRNPQ can be in vitro phosphorylated by PKCd. Finally, we discovered that the sub-cellular localization of hnRNPQ undergoes modification after activation of PKC pathways. This also occurs after application of endoplasmic reticulum stress (using tarpsigargin), oxidative or heat stress. Under all of these conditions hnRNPQ translocated from the nucleus to the cytoplasm, where it is found at defined vesicles or granules. In summary, our data suggest that the diverse functions of hnRNPQ in the context of mRNA metabolism, may suffer specific regulations, by post-translational modifications, including phosphorylation and methylation, which modify both the proteins sub-cellular localizations as well as its affinity to interacting protein partners / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular