No laboratório de investigação médica da disciplina de Cirurgia Torácica do Departamento de Cardio-pneumologia da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo vem sendo desenvolvida uma linha de pesquisa experimental sobre transplante pulmonar, visando elucidar os efeitos que a cirurgia sobre o brônquio e o uso de drogas imunossupressoras têm sobre o aparelho mucociliar. O presente estudo tem por objetivo avaliar os efeitos da azatioprina e da transecção brônquica sobre o aparelho mucociliar em ratos. Utilizamos 36 ratos machos da raça Wistar, não isogênicos, pesando de 200 a 250g, obtidos no biotério da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo. Todos os animais foram submetidos à anestesia geral, intubação orotraqueal e ventilação mecânica. Em seguida foi realizada uma toracotomia esquerda com transecção e reanastomose do brônquio principal esquerdo. Por fim síntese do tórax e drenagem fechada, que era retirada quando o animal acordava. Os animais foram divididos em dois grupos: com administração de azatioprina e com administração de solução de salina. Eles foram sacrificados aos 7, 15 e 30 dias para retirada dos pulmões e árvore brônquica. O muco foi coletado do brônquio direito e esquerdo. Foi realizada a medida da velocidade do transporte mucociliar à direita e esquerda dos dois grupos e posterior análise das propriedades dos mucos através da medida da velocidade de transporte relativa no palato de rã e da medida do ângulo de contato. As medidas das variáveis dos brônquios direito e esquerdo com e sem azatioprina nos três tempos de avaliação foram submetidas ao teste de Análise de Variância de Duplo Fator. Nos resultados a velocidade do transporte à esquerda foi significativamente reduzida pela transecção brônquica quando comparada entre os grupos: mostrando-se pior aos 30 dias. A velocidade relativa e o ângulo de contato dos mucos coletados à esquerda mostraram com significado estatístico uma piora nas propriedades do muco pela transecção, pricipalmente aos 30 dias. Com a azatioprina e a transecção observamos piora na velocidade do transporte mucociliar significativa ao longo do tempo, maior aos sete dias e com uma progressiva melhora até os 30 dias. O estudo mostrou que a azatioprina não acarretou piora quando associada à transecção. Na presença de azatioprina houve melhora das propriedades do muco, tendo a velocidade do transporte relativo e o ângulo de contato melhora significativa ao longo do tempo. A azatioprina previne uma piora da qualidade do muco. Concluímos que a transecção brônquica piora o transporte mucociliar; a azatioprina preserva as propriedades do muco; a azatioprina piora o transporte até os sete dias; a azatioprina não interage com a transecção para a redução da velocidade do transporte mucociliar e para a piora do muco / At the Experimental Thoracic Surgery Laboratory, Department of Cardio-Pneumology , Department of Pathology, Experimental Air Pollution Laboratory, in the Medical School, São Paulo University, research in lung transplantation, administration of imunossupression drugs and their effects on the mucociliary system are carried out. We develop models of bronchial transeccion and reanastomosis, unilateral lung transplantation, mucociliary transport velocity and mucus transportability in rats, which allow us to observe the resulting alterations. The mechanisms involved in the impairment of the mucociliary function after lung transplantation and immunosuppression therapy are not yet completely understood. The purpose of the present study was to evaluate the effects of azathioprine on the mucociliary system in a model of bronchial transeccion and reanastomosis in rats. We used 36 rats, submitted to general anesthesia, tracheal tube, mechanical ventilation and left thoracotomy, followed by a left main stem bronchus transeccion and reanastomosis. The animals were separated into 2 groups that received or not azathioprine (AZA), and being sacrificed at 7, 15 and 30 days after the surgical procedure. In situ bronchial mucociliary transport (MCT) was determined distal to the anastomosis of the left main stem transected bronchus (LTB) and in the right intact bronchus (RIB). We also studied the surface properties of mucus by using in vitro mucus transportability with a frog palate preparation and mucus contact angle (mucus adhesively) collecting mucus from LTB and RIB. The measures obtained were submitted to statistical analysis. The results showed that the MCT velocity (mm/min) was significantly lower (p<0.01) in the LTB without the AZA administration compared with the RIB with or without AZA. At the LTB with AZA administration there was significant difference (p<0.05) at 7 days compared with the RIB with and without AZA and no significant difference at 15 and 30 days (p>0.05). Mucus in vitro transportability and adhesiveness showed the worst result at the LTB without AZA (p<0.05). In the group that received AZA on 30 days of LTB there was no significantly difference in mucus properties (p>0.05) compared with the RIB groups (with and without AZA). We concluded that AZA led to a temporary marked impairment of MCT, while this occurrence was maintained up to 30 days in the transected bronchus. In addition, AZA contributes to preventing alterations in the mucus surface properties

Os estudos epidemiológicos relativos ao denominado câncer ocupacional têm como objetivo o estudo do câncer em populações trabalhadoras e a identificação de fatores causais. O número de agentes que comprovadamente causam câncer em seres humanos é ainda pequeno, cerca de trinta. A estes fatores podem ser agregados algumas atividades ocupacionais e processos industriais onde agentes potencialmente cancerígenos existem mas não foram ainda identificados. A quase totalidade dos estudos epidemiológicos buscando relacionar ocupação e câncer foram realizados nos países desenvolvidos, com processos de industrialização mais antigos e consolidados. Nesta investigação o objetivo é estudar a relação trabalho e câncer no contexto de um país subdesenvolvido e recentemente industrializado. O estudo explora os riscos ocupacionais determinantes da neoplasia pulmonar na Região Metropolitana de São Paulo (RMSP). O trabalho está dividido em duas partes. Na primeira são discutidos aspectos relativos ao câncer com particular destaque ao carcinoma broncogênico e à aplicação da metodologia epidemiológica na área da saúde do trabalhador, em especial para o estudo do câncer relacionado à ocupação. A segunda parte contempla a descrição do estudo de caso-controle construído para atingir os objetivos definidos. Os dados do estudo foram levantados no período de 1º de julho de 1990 a 31 de janeiro de 1991 em quatorze hospitais que concentram o atendimento a pacientes com câncer de pulmão na RMSP. Um total de 316 casos e 536 controles, emparelhados com os casos por sexo e idade, foram selecionados para análise. Tabagismo, tabagismo passivo, história migratória, outros cânceres na família e estrato sócio-econômico, além de sexo e idade, foram as outras variáveis estudadas. A análise univariada permitiu identificar as variáveis que estavam interferindo na relação principal estudada. Posteriormente, utilizou-se as técnicas de análise estratificada e de regressão logística para controlar as variáveis tabagismo, referência à carcinoma de pulmão na família, sexo e idade. Os resultados revelam que os trabalhadores que estiveram ligados por tempo prolongado aos setores de produção, de ramos de atividades industriais nos quais há maior probabilidade de exposição à substâncias cancerígenas, têm cerca de duas vezes o risco de desenvolverem carcinoma broncogênico em relação aos trabalhadores com menor probabilidade de exposição a substâncias cancerígenas como os que referiram nunca terem trabalhado fora de casa. / Epidemiological studies on occupational cancer have as their objective the study of cancer in working populations and the distribution of causal factors. The number of agents proved to cause cancer in humans is still rather small, about thirty. It could be added some occupational activities and industrial processes where hazardous agents are known to exist, but have not been identified. Almost all epidemiological studies to evaluate the relationship between occupation and cancer were carried out in developed countries, where industrialization process is older and more structured. In this investigation the objective is to study the association between occupation and cancer in a developing and newly industrialized country context. In this sense, the study explores occupational risks for lung cancer in the Metropolitan Region of São Paulo (MRSP). This work is split in two parts. Firstly it was introduced a review of some aspects on cancer, particularly lung cancer, and the use of epidemiologic methodology related to worker\'s health, particularly cancer. In the second part it was described the hospital-based case-control study carried out to reach defined objectives. This research was conducted between 1st July 1990 and 31st January 1991 in fourteen hospitais which concentrate lung cancer cases in the MRSP. It has been selected a total of 316 cases and 536 controls, matched by hospital, sex and age with cases. Smoking, passive smoking, migratory history, cancer in the family and socio-economic status, besides sex and age, were other variables studied. Univariate analysis identified variables that could interfere in the main studied associatian. Through stratification and logistic regression approaches the variables gender and age, smoking and reference to lung neoplasy in family, were controlled. The results showed that workers linked to the production sectors of industries where there are higher risk of exposure to carcinogenic products have about two fold the risk of developing lung cancer rather than those workers with the lowest risk of exposure to carcinogens.

Submitted by Lucas Martins Ikeziri (lucas.ikeziri@unesp.br) on 2018-08-13T13:57:43Z No. of bitstreams: 1 Dissertação - Lucas Martins Ikeziri.pdf: 3834872 bytes, checksum: dcbff094cc5b0ef08e5910d9efbb4364 (MD5) / Approved for entry into archive by Minervina Teixeira Lopes null (vina_lopes@bauru.unesp.br) on 2018-08-13T18:33:33Z (GMT) No. of bitstreams: 1 ikeziri_lm_me_bauru.pdf: 3267956 bytes, checksum: 0073dc72ff68b084049d7c710e797002 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-08-13T18:33:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ikeziri_lm_me_bauru.pdf: 3267956 bytes, checksum: 0073dc72ff68b084049d7c710e797002 (MD5) Previous issue date: 2018-06-28 / O gerenciamento de estoques em cadeias de suprimentos vem enfrentando diversos problemas, como baixa rotatividade, altos investimentos em estoque, vendas perdidas por rupturas e alto índice de obsolescência dos produtos estocados. Assim, esta pesquisa tem o objetivo de avaliar a efetividade da técnica Gerenciamento Dinâmico do Pulmão (Dynamic Buffer Management - DBM) como forma de preservar a disponibilidade de produtos destinados à entrega imediata em ambientes que adotem a solução de distribuição e reposição puxada da Teoria das Restrições. Para tanto, foram realizadas simulações no software ProModel utilizando dados estocásticos para o tempo de reposição e cenários com diferentes combinações de demanda. Esta, por sua vez, pode se comportar de duas formas: i) média sem tendência com dois níveis de coeficiente de variação e ii) média com tendência sazonal com dois níveis de intensidade. Dois algoritmos do DBM foram modelados segundo seus princípios constatados na literatura e combinados com parâmetros para ajuste dinâmico do estoque alvo. Os modelos foram avaliados por meio dos seguintes indicadores: fill rate, estoque médio no sistema e rotatividade por atendimento imediato da demanda. Os resultados indicam que para a demanda média sem tendência, desativar o DBM e manter um nível sensato de estoque alvo no sistema inibe ajustes indevidos e garante um bom desempenho do modelo. Contudo, para a demanda média com tendência sazonal, o DBM é altamente recomendado para assegurar a performance do sistema e ajustar os níveis de estoque conforme o padrão da demanda se altera. / Inventory management in supply chains has faced several problems, such as low turnover, high inventory investments, lost sales due to disruptions, and high obsolescence of stored products. Thus, this research aims to evaluate the effectiveness of the Dynamic Buffer Management (DBM) technique as a way of preserving the availability of products destined for immediate delivery in environments that adopt the distribution solution and pull replenishment of the Theory of Constraints (TOC). For that, simulations were performed in the ProModel software using stochastic data for the replenishment time and scenarios with different combinations of demand. This, in turn, can behave in two ways: i) average without trend with two levels of coefficient of variation and ii) average with seasonal trend with two levels of intensity. Two DBM algorithms were modeled according to their principles found in the literature and combined with parameters for dynamic adjustment of the target level. The models were evaluated through the following indicators: fill rate, average inventory in the system and turnover for immediate demand response. The results indicate that for the average demand without trend, disabling DBM and maintaining a sensible level of target level in the system inhibits undue adjustments and ensures good model performance. However, for average demand with seasonal trend, DBM is highly recommended to ensure system performance and adjust inventory levels as the demand pattern changes.

Os estudos epidemiológicos relativos ao denominado câncer ocupacional têm como objetivo o estudo do câncer em populações trabalhadoras e a identificação de fatores causais. O número de agentes que comprovadamente causam câncer em seres humanos é ainda pequeno, cerca de trinta. A estes fatores podem ser agregados algumas atividades ocupacionais e processos industriais onde agentes potencialmente cancerígenos existem mas não foram ainda identificados. A quase totalidade dos estudos epidemiológicos buscando relacionar ocupação e câncer foram realizados nos países desenvolvidos, com processos de industrialização mais antigos e consolidados. Nesta investigação o objetivo é estudar a relação trabalho e câncer no contexto de um país subdesenvolvido e recentemente industrializado. O estudo explora os riscos ocupacionais determinantes da neoplasia pulmonar na Região Metropolitana de São Paulo (RMSP). O trabalho está dividido em duas partes. Na primeira são discutidos aspectos relativos ao câncer com particular destaque ao carcinoma broncogênico e à aplicação da metodologia epidemiológica na área da saúde do trabalhador, em especial para o estudo do câncer relacionado à ocupação. A segunda parte contempla a descrição do estudo de caso-controle construído para atingir os objetivos definidos. Os dados do estudo foram levantados no período de 1º de julho de 1990 a 31 de janeiro de 1991 em quatorze hospitais que concentram o atendimento a pacientes com câncer de pulmão na RMSP. Um total de 316 casos e 536 controles, emparelhados com os casos por sexo e idade, foram selecionados para análise. Tabagismo, tabagismo passivo, história migratória, outros cânceres na família e estrato sócio-econômico, além de sexo e idade, foram as outras variáveis estudadas. A análise univariada permitiu identificar as variáveis que estavam interferindo na relação principal estudada. Posteriormente, utilizou-se as técnicas de análise estratificada e de regressão logística para controlar as variáveis tabagismo, referência à carcinoma de pulmão na família, sexo e idade. Os resultados revelam que os trabalhadores que estiveram ligados por tempo prolongado aos setores de produção, de ramos de atividades industriais nos quais há maior probabilidade de exposição à substâncias cancerígenas, têm cerca de duas vezes o risco de desenvolverem carcinoma broncogênico em relação aos trabalhadores com menor probabilidade de exposição a substâncias cancerígenas como os que referiram nunca terem trabalhado fora de casa. / Epidemiological studies on occupational cancer have as their objective the study of cancer in working populations and the distribution of causal factors. The number of agents proved to cause cancer in humans is still rather small, about thirty. It could be added some occupational activities and industrial processes where hazardous agents are known to exist, but have not been identified. Almost all epidemiological studies to evaluate the relationship between occupation and cancer were carried out in developed countries, where industrialization process is older and more structured. In this investigation the objective is to study the association between occupation and cancer in a developing and newly industrialized country context. In this sense, the study explores occupational risks for lung cancer in the Metropolitan Region of São Paulo (MRSP). This work is split in two parts. Firstly it was introduced a review of some aspects on cancer, particularly lung cancer, and the use of epidemiologic methodology related to worker\'s health, particularly cancer. In the second part it was described the hospital-based case-control study carried out to reach defined objectives. This research was conducted between 1st July 1990 and 31st January 1991 in fourteen hospitais which concentrate lung cancer cases in the MRSP. It has been selected a total of 316 cases and 536 controls, matched by hospital, sex and age with cases. Smoking, passive smoking, migratory history, cancer in the family and socio-economic status, besides sex and age, were other variables studied. Univariate analysis identified variables that could interfere in the main studied associatian. Through stratification and logistic regression approaches the variables gender and age, smoking and reference to lung neoplasy in family, were controlled. The results showed that workers linked to the production sectors of industries where there are higher risk of exposure to carcinogenic products have about two fold the risk of developing lung cancer rather than those workers with the lowest risk of exposure to carcinogens.

O câncer de pulmão é o tipo de câncer que apresenta o maior índice de mortalidade em todo o mundo. As alterações genéticas mais frequentes em câncer de pulmão são as mutações pontuais no oncogene que codifica a GTPase KRAS. Apesar destas mutações estarem diretamente ligadas à oncogênese, terapias que visam inibir diretamente a proteína Ras falharam em ensaios clínicos. Uma das propriedades mais importantes na oncogênese é a aquisição de capacidade metastática tumoral. Desta forma, o objetivo deste projeto é identificar alvos terapêuticos que inibam as metástases tumorais induzidas pelo oncogene KRAS no pulmão. Com base em relatos recentes mostrando que a forma oncogênica de KRAS promove, não só a iniciação tumoral, mas também promove a aquisição de um fenótipo metastático, a hipótese deste projeto é que (1) a capacidade mestastática tumoral induzida por KRAS no pulmão é potencializada pela quinase IKK&#946;; e (2) que a inibição desta quinase reduzirá a capacidade invasiva celular e metastática tumoral. Esta hipótese foi formulada com base em estudos anteriores, os quais demonstraram que o principal substrato da IKK&#946;, o fator de transcrição NF-&#954;B, é ativado por KRAS em tumores pulmonares in situ de forma dependente da IKK&#946;, que o NF-&#954;B é capaz de promover metástase em diferentes modelos tumorais, e que a inibição da atividade da IKK&#946; com um inibidor farmacológico em um modelo animal de câncer de pulmão induzido por KRAS, diminui o crescimento tumoral e a progressão tumoral para graus histológicos mais avançados. Nosso objetivo era avaliar se a inibição de IKK&#946; é capaz de afetar a migração e invasão de células portadoras de mutação em KRAS in vitro e se a inibição de IKK&#946; é capaz de afetar a capacidade metatática dessas células in vivo. Primeiramente, avaliamos a expressão de enzimas relacionadas ao fenótipo metastático, as metaloproteinases de matriz 2 e 9 (MMP-2 e MMP-9) e, também uma molécula intimamente relacionada ao processo de adesão mediado por integrinas, FAK (quinase de adesão focal), frente a inibição de IKK&#946; através de um inibidor farmacológico altamente especifico (Composto A) e frente a inibição genética de IKK&#946; por interferência de RNA (siRNA) em células A549 e H358. Avaliamos também a atividade das MMPs frente inibição genética de KRAS (siKRAS) e IKK&#946; (siIKK&#946;) e vimos que IKK&#946; parece modular a expressão ou atividade de MMP-9 e reduz a expressão de FAK. Já a expressão de MMP-2 não apresentou alteração. Posteriormente avaliamos migração na célula A549 e invasão nas células A549 e H358 com inibição de IKK&#946;, por ensaios Transwell, e observamos uma redução da migração e invasão celular in vitro. Em seguida, fomos gerar linhagens celulares paraa expressar luciferase, as linhagens A549 pLUC e H358 pLUC. Os clones A549 pLUC B4 e H358 pLUC F1 com inibição de KRAS e IKK&#946; por interferência de RNA, foram injetados pela veia da cauda nesses camundongos e as metástases foram monitoradas por imageamento in vivo. Houve metástases em 20% dos animais com siIKK&#946; na região anatômica da boca. Os animais que receberam siControle e siKRAS não apresentaram nenhuma metástase visível no equipamento, mas foi observado micrometástases nas análises histológicas dos pulmões. O resultado do experimento de metástase in vivo é inesperado, não só pelo fato de ocorrer no grupo experimental siIKK&#946;, mas também pelo local anatômico do tumor, sendo necessária uma maior investigação do papel de IKK&#946; nesse processo, podendo ser um resultado aleatório. Quando avaliamos em conjunto, nossos resultados sugerem que a quinase IKK&#946; desempenha um papel importante no fenótipo migratório e invasivo de células pulmonares portadoras de KRAS oncogênica, contribuindo para a capacidade metastática. / Lung cancer is the leading cause of cancer deaths worldwide. The most frequent genetic changes found in lung cancer are driver mutations in the KRAS proto-oncogene. Even though KRAS mutations have been causally linked to the oncogenic process, therapies targeted to oncogenic RAS have failed in clinical trials. One of the main characteristics in oncogenesis is the ability of tumors to acquire metastatic capability. The objective of this project is to identify therapeutic targets that reduce KRASinduced lung cancer metastasis. Based on previous reports that oncogenic KRAS, drives not only tumor initiation, but also promotes a metastatic phenotype, the hypothesis of this project is that (1) the acquisition of metastatic ability induced by KRAS in the lung is potentiated by the IKK kinase; and (2) that IKK&#946; inhibition will reduce KRAS-induced cell invasive properties and KRAS-induced tumor metastasis. This hypothesis has been formulated on the basis of previous studies showing that the main IKK&#946; substrate, the transcription factor NF-&#954;B, is activated by KRAS in lung tumors in situ in an IKK&#946;-dependent manner, that NF-&#954;B is known to promote metastasis in different tumor models, and that pharmacological IKK&#946; inhibition in a KRAS-induced lung cancer mouse model reduces tumor growth and progression to higher histological tumor grades. Our goal was evaluate how inhibition of IKK&#946; affects migration and invasion of KRAS-positive lung cells in vitro and whether inhibition of IKK&#946; is capable of affecting the metatactic capacity of these cells in vivo. First, we evaluated the expression of enzymes involved in the metastatic phenotype, matrix metalloproteinases 2 and 9 (MMP-2 and MMP-9) and also a molecule involved in the integrinmediated adhesion, FAK (focal adhesion kinase), we targeted IKK&#946; by a highly specific IKK inhibitor (Compound A) or with RNA interference in A549 and H358 cells. We also used colorimetric Matrix Biotrak Activity Assay System to measure the activity of MMPs with RNA interference for KRAS (siKRAS) and IKK&#946; (IKK&#946;) and we have seen that IKK&#946; appears to modulate the expression or activity of MMP-9 and decreases the expression of FAK. The expression of MMP-2 did not change. Then we evaluated migration in A549 cell and invasion in A549 and H358 cells with inhibition of IKK by RNA interference or with Compound A treatment in Transwell assays, and observed a significantly reduced cell migration and invasion in vitro. We then generated cell lines to express luciferase, the A549 pLUC and H358 pLUC lines. A549 pLUC B4 and H358 pLUC F1 cells with RNA interference for KRAS and IKK&#946; were injected in the tail vein in nude (balb/c) mice and metastases were monitored by in vivo imaging. There were metastases in 20% of IKK&#946; animals in the anatomical region of the mouth. Animals that received siControl and siKRAS had no visible metastasis in the live imaging, but micrometastases were observed in the histological analyzes of the lungs. The result of this experiment is unexpected, not only due to the fact that it occurs in the IKK&#946; experimental group, but also due to the anatomical site of the tumor, and a further investigation of the role of IKK&#946; in this process, can be a random result. When evaluated together, our results suggest that the IKK&#946; kinase plays an important role in the migratory and invasive phenotype of in KRAS positive lung cancer cells, contributing to metastatic capacity.

O câncer de pulmão é a principal causa de morte relacionada ao câncer no mundo. Mutações em KRAS são altamente prevalentes no câncer e têm sido diretamente associadas ao processo tumorigênico. Apesar disso, até hoje todas as terapias visando inibir KRAS diretamente falharam e a caracterização de alvos indiretos, importantes para a oncogênese mediada por KRAS, é fundamental para o desenvolvimento de novas terapias contra o câncer de pulmão. Nós mostramos previamente que as quinases Aurora A (AURKA) e B (AURKB) são alvos a jusante de KRAS, importantes para o crescimento, viabilidade e oncogenicidade de linhagens celulares derivadas de tumores pulmonares mediados por KRAS. Aqui, nós aprofundamos os nossos estudos para melhor caracterizar AURKA e AURKB como potenciais alvos terapêuticos no câncer de pulmão. Os objetivos deste trabalho foram (1) investigar o mecanismo de perda de viabilidade induzido pela inibição de AURKA e/ou AURKB; (2) avaliar como a inibição de AURKA e/ou AURKB afeta propriedades oncogênicas relacionadas à agressividade tumoral; e (3) como a inibição destas quinases afeta o crescimento tumoral in vivo. Para tanto, nós utilizamos dois modelos celulares: (1) células A549 e H358, que apresentam mutações em KRAS, geneticamente modificadas para a expressão estável e induzível de shRNAs contra AURKA ou AURKB, e (2) células tumorais H1703, que não apresentam mutações em KRAS, geneticamente modificadas para a expressão induzível de KRASG12V, tratadas ou não com inibidores farmacológicos das quinases Aurora. A inibição farmacológica ou por interferência de RNA de AURKA e/ou AURKB em células H358 e A549 reduziu a proliferação celular, sendo esta inibição acompanhada de anomalias mitóticas, além de aneuploidia e poliploidia. A inibição destas quinases também induziu morte celular in vitro, tanto em mitose, quanto em interfase. Mais interessantemente, a inibição farmacológica dual de AURKA e AURKB induziu morte celular in vitro em células H1703, somente na presença de KRASG12V, indicando que a inibição das quinases Aurora afeta preferencialmente células portadoras de mutações em KRAS. Além disso, a inibição de AURKA e/ou AURKB reduziu propriedades malignas celulares relacionadas à agressividade tumoral, como migração, invasão e adesão. Finalmente, a inibição de AURKA por RNA de interferência em células A549 também reduziu a formação de tumores in vivo. Entretanto, como a inibição destas quinases levou a anomalias mitóticas e à instabilidade genética, nós resolvemos investigar se a inibição de TPX2, um substrato e ativador de AURKA, poderia ser uma abordagem alternativa para inibir esta via em câncer de pulmão induzido por KRAS. Primeiramente, nós observamos nos nossos modelos celulares que KRAS regula positivamente a expressão de TPX2. Além disso, a inibição de TPX2 em células pulmonares portadoras de KRAS oncogênica reduziu a viabilidade e proliferação celulares e induziu morte celular. Mais interessantemente, esses efeitos ocorreram preferencialmente em células que expressam KRAS oncogênica. Em conclusão, nossos resultados apoiam a hipótese de que a ativação de AURKA/TPX2 e AURKB por KRAS são eventos importantes no câncer de pulmão e sugerem a inibição destas vias, possivelmente em combinação com outras terapias citotóxicas, como uma nova abordagem terapêutica para o câncer de pulmão induzido por KRAS. / Lung cancer is the leading cause of cancer-related deaths worldwide. KRAS mutations are widespread in lung cancer and have been causally linked to tumorigenesis. Nonetheless, therapies targeting KRAS directly have so far failed and characterization of indirect KRAS targets, which play important roles in KRAS-mediated oncogenesis, is crucial for the development of new therapies for lung cancer. We have previously shown that mitotic kinases Aurora A (AURKA) and B (AURKB) are downstream targets of oncogenic KRAS, important for the growth, viability, and oncogenicity of KRAS-transformed lung cancer cell lines. Here, we studied these kinases more in depth in order to better characterize them as potential therapeutical targets for KRAS-induced lung cancer. The aims of this study were (1) to investigate the mechanism leading to loss of viability upon AURKA and/or AURKB targeting; (2) to evaluate how AURKA and/or AURKB inhibition affects malignant properties associated with tumor aggressiveness; and (3) to determine whether AURKA and/or AURKB inhibition reduces KRAS-induced tumor growth in vivo. For that purpose, we used two cell-based models: (1) KRAS mutant A549 and H358 cells with stable and inducible shRNA-mediated knockdown of AURKA or AURKB, and (2) KRAS wildtype H1703 tumor cell lines, genetically engineered to inducibly express oncogenic KRASG12V treated or not with Aurora kinase pharmacological inhibitors. Targeting AURKA and/or AURKB pharmacologically or by RNA interference in H358 and A549 cells led to decreased cell proliferation, which was accompanied by mitotic abnormalities, leading to aneuploidy and hyperploidy. Aurora kinase targeting also induced cell death in vitro, both during mitosis and interphase. More importantly, AURKA and AURKB inhibition with a dual pharmacological inhibitor in H1703 cells induced cell death in vitro, but only in the presence of KRASG12V, indicating that Aurora kinase targeting affects preferentially lung cells harboring oncogenic KRAS. Furthermore, AURKA and/or AURKB targeting reduced malignant properties associated with tumor aggressiveness, such as cell migration, invasion and adhesion. Finally, AURKA targeting by RNA interference in A549 cells also reduced growth of xenograft tumors in vivo. Nonetheless, since Aurora targeting was associated with mitotic abnormalities and genetic instability, we decided to investigate if targeting TPX2, a substrate and an activator of AURKA, could constitute an alternative approach to targeting this pathway in KRAS-induced lung cancer. First, using our cell-based models, we determined that KRAS positively regulates TPX2 expression. In addition, TPX2 inhibition by RNA interference in KRAS-positive lung cells reduced cell viability and proliferation and induced cell death. Finally, these effects occurred preferentially in cells harboring oncogenic KRAS. In conclusion, our results support the hypothesis that activation of AURKA/TPX2 and AURKB by KRAS are important events in lung cancer and suggest inhibition of these pathways, possibly in combination with other cytotoxic therapies, as a new approach for KRAS-induced lung cancer therapy.

O câncer de pulmão está entre os tipos de câncer com maiores índices de mortalidade no mundo. Na década de 90, houve a descoberta de populações de células tumorais com características de células-tronco e implicou na hipótese das células-tronco cancerosas (CTCs). Se a hipótese das CTCs for correta, a recorrência/recidiva dos cânceres é gerada por uma porcentagem de células (CTCs) que prolifera pouco e é resistente a quimioterapia convencional. Desta forma, a busca por novos alvos terapêuticos que tenham como alvo estas CTCs tem enorme implicação no desenvolvimento de novos fármacos ou modalidades terapêuticas contra o câncer. O guaraná (Paullinia cupana Mart var. sorbilis) tem demonstrado efeitos promissores sobre o câncer, em especial efeitos quimiopreventivos e antineoplásicos. Portanto, objetivando-se neste projeto avaliar a presença de CTCs a partir de células tumorais de pulmão de camundongo, onde se possa conseguir rapidamente uma alta porcentagem deste tipo celular para posteriores estudos, além de avaliar os efeitos do extrato etanólico do guaraná e de suas frações butanólica e aquosa, sobre as células tumorais e em especial verificar os efeitos sobre a população rica em CTCs, onde foi possível observar a presença de possíveis CTCs, a partir de cultivo de células tumorais de pulmão de camundongo, como também que o guaraná apresentou um efeito sobre estas possíveis CTCs devido a diminuição da expressão dos genes ABCG2 e ALDH1a1. / Lung cancer is among the cancers with the highest mortality rates in the world. In the 90\'s, there was the discovery of tumor cell populations with stem cell characteristics implied in the case of cancer stem cells (CSCs). If the hypothesis is correct CSCs of the recurrence / relapse of cancers is generated by a percentage of cells (CSCs) that growth low and are more resistant to conventional chemotherapy. Thus, the search for new therapeutic targets that target these CSCs has huge implications in developing new drugs or therapeutic approaches against cancer. Guarana (Paullinia cupana Mart var. Sorbilis) has shown promising effects on cancer, especially chemopreventive and anticancer effects. Therefore, the objective in this project is to evaluate the presence of CSCs from tumor cells of mouse lung, where it can quickly get a high percentage of this cell type for further studies and to evaluate the effects of ethanol extract of guarana and its butanol and aqueous fractions on tumor cells and in particular to verify the effect on the population rich in CSCs, where it was possible to observe the possible presence of CSCs from cultivation of tumor cells from mouse lung, as well as guarana presented an effect on these CSCs possible to decreased expression of ABCG2 and ALDH1a1 genes.

Estudos epidemiológicos estabelecem uma associação evidente entre poluição do ar e o aumento de morbimortalidade cardiovascular e respiratória. No entanto, os mecanismos moleculares subjacentes aos efeitos do material particulado fino (MP2,5) sobre o organismo ainda estão pouco esclarecidos. O objetivo deste trabalho foi caracterizar o impacto da exposição ao MP2,5 sobre a biologia do endotélio pulmonar e do coração, através da avaliação do perfil de expressão gênica por microarray. Camundongos adultos fêmeas foram anestesiados e submetidos à instilação intratraqueal de MP2,5 (grupo exposto) ou veículo (grupo controle). Os animais foram sacrificados 12 a 18 horas após a instilação e pulmão, coração e sangue da veia cava inferior foram coletados. Os pulmões foram dissociados com colagenase tipo I e células endoteliais foram positivamente selecionadas por captura imuno-magnética através de micro-ímãs acoplados a anti-CD31. O cRNA derivado de endotélio pulmonar e de coração total foi hibridizado em membrana de microarray de baixa densidade desenhada para representar genes relevantes à biologia endotelial. Os genes encontrados diferencialmente expressos no pulmão foram Itgb1, Cxcl1, Tnf, Ecgf1 e Tnfaip3 (hiper-expressos em expostos a MP2,5) e Enpep, Pdgfra, Gzmb, Birc2, Npr1, Angpt1, Cxcl5 e Il7 (hipo-expressos). Não foi possível realizar análise de inferência estatística de membranas do coração neste trabalho. Não houve diferença estatisticamente significativa entre os grupos exposto e controle na contagem sangüínea de neutrófilos, linfócitos ou plaquetas, apesar dos dois grupos apresentarem plaquetose. Os achados indicam que MP2,5 altera a transcrição de genes envolvidos não só na inflamação e estresse oxidativo, mas também no tônus e remodelamento vascular, que podem ser os responsáveis pelos efeitos cardiovasculares agudos do MP2,5 / Epidemiological studies establish a clear association between air pollution and increased cardiovascular and respiratory morbidity and mortality. However, the molecular mechanisms underlying the effect of fine particulate matter (PM2,5) are still poorly understood. The aim of this study was to characterize the impact of exposure to PM2,5 on the biology of pulmonary endothelium and the heart, through the assessment of gene expression profiling by microarray. Adult female mice were anesthetized and submitted to intratracheal instillation of either PM2,5 (challenged group) or vehicle (control group). The animals were sacrificed 12 to 18 hours after instillation and lung, heart and blood samples from the inferior vena cava were collected. The lungs were dissociated with collagenase type I and endothelial cells were positively selected by immuno-magnetic capture through microbeads coupled to anti-CD31. The cRNA derived from the pulmonary endothelial cells and heart were hybridized to low-density microarray designed specifically to represent genes relevant to endothelial biology. Genes found differentially expressed in the lung were Itgb1, Cxcl1, Tnf, Ecgf1, and Tnfaip3 (over-expressed in challenged group) and Enpep, Pdgfra, Gzmb, Birc2, Npr1, Angpt1, Cxcl5 and IL7 (under-expressed). It was not possible to perform statistical inference of heart samples in this study. There was no statistically significant difference between challenged and control groups in blood counts of neutrophils, lymphocytes or platelets, despite both groups presented increased number of platelets. The findings indicate that PM2,5 alters transcription of genes involved not only in inflammation and oxidative stress, but also in vascular tonus and remodeling, which may be responsible for the acute cardiovascular effects of PM2,5

Neste estudo investigamos os mecanismos reguladores associados à indução da inflamação pulmonar decorrente da /IR intestinal. A hipótese é que mediadores inflamatórios gerados no intestino, drenados pelo sistema linfático medeiam as repercussões pulmonares observadas na SDRA. Grupos de ratos foram submetidos à isquemia intestinal por meio da oclusão da artéria mesentérica superior (45 min) seguida da reperfusão intestinal por 2h. Grupos de ratos foram submetidos à obstrução do fluxo linfático (canulação do dueto torácico linfático, ou sua secção) previamente à indução da I/R intestinal. Os dados indicaram que a secção do dueto linfático torácico reduziu a atividade pulmonar de MPO (índice indireto de presença de neutrófilos), bem como a permeabilidade vascular (extravasamento do corante Azul de Evans) pulmonar e intestinal e aumento da atividade de LDH intestinal (índice de lesão tecidual). Sistemicamente, a ligação do dueto linfático antes da indução de l/R intestinal reduziu os níveis séricos de TNF-<font face=\"symbol\">a, IL- 1<font face=\"symbol\">b e elevou aqueles de IL-10, LTB4e TXB2. Ainda, observamos que a linfa coletada nesses animais é rica em TNF-<font face=\"symbol\">a, IL-1<font face=\"symbol\">b, IL-10, LTB4 e TXB2. O tratamento dos animais previamente à l/R intestinal com o inibidor de síntese de TNF-<font face=\"symbol\">a, pentoxifilina (PTX), reduziu a atividade de MPO pulmonar nos animais submetidos a l/R intestinal com o dueto linfático intaeto e a potencializou naqueles onde o dueto torácico linfático foi seccionado. A PTX reduziu o aumento de permeabilidade vascular pulmonar e intestinal em condições onde dueto linfático torácico foi mantido intacto. Por outro lado em animais l/R intestinal com o dueto linfático seccionado, a PTX não causou redução adicional da permeabilidade vascular, mas reduziu os níveis séricos de IL-1<font face=\"symbol\">b e aumentou os de LTB4, enquanto na linfa, o tratamento com PTX aumentou a concentração de IL-10 e LTB4 e reduziu a de IL-1<font face=\"symbol\">b e TXB2. A inibição não seletiva das NOS com o composto L-NAME causou aumento dos níveis séricos de TNF-<font face=\"symbol\">a, os quais foram reduzidos pela secção do dueto linfático. O bloqueio da geração do NO nos animais com dueto seccionado não alterou o perfil no soro de IL-10, mas elevou a concentração de IL-1<font face=\"symbol\">b. Ainda, na linfa dos animais tratados com L-NAME, houve aumento de IL-1<font face=\"symbol\">b, IL-10, LTB4 e TXB2 e redução de TNF-<font face=\"symbol\">a. Nossos dados ainda revelaram que o pulmão dos animais I/R intestinal gerou IL1<font face=\"symbol\">b e IL-10 quando o dueto linfático estava intacto, e que sua secção reduziu os níveis gerados dessas citocinas. A PTX reduziu a geração de IL-1<font face=\"symbol\">b e aumentou a IL-10 no pulmão.O L-NAME aumentou a IL-1<font face=\"symbol\">b e IL-10 nos animais com o dueto intacto e interrupção do fluxo linfático aumentou os níveis de IL-1<font face=\"symbol\">b. A I/R intestinal, em animais com o dueto intacto, aumentou, enquanto na vigência da obstrução do fluxo linfático, houve redução da expressão de ICAM-1, Mac-1 e E-selectina no pulmão. Finalmente, os dados apresentados neste estudo sugerem que eventos isquêmicos intestinais seguidos de sua reperfusão, induzem a geração de mediadores inflamatórios locais (intestino) os quais uma vez drenados pelo sistema linfático mesentérico são transportados pela linfa e atingem o pulmão. Nessas condições observa-se inflamação pulmonar e geração adicional de mediadores inflamatÓrios os quais são lançadas à circulação e concorrem para o desenvolvimento da inflamação sistêmica e eventualmente para a falência múltipla dos órgãos. / In this study we investigated the role of lymphatic system on the mechanisms associated to the induction of lung inflammation afier intestinal I/R in rats. The hypothesis ofthe study was that upon intestinal I/R, inflammatory mediators are generated in the intestine and once drained by mesenteric lyrnphatic system interfere with the lung homeostasis contributing to lung dysfunction observed in ARDS. To these purposes groups of rats were submitted to occlusion of superior mesenteric artery (45 min) followed by intestinal reperfusion during 2h when the rats were killed. Groups of rats were subjected to thoracic lymphatic duct ligation previously to induction of the intestinal I/R. The data showed that the thoracic duct ligation significantly reduced the increased pulmonary MPO activity and the augrnented vascular perrneability (extravasation of the Evans blue dye) in lung and intestine. In addition, thoracic duct ligation increased the intestinal activity of LDH. Systemically, the obstruction of lymph flow, leaded to reduction of TNF in serum of rats upon intestinal I/R and increased the levels of IL-1O, LTB4 and TXB2. Elevated levels of TNF-<font face=\"symbol\">a, IL-l<font face=\"symbol\">b), IL-1O, LTB4 and TXB2 were also found in lymph ofrats upon intestinal I/R. The treatment of the animals previously to the intestinal I/R induction with inhibitor of TNF-<font face=\"symbol\">a synthesis, pentoxyfilline (PTX), reduced the lung MPO activity upon lymphatic duct intact that was exacerbated by thoracic duct ligation. PTX treatment reduced the increased vascular permeability of the lung and intestine conditions in rats with lymphatic duct intact. On the other hand, when the thoracic duct was ligated, the PTX did not cause additional reduction of vascular permeability in both tissues , but reduced the serum levels of IL-1<font face=\"symbol\">b) and increased those of LTB4. Lymph of rats treated with PTX revealed an increased leveI of IL-10 and LTB4 and a reduced leveI of IL-<font face=\"symbol\">b) and TXB2. L-NAME treatment increased the serum levels of TNF-<font face=\"symbol\">a, which were reduced by the thoracic lymphatic duct ligation. The blockade of NO synthesis in rats with lymphatic duct ligation did not modify the IL-10 serum levels, but increased those of IL-1<font face=\"symbol\">b). Lymph of rats upon L-NAME treatment, an increased level of IL-1<font face=\"symbol\">b), IL-1O, LTB4 and TXB2 and a reduction of TNF-<font face=\"symbol\">a levels were detected. Pulmonary tissue of Iymphatic duct intact rats after intestinal I/R were increased the release of IL-1<font face=\"symbol\">b) and IL-10 whereas the thoracic duct ligation reduced the release of these cytokines. PTX treatment reduced the levels of IL-1<font face=\"symbol\">b) and increased the IL-10 in the lung. L-NAME treatment increased the IL-1<font face=\"symbol\">b) and IL-10 in lung of intact duct rats but the obstruction of lymph flow caused an increase release of IL-1<font face=\"symbol\">b levels. Intestinal I/R in intact duct rats, increased whereas the thoracic duct ligation reduced the pulmonary expression of ICAM-1, Mac-1 and E-selectin. In conclusion, our data suggest that intestinal I/R, induces the generation of local inflammatory mediators (intestine) which drained by the mesenteric lymphatic system are carried by the lymph and reach the lung. ln these conditions we observed pulmonary inflammation and additional generation of inflammatory mediators and eventually the development of the systemic inflammation. Our data support the view that lymphatic system play a role a path underlying the spread oflung and gut injury after intestinal I/R.

Introdução: Apesar dos importantes avanços na preservação pulmonar alcançados nas últimas décadas esta questão permanece longe do ideal e representa um dos maiores problemas enfrentados pelos grupos de transplante pulmonar. O grupo da Suécia liderado pelo Prof. Stig Steen descreveu um novo método de preservação pulmonar chamado de ECMOtópico que foi publicado nos mesmos artigos que divulgaram o sistema de perfusão ex vivo. Todavia, este novo método nunca foi avaliado de forma comparativa contra a forma atualmente mais aceita de preservação pulmonar: a isquemia fria após infusão de solução de preservação. O presente estudo compara estas duas formas de preservação utilizando um modelo de avaliação pulmonar ex vivo. Como objetivos secundários foram estudados: a capacidade de recuperação da função pulmonar pelo sistema ex vivo e a utilidade do modelo experimental bloco pulmonar dividido. Métodos: Quatorze pulmões foram captados de sete doadores em morte encefálica negados para transplante pulmonar. Após a preservação inicial com perfusão anterógrada de solução de LPD-glicose o bloco pulmonar foi dividido, sendo cada lado submetido a um médoto diferente de preservação: ECMO-tópico ou isquemia fria por oito horas. Após este período os pulmões foram re-conectados e avaliados em um sistema de reperfusão pulmonar ex vivo estudando-se parâmetros funcionais e histológicos; biópsias pulmonares foram coletadas em três tempos em cada lado. As variáveis funcionais estudadas foram: capacidade de oxigenação (CO), pressão de artéria pulmonar (PAP) e resistência vascular pulmonar (RVP). As variáveis histológicas foram: escore de lesão pulmonar (ELP), contagem de células apoptóticas (CCA) e estudo de microscopia eletrônica de transmissão. Resultados: Sete casos foram incluídos. A idade média foi de 53.86 anos (±16.7); sexo masculino em 4 casos (57.1%); causa da morte encefálica: acidente vascular encefálico hemorrágico em 5 doadores e trauma crânio encefálico em 2. O lado submetido ao ECMO-tópico: direito em 4 e esquerdo em 3 casos. A média da CO foi 468.00 mmHg (±81.69) no grupo ECMOtópico e 455.86 (±54.05) no grupo isquemia fria (p=0. 758); a mediana da PAP foi de 140 mmHg(120 160) para o ECMO-tópico e 140mmHg(140 150) para isquemia fria (p=0,285); a mediana da RVP 459 dina.s.cm-5 (432,43 492,30) no grupo ECMO-tópico e 474,5 dina.s.cm-5 (459,01 545,45) no grupo isquemia fria (p=0,285). As médias dos escores de lesão pulmonar encontrados foram: para o grupo ECMO-tópico em T1 6,285 (±4,029), em T2 8,714 (±7,714) e em T3 9,571 (±7,857); já no grupo isquemia fria as médias foram em T1 7,571 (±4,429), em T2 7,714 (±4,785) e em T3 7,857 (±6,121) p = 0,531. As médias das contagens de células apoptóticas foram: para o grupo ECMO-tópico em T1 16,71(±2,545), em T2 20,71 (±5,843) e em T3 25,00 (±9,34); no grupo isquemia fria em T1 18,57 (±5,118), em T2 17,57 (±3,014) e em T3 24,86 (±10,374) p=0,803. O estudo de microscopia eletrônica de transmissão não demonstrou diferenças entre os grupos. Conclusões: Neste estudo o ECMOtópico não demonstrou melhora na preservação pulmonar, comparado a isquemia fria, em nenhum dos parâmetros estudados . O modelo de reperfusão pulmonar ex vivo permitiu importante melhora na função pulmonar, e o modelo experimental com bloco pulmonar dividido demonstrou ser um método adequado para estudos experimentais comparativos com pulmões humanos / Background: Besides the important advances in lung preservation reached in last decades this subject continues far from ideal and still represent a major challenge for the lung transplant groups. The Swedish group lead by Prof. Stig Steen has described a new method of preservation so called topical- ECMO along with the ex vivo perfusion system. However this new method has never been tested against the most popular formula of preservation: cold ischemia after single flush perfusion. This study compares these two forms of lung preservation on an ex vivo evaluation model. As secondarys end-points we also study the ex vivo lung perfusion capacity for recover damaged lungs to transplant and the usefulness of the lung bloc split model for experimental study of human lungs. Methods: Fourteen lungs were retrieved from seven brain-dead organ donors refused for transplantation. After initial preservation with single flush of LPD glucose, the lung bloc was divided and each side was preserved by topical-ECMO or cold ischemia for 8 hours. After this the bloc was reconnected than assessed on ex vivo lung system for functional and histological parameters; lung biopsies were collect in three different times on each side. The functional variables assessed were: oxygenation capacity (OC), pulmonary artery pressure (PAP) and pulmonary vascular resistance (PVR). The histological variables were: lung injury score (LIS), apoptotic cells counting and transmission electron microscopy study. Results: Seven cases were included. Mean age 53.86 years (±16.7); male 4 (57.1%); cause of death: hemorrhagic stroke for 5 donors and head trauma for 2. Side of topical- ECMO: Right 4 e Left 3. The mean OC was 468.00 mmHg (±81.69) on topical-ECMO group and 455.86 (±54.05) on Cold Ischemia group (p=0. 758); median PAP median was 140 mmHg(120 160) for topical-ECMO and 140mmHg (140 150) for Cold Ischemia (p=0,285); median PVR 459 dina.s.cm-5 (432,43 492,30) on topical-ECMO group and 474,5 dina.s.cm-5 (459,01 545,45) on Cold Ischemia group (p=0,285). The median for LIS was: topical-ECMO group on T1 6,285 (±4,029), on T2 8,714 (±7,714) and on T3 9,571 (±7,857); Cold Ischemia group on T1 7,571 (±4,429) on T2 7,714 (±4,785) and on T3 7,857 (±6,121) p=0,531. For apoptotic cell counting: topical-ECMO group on T1 16,71(±2,545), on T2 20,71 (±5,843) and on T3 25,00 (±9,34); for Cold Ischemia group it was on T1 18,57 (±5,118), on T2 17,57 (±3,014) and on T3 24,86 (±10,374) p=0,803. The transmission electron microscopy study shows no difference between groups. Conclusions: In our study the topical-ECMO failed to show improvement of lung preservation compared with the cold ischemia in all studied parameters. However the ex vivo lung perfusion model was responsible for a important increase on lung function, and the lung bloc split model appears as a reliable method for experimental human lung studies