Αξιοσημείωτη πρόοδος έχει σημειωθεί τα τελευταία χρόνια στην αποσαφήνιση των μορίων που πρωταγωνιστούν στην αγγειογένεση, με τον αγγειακό ενδοθηλιακό αυξητικό παράγοντα (VEGF) να παίζει πρωταγωνιστικό ρόλο. Ο VEGF προκαλεί αρκετές αγγειογενετικές λειτουργίες στα ενδοθηλιακά κύτταρα διαμέσου των υποδοχέων του VEGFR-1 και VEGFR-2 ή KDR. Η προκαλούμενη από τον VEGF μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων φαίνεται ότι μεσολαβείται από τον KDR, πιθανά μέσω δέσμευσης του με την ιντεγκρίνη αvβ3. Η πλειοτροπίνη (PTN) είναι ένας εκκρινόμενος αυξητικός παράγοντας με συγγένεια δέσμευσης ηπαρίνης και διαμέσου του υποδοχέα της με δράση φωσφατάσης τυροσίνης β/ζ (RPTPβ/ζ) και την ανβ3 ιντεγκρίνη προάγει τη μετανάστευση στα ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα. Πρόσφατα δείξαμε ότι εξωγενώς χορηγούμενη PTN αναστέλλει την προκαλούμενη από τον VEGF μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων. Στην παρούσα εργασία μελετήσαμε την επίδραση της ενδογενούς PTN και του υποδοχέα της RPTPβ/ζ στη προκαλούμενη από τον VEGF μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων. Βρήκαμε ότι η ενδογενής PTN δε συμμετέχει στη μετανάστευση που προκαλεί ο VEGF. Αντίθετα, μείωση της έκφρασης του ενδογενούς RPTPβ/ζ με siRNA είχε ως αποτέλεσμα πλήρη αναστολή της επαγόμενης από VEGF κυτταρικής μετανάστευσης. Η αποσιώπηση του γονιδίου του RPTPβ/ζ δεν επηρέασε την προκαλούμενη από τον VEGF ενεργοποίηση των ERK1/2, αλλά μείωσε την επαγόμενη από VEGF αλληλεπίδραση ανάμεσα στον VEGFR-2 και την ιντεγκρίνη ανβ3, αλληλεπίδραση σημαντική για την προκαλούμενη από τον VEGF κυτταρική μετανάστευση. Τέλος, βρέθηκε ότι ο VEGF αλληλεπιδρά άμεσα με τον RPTPβ/ζ, αφού τα δύο μόρια συγκατακρημνίζονται σε εκχυλίσματα κυττάρων που εκφράζουν τόσο VEGF όσο και RPTPβ/ζ. Συμπερασματικά, ο RPTPβ/ζ φαίνεται να δρα ως υποδοχέας του VEGF και να είναι απαραίτητος για την προκαλούμενη από τον VEGF μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων διαμέσου του VEGFR-2. / A considerable progress has been made during the past years in elucidating the molecular actors of angiogenesis, with vascular endothelial growth factor (VEGF) representing the major inducer of angiogenesis up to date. VEGF induces several angiogenic functions of endothelial cells through its receptors VEGFR-1 and VEGFR-2 or KDR. VEGF-induced endothelial cell migration seems to be mediated by KDR, possibly via engagement of integrin αvβ3. Pleiotrophin (PTN) is a secreted heparin-binding growth factor that through its receptor protein tyrosine phosphatase β/ζ (RPTPβ/ζ) and ανβ3 integrin induces human endothelial cell migration. We have previously shown that exogenous PTN inhibits VEGF-induced endothelial cell migration. In the present work we studied the effect of endogenous PTN and its receptor RPTPβ/ζ in VEGF-induced endothelial cell migration. We found that endogenous PTN is not involved, while RPTPβ/ζ is required for VEGF-induced endothelial cell migration. Although VEGF may directly interact with RPTPβ/ζ, down-regulation of the latter by siRNA does not affect VEGF-induced ERK1/2 activation but seems to affect the interaction of KDR with ανβ3, which is important for VEGF-induced cell migration. Collectively, RPTPβ/ζ seems to be required for VEGF-induced endothelial cell migration through its receptor KDR.

Η πλειοτροπίνη αποτελεί έναν αυξητικό παράγοντα με ποικίλες δράσεις και σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη των όγκων και την αγγειογένεση. Η ερευνητική μας ομάδα έχει δείξει σε προηγούμενη μελέτη ότι η πλειοτροπίνη επάγει τη μετανάστευση ενδοθηλιακών κυττάρων, μέσω πρόσδεσής της στον υποδοχέα της RPTPβ/ζ. Στην παρούσα μελέτη δείξαμε ότι μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι της ιντεγκρίνης ανβ3, αλλά όχι έναντι της α5β1, ανέστειλε την επαγόμενη από την πλειοτροπίνη μετανάστευση ανθρώπινων ενδοθηλιακών κυττάρων με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Η πλειοτροπίνη βρέθηκε να αλληλεπιδρά με την ιντεγκρίνη ανβ3 και η αλληλεπίδραση αυτή είναι ανεξάρτητη από τη θέση δέσμευσης της αλληλουχίας RGD της ιντεγκρίνης. Αντίθετα, ένα συνθετικό πεπτίδιο το οποίο αντιστοιχεί στην κυστεϊνική θηλιά (177CYDMKTTC184) στο εξωκυτταρικό τμήμα της υπομονάδας β3 ανέστειλε την αλληλεπίδραση της πλειοτροπίνης με την ιντεγκρίνη ανβ3 και την επαγόμενη από την πλειοτροπίνη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων. Επιπλέον, η ιντεγκρίνη ανβ3 βρέθηκε να αλληλεπιδρά και με τον υποδοχέα RPTPβ/ζ, ενώ η επαγόμενη από την πλειοτροπίνη φωσφορυλίωση της τυροσίνης 773 της ιντεγκρίνης β3 διαμεσολαβείται μέσω του RPTPβ/ζ και της καθοδικής αυτού κινάσης c-Src, η οποία επιπλέον αλληλεπιδρά και με την ιντεγκρίνη β3. Η midkine βρέθηκε ότι αλληλεπιδρά με τον υποδοχέα RPTPβ/ζ, αλλά όχι με την ιντεγκρίνη ανβ3, ενώ προκάλεσε μια μικρή, αλλά στατιστικά σημαντική αναστολή στη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων. Στο ίδιο πλαίσιο, η πλειοτροπίνη ανέστειλε τη μετανάστευση διαφορετικών κυτταρικών σειρών γλοιώματος τα οποία εκφράζουν τον RPTPβ/ζ, αλλά όχι την ιντεγκρίνη ανβ3¬, ενώ προκάλεσε επαγωγή της μετανάστευσης στα κύτταρα U87MG, που εκφράζουν την ιντεγκρίνη ανβ3 στην κυτταρική τους μεμβράνη. Υπερέκφραση της ιντεγκρίνης β3 σε κύτταρα γλοιώματος είχε ως αποτέλεσμα την επαγωγική δράση της πλειοτροπίνης στην κυτταρική μετανάστευση. Παρόμοια, η πλειοτροπίνη δεν είχε καμία δράση στη μετανάστευση κυττάρων CHO που δεν εκφράζουν την ιντεγκρίνη β3, ενώ προκάλεσε σημαντική επαγωγή στη μετανάστευση των ίδιων κυττάρων σταθερά διαμολυσμένων ώστε να υπερεκφράζουν την ιντεγκρίνη β3. Σε κύτταρα CHO σταθερά διαμολυσμένα ώστε να υπερεκφράζουν μία μεταλλαγμένη μορφή της ιντεγκρίνης β3, στην οποία οι τυροσίνες 773 και 785 έχουν αντικατασταθεί με φαινυλαλανίνη, η πλειοτροπίνη δεν είχε καμία δράση, γεγονός που υποδηλώνει ότι η φωσφορυλίωση της τυροσίνης 773 είναι απαραίτητη για τη μεταγωγή του σήματος της πλειοτροπίνης που οδηγεί σε κυτταρική μετανάστευση. Το γεγονός ότι και η midkine προκάλεσε επαγωγή της φωσφορυλίωσης της τυροσίνης 773 δείχνει επιπλέον ότι η φωσφορυλίωση αυτή από μόνη της δεν είναι ικανή να οδηγήσει σε επαγωγή της κυτταρικής μετανάστευσης. Συνοπτικά, τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι η ιντεγκρίνη ανβ3 είναι ένα μόριο που καθορίζει την επαγωγική ή ανασταλτική δράση της πλειοτροπίνης στην κυτταρική μετανάστευση. Επιπλέον, στα πλαίσια της παρούσας εργασίας εξιχνιάσθηκε ο μηχανισμός δράσης ενός πεπτιδίου που αντιστοιχεί στα 26 τελευταία αμινοξέα του καρβοξυτελικού άκρου της πλειοτροπίνης (πεπτίδιο S1), και το οποίο έχει βρεθεί να αναστέλλει την αγγειογένεση in vivo και την επαγωγική δράση της πλειοτροπίνης στη μετανάστευση και το σχηματισμό αυλών των ενδοθηλιακών κυττάρων in vitro. Το πεπτίδιο S1 βρέθηκε ότι αναστέλλει την αλληλεπίδραση της πλειοτροπίνης με την ιντεγκρίνη ανβ3, ενώ δεν επηρεάζει την αλληλεπίδρασή της με τον RPTPβ/ζ στα ενδοθηλιακά κύτταρα. Η ανταγωνιστική δράση μεταξύ της πλειοτροπίνης και του πεπτιδίου S1 για πρόσδεση στην ιντεγκρίνη ανβ3 θα μπορούσε να εξηγήσει την ανασταλτική δράση του πεπτιδίου στις επαγόμενες από την πλειοτροπίνη βιολογικές δράσεις, αλλά το κυριότερο, δείχνει ότι η το καρβοξυτελικό άκρο της πλειοτροπίνης είναι υπεύθυνο τμήμα για τη δέσμευσή της στην ιντεγκρίνη ανβ3. Επιπλέον, ανοίγει το δρόμο για την ανάπτυξη μορίων που θα αναστέλλουν τις δράσεις της πλειοτροπίνης μέσω της ιντεγκρίνης ανβ3 και θα μπορούν να χρησιμοποιηθούν θεραπευτικά σε καταστάσεις, στις οποίες η αλληλεπίδραση αυτή παίζει σημαντικό ρόλο. / Pleiotrophin is a growth factor that among other functions, plays a significant role on tumor growth and angiogenesis. Our group has previously shown that pleiotrophin is able to induce migration of endothelial cells through binding to its receptor protein tyrosine phosphatase β/ζ (RPTPβ/ζ). In the present study we show that a monoclonal antibody against ανβ3 but not α5β1 integrin abolished pleiotrophin-induced human endothelial cell migration in a concentration-dependent manner. Integrin ανβ3 was found to directly interact with pleiotrophin in an RGD-independent manner, whereas a synthetic peptide corresponding to the specificity loop of the β3 integrin extracellular domain (177CYDMKTTC184) inhibited pleiotrophin-ανβ3 interaction and totally abolished pleiotrophin-induced endothelial cell migration. Interestingly, ανβ3 was also found to directly interact with RPTPβ/ζ, and pleiotrophin-induced Y773 phosphorylation of β3 integrin was dependent on both RPTPβ/ζ and the downstream c-Src kinase activation, which furthermore interacts with β3 integrin. Midkine was found to interact with RPTPβ/ζ, but not with ανβ3, and caused a small but statistically significant decrease in cell migration. In the same line, pleiotrophin decreased migration of different glioma cell lines that express RPTPβ/ζ but do not express ανβ3, while it stimulated migration of U87MG cells that express ανβ3 on their cell membrane. Overexpression of β3 in glioma cells stimulated the effect of pleiotrophin on cell migration. In the same line, pleiotrophin had no effect on migration of CHO cells that do not express β3, while it induced proliferation of the same cells, stably transfected to over-express wild-type β3. In cells over-expressing mutant β3 with replacement of cytoplasmic tyrosines 773 and 785 to phenylalanines, PTN had no effect on migration, suggesting that PTN-induced phosphorylation of tyrosine 773 is required for PTN-induced cell migration. However, the fact that midkine also induces phosphorylation of tyrosine 773 suggests that it is not sufficient by itself to transducer the stimulatory effect of PTN. Collectively, these data suggest that ανβ3 is a key molecule that determines the stimulatory or inhibitory effect of pleiotrophin on cell migration. Furthermore, the mode of action of a synthetic peptide that corresponds to the last 26 aminoacids of the C-terminal region of pleiotrophin (S1 peptide) and has inhibitory effects on angiogenesis in vivo and on pleiotrophin-induced endothelial cell migration and tube formation in vitro was further clarified. The peptide was found to inhibit pleiotrophin binding to ανβ3 integrin whereas it did not affect pleiotrophin binding to RPTPβ/ζ in human endothelial cells. These data explain the inhibitory effects of peptide S1 on pleiotrophin-induced biological activities and clarify that the C-terminal region of pleiotrophin is the domain responsible for the interaction with ανβ3 integrin. Finally, peptide S1 can be used to develop effective molecules in inhibiting actions of pleiotrophin through integrin ανβ3, in order to be used for treating pathologies where pleiotrophin seems to have significant role.

Η πλειοτροπίνη (PTN) αποτελεί έναν αυξητικό παράγοντα με ποικίλες δράσεις και σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη όγκων και την αγγειογένεση. Διάφοροι υποδοχείς αλληλεπιδρούν με την ΡΤΝ και διαμεσολαβούν τις βιολογικές της δράσεις, όπως η Ν-συνδεκάνη, ο ALK (κινάση αναπλαστικού λεμφώματος) και ο RPTPβ/ζ (υποδοχέας με δράση φωσφατάσης τυροσίνης β/ζ). Η ερευνητική μας ομάδα έχει δείξει σε προηγούμενη μελέτη ότι η ικανότητα της PTN να επάγει κυτταρική μετανάστευση εξαρτάται από το σχηματισμό ενός λειτουργικού συμπλόκου που αποτελείται από τον RPTPβ/ζ και την ιντεγκρίνη ανβ3. Η πολυ-λειτουργική πρωτεΐνη νουκλεολίνη (NCL), η οποία υπερεκφράζεται στην επιφάνεια ενεργοποιημένων ενδοθηλιακών και καρκινικών κυττάρων και διαμεσολαβεί τις διεγερτικές δράσεις διαφόρων αγγειογενετικών παραγόντων, έχει επίσης προταθεί ως υποδοχέας χαμηλής συγγένειας για την ΡΤΝ, με άγνωστες όμως λειτουργίες. Στην παρούσα μελέτη δείξαμε, με τη χρήση μεθόδων ανοσοκατακρήμνισης-ανοσοαποτυπώματος, διπλού ανοσοφθορισμού και προσδιορισμού αλληλεπίδρασης λόγω εγγύτητας, ότι η PTN αλληλεπιδρά άμεσα με τη NCL. Η αλληλεπίδραση αυτή περιλαμβάνει πρόσδεση της αμινοτελικής περιοχής της ΡΤΝ (αμινοξέα: 16-24) στην κεντρική περιοχή της NCL (αμινοξέα: 308-645). Μείωση της έκφρασης της NCL με siRNA ή λειτουργική αναστολή της μεμβρανικής NCL από το πεπτίδιο 5(KPR)TASP ανέστειλε πλήρως την επαγόμενη από ΡΤΝ μετανάστευση ενδοθηλιακών κυττάρων. Με αφετηρία την παρατήρηση ότι ο εντοπισμός της NCL στην κυτταρική επιφάνεια ανιχνεύθηκε μόνο σε κύτταρα που εκφράζουν την ανβ3, και πραγματοποιώντας πειράματα ανοσοφθορισμού και βιοχημικές μελέτες σε κύτταρα με γενετικά τροποποιημένη έκφραση των υπό μελέτη μορίων, δείξαμε ότι ο εντοπισμός της NCL στην πλασματική μεμβράνη εξαρτάται από τη φωσφορυλίωση της β3 στην τυροσίνη 773 μέσω ενεργοποίησης του RPTPβ/ζ και της c-src. Καθοδικά της ανβ3, η PI3K συμμετέχει σε αυτή τη δράση. Ο VEGF165 που επίσης επάγει το μεμβρανικό εντοπισμό της NCL, δρα μέσω δέσμευσης στον RPTPβ/ζ και ενεργοποίησης του σηματοδοτικού μονοπατιού RPTPβ/ζ/c-src/ανβ3. Η περιοχή δέσμευσης στους υποδοχείς VEGFR-1 και VEGFR-2 ή η περιοχή δέσμευσης στην ηπαρίνη στο μόριο του VEGF165 δεν εμπλέκονται στον επαγόμενο από VEGF165 εντοπισμό της NCL στην κυτταρική μεμβράνη. Εκτός από την PI3K, στη δράση του VEGF165 καθοδικά της ανβ3 εμπλέκεται και η κινάση p38, η ενεργοποίηση της οποίας είναι ανεξάρτητη από τον RPTPβ/ζ και τη φωσφορυλίωση της β3 στις τυροσίνες 773 ή 785, και φαίνεται να ανήκει σε μονοπάτι που ενεργοποιείται παράλληλα και που παραμένει αδιευκρίνιστο. Μηχανιστικά, η NCL βρέθηκε να αλληλεπιδρά άμεσα με την ανβ3, τον RPTPβ/ζ, τον VEGF165 και τον VEGFR-2, αλλά επηρεάζει τον ενδοκυτταρικό εντοπισμό μόνο του RPTPβ/ζ και της PTN. Θετική συσχέτιση παρατηρήθηκε ως προς την έκφραση της μεμβρανικής NCL και της ανβ3 σε μικροσυστοιχίες ιστών προερχόμενων από ανθρώπινα γλοιοβλαστώματα. Τέλος, βρέθηκε ότι το μονοκλωνικό αντίσωμα anti-C23 και τα πεπτίδια που στοχεύουν τη μεμβρανική NCL, 5(KPR)TASP, ΗΒ-19 και Nucant 6L, ανέστειλλαν σημαντικά τη μετανάστευση κυττάρων που εκφράζουν ανβ3, ενώ είχαν μικρή ή καθόλου δράση στη μετανάστευση κυττάρων που δεν εκφράζουν ανβ3 ή υπερεκφράζουν μετάλλαγμα της β3 με αντικατάσταση της κυτταροπλασματικής τυροσίνης 773 σε φαινυλαλανίνη. Συνολικά, από τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής προκύπτει ότι η έκφραση της ανβ3 και η φωσφορυλίωση της β3 στην τυροσίνη 773 καθορίζουν τον εντοπισμό της NCL στην κυτταρική επιφάνεια, καθοδικά του σηματοδοτικού μονοπατιού RPTPβ/ζ/c-src που συμμετέχει στην κυτταρική μετανάστευση που επάγεται τόσο από την ΡΤΝ, όσο και από τον VEGF165. Επίσης, φαίνεται ότι η έκφραση της ανβ3 θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ως βιοδείκτης για τη χρήση ανταγωνιστών της μεμβρανικής NCL ως αντικαρκινικών παραγόντων. / Pleiotrophin (PTN) is a growth factor that plays a significant role on tumor growth and angiogenesis. Several receptors interact with PTN and mediate its biological actions, such as N-syndecan, anaplastic lymphoma kinase (ALK) and receptor protein tyrosine phosphatase beta/zeta (RPTPβ/ζ). Our group has previously shown that the ability of PTN to stimulate migratory responses depends on the formation of a functional complex consisting of RPTPβ/ζ and integrin ανβ3. The multifunctional protein nucleolin (NCL), which is over-expressed on the surface of activated endothelial and tumor cells and mediates the stimulatory actions of several angiogenic factors, has been also suggested as a low affinity receptor for PTN, however with unknown functions. In the present study, by using immunoprecipitation/Western blot analyses, double immunofluorescence and proximity ligation assays, we showed that PTN directly interacts with NCL. This interaction involves binding of the amino-terminal domain of PTN (amino acids: 16-24) to the central domain of NCL (amino acids: 308-645). Down-regulation of NCL by siRNA or blockage of cell surface NCL by its ligand 5(KPR)TASP completely abolished PTN-induced endothelial cell migration. Based on the observation that cell surface NCL localization was detected only in cells expressing ανβ3 and by performing immunofluorescence and biochemical studies in cells with genetically altered expression of the studied molecules, we demonstrated that cell surface NCL localization depends on the phosphorylation of β3 at Tyr773 through RPTPβ/ζ and c-src activation. Down-stream of ανβ3, PI3K activity is required for cell surface NCL localization. VEGF165 that also induces cell surface NCL localization acts through binding to RPTPβ/ζ and activation of the RPTPβ/ζ/c-src/ανβ3 signaling pathway. The receptor or the heparin binding sites on the VEGF165 molecule do not seem to be involved in this VEGF165 action. Apart from PI3K, in VEGF165-induced cell surface NCL localization, p38 that lays down-stream of ανβ3, is also involved. Activation of p38 is independent of RPTPβ/ζ and β3 Tyr773 or Tyr785 phosphorylation, and seems to belong to a parallel signaling pathway that remains unclear. Mechanistically, NCL was found to directly interact with ανβ3, RPTPβ/ζ, VEGF165 and VEGFR-2, but only affects the intracellular localization of RPTPβ/ζ and PTN. Positive correlation of cell surface NCL and ανβ3 expression was observed in human glioblastoma tissue arrays. Finally, the monoclonal antibody anti-C23 and the peptides targeting cell surface NCL, 5(KPR)TASP, HB-19 and Nucant 6L, significantly inhibited migration of cells expressing ανβ3 in the presence of serum, while they had a minor or no effect on cells lacking ανβ3 or over-expressing mutant β3 with replacement of cytoplasmic tyrosine 773 to phenylalanine. Collectively, these data suggest that ανβ3 expression and β3 phosphorylation at Tyr773 downstream of the RPTPβ/ζ/c-src signaling cascade determines the cell surface localization of NCL, which is required for cell migration induced by both PTN and VEGF165. Moreover, expression of ανβ3 could be used as a biomarker for the use of cell surface NCL antagonists as anticancer agents.

Η HARP (Heparin Affin Regulatory Peptide), γνωστή και ως πλειοτροπίνη, είναι ένας αυξητικός παράγοντας που η έκφρασή του στα ενήλικα άτομα είναι περιορισμένη σε συγκεκριμένους ιστούς. Ωστόσο, έκφραση ή υπερέκφρασή της έχει παρατηρηθεί in vivo σε διάφορους όγκους και στον ορό του αίματος ασθενών με διάφορες μορφές καρκίνου, καθώς και in vitro σε διάφορες καρκινικές κυτταρικές σειρές. Παρόλο που οι in vivo βιολογικές δράσεις της HARP είναι αδιαμφισβήτητες, δεν έχει διασαφηνιστεί ο μηχανισμός με τον οποίο ασκεί τις δράσεις αυτές. Επίσης, υπάρχουν πολλά αντικρουόμενα αποτελέσματα αναφορικά με τις in vitro βιολογικές της δράσεις. Στη συγκεκριμένη εργασία διερευνήθηκε το εάν η διαφορετική έκφραση των υποδοχέων της HARP, RPTPβ/ζ και ALK, είναι ένας άλλος λόγος για τα αντικρουόμενα αυτά αποτελέσματα. Χρησιμοποιώντας την RNAi τεχνολογία, δημιουργήσαμε DU145 και PC3 κύτταρα (κυτταρικές σειρές από καρκίνο ανθρώπινου προστάτη), τα οποία σταθερά έχουν μειωμένα επίπεδα έκφρασης του RPTPβ/ζ και του ALK. Τα DU145 κύτταρα εκφράζουν μόνο τον RPTPβ/ζ, σε αντίθεση με τα PC3 κύτταρα που εκφράζουν και τους δύο υποδοχείς. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ο RPTPβ/ζ καταστέλλει την επαγόμενη από HARP κυτταρική προσκόλληση και μετανάστευση, ενώ ο ALK επάγει την επαγόμενη από HARP κυτταρική μετανάστευση. Επιπλέον, η μελέτη της μεταγωγής σήματος αυτών των υποδοχέων έδειξε ότι ο RPTPβ/ζ καταστέλλει τα επίπεδα φωσφορυλίωσης της κινάσης Src, της Fak, της Pten/Akt και των Erk1/2, ενώ ο ALK επάγει την ενεργότητα της Akt και των Erk1/2. Επιπρόσθετα, η μείωση της έκφρασης του RPTPβ/ζ σχετίζεται με την επαγωγή EMT φαινοτύπου, αφού καταστέλλει την έκφραση της E-καντερίνης και επάγει την έκφραση της Ν-καντερίνης, των ιντεγκρινών-α5, -αv και β3, καθώς και της MMP9. Επιπλέον, είναι γνωστό ότι οι αυξητικοί παράγοντες αποτελούν υπόστρωμα για διάφορα πρωτεολυτικά ένζυμα του κυτταρικού μικροπεριβάλλοντος, με αποτέλεσμα την παραγωγή βιολογικά ενεργών πεπτιδίων που μπορούν να έχουν παρόμοιες ή και αντίθετες δράσεις με το ολικό μόριο. Η πλασμίνη, η τρυψίνη και η MMP2, πέπτουν την HARP και παράγουν πεπτίδια που αναστέλλουν την επαγωγική της δράση. Σύμφωνα με αυτές τις μελέτες, το ενδιαφέρον για την ανακάλυψη πεπτιδίων με αντικαρκινική δράση εντοπίζεται στο καρβοξυτελικό τμήμα της HARP, καθώς και στις δύο κεντρικές περιοχές που παρουσιάζουν ομολογία με τις επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες της θρομβοσπονδίνης-1. Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε ο μηχανισμός δράσης του P(122-131) και οι βιολογικές δράσεις των P(13-39) και P(65-97). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το P(122- 131) μετά την πρόσδεσή του στον RPTPβ/ζ, μειώνει τα επίπεδα φωσφορυλίωσης της κινάσης Src, της Fak, της Pten και των Erk1/2 και καταστέλλει την in vitro προσκόλληση και μετανάστευση των DU145 και LNCaP κυττάρων. Επιπλέον, τα αποτελέσματα υποστηρίζουν την υπόθεση ότι το P(122-131) καταστέλλει αυτές τις διαδικασίες και μετά από τον ανταγωνισμό του με τη HARP για την πρόσδεση όχι μόνο στον ALK, αλλά και σε άλλους υποδοχείς. Τέλος, χρησιμοποιώντας το σύστημα της χοριοαλλαντοϊδικής μεμβράνης εμβρύου όρνιθας, παρατηρήσαμε ότι το P(122-131) καταστέλλει και την in vivo αγγειογένεση. Παρόμοια με το P(122-131), τα P(13-39) και P(65-97) καταστέλλουν την in vitro προσκόλληση και μετανάστευση των DU145 και PC3 κυττάρων μετά την πρόσδεσή τους στον RPTPβ/ζ. Συμπερασματικά, στην παρούσα εργασία καταδεικνύεται ο ρόλος των υποδοχέων RPTPβ/ζ και ALK στον μηχανισμό δράσης του αυξητικού παράγοντα HARP και των πεπτιδίων του. Για πρώτη φορά αποδεικνύεται ότι η ανασυνδυασμένη HARP προκαρυωτικής προέλευσης είναι βιολογικά ενεργή και ότι η δράση της εξαρτάται από τη συνισταμένη των δράσεων που έχει κάθε υποδοχέας της, αντικατοπτρίζοντας τον περίπλοκο μηχανισμό δράσης της HARP και των πεπτιδίων της. / HARP (Heparin Affin Regulatory Peptide), also known as Pleiotrophin, is a growth factor that is thought to be involved in carcinogenesis. Elevated concentrations of this growth factor are found in many types of tumors, as well as in the plasma of patients with different types of cancer. However, contradictory results have been published concerning the in vitro activities of HARP. Here, we investigated whether the differential expression of HARP receptors, namely RPTPβ/ζ and ALK, is another reason for these controversies. Using the RNAi technology, we stably transformed prostate cancer cell lines DU145 and PC3 to knockdown RPTPβ/ζ or ALK expression. DU145 cells express only RPTPβ/ζ, while PC3 cells express both RPTPβ/ζ and ALK. Our results showed that RPTPβ/ζ inhibits HARP-mediated cellular adhesion and migration, while ALK induces HARP-mediated cellular migration. Investigation of the transduction mechanism revealed that RPTPβ/ζ inactivates Src, Fak, Pten/Akt, and Erk1/2, while ALK activates Akt and Erk1/2. In addition, RPTPβ/ζ knockdown promotes a shift in expression form E- to N-cadherin, and induces the expression of integrin-α5, -αv, -β3, and MMP9. Growth factors can be hydrolyzed by proteases, leading to the production of biological active peptides. Previous studies indicate that HARP is cleaved by enzymes in the extracellular environment, such as plasmin, trypsin, chymotrypsin, and MMP2. Moreover, the resulting peptides exert altered biological functions compared to the whole molecule. Here, we investigated the effect of (P122-131), corresponding to the basic cluster of the C-terminal region of HARP, as well as the effect of P(13-39) and P(65-97) derived from the TSR domains of HARP. Our results demonstrated that P(122-131) interacts with RPTPβ/ζ, inactivates its catalytic activity, and triggers a signal transduction pathway that inhibits DU145 and LNCaP adhesion and migration, while in parallel interferes with ALK or other pleiotrophin receptors inhibiting pleiotrophin-induced cellular adhesion and migration. In addition, P(122-131) inhibits angiogenesis in vivo, as determined by the chicken embryo CAM assay. Furthermore, P(13-39) and P(65-97) interacts with RPTPβ/ζ and inhibits DU145 and PC3 adhesion and migration. Taken together, the results of this study demonstrate the effect of RPTPβ/ζ and ALK on HARP and its peptides-mediated biological actions. Our results support the hypothesis that the overall effect of pleiotrophin depends on the expression profile of its receptors. Concluding, we show that bacterial pleiotrophin is biological active and part of the diversity of pleiotrophin biological actions is due to RPTPβ/ζ and /or ALK and the complex way of their interactions and signaling.