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Evolução in vitro de anticorpos anti-CD3 pela seleção de cadeias leve (VL) humanas por phage display

Oliveira, Yuri Santos 02 1900 (has links)
Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2009. / Submitted by Jaqueline Ferreira de Souza (jaquefs.braz@gmail.com) on 2010-03-18T13:38:57Z No. of bitstreams: 1 2009_YuriSantosOliveira.pdf: 1895347 bytes, checksum: 419eb5913705e8f045ad7b3a3c6dfda0 (MD5) / Approved for entry into archive by Lucila Saraiva(lucilasaraiva1@gmail.com) on 2010-05-03T21:20:41Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_YuriSantosOliveira.pdf: 1895347 bytes, checksum: 419eb5913705e8f045ad7b3a3c6dfda0 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-05-03T21:20:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_YuriSantosOliveira.pdf: 1895347 bytes, checksum: 419eb5913705e8f045ad7b3a3c6dfda0 (MD5) Previous issue date: 2009-02 / Nos últimos 20 anos a utilização de anticorpos monoclonais (mAbs) para fins terapêuticos vêm revolucionando o tratamento de diversas enfermidades. Desde a aprovação pelo FDA (Food and Drug Administration USA), em 1986, do anticorpo murino anti-CD3, Orthoclone OKT3 o mercado de anticorpos monoclonais vem crescendo a passos largos. Esse trabalho teve como objetivo o melhoramento do anticorpo OKT3 humanizado utilizando a técnica de domain shuffling. Para tanto scFvs contendo a região codante da cadeia variável pesada humanizada foram obtidos variando-se os genes de cadeias leves, clonadas a partir de uma biblioteca humana. Esses scFvs foram produzidos na forma de partículas virais de fusão para serem utilizados em procedimentos de seleção de acordo com a técnica de phage display. Para dar início a seleção de partículas virais ligantes, foi necessária a expressão e purificação do antígeno CD3 recombinante em E. coli. Esse antígeno foi expresso na fração citoplasmática solúvel de células da linhagem BL21. Foi realizada a purificação e constatou-se a manutenção das características antigênicas do CD3 por imunoensaio com anticorpos anti-CD3 comerciais ou recombinantes. Em seguida, averiguou-se se os fagos selecionados eram capazes de se ligar ao antígeno e a quais ciclos de seleção eles pertenciam. Concluiu-se com o presente trabalho que o procedimento de seleção de anticorpos na forma de scFv pela estratégia de shuffling de cadeia aliada à técnica de Phage Display foi eficaz em selecionar clones com capacidade de ligação ao antígeno recombinante. Esse trabalho aponta para a validação dos anticorpos obtidos em comparação com os anticorpos comerciais (OKT3 e UCHT). _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / In the last 20 years the use of monoclonal antibodies (mAbs) for therapeutic purposes are revolutionizing the treatment of various diseases. Since the approval by the FDA (Food and Drug Administration - USA) in 1986, the murine anti-CD3 antibody, Orthoclone OKT3, monoclonal antibodies market is scaling up. This work aimed the improvement of a humanized OKT3 antibody using the technique of domain shuffling. The strategy chosen was keeping constant the anti-CD3 humanized heavy chain coding region combined with light chains genes, cloned from a human Fab library. These scFvs were fused to filamentous phage gene protein III. These fusion virions were used in selection procedures as stated by Phage Display technique. To proceed the selection we first expressed and purificated the CD3 recombinant antigen in E. coli. This antigen was recovered from the soluble cytoplasmatic fraction of E. coli strain BL21cells. Purification was carried out by metal affinity chromatography, and the recombinant protein antigenic features were assessed by immunoassay using comercial or recombinant anti-CD3 antibodies. The selection procedure was performed in four selection rounds, and the selected phages were screened by their ability of antigen recognition. The bound phages were found predominantly among those from round four (86 % of the assayed phage clones). In conclusion, this work was able to select new anti-CD3 antibodies and these new molecules must now be further charicterized to validate them in comparison with commercial antibodies (OKT3 and UCHT) and as a second generation of biopharmaceuticals.
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Caracterização da atividade ligante e da função efetora de anticorpos humanizados Anti–CD3 humano

Silva, Hernandez Moura January 2008 (has links)
Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2008. / Submitted by Larissa Ferreira dos Angelos (ferreirangelos@gmail.com) on 2009-09-14T19:32:53Z No. of bitstreams: 1 Dissert_ Hernandez Moura Silva.pdf: 4796639 bytes, checksum: 25de57ac126c223d229f1cdfef26506e (MD5) / Approved for entry into archive by Gomes Neide(nagomes2005@gmail.com) on 2010-06-30T20:24:42Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissert_ Hernandez Moura Silva.pdf: 4796639 bytes, checksum: 25de57ac126c223d229f1cdfef26506e (MD5) / Made available in DSpace on 2010-06-30T20:24:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissert_ Hernandez Moura Silva.pdf: 4796639 bytes, checksum: 25de57ac126c223d229f1cdfef26506e (MD5) Previous issue date: 2008 / O anticorpo anti-CD3 tem sido utilizado como imunoterápico na prevenção da rejeição a órgãos transplantados e considerado um fármaco promissor para o tratamento de doenças auto-imunes. Entretanto, o único anticorpo anti-CD3 utilizado para uso clínico aprovado pelo FDA, o OKT3, possui origem murina o que gera uma resposta imunogênica quando administrado, impossibilitando uma utilização prolongada e, assim, diminuindo sua eficácia. Uma técnica que vem ao encontro da solução desse problema é a humanização de anticorpos, que por meio de manipulações gênicas propicia um aspecto “mais humano” a essa molécula, atenuando a resposta imunogênica desencadeada. Nesse sentido, foi avaliada a atividade ligante e a função efetora de duas versões humanizadas do anticorpo anti-CD3 apresentando o resíduo murino treonina (T) ou o resíduo humano arginina (R) na posição 86 da cadeia variável pesada. Posição essa, considerada importante estruturalmente. Para expresão dos anticorpos humanizados foram construídos vetores de expressão dicistrônicos, os quais foram utilizados para produção das imunoglobulinas em células de mamíferos da linhagem CHO, de forma estável. Os anticorpos produzidos foram purificados por cromatografia de afinidade para posterior análise da atividade ligante e da função efetora. Os resultados indicam que os anticorpos humanizados são capazes de se ligar ao CD3 na superfície de linfócitos. Contudo, são incapazes de bloquear completamente a ligação do anticorpo murino OKT3 à superfície de linfócitos, em ensaios de competição. Em conjunto com análises estruturais, esses dados indicam uma perda de afinidade das versões humanizadas provavelmente devido à substituição de resíduos importantes estruturalmente na cadeia leve humanizada. As versões humanizadas também apresentam uma capacidade mitogênica menor que a apresentada pelo OKT3, corroborando a perda de afinidade desses anticorpos. Esses dados sugerem que os anticorpos humanizados são capazes de se ligar ao CD3 na superfície de linfócitos, mas o processo de humanização levou a uma diminuição da afinidade original desses anticorpos. Nesse sentido, para se restabelecer a atividade ligante dos anticorpos recombinantes sugerimos a realização de algumas mutações específicas para com isso avaliar o seu futuro uso clínico. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Anti-CD3 antibodies have been used for the prevention of organ allograft rejection and are also considered a promising immunotherapic for autoimmune diseases treatment. Currently, there is only one anti-CD3 antibody approved by FDA for clinical use, the OKT3. Unfortunately, due to its murine origin, it promotes an immunogenic reaction when administrated, limiting its long-term use and reducing the treatment effectiveness. To solve this problem we have proposed humanized versions of this anti-CD3 to avoid its immunogenic properties. In this work was evaluated the binding activity and effector function of two humanized anti-CD3 antibodies. The first one has the murine residue threonine (T) 86 VH position while the second version shows the human residue arginine (R) at position 86 in VH. Modeling analysis indicated that this position is structurally important. To express the recombinant antibodies we constructed a dicistronic expression vector and produced the immunoglobulins in CHO cell lines. To analyze the binding activity and effector function, the recombinant proteins were previously purified by affinity chromatography. The results show that humanized antibodies were able to binding to the human CD3 on the T lymphocyte surface. However, they weren’t able to completely block OKT3 binding to T lymphocyte surface on competitive assays. Along with structural analysis, this data indicate an affinity loss of humanized versions probably due the substitution of important residues on humanized VL. The humanized versions also presented a less mitogenic activity than that observed by OKT3, corroborating the affinity loss of these antibodies. These data suggest that the humanized antibodies are able to bind to human CD3, but the humanization procedure caused a decrease on recombinant antibody affinity, compared with OKT3. To restore the binding activity of these antibodies specific mutations and back mutations must have to be taken in order to permit its future clinical use evaluation.
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Estudo da variabilidade genética da CDR H3 em anticorpos anti-DNA no contexto das famílias murinas VH10 e VH4

Costa, Maria Beatriz Walter 06 June 2012 (has links)
Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2012. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2012-09-27T12:41:51Z No. of bitstreams: 1 2012_MariaBeatrizWalterCosta.pdf: 4472250 bytes, checksum: aa1c67471c8a9327387daa575bc0ec6b (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2012-10-03T13:34:27Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_MariaBeatrizWalterCosta.pdf: 4472250 bytes, checksum: aa1c67471c8a9327387daa575bc0ec6b (MD5) / Made available in DSpace on 2012-10-03T13:34:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_MariaBeatrizWalterCosta.pdf: 4472250 bytes, checksum: aa1c67471c8a9327387daa575bc0ec6b (MD5) / O conhecimento sobre as intera cções moleculares entre anticorpos com a nidade a acidos nucl eicos e seus alvos ainda e muito limitado. Trabalhos anteriores do grupo de Imunologia Molecular da Universidade de Bras lia de busca em bancos de dados apon- tavam para uma prov avel tendência de reconhecimento de acidos nucl eicos dos anticorpos pertencentes a fam lia murina de imunoglobulina de cadeia vari avel pesada dez, ou VH10. Portanto, para melhor entender esse comportamento, decidiu-se analisar bibliotecas de regiões determinantes de complementaridade tr^es de cadeia pesada, CDR H3, em contextos das fam lias murinas VH10 e VH4, antes e ap os essas bibliotecas terem sido selecionadas contra DNA ta simples. Desta forma, procurou-se compreender o comportamento dessas duas fam lias e de certos determinantes da CDR H3 no reconhecimento de anticorpos a DNA. As bibliotecas de estudo foram submetidas a seq uenciamento de alto-desempenho, utilizando-se a metodologia Illumina, e foram ent~ao analisadas por meio de um pipeline de Bioinform atica. Esse pipeline consistiu na prepara c~ao das seq uências FASTQ recebidas e na an alise posterior, sendo esta ultima composta por estudos de variabilidade das bibliotecas, enriquecimento de seq uências ap os a sele ção contra DNA, divergência de Kullback-Leibler, compara ção de padrões e composi ção da CDR H3. A an alise revelou que a os padrões de seq uências selecionadas positivamente e negativamente são muito semelhantes em VH10, e que este arcabou co e menos estringente que VH4 em relação a exigir seq uências de CDR H3 mais espec cas a DNA. Portanto, concluiu-se que a fam lia VH10 apresenta tendência intr nseca a forma c~ao de anticorpos anti-DNA, o que não ocorre com a fam lia VH4. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / We still possess very little knowledge of the molecular interaction between anti-nucleic acids and their targets. Previous research in databases made by the Molecular Immunology group of the University of Brasilia has indicated a probable tendency of nucleic acids' recognition of the antibodies of the murine heavy chain immunoglobulin family ten, VH10. Therefore, to better understand this behaviour, we analysed libraries of heavy chain complementarity determinig region three, CDR H3, in the context of the murine families VH10 and VH4, before and after these libraries have been selected against DNA single strand. In this manner, we sought to understand the behaviour of these families and of certain CDR H3 features in the antibody's recognition of DNA. The libraries were submitted to deep-sequencing Illumina platform and then analysed by a Bioinformatics pipeline. The pipeline was comprised in the preparation of the FASTQ Illumina sequences and in an afterwards analysis, which consisted in studies of library variability, sequence enrichment, Kullback-Leibler divergence, pattern comparison and CDR H3 composition. Analysis revealed that the patterns of the positive and negative selected groups are similar in VH10 and that this framework is more stringent than VH4 in demanding CDR H3 sequences that are more DNA-speci c. Therefore, it was concluded that the VH10 family presents an intrinsic tendency to form anti-DNA antibodies, which does not occur with the VH4 family.
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Estratégias para expressão de um anticorpo anti-CD3 humanizado em células de mamífero

Bezerra, Maryani Andressa Gomes January 2009 (has links)
Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2009. / Submitted by Raquel Viana (tempestade_b@hotmail.com) on 2010-04-27T20:17:10Z No. of bitstreams: 1 2009_MaryaniAndressaGBezerra.pdf: 7729100 bytes, checksum: 7d54aa00068c38faeeb56a4769c97ce8 (MD5) / Approved for entry into archive by Lucila Saraiva(lucilasaraiva1@gmail.com) on 2010-04-27T22:07:15Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_MaryaniAndressaGBezerra.pdf: 7729100 bytes, checksum: 7d54aa00068c38faeeb56a4769c97ce8 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-04-27T22:07:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_MaryaniAndressaGBezerra.pdf: 7729100 bytes, checksum: 7d54aa00068c38faeeb56a4769c97ce8 (MD5) Previous issue date: 2009 / O desenvolvimento de novos anticorpos recombinantes teve impacto significativo no tratamento de diversas doenças. Contudo, devido a complexidade estrutural da molécula de imunoglobulina, a produção desta em células de mamífero ainda é um desafio. Uma das dificuldades é obter uma produção equimolar das cadeias pesada e leve para a prevenção do acúmulo de cadeias não-montadas, seguido de apoptose por estresse. Em nosso grupo, vimos trabalhando com um anticorpo com potencial imunoregulatório específico para o antígeno CD3 humano. Anticorpos anti-CD3 têm sido utilizados como imunoterápicos na prevenção da rejeição aguda de órgãos transplantados e é considerado um fármaco promissor para o tratamento de doenças auto-imunes. A produção desse anticorpo em cultura de células animais tem se mostrado limitante devido ao baixo rendimento de anticorpo recombinante. Na tentativa de desenvolver estratégias alternativas para aprodução de anticorpo recombinante, foram construídos vetores de expressão, onde o anticorpo inteiro é produzido a partir de construções monocistrônicas, bicistrônicas e tricistrônica em células de mamíferos. As versões monocistrônicas possuem uma seqüência codificadora de um sítio clivável por furina entre as duas cadeias do anticorpo. A versão bicistrônica possui um elemento IRES sintético entre as duas cadeias. Além disso, foi introduzida uma marca seletiva para o antibiótico Geneticina associada ao mesmo cassete de expressão como um cístron extra guiado por outro elemento IRES. Para produção do anticorpo anti-CD3 foram utilizadas as linhagens celulares HEK293 e BHK-21, de forma transiente e estável. Os anticorpos produzidos foram purificados por cromatografia de afinidade e analisados para a produção de imunoglobulina intacta. Os resultados indicam que a construção bicistrônica pMACIA HIL e monocistrônica pMACIA HL são capazes de garantir a expressão de ambas as cadeias de anticorpo. Já as construções monocistrônica pMACIA LH e bicistrônica pMACIA HL IRES neo não foram capazes de produzir o anticorpo recombinante. A construção tricistrônica pMACIA HIL IRES neo foi a construção que se mostrou mais promissora, apresentando estabilidade de produção do anticorpo em transfectomas estáveis. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The development of new pharmaceuticals derived from recombinant antibodies had a significant impact in the treatment of various illnesses. However, due to the structural complexity of the immunoglobulin molecule, the production of these molecules in mammal cells is still challenging. One of the difficulties is the equimolar production of heavy and light chains and the prevention of the stress induced by the accumulation of unassembled protein. We are working with a potentially immunoregulatory recombinant humanized antibody specific for the human CD3 antigen. Anti-CD3 antibodioes have been used in the prevention of the acute graft rejection and are considered as a promising pharmaceutical for the treatment of autoimmune diseases. The production of this antibody in culture of animal cells has shown to be problematic due to the low yield of recombinant antibody recovery. In the attempt to create alternative strategies for recombinant production of antibody, monocistronic, bicistronic and tricistronic expression vectors were constructed to coordinate the expression of a complete antibody in mammal cells. The monocistronic versions possess a furin cleavage coding sequence between the both antibody chains. The bicistronic version possesses a synthetic IRES element between the two chains. A selective mark for the Geneticin antibiotic was introduced in the expression cassette as an extra cistron driven by another IRES element. The cell lines HEK293 and BHK-21 were used for transient or stable production of the anti- CD3 antibody. Recombinant antibodies were purified by affinity chromatography and analyzed for the production of intact immuglobulin. The results indicate that the bicistronic construction pMACIA HIL and the monocistronic construction pMACIA HL are capable to express both antibody chains. On the other hand, the monocistronic construction pMACIA LH or the bicistronic construction pMACIA HL IRES neo were not able to produce the recombinant antibody. The tricistronic vector pMACIA HIL IRES neo was shown to be the most promising construction to obtain the whole antibody production in stable transfectomes.
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Expressão de antígeno tetra-epitopo do vírus Dengue em cloroplastos de alface e avaliação do seu potencial diagnóstico para detecção de anticorpos IgG contra os quatro sorotipos da Dengue

Maldaner, Franciele Roberta 12 March 2013 (has links)
Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2013. / Submitted by Tania Milca Carvalho Malheiros (tania@bce.unb.br) on 2013-09-30T18:52:16Z No. of bitstreams: 1 2013_FrancieleRobertaMaldaner_Parcial.pdf: 1774345 bytes, checksum: 85eb8e352daa81fdbb9866dbb18a1410 (MD5) / Rejected by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br), reason: Tânia, Por favor trocar o arquivo. Obrigada! Jacqueline on 2013-10-04T11:32:16Z (GMT) / Submitted by Tania Milca Carvalho Malheiros (tania@bce.unb.br) on 2013-10-04T13:26:06Z No. of bitstreams: 1 2013_FrancieleRobertaMaldaner_Parcial.pdf: 1775439 bytes, checksum: 9750037815e489af5ac3a4209e8d8afe (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2013-10-04T14:01:07Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_FrancieleRobertaMaldaner_Parcial.pdf: 1775439 bytes, checksum: 9750037815e489af5ac3a4209e8d8afe (MD5) / Made available in DSpace on 2013-10-04T14:01:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_FrancieleRobertaMaldaner_Parcial.pdf: 1775439 bytes, checksum: 9750037815e489af5ac3a4209e8d8afe (MD5) / A Dengue hoje está presente em mais de 100 países, causando aproximadamente 100 milhões de casos da doença. O diagnóstico laboratorial é de fundamental importância, devido a semelhança de sintomas confundidos com outras doenças como a Febre amarela, Sarampo, Rubéola e Influenza. Técnicas sorológicas como o ELISA são amplamente empregadas para o diagnóstico, entretanto, devido ao uso de extrato bruto viral como fonte de antígeno, ocorrem problemas de reações cruzadas, variação de qualidade e alto custo de produção. Objetivando a diminuição destes problemas com ensaios convencionais de ELISA, antígenos virais recombinantes têm sido produzidos e utilizados em ensaios diagnósticos. Neste trabalho utilizou-se o sistema de transplastomia em alface para a produção de um antígeno recombinante tetra-epitopo, o que permitiu o emprego do extrato bruto proteico de cloroplastos, sem purificação, na detecção sorológica de anticorpos IgG contra os 4 sorotipos da Dengue. O antígeno tetra-epítopo desenvolvido, compreende a região de epítopos que vai do aminoácido 34 ao 57, entre os domínios I/II da proteína do envelope do vírus. O antígeno é composto pelos sorotipos na ordem 4-3-2-1 unidos por linker de 5 glicinas. Na região C terminal adicionou-se cauda de hexa-histidina com o intuito de facilitar a purificação. O ELISA para detecção de IgG, apresentou uma sensibilidade geral de 71%, e especificidade de 100% para soros onde não havia sido determinado a fase e tipo de infecção. Houve diferença de sensibilidade dentre os sorotipos, que foi estimada em 91.6%, 86.6%, 75.0%, e 18,2% para os sorotipos de DENV-1-4, respectivamente. Não observou-se reação cruzada com soros positivos para Febre amarela, Rubéola e Sarampo. Na avaliação com soros pareados, o ELISA revelou uma sensibilidade maior na fase convalescente do que na aguda da doença, tanto para infecções primárias quanto secundárias. A sensibilidade geral para os dois perfis de infecções desconsiderando a fase da doença (aguda ou convalescente), revelou uma sensibilidade geral de 89% para as infecções primárias, e 96% para as infecções secundárias. Quanto à planta transplastômica, esta ainda apresenta um perfil de transformação heteroplásmico. Almeja-se a obtenção de uma planta homoplásmica que provavelmente será obtida através da seleção em meio seletivo. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Currently Dengue occurs in more than 100 countries causing about 100 million cases of Dengue disease per year. Laboratory diagnosis is crucial, because of the similarity of symptoms confused with other diseases such as Yellow Fever, Measles, Rubella and Influenza. Serological techniques as ELISA are widely used for the diagnosis; however, due to the use of crude extract as the viral antigen source, problems may occur as cross-reactions, variation in quality and high production costs. Aiming to decrease these problems with conventional ELISA kits, recombinant viral antigens have been produced and used in diagnostic kits. In this study lettuce transplastomic system was used to produce a recombinant tetra-epitope antigen, which allowed the use of crude protein extract from chloroplasts, without purification, for serological detection of IgG antibodies against the four Dengue serotypes. The tetra-epitope antigen developed, comprising the epitope region of position 34-57 amino acid, which is located between domains I / II of the virus envelope protein. The antigen is composed of serotypes in the following order 4-3-2-1 joined by 5 glycines linkers. In the C terminal region, a hexa-histidine tail was added for purification. The ELISA for detection of IgG in patients’ sera, showed an overall sensitivity of 71% and specificity of 100% using sera which had not been determined the phase and type of infection. There was a difference in sensitivity between the serotypes that was estimated around 91.6%, 86.6%, 75.0%, and 18,2%, for DENV 1-4 serotypes, respectively. No cross-reaction was observed with positive sera for Yellow Fever, Rubella and Measles. In evaluation with paired sera, the ELISA showed greater sensitivity in convalescent than in acute phase of disease development for both, primary and secondary infections. The overall sensitivity for the two profiles infections not considering the disease phase (acute or convalescent), revealed 89% for primary infections, and 96% for secondary infections. As for the transplastomic plant, it still has a heteroplasmic transformation profile. Probably the homoplasmic plant may be obtained by selection on selective medium.
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Nova abordagem para expressão da partícula sSHbsAg do antígeno HBsAg do vírus da Hepatite B em células de inseto

Araujo, Ana Carolina Oliveira de 29 July 2011 (has links)
Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde. / Submitted by Shayane Marques Zica (marquacizh@uol.com.br) on 2011-11-08T19:34:30Z No. of bitstreams: 1 2011_AnaCarolinaOliveiradeAraújo.pdf: 3209514 bytes, checksum: ae2cd9ee0a8a8200911cb3ad232d7e29 (MD5) / Approved for entry into archive by Leila Fernandes (leilabiblio@yahoo.com.br) on 2011-12-20T12:52:35Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_AnaCarolinaOliveiradeAraújo.pdf: 3209514 bytes, checksum: ae2cd9ee0a8a8200911cb3ad232d7e29 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-12-20T12:52:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_AnaCarolinaOliveiradeAraújo.pdf: 3209514 bytes, checksum: ae2cd9ee0a8a8200911cb3ad232d7e29 (MD5) / As Hepatites virais são doenças causadas por diferentes agentes etiológicos, que possuem distribuição universal e têm em comum o hepatotropismo. Em todo mundo, as hepatites A e B continuam a ser um grande problema de saúde pública. A Organização Mundial da Saúde (OMS) estima que 170 milhões de pessoas estejam infectadas com o vírus da hepatite C (HCV) e que 300 milhões vivam com o vírus da hepatite B (HBV). O vírus da hepatite B está classificado na família Hepadnavirus, contém características como o tropismo pelas células hepáticas e material genético constituído por uma molécula de DNA com fita parcialmente dupla. O diagnóstico de qualquer uma das formas clínicas da Hepatite B realiza-se através de técnicas sorológicas. Tais técnicas revelam-se fundamentais não apenas para o diagnóstico, mas também mostram-se muito úteis no acompanhamento da infecção viral, na avaliação do estado clínico do paciente e na utilização de terapêutica específica. As importantes descobertas realizadas nas áreas da virologia e da biologia molecular desses vírus, nos últimos anos, foram progressivamente sendo incorporados à rotina diária dos laboratórios de patologia clínica, permitindo aos profissionais da área de saúde acesso às modernas técnicas capazes de avaliar a carga viral presente no indivíduo, o índice de replicação do agente infeccioso e a eficácia de novas medicações utilizadas no tratamento dessa virose. O HBsAg é uma glicoproteína antigênica exposta na superfície do envelope do HBV cuja presença no soro do paciente indica uma infecção ativa . Capaz de ativar uma resposta imunológica, o HBsAg é utilizado na confecção de vacinas e Kits diagnósticos. Este trabalho descreve a construção de um baculovírus recombinante contendo o gene do antígeno HBsAg de HBV fusionado ao gene da poliedrina do Autographa californica multicapsid nucleopolyhedrovirus (AcMNPV). O vírus reecombinante foi usado para infectar células de insetos e insetos e sua expressão analisada por SDS-PAGE. A proteina recombinante foi expressa em grande quantidade, purificada por centrifugação em gradiente de sacarose e usada como antígeno em um teste de diagnóstico comumente utilizado em latoratórios clínicos. A proteina recombinante foi reconhecida pelo soro de pacientes infectados pelo HBV e desta forma, possui potencial para ser usada em testes de diagnóstico dessa importante doença viral humana. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Viral hepatitis are diseases caused by different etiologic agents, that have worldwide distribution and have in common hepatotropism. Worldwide, hepatitis A and B remains a major public health problem . The World Health Organization (WHO) estimates that 170 million people are infected with hepatitis C virus (HCV) and 300 million are living with hepatitis B virus (HBV). Hepatitis B is classified in the Hepadnavirus family, contains commun features such as tropism for liver cells and its genetic material consists of a partial double stranded DNA molecule. The diagnosis of a clinical form of hepatitis B is carried out by serological techniques. These techniques are not only important for diagnosis but are also very useful in monitoring viral infection, in assessing the patient's clinical status and in the use of specific therapy. Important developments derived from research in virology and molecular biology of these viruses in recent years, have gradually been incorporated into the daily routine of clinical pathology laboratories, allowing healthcare professionals to access modern techniques to evaluate the viral load present the individual, the replication of the infectious agent and effectiveness of new medications used to treat this viral infection. HBsAg is a glycoprotein antigen exposed on the surface of the envelope of HBV, whose presence in the serum of the patient indicates an active infection. HBSAg is able to activate a human immune response and is used in the production of vaccines and diagnostic kits. This work shows the construction of a recombinant baculovirus containing the HBsAg gene (from HBV) fused to the polyhedrin gene of the Autographa californica multicapsid Nucleopolyhedrovirus virus (AcMNPV). The recombinant virus was used to infect insect cells and insects and the expression of the recombinant protein was analysed by SDS-PAGE. The recombinant protein was highly expressed, purified by sucrose gradient centrifugation, and used as antigen in a diagnostic test commonly used in clinical laboratories m(ELISA). The recombinant protein was shown to be recognized by serum of HBV-infected patients and therefore, have the potential to be used in diagnosis of this important human viral disease.
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Estabelecimento de um sistema de genética reversa para Pepper mild mottle virus e uso da capa proteica como apresentador de epítopos

Junqueira, Bruna Rayane Teodoro 28 February 2014 (has links)
Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2014. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2014-04-28T15:56:09Z No. of bitstreams: 1 2014_BrunaRayaneTeodoroJunqueira.pdf: 3067398 bytes, checksum: 8b5b8fc5895525f6b62933ad8fa85832 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2014-04-29T11:49:00Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_BrunaRayaneTeodoroJunqueira.pdf: 3067398 bytes, checksum: 8b5b8fc5895525f6b62933ad8fa85832 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-04-29T11:49:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_BrunaRayaneTeodoroJunqueira.pdf: 3067398 bytes, checksum: 8b5b8fc5895525f6b62933ad8fa85832 (MD5) / Pepper mild mottle virus (PMMoV) é um tobamovírus que possui genoma de RNA de fita simples com polaridade positiva. O vírion é composto pelo genoma envolvido por múltiplas cópias da proteína do capsídeo (CP). A fim de construir clones infectivos de PMMoV para desenvolver vetor de expressão de proteína heteróloga, duas estratégias simplificadas foram avaliadas, a primeira baseada na produção in vitro de transcritos infectivos e a segunda com o uso de vetor binário para agroinoculação. Primeiramente, o cDNA de PMMoV foi clonado no vetor pCR4-TOPO e, posteriormente, subclonado em pUC19, sob o comando do promotor T7 para a realização da transcrição in vitro. Os transcritos foram inoculados em folhas de Nicotiana benthamiana e após três semanas mostraram sintomas de mosaico e distorção foliar, indicações diretas da recuperação do vírus com este procedimento. A recuperação de vírus e infecção foi confirmada por DIBA usando anticorpo policlonal anti-PMMoV e microscopia eletrônica de transmissão. A segunda estratégia consistiu na clonagem do genoma no vetor binário derivado de pTRV2-MCS contendo o plasmídeo pCAMBIA 0390 modificado, pela técnica de overlap-extension PCR. A clonagem foi confirmada a partir da análise do padrão de digestão por enzima de restrição e sequenciamento. Agrobacterium tumefaciens foi transformada com a construção pCAMBIAPMMoV e folhas de N. benthamiana foram inoculadas para avaliar a recuperação do vírus. As plantas agroinoculadas apresentaram sintomas típicos de PMMoV em folhas inoculadas e folhas acima. A infecção foi confirmada por DIBA usando anticorpo policlonal anti-PMMoV. A possibilidade da adição de epítopos na capa proteica do vírus como ferramenta biotecnológica foi avaliada, inserindo genes de epítopo do vírus da dengue no clone agroinfectivo. Essa estratégia poderá fornecer uma ferramenta de apresentação de epítopos na superfície da CP em partículas montadas de PMMoV em grande escala. Um peptídeo de 24 aminoácidos contendo dois epítopos em tandem localizado nos domínios I/II da proteína E de DENV-1 foi inserido em duas posições distintas no gene cp: um entre os aminoácidos 59/60 e outro entre os aminoácidos 154/155. Após a inoculação, não apareceram sintomas de PMMoV e não foi possível detectar CP modificada em ambas as construções, apesar da confirmação dos clones por sequenciamento. Provavelmente a adição de 24 aminoácidos em cp interferiu no padrão de dobramento e na sua propriedade de automontagem. O tamanho do epítopo para display deverá ser avaliado no futuro. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Pepper mild mottle virus (PMMoV) is a tobamovirus and consists of a monopartite single-stranded RNA genome in a positive polarity. The virion forms nucleoproteins in rodshaped rigid particles. Aiming to construct infectious PMMoV clones for expressing heterologous proteins, two distinct, strategies were attempted. The first strategy was based on in vitro infectious transcripts and the second on binary vector for agro-infiltration. The cDNA of PMMoV was cloned into pCR4-TOPO and subcloned into pUC19 under the T7 promoter for in vitro transcription. Transcripts were inoculated in Nicotiana benthamiana leaves. After three weeks plants showed typical PMMoV symptoms, such as mosaic and distortion. The virus recovery, hence infection, was confirmed by DIBA using polyclonal antibody raised against PMMoV and electron microscopy. The PMMoV complete genome and the binary plasmid, derived from pTRV2-MCS (modified pCAMBIA 0390) were fused by overlapextension PCR. Selected clones were confirmed by restriction digestion profile and DNA sequencing. N. benthamiana plants were agroinoculated with A. tumefaciens harvesting pCAMBIA-PMMoV clones. Plants showed symptoms similar to those from wild type virus both in inoculated and upper leaves. Infection was confirmed by DIBA. The use of coat protein as epitope display platform tool was evaluated by inserting an epitope from Dengue virus 1 in the agroinfectious clone pCAMBIA-PMMoV. This strategy can be applied for epitope display on the CP surface in PMMoV particles in large scale. A peptide of 25 amino acids containing two epitopes in tandem (domains I/II E protein from DENV-1) was inserted in two different positions in the cp gene; between amino acids 59/60 and 154/155. After agroinoculation it was not possible to detect CP carrying the epitope in both constructions, however DNA sequencing confirmed the epitope presence. Probably the 25-amino acid insertion in the cp gene led to incorrect CP folding and to unfavorable self-assembly. The epitope length will be evaluated for future display studies.
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Estudo genético, imunológico e parasitológico das infecções pelo Trypanosoma cruzi em famílias do estado do Pará, Brasil

Araújo, Perla Fabíola de 20 December 2012 (has links)
Tese (Doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2012. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2013-06-12T16:14:53Z No. of bitstreams: 1 2012_PerlaFabiolaAraujo.pdf: 2398314 bytes, checksum: 643aa548a229087115e257fc8fc91617 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2013-06-13T12:56:17Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_PerlaFabiolaAraujo.pdf: 2398314 bytes, checksum: 643aa548a229087115e257fc8fc91617 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-06-13T12:56:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_PerlaFabiolaAraujo.pdf: 2398314 bytes, checksum: 643aa548a229087115e257fc8fc91617 (MD5) / A primeira microepidemia pelo Trypanosoma cruzi na Amazônia brasileira foi publicada em 1969 e, desde então, outras têm sido observadas em famílias residentes em vários municípios dos Estados daquela região. Em 2007 e 2009 foram identificados casos clínicos de doença de Chagas aguda (DCA) em famílias dos municípios de Barcarena e Breves, Estado do Pará. Este estudo mostrou anticorpos da classe IgG contra antígenos do T. cruzi em 35,7% (39/109) das pessoas, sendo 29,5% (13/44), 26,6% (4/15), 20,6% (6/29), respectivamente, das famílias A, B, e C residentes no município de Barcarena, e em 76,1% (16/21) da família D do município de Breves; em 66,6% (14/21) dos casos dessa família foram identificados anticorpos IgM anti-T. cruzi. Os resultados de PCR com iniciadores de nDNA do parasito foram positivos em 76,1% (83/109) dos casos: Família A, 77,2%; B, 100%; C, 75,8% e D, 57,1%. De grande interesse, em 21 casos de DCA o exame parasitológico positivo foi convalidado pela PCR com iniciadores de nDNA de T. cruzi. Ademais, nas células germinativas do sêmen foi confirmada infecção ativa pelo T. cruzi, também presente nas células somáticas do sangue, pela PCR com iniciadores específicos de nDNA e kDNA. Adicionalmente, 16,5% (18/109) casos positivos apenas para kDNA, sem a infecção ativa, retiveram seqüências de minicírculos integradas no genoma. Nesses 18 casos as mutações de kDNA foram transferidas para as progênies pela reprodução sexuada. Com esse respeito, a diferença de 53% (44/83) entre os resultados obtidos pela PCR para nDNA e aqueles dos testes imunológicos contra antígenos de T. cruzi tem importância epidemiólogica ainda não apreciada em outra investigação. Pois, a presença de nDNA e kDNA foi encontrada na ausência de anticorpos contra antígenos de T. cruzi nos hospedeiros tolerantes aos antígenos do parasito. Ademais, em todos esses casos de infecção ativa também ocorreu transferência vertical de seqüências de minicírculos de kDNA do T. cruzi pela reprodução sexuada e as mutações foram prontamente identificadas no genoma humano. Então, a larga diferença entre os resultados de testes imunológicos e de PCR pode ser explicada pela aquisição da infecção via sexual ou transplacentária, durante a fecundação ou na fase inicial da gestação, antes do desenvolvimento do sistema imune do embrião, e o indivíduo nasce tolerante aos antígenos de T. cruzi. As mutações de kDNA foram identificadas nos cromossomos, e o principal sítio de integração foi retrotransposon LINE-1 em 70% (301/430) das quimeras identificadas. Em 83,3% (50/60) dos casos as mutações ocorreram no gene do receptor olfatório OR1-17, e em apenas 16,6% (10/60) foram encontradas em genes com outras funções reconhecidas. O achado mais relevante neste estudo foi a documentação de transmissão do kDNA e do nDNA do T. cruzi pela reprodução sexuada. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / By 1969, a microepidemic of Trypanosoma cruzi was recognized in the Brazilian Amazonia, and lately they have been constantly reported in families from several counties in the region. By 2007 and 2009, clinical cases of acute Chagas disease were identified in families living in counties of Barcarena and Breves, Estado do Pará. The exams revealed IgG antibodyes against T. cruzi antígens in 35,7% (39/109) cases of the study population: Family A, 29,5% (13/44); B, 26,6% (4/15); C, 20,6% (6/29) of Barcarena county, and Family D, 76,1% (16/21) of Breves; Anti-T. cruzi IgM antibody was identified in 66,6% (14/21) of family D cases. The PCR assays with specific nDNA primer sets yielded positive results in 76,1% (83/109) cases: Family A, 77,2%; B, 100%; C, 75,8%; and D, 57,1%. Of interest, 21 cases showing symptoms of acute Chagas disease had parasitologic demonstration of T. cruzi and these were convalidated by the PCR assays with nDNA primer sets. Moreover, germline cells from male gametes showed T. cruzi nDNA and kDNA as well as somatic mononuclear cells from blood. Additionally, 16,5% (18/109) of kDNA positive cases in absence of active infection retained the minicircle sequences in the genome. In these cases the kDNA mutations were vertically transfered to progenie by sexual reproduction. With this respect, the reported differences 53% (44/83) between results of antibody assays and those obtained by PCR with primer sets to T. cruzi nDNA have broad epidemiologic importance not yet reported by previous investigation. The presence of nDNA and kDNA was documented in the absence of antibody against T. cruzi antigens in hosts’ immue tolerant to the parasite antigens. Furthermore, vertical transfer of T. cruzi minicircle occurs by sexual reproduction in every case nDNA and kDNA are present in the course of an active infection. Insofar, the reported differences herein can be explained by the acquisition of the infection during fecundation or in the early gestational period, via sexual transmissão or transplacenta from mother to offspring before embryo immune system development; and the newborn becomes tolerant to T. cruzi antigens. The kDNA mutations were identified in several chromosomes, and the main integration hotspot was LINE-1 in 70% (301/430) cases. The mutations entered at the olfactory ORI-17 gene in (50/60) cases (83,3%) and in (10/60) cases (16,6%) they were found in genes with annotated functions. A highly relevant finding in this study was the documentation of transmission of kDNA, and of nDNA from T. cruzi active infection by sexual reproduction.
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Prevalência do antígeno criptocócico utilizando Lateral Flow Assay (LFA) no screening de pacientes com HIV/AIDS

Machado, Herion Alves da Silva January 2015 (has links)
Made available in DSpace on 2016-06-23T12:19:34Z (GMT). No. of bitstreams: 2 herion_machado_ioc_mest_2015.pdf: 993243 bytes, checksum: 1c7e0c3122970a0c01e9ff3253f900c4 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015 / Made available in DSpace on 2016-07-05T23:52:48Z (GMT). No. of bitstreams: 3 herion_machado_ioc_mest_2015.pdf.txt: 114168 bytes, checksum: 0b16d652e923152bc1715e232dfbbe05 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) herion_machado_ioc_mest_2015.pdf: 993243 bytes, checksum: 1c7e0c3122970a0c01e9ff3253f900c4 (MD5) Previous issue date: 2015 / Instituto de Doenças Tropicais Natan Portela. Teresina, PI, Brasil / Meningite criptocócica causa aproximadamente 15% da mortalidade relacionada com a AIDS anualmente. A Criptococose é uma enfermidade negligenciada. Contudo, pode ser prevenida pela realização do screening através da pesquisa do Antígeno Criptocócico(CrAg) e de tratamento precoce durante um longo período de detecção ou infecção subclínica. Nosso estudo determinou a prevalência da antigenemia criptocócica levando em consideração níveis de linfócitos CD4 e sintomas clínicos. MÉTODOS: Ao todo, 109 pacientes com HIV/AIDS, consentiram em participar deste estudo. Inicialmente, fez-se um levantamento de dados sócio- demográficos dos mesmos, além dos dados clínicos contidos no prontuário. A pesquisa de antígeno criptocócico utilizando Lateral Flow Assay( CrAg/LFA) no sangue e urina foi realizado em todos os pacientes inclusos no estudo, independente dos níveis de linfócitos CD4. Para os que apresentaram CrAg positivo em sangue e urina, foram submetidos a punção lombar para avaliação de CrAg no líquor RESULTADOS: Dos 109 pacientes, 67% eram do sexo masculino, 92% eram provenientes da área urbana e 76% eram procedentes do estado do Piauí. A média de idade foi de 35 anos, sendo 57% com idade entre 31-45 anos de idade. Cerca de 49,5% faziam uso irregular da terapia antirretroviral (TARV), 18% usavam corretamente a TARV e 32,5% eram virgens de tratamento. A prevalência de antigenemia criptocócica, foi de 8,2%. Daqueles pacientes com CrAg no sangue e urina positivos, em 3,6 % apresentava-se com CD4< 100 cél/mm3, 58,7% com CD4 100-199 cel/mm3 e 37,7% com CD4 \2265 200 cel/mm3. Os sintomas mais comuns nos pacientes com CrAg positivo foram cefaleia, febre e vômitos. CONCLUSÃO: O CrAg/LFA permite um exame simples, rápido e de baixo custo para o diagnóstico da criptococose e é recomendado para uso com soro, plasma, urina ou líquor em pacientes sintomáticos. O uso adequado da terapia antirretroviral contribui para uma redução da morbimortalidade dos pacientes com HIV/AIDS. Além disso, CrAg/LFA tem o potencial para identificar pacientes com infecção assintomática quem devem receber fluconazol profilático / Annually, cryptococcal meningitis causes approximately 15% of deaths related to AIDS. The cryptococcosis is a neglected disease. Nevertheless, it can be prevented by performing the screening by means of investigating the cryptococcal antigen (CrAg) and early treatment for a long period of detection or subclinical infection. Our study determined the prevalence of cryptococcal antigenemia taking into account the levels of CD4 lymphocytes and clinical symptoms. METHODS: All together, 109 patients with HIV / AIDS, agreed to participate in this study. Initially, there was a survey of patients\2019 socio-demographic data, in addition to clinical data from the medical record. The cryptococcal antigen test using Lateral Flow Assay (CrAg / LFA) in blood and urine was carried out in all patients included in the study, regardless of CD4 lymphocyte levels. Those who were CrAg positive for blood and urine underwent a lumbar puncture for CrAg assessment in the fluid RESULTS: From the 109 patients, 67% were male, 92% were from urban areas and 76% were from the state of Piauí. The average age was 35 years, 57% aged between 31-45 years old. About 49.5% made irregular use of antiretroviral therapy (ART), 18% correctly used the ART and 32.5% were treatment-naïve patients. The prevalence of cryptococcal antigenemia was 8.2%. From the patients tested positive for CrAg for blood and urine, 3.6% had CD4 < 100 cells/mm³, 58.7% had CD4 100-199 cells/mm³ and 37.7% had CD4 \2265 200 cells/mm³. The most common symptoms in patients with CrAg positive were headaches, fever and vomiting. CONCLUSION: CrAg / LFA allows a simple, fast and low cost test for the diagnosis of cryptococcosis and is recommended for use with serum, plasma, urine or fluid in symptomatic patients. The correct use of the antiretroviral therapy contributes to a reduction in morbidity and mortality of HIV / AIDS patients. Furthermore, CrAg / LFA have the potential to identify patients with asymptomatic infection who must receive prophylactic fluconazole
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Seleção de peptídeos miméticos do epítopo reconhecido por anticorpos terapêuticos contra o antígeno CD3 humano

Nunes, Ana Paula Costa Athayde 03 August 2018 (has links)
Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2018. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES). / O CD3 como alvo terapêutico de anticorpos, pode induzir a depleção parcial dos linfócitos T circulantes, provocando uma imunossupressão, que pode ser explorada clinicamente. Com isso, a busca por anticorpos anti-CD3 humanizados tem relevância biotecnológica. Entretanto, o CD3 é um antígeno de membrana de difícil preparação. Desse modo, procuramos obter um antígeno mimético ao CD3 que se ligue com alta afinidade a um anticorpo conhecidamente imunomodulador, o anticorpo monoclonal OKT3, de forma a facilitar a busca de novos anticorpos terapeuticos. Para isso utilizou-se o biopanning, por phage display, para selecionar peptídeos ligantes, a partir de uma biblioteca de peptídeos randômicos constrita de sete resíduos, PhDC7C (Biolabs). Um protocolo de seleção baseado em seleção negativa com IgG2a de camundongo, seguido de três ciclos sucessivos de seleção positiva. Para validação desses biopanning foi feita a titulação dos ciclos comparando-os a uma curva padrão, usando a biblioteca original amplificada por PCR, que foi utilizada para normalizar a quantidade de DNA. Foram obtidas sub-bibliotecas com um título em torno de 106 pfu/mL. Essas sub-bibliotecas foram analisadas por sequenciamento de DNA de alto desempenho e por bioinformática em busca de peptídeos selecionados especificamente pelo paratopo do anticorpo OKT3, um anti-CD3. Com a análise de bioinformática foi permitido à comparação das sequencias obtidas aos bancos de dados, existentes. Assim, foram excluídos, os peptídeos conhecidamente resultante de seleção inespecífica. Em conclusão, não foi possível encontrar um peptídeo ligante ao alvo de interesse. Provavelmente o viés encontrado na biblioteca, interferiu no sucesso da técnica, mas modificações no protocolo de seleção deverão ser considerados na seleção de peptídeos ligantes, que sirvam de mimotopos. / Anti-CD3 antibodies, a target for antibody therapy, may induce partial depletion of circulating T lymphocytes, causing immunosuppression, which can be explored clinically. Thus, a search for humanized anti-CD3 antibodies has a biotechnological relevance. However, CD3 is a difficult-to-prepare membrane antigen. Thus, we aim to obtain a CD3 antigen mimetic that binds with high affinity to a known immunomodulatory anti-CD3, the mouse monoclonal antibody OKT3. We use a seven-residue, phage display peptide library PhDC7C (Biolabs) to select for OKT3 mAb ligands peptides. The screening involves a negative selection with mouse IgG2a and three successive positive selection cycles. The validation of biopanning was done with PCR, which was used to quantify the amount of DNA. Sub-libraries with a titer of about 106 pfu / ml were obtained. These sub-libraries were analyzed by high-throughput DNA sequencing and by bioinformatics in search peptides selected specifically for the paratope of the OKT3 molecule. With a bioinformatics analysis it was possible to compare the sequences with the existing databases. Thus, peptides known as non-specific binding were excluded. However, a peptide binding to the target of interest could not be found. Further improvement in selection techinique may yield to specific OKT3 binding mimotopes.

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