O ATP extracelular atua como um mediador pró-inflamatório e a adenosina tem sido descrita por suas propriedades anti-inflamatórias. O papel desse nucleosídeo no controle da inflamação ocorre principalmente via receptores A2A. As ecto-enzimas responsáveis pelo controle dos níveis de nucleotídeos e nucleosídeos extracelulares são as ectonucleotidases. Esse grupo de ecto-enzimas é composto pela família das ecto-nucleosídeo trifosfato difosfoidrolases (E-NTPases), a família das ecto-nucleotídeo pirofosfatase/fosfodiesterases (E-NPP) e pela ecto-5'-nucleotidase. Considerando o papel que os nucleotídeos e nucleosídeos exercem durante eventos inflamatórios, e a importância das ectonucleotidases na manutenção dos seus níveis extracelulares, o objetivo deste trabalho foi investigar o efeito da indução do modelo de endotoxemia sobre as atividades ectonucleotidásicas em diferentes tipos e frações celulares. O envolvimento do receptor A2A sobre esses parâmetros também foi avaliado, através da utilização do agonista específico do receptor A2A, GCS-21680, no intuito de melhor compreender o envolvimento do sistema purinérgico no processo inflamatório. Para a indução do modelo de endotoxemia os ratos foram injetados intraperitonialmente (i.p.) com 2 mg/kg de LPS e os camundongos foram injetados i.p. com 12 mg/kg de LPS e/ou CGS-21680 (0,5 mg/kg, i.p.). As atividades ectonucleotidásicas foram determinadas em plaquetas de ratos, linfócitos de linfonodos mesentéricos de camundongos e preparações de membranas renais de camundongos. A análise da expressão das ectonucleotidases foi realizada através de RT-PCR. Os resultados demonstraram uma diminuição na hidrólise de ATP, ADP, AMP e 5'TMP em plaquetas de ratos após a indução da endotoxemia (28%, 28%, 30% e 26%, respectivamente). A contagem e a agregação plaquetária também foram diminuídas (40% e 55%, respectivamente). Em linfócitos de camundongos, houve um aumento na hidrólise de ATP, ADP, AMP e 5'TMP 24 horas após a injeção de LPS (178%, 111%, 207% e 62%, respectivamente) e 48 horas após a indução do modelo (135%, 178%, 121% e 116%, respectivamente). Quando o agonista do receptor A2A de adenosina, CGS-21680, foi co-administrado com o LPS, esse aumento foi revertido para as hidrólises de ATP, AMP e 5'-TMP. Em membranas renais de camundongos, os resultados demonstraram um aumento na hidrólise de ATP e 5'-TMP 48 horas após a injeção de LPS (48% e 47%, respectivamente) e a hidrólise do AMP foi diminuída 24 horas após a indução do modelo (40%). Os níveis extracelulares de ATP e adenosina foram diminuídos nos grupos tratados quando comparados ao controle em preparações de membranas renais. Os resultados deste trabalho indicam que as ectonucleotidases são moduladas pela endotoxemia em diferentes frações biológicas, sugerindo que as alterações observadas são conseqüência da resposta inflamatória. Em linfócitos esse efeito foi revertido pela ativação dos receptores A2A. Esses dados demonstram a interação cruzada entre a ativação dos receptores A2A de adenosina e as enzimas que modulam a produção do agonista desse receptor, bem como que a influência da ativação dos receptores A2A sobre as ectonucleotidases pode ser um dos mecanismos relacionados com as ações anti-inflamatórias e a resposta imune mediada por esse receptor. / Extracellular ATP mainly functions as a proinflammatory mediator and adenosine has been reported to exert anti-inflammatory properties. A role for this nucleoside in the control of inflammation has been suggested acting mainly on adenosine A2A receptors. The ecto-enzymes responsible for the control of extracellular nucleotides and nucleosides levels are ectonucleotidases. This group of ectoenzymes is composed by the ecto-nucleoside triphosphate diphosphohydrolase (E-NTPDase) family, the ecto-pyrophosphatase/phosphodiesterase (E-NPP) family and the ecto-5’-nucleotidase. Considering the roles that the nucleotides and nucleosides play during inflammatory events, and the importance of ectonucleotidases for the maintenance of extracellular levels of the former, we investigated the effect of endotoxemia model on ectonucleotidase activities in different cells and cellular fractions. The involvement of A2A receptor under these parameters was also analyzed, utilizing CGS-21680, a specific A2A receptor agonist, in order to better understand the involvement of purinergic system in this process. For endotoxemia model induction, rats were injected intraperitoneally (i.p.) with 2 mg/kg LPS and mice were injected with 12 mg/kg and/or 0.5 mg/kg CGS-21680. Nucleotidase activities were determined in rat platelets, mice lymphocytes from mesenteric lymph nodes and mice kidney membrane preparations. Analysis of ectonucleotidase expression was carried out by a semi-quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) assay. Results demonstrated a decrease on ATP, ADP, AMP and 5'TMP hydrolysis in rat platelets (28%, 28%, 30% and 26%, respectively), platelet account and aggregation (40% and 55%, respectively) after induction of endotoxemia model. In mice lymphocytes, we observed an increase in ATP, ADP, AMP and 5'TMP hydrolysis 24 hours after LPS injection (178%, 111%, 207% and 62%, respectively) and 48 hours after LPS injection (135%, 178%, 121% and 116%, respectively). When CGS-21680 was administered concomitant with LPS, this increase was reversed for ATP, AMP and 5'-TMP hydrolysis. In kidney membrane preparations of mice, results showed an increase on ATP and 5'-TMP hydrolysis 48 hours after LPS injection (48% and 47%, respectively) and 24 hours after LPS exposure there was a decrease on AMP hydrolysis (40%). The extracellular levels of ATP and adenosine were decrease in treated groups in kidney membrane preparations. These results indicate that endotoxemia modulates ectonucleotidases in different biological fractions, suggesting that these alterations are consequence of inflammatory response. The effect promoted by CGS-21680 in lymphocytes indicates a cross-talk between the A2A activation and the enzymes responsible for adenosine generation, but also that the influence of A2A receptor activation on ectonucleotidases might be one of the mechanisms related with its anti-inflammatory properties.

O ATP extracelular atua como um mediador pró-inflamatório e a adenosina tem sido descrita por suas propriedades anti-inflamatórias. O papel desse nucleosídeo no controle da inflamação ocorre principalmente via receptores A2A. As ecto-enzimas responsáveis pelo controle dos níveis de nucleotídeos e nucleosídeos extracelulares são as ectonucleotidases. Esse grupo de ecto-enzimas é composto pela família das ecto-nucleosídeo trifosfato difosfoidrolases (E-NTPases), a família das ecto-nucleotídeo pirofosfatase/fosfodiesterases (E-NPP) e pela ecto-5'-nucleotidase. Considerando o papel que os nucleotídeos e nucleosídeos exercem durante eventos inflamatórios, e a importância das ectonucleotidases na manutenção dos seus níveis extracelulares, o objetivo deste trabalho foi investigar o efeito da indução do modelo de endotoxemia sobre as atividades ectonucleotidásicas em diferentes tipos e frações celulares. O envolvimento do receptor A2A sobre esses parâmetros também foi avaliado, através da utilização do agonista específico do receptor A2A, GCS-21680, no intuito de melhor compreender o envolvimento do sistema purinérgico no processo inflamatório. Para a indução do modelo de endotoxemia os ratos foram injetados intraperitonialmente (i.p.) com 2 mg/kg de LPS e os camundongos foram injetados i.p. com 12 mg/kg de LPS e/ou CGS-21680 (0,5 mg/kg, i.p.). As atividades ectonucleotidásicas foram determinadas em plaquetas de ratos, linfócitos de linfonodos mesentéricos de camundongos e preparações de membranas renais de camundongos. A análise da expressão das ectonucleotidases foi realizada através de RT-PCR. Os resultados demonstraram uma diminuição na hidrólise de ATP, ADP, AMP e 5'TMP em plaquetas de ratos após a indução da endotoxemia (28%, 28%, 30% e 26%, respectivamente). A contagem e a agregação plaquetária também foram diminuídas (40% e 55%, respectivamente). Em linfócitos de camundongos, houve um aumento na hidrólise de ATP, ADP, AMP e 5'TMP 24 horas após a injeção de LPS (178%, 111%, 207% e 62%, respectivamente) e 48 horas após a indução do modelo (135%, 178%, 121% e 116%, respectivamente). Quando o agonista do receptor A2A de adenosina, CGS-21680, foi co-administrado com o LPS, esse aumento foi revertido para as hidrólises de ATP, AMP e 5'-TMP. Em membranas renais de camundongos, os resultados demonstraram um aumento na hidrólise de ATP e 5'-TMP 48 horas após a injeção de LPS (48% e 47%, respectivamente) e a hidrólise do AMP foi diminuída 24 horas após a indução do modelo (40%). Os níveis extracelulares de ATP e adenosina foram diminuídos nos grupos tratados quando comparados ao controle em preparações de membranas renais. Os resultados deste trabalho indicam que as ectonucleotidases são moduladas pela endotoxemia em diferentes frações biológicas, sugerindo que as alterações observadas são conseqüência da resposta inflamatória. Em linfócitos esse efeito foi revertido pela ativação dos receptores A2A. Esses dados demonstram a interação cruzada entre a ativação dos receptores A2A de adenosina e as enzimas que modulam a produção do agonista desse receptor, bem como que a influência da ativação dos receptores A2A sobre as ectonucleotidases pode ser um dos mecanismos relacionados com as ações anti-inflamatórias e a resposta imune mediada por esse receptor. / Extracellular ATP mainly functions as a proinflammatory mediator and adenosine has been reported to exert anti-inflammatory properties. A role for this nucleoside in the control of inflammation has been suggested acting mainly on adenosine A2A receptors. The ecto-enzymes responsible for the control of extracellular nucleotides and nucleosides levels are ectonucleotidases. This group of ectoenzymes is composed by the ecto-nucleoside triphosphate diphosphohydrolase (E-NTPDase) family, the ecto-pyrophosphatase/phosphodiesterase (E-NPP) family and the ecto-5’-nucleotidase. Considering the roles that the nucleotides and nucleosides play during inflammatory events, and the importance of ectonucleotidases for the maintenance of extracellular levels of the former, we investigated the effect of endotoxemia model on ectonucleotidase activities in different cells and cellular fractions. The involvement of A2A receptor under these parameters was also analyzed, utilizing CGS-21680, a specific A2A receptor agonist, in order to better understand the involvement of purinergic system in this process. For endotoxemia model induction, rats were injected intraperitoneally (i.p.) with 2 mg/kg LPS and mice were injected with 12 mg/kg and/or 0.5 mg/kg CGS-21680. Nucleotidase activities were determined in rat platelets, mice lymphocytes from mesenteric lymph nodes and mice kidney membrane preparations. Analysis of ectonucleotidase expression was carried out by a semi-quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) assay. Results demonstrated a decrease on ATP, ADP, AMP and 5'TMP hydrolysis in rat platelets (28%, 28%, 30% and 26%, respectively), platelet account and aggregation (40% and 55%, respectively) after induction of endotoxemia model. In mice lymphocytes, we observed an increase in ATP, ADP, AMP and 5'TMP hydrolysis 24 hours after LPS injection (178%, 111%, 207% and 62%, respectively) and 48 hours after LPS injection (135%, 178%, 121% and 116%, respectively). When CGS-21680 was administered concomitant with LPS, this increase was reversed for ATP, AMP and 5'-TMP hydrolysis. In kidney membrane preparations of mice, results showed an increase on ATP and 5'-TMP hydrolysis 48 hours after LPS injection (48% and 47%, respectively) and 24 hours after LPS exposure there was a decrease on AMP hydrolysis (40%). The extracellular levels of ATP and adenosine were decrease in treated groups in kidney membrane preparations. These results indicate that endotoxemia modulates ectonucleotidases in different biological fractions, suggesting that these alterations are consequence of inflammatory response. The effect promoted by CGS-21680 in lymphocytes indicates a cross-talk between the A2A activation and the enzymes responsible for adenosine generation, but also that the influence of A2A receptor activation on ectonucleotidases might be one of the mechanisms related with its anti-inflammatory properties.

O ATP extracelular atua como um mediador pró-inflamatório e a adenosina tem sido descrita por suas propriedades anti-inflamatórias. O papel desse nucleosídeo no controle da inflamação ocorre principalmente via receptores A2A. As ecto-enzimas responsáveis pelo controle dos níveis de nucleotídeos e nucleosídeos extracelulares são as ectonucleotidases. Esse grupo de ecto-enzimas é composto pela família das ecto-nucleosídeo trifosfato difosfoidrolases (E-NTPases), a família das ecto-nucleotídeo pirofosfatase/fosfodiesterases (E-NPP) e pela ecto-5'-nucleotidase. Considerando o papel que os nucleotídeos e nucleosídeos exercem durante eventos inflamatórios, e a importância das ectonucleotidases na manutenção dos seus níveis extracelulares, o objetivo deste trabalho foi investigar o efeito da indução do modelo de endotoxemia sobre as atividades ectonucleotidásicas em diferentes tipos e frações celulares. O envolvimento do receptor A2A sobre esses parâmetros também foi avaliado, através da utilização do agonista específico do receptor A2A, GCS-21680, no intuito de melhor compreender o envolvimento do sistema purinérgico no processo inflamatório. Para a indução do modelo de endotoxemia os ratos foram injetados intraperitonialmente (i.p.) com 2 mg/kg de LPS e os camundongos foram injetados i.p. com 12 mg/kg de LPS e/ou CGS-21680 (0,5 mg/kg, i.p.). As atividades ectonucleotidásicas foram determinadas em plaquetas de ratos, linfócitos de linfonodos mesentéricos de camundongos e preparações de membranas renais de camundongos. A análise da expressão das ectonucleotidases foi realizada através de RT-PCR. Os resultados demonstraram uma diminuição na hidrólise de ATP, ADP, AMP e 5'TMP em plaquetas de ratos após a indução da endotoxemia (28%, 28%, 30% e 26%, respectivamente). A contagem e a agregação plaquetária também foram diminuídas (40% e 55%, respectivamente). Em linfócitos de camundongos, houve um aumento na hidrólise de ATP, ADP, AMP e 5'TMP 24 horas após a injeção de LPS (178%, 111%, 207% e 62%, respectivamente) e 48 horas após a indução do modelo (135%, 178%, 121% e 116%, respectivamente). Quando o agonista do receptor A2A de adenosina, CGS-21680, foi co-administrado com o LPS, esse aumento foi revertido para as hidrólises de ATP, AMP e 5'-TMP. Em membranas renais de camundongos, os resultados demonstraram um aumento na hidrólise de ATP e 5'-TMP 48 horas após a injeção de LPS (48% e 47%, respectivamente) e a hidrólise do AMP foi diminuída 24 horas após a indução do modelo (40%). Os níveis extracelulares de ATP e adenosina foram diminuídos nos grupos tratados quando comparados ao controle em preparações de membranas renais. Os resultados deste trabalho indicam que as ectonucleotidases são moduladas pela endotoxemia em diferentes frações biológicas, sugerindo que as alterações observadas são conseqüência da resposta inflamatória. Em linfócitos esse efeito foi revertido pela ativação dos receptores A2A. Esses dados demonstram a interação cruzada entre a ativação dos receptores A2A de adenosina e as enzimas que modulam a produção do agonista desse receptor, bem como que a influência da ativação dos receptores A2A sobre as ectonucleotidases pode ser um dos mecanismos relacionados com as ações anti-inflamatórias e a resposta imune mediada por esse receptor. / Extracellular ATP mainly functions as a proinflammatory mediator and adenosine has been reported to exert anti-inflammatory properties. A role for this nucleoside in the control of inflammation has been suggested acting mainly on adenosine A2A receptors. The ecto-enzymes responsible for the control of extracellular nucleotides and nucleosides levels are ectonucleotidases. This group of ectoenzymes is composed by the ecto-nucleoside triphosphate diphosphohydrolase (E-NTPDase) family, the ecto-pyrophosphatase/phosphodiesterase (E-NPP) family and the ecto-5’-nucleotidase. Considering the roles that the nucleotides and nucleosides play during inflammatory events, and the importance of ectonucleotidases for the maintenance of extracellular levels of the former, we investigated the effect of endotoxemia model on ectonucleotidase activities in different cells and cellular fractions. The involvement of A2A receptor under these parameters was also analyzed, utilizing CGS-21680, a specific A2A receptor agonist, in order to better understand the involvement of purinergic system in this process. For endotoxemia model induction, rats were injected intraperitoneally (i.p.) with 2 mg/kg LPS and mice were injected with 12 mg/kg and/or 0.5 mg/kg CGS-21680. Nucleotidase activities were determined in rat platelets, mice lymphocytes from mesenteric lymph nodes and mice kidney membrane preparations. Analysis of ectonucleotidase expression was carried out by a semi-quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) assay. Results demonstrated a decrease on ATP, ADP, AMP and 5'TMP hydrolysis in rat platelets (28%, 28%, 30% and 26%, respectively), platelet account and aggregation (40% and 55%, respectively) after induction of endotoxemia model. In mice lymphocytes, we observed an increase in ATP, ADP, AMP and 5'TMP hydrolysis 24 hours after LPS injection (178%, 111%, 207% and 62%, respectively) and 48 hours after LPS injection (135%, 178%, 121% and 116%, respectively). When CGS-21680 was administered concomitant with LPS, this increase was reversed for ATP, AMP and 5'-TMP hydrolysis. In kidney membrane preparations of mice, results showed an increase on ATP and 5'-TMP hydrolysis 48 hours after LPS injection (48% and 47%, respectively) and 24 hours after LPS exposure there was a decrease on AMP hydrolysis (40%). The extracellular levels of ATP and adenosine were decrease in treated groups in kidney membrane preparations. These results indicate that endotoxemia modulates ectonucleotidases in different biological fractions, suggesting that these alterations are consequence of inflammatory response. The effect promoted by CGS-21680 in lymphocytes indicates a cross-talk between the A2A activation and the enzymes responsible for adenosine generation, but also that the influence of A2A receptor activation on ectonucleotidases might be one of the mechanisms related with its anti-inflammatory properties.

O câncer de mama é um dos tumores malignos mais comuns e que afeta um grande número de mulheres da população mundial. O processo inflamatório gerado juntamente com o crescimento descontrolado das células tumorais promove um estresse metabólico no microambiente tumoral levando ao acúmulo de adenosina extracelular decorrente da hipóxia tecidual. A adenosina gerada e seus efeitos mediados via receptor A2A (A2AR) interfere em vários subtipos celulares. Neste trabalho, avaliamos o papel do receptor A2A na indução de uma resposta de células Th17 durante o carcinoma mamário experimental, visto que estas desempenham um importante papel no crescimento e na progressão do tumor de mama invasivo. Para isso, utilizamos o modelo de carcinoma mamário murino que desenvolve (4T-1) e o que não desenvolve metástase (67NR). Nossos resultados mostraram que o tumor mamário 4T-1 apresenta alta expressão do receptor A2A comparado com o tumor 67NR. A deficiência do receptor A2a preveniu o crescimento do tumor mamário 4T- 1 e de colônias de células tumorais em sítios secundários da doença, concomitante com a diminuição da resposta de perfil Th17 e do recrutamento de neutrófilos para o sitio primário. Ainda, que as células tumorais 4T-1 apresentaram uma alta expressão dos receptores de adenosina e das ectonucleotidases (CD73 e CD39), sugerindo que a via de sinalização de adenosina exerce um efeito direto nessas células. A administração de adenosina ou AMP (trifosfato de adenosina) em culturas de células tumorais 4T-1 induziu xvi um aumento da expressão de IL-6, CCL20 e CXCL1, mediadores importantes para o recrutamento de linfócitos T produtores de IL-17 e de neutrófilos. Além disso, durante o crescimento do tumor 4T-1, observamos uma alta expressão da enzima ciclooxigenase 2 (Cox-2) comparado com o tumor 67NR. No entanto, os animais deficientes geneticamente do receptor A2A apresentaram uma redução significativa da expressão de Cox-2 no microambiente tumoral comparados com os animais BALB/c. A inibição da enzima Cox-2 com indometacina ou celecoxicib (inibidor seletivo) em animais com tumor 4T-1 preveniu o crescimento do tumor primário e, consequentemente, resultou na redução da expressão de moléculas relacionadas como o perfil de resposta de células Th17 tais como IL-6, CCL20, IL-17A e Ror?t. Esses resultados indicam que o bloqueio da via de sinalização do receptor A2A interfere na indução de resposta de células Th17, abrindo novas perspectivas para o desenvolvimento de terapias alternativas para o controle de tumores invasivos / Breast cancer is one of the most common and aggressive malignant tumors, affecting a large number of women in the worldwide population. The inflammatory process generated along with the uncontrolled growth of tumor cells promotes metabolic stress in the tumor microenvironment leading to the accumulation of extracellular adenosine due to the generation of tissue hypoxia. The generated adenosine and its effects mediated by A2A (A2AR) interfere in several cell subtypes. In this study, we evaluated the role of A2A receptor in the induction of a Th17 cell response in experimental breast carcinoma, given that these cells play an important role in invasive breast tumor growth and progression. For this, we employed the murine mammary metastatic (4T-1) and nonmetastatic carcinoma (67NR) model. Our results showed that there is high expression of adenosine A2A receptor in breast tumor 4T-1 compared to 67NR. The A2AR deficiency prevented the growth of metastatic breast tumor 4T-1 and tumor cell colonies in secondary disease sites, together with a decrease in Th17 response profile and in the neutrophils recruitment to the primary site. The tumor cells 4T-1 presented high expression of adenosine receptors and ectonucleotidases (CD73 and CD39), suggesting that the adenosine signaling pathway has a direct effect on these cells. Adenosine or AMP (adenosine triphosphate) administration in tumoral 4T-1 cell cultures induced an increase in IL-6, CCL20 and CXCL1 expression, important mediators in the recruitiment of IL-17 producing T lymphocytes and neutrophils. Besides that, during 4T-1 tumor growth we observed high expression of cyclooxygenase 2 (Cox-2) compared to 67RN tumor. However A2A deficient mice showed a significative reduction in Cox-2 expression in tumoral microenvironment compared to BALB/c mice. Cox-2 inhibition with indometacine or celecoxib (selective inhibitor) in mice with 4T-1 tumor prevented primary tumor growth and, consequently, resulted in reduction of the expression of molecules related to the Th17 profile, as IL-6, CCL20, IL-17A and Ror?t. These results indicate that the blockade of the A2A signaling pathway interfere on the induction of Th17 cells response, opening new perspectives for the development of alternative therapies to the control of invasive tumors

Adenosina e óxido nítrico, importantes neuromoduladores endógenos, atuam modulando finamente o controle neural cardiovascular no núcleo de trato solitário (NTS). Embora se tenha conhecimento sobre a relação entre adenosina e NO periférica e centralmente, em particular, no bulbo, os mecanismos pelos quais a adenosina interfere na dinâmica da neurotransmissão nitrérgica, ainda não são totalmente conhecidos. Logo, alterações na interação entre esses sistemas podem ser especialmente relevantes para indivíduos predispostos à hipertensão. Dessa forma, os objetivos do presente estudo foram estudar a interação entre o sistema adenosinérgico e nitrérgico em culturas de células da porção dorsomedial do bulbo de ratos normotenso Wistar Kyoto (WKY) e espontaneamente hipertensos (SHR). Para tal, utilizou-se técnicas para quantificação dos níveis de nitrito, PCR em tempo real e RNA de interferência. Foi observada uma redução e um aumento concentração-dependente nos níveis de nitrito e do mRNA da nNOS induzido pelos agonistas dos receptores A1(A1R) e A2A(A>sub>2AR), CPA e CGS21680, respectivamente. Os efeitos nos níveis de nitrito foram atenuados pela administração dos antagonistas seletivos dos A1R e A2AR, CPT e ZM241385. Knockdown dos A1R e A2AR mostraram que a redução da expressão desses receptores aumentaram e diminuíram os níveis de expressão da nNOS, respectivamente. Pré-tratamento com o inibidor não seletivo da nNOS, L-NAME, aboliu os níveis aumentados de nitrito desencadeados pelo CGS21680 em células de WKY e SHR. Por fim, é mostrado que a via cAMP-PKA está envolvida na sinalização que deflaga tantos os níveis reduzidos de nitrito, via A1R, quantos os níveis aumentados de nitrito, via A2AR, em culturas de WKY e SHR. Em síntese, nossos resultados destacam a influência da adenosina sobre a síntese de NO em culturas de células da porção dorsomedial do bulbo de ratos WKY e SHR. Pelo menos em parte, o perfil modulatório é diferenciado em ratos SHR / Adenosine and nitric oxide, important endogenous neuromodulators, act on the fine tuning regulation of neural cardiovascular control in the nucleus tractus solitarius (NTS). Although the relationship between adenosine and NO peripheral and centrally, is well established, in particular, in the oblongata medulla, the mechanisms by which adenosine interferes in the dynamics of nitrergic neurotransmission, is not completely understood. Thus, changes in the interaction between these systems may be especially relevant for individuals predisposed to hypertension. The aim of this study was to evaluate the interaction between the adenosinergic and nitrergic systems in cell culture from the dorsomedial medulla oblongata of Wistar Kyoto (WKY) and spontaneously hypertensive rats (SHR). This purpose was performed the quantification of nitrite level, RT-PCR analysis and RNA interference. We observed a concentration-dependent decrease and increase of nitrite and nNOS mRNA levels in cultured cells of WKY and SHR rats induced by agonists of adenosine A1 (A1R) and A2A receptor (A2AR), CPA and CGS21680, respectively. These effects in nitrite level were attenuated by the administration of the A1R and A2AR selective antagonist, CPT and ZM241385. Furthermore, knockdown of A1R and A2AR showed an increase and decrease of nNOS mRNA levels, respectively. The pretreatment with nonselective inhibitor of NOS, L-NAME, abolished nitrite-increased levels triggered by CGS 21680 in WKY and SHR cells. Finally, it is shown that the cAMP-PKA pathway is involved in A1R and A2AR -mediated decrease and increase in nitrite levels in SHR and WKY cells. In summary, our results highlight the influence of adenosine on nitric oxide levels in cultured cells from dorsal medulla oblongata of WKY and SHR rats. In part, the modulatory profile is different in the SHR strain

A cafeína é o psicoestimulante mais consumido mundialmente. Sua ação farmacológica consiste em bloquear os receptores de adenosina A1 e A2A. A administração crônica de cafeína previne déficits cognitivos decorrentes da idade e em modelos experimentais da doença de Alzheimer. Esses efeitos preventivos são também observados pela administração do antagonista seletivo do receptor de adenosina A2A. Nesse trabalho investigou-se a participação dos receptores de adenosina A1 e A2A na prevenção dos déficits cognitivos induzidos por escopolamina. Também foi investigado se a manipulação dos receptores A2A teria algum impacto na memória em camundongos naive. Para isso, foram utilizadas três tarefas comportamentais que avaliaram três tipos de memória: a tarefa de reconhecimento de objetos (RO), a esquiva inibitória (EI) e o labirinto em Y. A administração intraperitoneal de escopolamina (1,0 mg/kg) prejudicou o desempenho da memória de curto prazo nas três tarefas utilizadas. O antagonista de receptores A1 (DPCPX, 1,0 mg / kg, i.p.) preveniu a amnésia induzida por escopolamina no RO e na EI, enquanto o antagonista de receptores A2A (SCH 58261, 0,5 mg / kg, i.p.) preveniu a amnésia em todos os testes. Além disso, ambos os antagonistas não apresentaram efeitos sobre a memória ou a locomoção em animais naive. Também foi observado que a ativação dos receptores A2A, a partir da administração de CGS 21680 (0,1 mg/kg, i.p.) antes da sessão de treino, foi suficiente para provocar prejuízos na memória em animais naive também nas três tarefas, e este efeito foi prevenido por meio da administração de SCH 58261 (0,5 mg/kg, i.p.). Por fim, a administração intracerebroventricular (i.c.v) de CGS 21680 (50 nmol) também prejudicou o desempenho dos animais na tarefa de RO. Em conjunto, estes resultados sugerem que a ativação dos receptores A2A é suficiente para provocar déficits de memória e ainda sugerem que os receptores A1 também participam de maneira seletiva no controle dos déficits de memória relacionados ao sistema colinérgico. / Caffeine, a non-selective adenosine receptor antagonist, prevents memory deficits, an effect mimicked by adenosine A2A receptor (A2AR), but not receptor A1 (A1R), antagonists upon aging and Alzheimer´s disease. We tested if A2AR were also necessary for the memory impairment upon direct perturbation of the cholinergic system with scopolamine and if A2AR activation was sufficient to trigger memory deficits in naive mice using 3 tests, to probe for short-term memory, namely the object recognition task, inhibitory avoidance and modified Y-maze. The intra-peritoneal (i.p.) administration of scopolamine (1.0 mg/kg) impaired short-term memory performance in 3 tests, namely the object recognition task, inhibitory avoidance and modified Y-maze. The scopolamine-induced amnesia was prevented by the A2AR (SCH 58261, 0.5 mg/kg, i.p.) as well as by A1R antagonist (DPCPX, 1 mg/kg, i.p.) in all tests, except for the modified Y-maze, and both antagonists were devoid of effects on memory or locomotion in naive rats. Notably, the activation of A2AR with CGS 21680 (0.1 mg/kg, i.p.) before the training session was sufficient to trigger memory impairment in the 3 tests in naive mice, and effect prevented by SCH 58261 (0.5 mg/kg, i.p.). Furthermore, the intracerebroventricular administration of CGS 21680 (50 nmol) also impaired recognition memory in the object recognition task. These results show that A2AR are necessary and sufficient to trigger memory impairment and they further suggest that A1R might also be selectively engaged to control the cholinergic driven memory impairment.

A cafeína é o psicoestimulante mais consumido mundialmente. Sua ação farmacológica consiste em bloquear os receptores de adenosina A1 e A2A. A administração crônica de cafeína previne déficits cognitivos decorrentes da idade e em modelos experimentais da doença de Alzheimer. Esses efeitos preventivos são também observados pela administração do antagonista seletivo do receptor de adenosina A2A. Nesse trabalho investigou-se a participação dos receptores de adenosina A1 e A2A na prevenção dos déficits cognitivos induzidos por escopolamina. Também foi investigado se a manipulação dos receptores A2A teria algum impacto na memória em camundongos naive. Para isso, foram utilizadas três tarefas comportamentais que avaliaram três tipos de memória: a tarefa de reconhecimento de objetos (RO), a esquiva inibitória (EI) e o labirinto em Y. A administração intraperitoneal de escopolamina (1,0 mg/kg) prejudicou o desempenho da memória de curto prazo nas três tarefas utilizadas. O antagonista de receptores A1 (DPCPX, 1,0 mg / kg, i.p.) preveniu a amnésia induzida por escopolamina no RO e na EI, enquanto o antagonista de receptores A2A (SCH 58261, 0,5 mg / kg, i.p.) preveniu a amnésia em todos os testes. Além disso, ambos os antagonistas não apresentaram efeitos sobre a memória ou a locomoção em animais naive. Também foi observado que a ativação dos receptores A2A, a partir da administração de CGS 21680 (0,1 mg/kg, i.p.) antes da sessão de treino, foi suficiente para provocar prejuízos na memória em animais naive também nas três tarefas, e este efeito foi prevenido por meio da administração de SCH 58261 (0,5 mg/kg, i.p.). Por fim, a administração intracerebroventricular (i.c.v) de CGS 21680 (50 nmol) também prejudicou o desempenho dos animais na tarefa de RO. Em conjunto, estes resultados sugerem que a ativação dos receptores A2A é suficiente para provocar déficits de memória e ainda sugerem que os receptores A1 também participam de maneira seletiva no controle dos déficits de memória relacionados ao sistema colinérgico. / Caffeine, a non-selective adenosine receptor antagonist, prevents memory deficits, an effect mimicked by adenosine A2A receptor (A2AR), but not receptor A1 (A1R), antagonists upon aging and Alzheimer´s disease. We tested if A2AR were also necessary for the memory impairment upon direct perturbation of the cholinergic system with scopolamine and if A2AR activation was sufficient to trigger memory deficits in naive mice using 3 tests, to probe for short-term memory, namely the object recognition task, inhibitory avoidance and modified Y-maze. The intra-peritoneal (i.p.) administration of scopolamine (1.0 mg/kg) impaired short-term memory performance in 3 tests, namely the object recognition task, inhibitory avoidance and modified Y-maze. The scopolamine-induced amnesia was prevented by the A2AR (SCH 58261, 0.5 mg/kg, i.p.) as well as by A1R antagonist (DPCPX, 1 mg/kg, i.p.) in all tests, except for the modified Y-maze, and both antagonists were devoid of effects on memory or locomotion in naive rats. Notably, the activation of A2AR with CGS 21680 (0.1 mg/kg, i.p.) before the training session was sufficient to trigger memory impairment in the 3 tests in naive mice, and effect prevented by SCH 58261 (0.5 mg/kg, i.p.). Furthermore, the intracerebroventricular administration of CGS 21680 (50 nmol) also impaired recognition memory in the object recognition task. These results show that A2AR are necessary and sufficient to trigger memory impairment and they further suggest that A1R might also be selectively engaged to control the cholinergic driven memory impairment.

O câncer de mama é um dos tumores malignos mais comuns e que afeta um grande número de mulheres da população mundial. O processo inflamatório gerado juntamente com o crescimento descontrolado das células tumorais promove um estresse metabólico no microambiente tumoral levando ao acúmulo de adenosina extracelular decorrente da hipóxia tecidual. A adenosina gerada e seus efeitos mediados via receptor A2A (A2AR) interfere em vários subtipos celulares. Neste trabalho, avaliamos o papel do receptor A2A na indução de uma resposta de células Th17 durante o carcinoma mamário experimental, visto que estas desempenham um importante papel no crescimento e na progressão do tumor de mama invasivo. Para isso, utilizamos o modelo de carcinoma mamário murino que desenvolve (4T-1) e o que não desenvolve metástase (67NR). Nossos resultados mostraram que o tumor mamário 4T-1 apresenta alta expressão do receptor A2A comparado com o tumor 67NR. A deficiência do receptor A2a preveniu o crescimento do tumor mamário 4T- 1 e de colônias de células tumorais em sítios secundários da doença, concomitante com a diminuição da resposta de perfil Th17 e do recrutamento de neutrófilos para o sitio primário. Ainda, que as células tumorais 4T-1 apresentaram uma alta expressão dos receptores de adenosina e das ectonucleotidases (CD73 e CD39), sugerindo que a via de sinalização de adenosina exerce um efeito direto nessas células. A administração de adenosina ou AMP (trifosfato de adenosina) em culturas de células tumorais 4T-1 induziu xvi um aumento da expressão de IL-6, CCL20 e CXCL1, mediadores importantes para o recrutamento de linfócitos T produtores de IL-17 e de neutrófilos. Além disso, durante o crescimento do tumor 4T-1, observamos uma alta expressão da enzima ciclooxigenase 2 (Cox-2) comparado com o tumor 67NR. No entanto, os animais deficientes geneticamente do receptor A2A apresentaram uma redução significativa da expressão de Cox-2 no microambiente tumoral comparados com os animais BALB/c. A inibição da enzima Cox-2 com indometacina ou celecoxicib (inibidor seletivo) em animais com tumor 4T-1 preveniu o crescimento do tumor primário e, consequentemente, resultou na redução da expressão de moléculas relacionadas como o perfil de resposta de células Th17 tais como IL-6, CCL20, IL-17A e Ror?t. Esses resultados indicam que o bloqueio da via de sinalização do receptor A2A interfere na indução de resposta de células Th17, abrindo novas perspectivas para o desenvolvimento de terapias alternativas para o controle de tumores invasivos / Breast cancer is one of the most common and aggressive malignant tumors, affecting a large number of women in the worldwide population. The inflammatory process generated along with the uncontrolled growth of tumor cells promotes metabolic stress in the tumor microenvironment leading to the accumulation of extracellular adenosine due to the generation of tissue hypoxia. The generated adenosine and its effects mediated by A2A (A2AR) interfere in several cell subtypes. In this study, we evaluated the role of A2A receptor in the induction of a Th17 cell response in experimental breast carcinoma, given that these cells play an important role in invasive breast tumor growth and progression. For this, we employed the murine mammary metastatic (4T-1) and nonmetastatic carcinoma (67NR) model. Our results showed that there is high expression of adenosine A2A receptor in breast tumor 4T-1 compared to 67NR. The A2AR deficiency prevented the growth of metastatic breast tumor 4T-1 and tumor cell colonies in secondary disease sites, together with a decrease in Th17 response profile and in the neutrophils recruitment to the primary site. The tumor cells 4T-1 presented high expression of adenosine receptors and ectonucleotidases (CD73 and CD39), suggesting that the adenosine signaling pathway has a direct effect on these cells. Adenosine or AMP (adenosine triphosphate) administration in tumoral 4T-1 cell cultures induced an increase in IL-6, CCL20 and CXCL1 expression, important mediators in the recruitiment of IL-17 producing T lymphocytes and neutrophils. Besides that, during 4T-1 tumor growth we observed high expression of cyclooxygenase 2 (Cox-2) compared to 67RN tumor. However A2A deficient mice showed a significative reduction in Cox-2 expression in tumoral microenvironment compared to BALB/c mice. Cox-2 inhibition with indometacine or celecoxib (selective inhibitor) in mice with 4T-1 tumor prevented primary tumor growth and, consequently, resulted in reduction of the expression of molecules related to the Th17 profile, as IL-6, CCL20, IL-17A and Ror?t. These results indicate that the blockade of the A2A signaling pathway interfere on the induction of Th17 cells response, opening new perspectives for the development of alternative therapies to the control of invasive tumors

A cafeína é o psicoestimulante mais consumido mundialmente. Sua ação farmacológica consiste em bloquear os receptores de adenosina A1 e A2A. A administração crônica de cafeína previne déficits cognitivos decorrentes da idade e em modelos experimentais da doença de Alzheimer. Esses efeitos preventivos são também observados pela administração do antagonista seletivo do receptor de adenosina A2A. Nesse trabalho investigou-se a participação dos receptores de adenosina A1 e A2A na prevenção dos déficits cognitivos induzidos por escopolamina. Também foi investigado se a manipulação dos receptores A2A teria algum impacto na memória em camundongos naive. Para isso, foram utilizadas três tarefas comportamentais que avaliaram três tipos de memória: a tarefa de reconhecimento de objetos (RO), a esquiva inibitória (EI) e o labirinto em Y. A administração intraperitoneal de escopolamina (1,0 mg/kg) prejudicou o desempenho da memória de curto prazo nas três tarefas utilizadas. O antagonista de receptores A1 (DPCPX, 1,0 mg / kg, i.p.) preveniu a amnésia induzida por escopolamina no RO e na EI, enquanto o antagonista de receptores A2A (SCH 58261, 0,5 mg / kg, i.p.) preveniu a amnésia em todos os testes. Além disso, ambos os antagonistas não apresentaram efeitos sobre a memória ou a locomoção em animais naive. Também foi observado que a ativação dos receptores A2A, a partir da administração de CGS 21680 (0,1 mg/kg, i.p.) antes da sessão de treino, foi suficiente para provocar prejuízos na memória em animais naive também nas três tarefas, e este efeito foi prevenido por meio da administração de SCH 58261 (0,5 mg/kg, i.p.). Por fim, a administração intracerebroventricular (i.c.v) de CGS 21680 (50 nmol) também prejudicou o desempenho dos animais na tarefa de RO. Em conjunto, estes resultados sugerem que a ativação dos receptores A2A é suficiente para provocar déficits de memória e ainda sugerem que os receptores A1 também participam de maneira seletiva no controle dos déficits de memória relacionados ao sistema colinérgico. / Caffeine, a non-selective adenosine receptor antagonist, prevents memory deficits, an effect mimicked by adenosine A2A receptor (A2AR), but not receptor A1 (A1R), antagonists upon aging and Alzheimer´s disease. We tested if A2AR were also necessary for the memory impairment upon direct perturbation of the cholinergic system with scopolamine and if A2AR activation was sufficient to trigger memory deficits in naive mice using 3 tests, to probe for short-term memory, namely the object recognition task, inhibitory avoidance and modified Y-maze. The intra-peritoneal (i.p.) administration of scopolamine (1.0 mg/kg) impaired short-term memory performance in 3 tests, namely the object recognition task, inhibitory avoidance and modified Y-maze. The scopolamine-induced amnesia was prevented by the A2AR (SCH 58261, 0.5 mg/kg, i.p.) as well as by A1R antagonist (DPCPX, 1 mg/kg, i.p.) in all tests, except for the modified Y-maze, and both antagonists were devoid of effects on memory or locomotion in naive rats. Notably, the activation of A2AR with CGS 21680 (0.1 mg/kg, i.p.) before the training session was sufficient to trigger memory impairment in the 3 tests in naive mice, and effect prevented by SCH 58261 (0.5 mg/kg, i.p.). Furthermore, the intracerebroventricular administration of CGS 21680 (50 nmol) also impaired recognition memory in the object recognition task. These results show that A2AR are necessary and sufficient to trigger memory impairment and they further suggest that A1R might also be selectively engaged to control the cholinergic driven memory impairment.

Adenosina e óxido nítrico, importantes neuromoduladores endógenos, atuam modulando finamente o controle neural cardiovascular no núcleo de trato solitário (NTS). Embora se tenha conhecimento sobre a relação entre adenosina e NO periférica e centralmente, em particular, no bulbo, os mecanismos pelos quais a adenosina interfere na dinâmica da neurotransmissão nitrérgica, ainda não são totalmente conhecidos. Logo, alterações na interação entre esses sistemas podem ser especialmente relevantes para indivíduos predispostos à hipertensão. Dessa forma, os objetivos do presente estudo foram estudar a interação entre o sistema adenosinérgico e nitrérgico em culturas de células da porção dorsomedial do bulbo de ratos normotenso Wistar Kyoto (WKY) e espontaneamente hipertensos (SHR). Para tal, utilizou-se técnicas para quantificação dos níveis de nitrito, PCR em tempo real e RNA de interferência. Foi observada uma redução e um aumento concentração-dependente nos níveis de nitrito e do mRNA da nNOS induzido pelos agonistas dos receptores A1(A1R) e A2A(A>sub>2AR), CPA e CGS21680, respectivamente. Os efeitos nos níveis de nitrito foram atenuados pela administração dos antagonistas seletivos dos A1R e A2AR, CPT e ZM241385. Knockdown dos A1R e A2AR mostraram que a redução da expressão desses receptores aumentaram e diminuíram os níveis de expressão da nNOS, respectivamente. Pré-tratamento com o inibidor não seletivo da nNOS, L-NAME, aboliu os níveis aumentados de nitrito desencadeados pelo CGS21680 em células de WKY e SHR. Por fim, é mostrado que a via cAMP-PKA está envolvida na sinalização que deflaga tantos os níveis reduzidos de nitrito, via A1R, quantos os níveis aumentados de nitrito, via A2AR, em culturas de WKY e SHR. Em síntese, nossos resultados destacam a influência da adenosina sobre a síntese de NO em culturas de células da porção dorsomedial do bulbo de ratos WKY e SHR. Pelo menos em parte, o perfil modulatório é diferenciado em ratos SHR / Adenosine and nitric oxide, important endogenous neuromodulators, act on the fine tuning regulation of neural cardiovascular control in the nucleus tractus solitarius (NTS). Although the relationship between adenosine and NO peripheral and centrally, is well established, in particular, in the oblongata medulla, the mechanisms by which adenosine interferes in the dynamics of nitrergic neurotransmission, is not completely understood. Thus, changes in the interaction between these systems may be especially relevant for individuals predisposed to hypertension. The aim of this study was to evaluate the interaction between the adenosinergic and nitrergic systems in cell culture from the dorsomedial medulla oblongata of Wistar Kyoto (WKY) and spontaneously hypertensive rats (SHR). This purpose was performed the quantification of nitrite level, RT-PCR analysis and RNA interference. We observed a concentration-dependent decrease and increase of nitrite and nNOS mRNA levels in cultured cells of WKY and SHR rats induced by agonists of adenosine A1 (A1R) and A2A receptor (A2AR), CPA and CGS21680, respectively. These effects in nitrite level were attenuated by the administration of the A1R and A2AR selective antagonist, CPT and ZM241385. Furthermore, knockdown of A1R and A2AR showed an increase and decrease of nNOS mRNA levels, respectively. The pretreatment with nonselective inhibitor of NOS, L-NAME, abolished nitrite-increased levels triggered by CGS 21680 in WKY and SHR cells. Finally, it is shown that the cAMP-PKA pathway is involved in A1R and A2AR -mediated decrease and increase in nitrite levels in SHR and WKY cells. In summary, our results highlight the influence of adenosine on nitric oxide levels in cultured cells from dorsal medulla oblongata of WKY and SHR rats. In part, the modulatory profile is different in the SHR strain