No presente estudo, observamos aumentada expressão de iNOS e de proteínas s-nitrosiladas (S-NT) em aorta (AO) e concentração de NO no plasma de ratas diabéticas (DB), que foram corrigidas pelo tratamento com insulina (INS), que foi incapaz de normalizar a glicemia. O tratamento com o inibidor da iNOS L-NIL reduziu a expressão de S-NT e a concentração de NO. A contração induzida por agonistas adrenérgicos (ADRs), mas não por cloreto de potássio, que estava reduzida em anéis de AO sem endotélio de ratas DB, foi corrigida pelos tratamentos com INS e L-NIL. A expressão dos receptores de estrógeno ESR2 e GPER estava aumentada em AO de ratas DB e foi corrigida pelo tratamento com INS. Nossos resultados mostram que o aumento da expressão da iNOS/geração de NO é responsável pela redução da contração mediada por receptor ADR, mas não daquela induzida por despolarização direta da membrana. A INS modula negativamente a expressão da iNOS e dos receptores ESR2 e GPER em aorta de ratas DB, efeito que pode contribuir com a restauração da contração induzida por agonistas ADRs. / In the present study, we observed that in aortas (AO) of diabetic (DB) female rats have an increase in iNOS and S-nitrosilated (S-NT) proteins expression along with higher levels of plasmatic NO. Although insulin (INS) treatment did not normalize blood glucose levels, it corrected protein expression and NO concentrations. The iNOS inhibitor treatment reduced the altered expression of S-NT proteins and NO levels. The reduced adrenergic agonists (ADR)-induced contractions in DB without endothelium were corrected by INS and L-NIL treatments, such treatments did not affect the reduced vasoconstriction response to KCl in DB AO. The increase expression of estrogen receptors GPER and ESR2 found in DB AO was recovered by INS treatment. Our results showed that the increased expression of iNOS/NO generation is responsible for reducing ADR-induced contraction, but not for membrane depolarization-induced contraction. INS negatively modulates protein expression of iNOS, ESR2, and GPER receptors in DB AO; such effect may contribute to restore ADR-induced vascular contraction.

RESUMO A similaridade entre o tecido da mama e o da glândula salivar está bem estabelecida. A porção das estruturas acinares e ductais destes órgãos são basicamente semelhantes. Estes aspectos, associados ao fato de que uma coexistência de carcinomas da mama e de glândula salivar, têm sido relatados em uma incidência maior do que a esperada. Guiaram estudos tentando determinar a importância dos receptores de estrógeno e progesterona em adenomas pleomórficos (AP). A neoplasia é mais freqüente nas glândulas salivares e exibe uma predileção para o sexo feminino. Recentemente a presença do receptor de estrógeno (RE) e do receptor de progesterona (RP) tem sido investigada no AP, entre outras neoplasias de glândula salivar, questionando-se a possibilidade da existência da dependência hormonal. A expressão dos receptores hormonais nos carcinomas de mama é importante para determinar o prognóstico e a probabilidade de responder à manipulação hormonal. Neoplasias que apresentam positividade para ambos os receptores, estrógeno e progesterona, exibem maior probabilidade de resposta à terapia anti-estrogênica do que as neoplasias que são negativas para estes receptores. Baseando-se na literatura científica pertinente, o presente trabalho se propõe a investigar a presença da proteína RE e da proteína RP em APs humanos, relacionando-os com a proliferação de linhagens celulares sob a influência destes hormônios. A técnica utilizada foi a imuno-histoquímica para a pesquisa dos RE e RP em 10 APs emblocados em parafina pertencentes ao arquivo do Serviço de Patologia Cirúrgica da FOUSP, e de duas linhagens de APs estabelecidas no mesmo serviço: uma derivada de um paciente do sexo masculino e a outra de um paciente do sexo feminino. No meio de cultivo onde subculturas destas células proliferavam foram diluídos 17-b-estradiol e progesterona. Através de contagens destas células em períodos pré-determinados (24 horas, 48 horas e 72 horas), pretendeu-se verificar a influência dos respectivos hormônios na multiplicação celular. Como controle positivo utilizou-se uma linhagem denominada T-47D, que foi largamente estudada na literatura. A T-47D é derivada de um carcinoma metastático de mama, reconhecidamente hormônio dependente. E como controle negativo, utilizou-se de uma linhagem de carcinoma epidermóide, denominada HN30. Encontrou-se positividade para o RE em 7 de 10 APs estudados (4 em homens e 3 em mulheres) e positividade para o RP em 8 Aps estudados (4 em mulheres e 4 em homens). Pela análise estatística, constatou-se que existe uma diferença significativa no índice proliferativo entre o controle e as células submetidas à ação do 17-b-estradiol e da progesterona. Para a linhagem derivada do paciente do sexo masculino houve diferença entre o controle e as células expostas ao 17-b-estradiol e a progesterona somente nas últimas 72 horas. Para a linhagem derivada do sexo feminino constatou-se uma diferença significativa entre o controle e as células sob a influência da progesterona, a partir de 48 horas de proliferação celular. A diferença significativa entre o controle e as células sob a ação do 17-b-estradiol ocorreu somente a partir das 72 horas, sugerindo que o AP poderia ser uma neoplasia influenciada pela ação hormonal. / SUMARY It is well established the similarity between mammary and salivary glands especially between the acinic and ductile structures. These aspects, associated to the fact of coexistence of breast carcinomas and of salivary gland tumors been described, leaded studies in attempt to determine the importance of the ERs and Pr in pleomorphic adenomas (PA), the most frequent salivary gland tumor and with predilection for the females. Lately, the presence of ERs and of the PRs has been investigated in PA and other salivary gland tumors pointing out their hormonal dependency. The expression of hormone receptors in breast carcinomas is crucial to determine a presence for both receptors. These tumors exhibit better response to anti-estrogenic therapy than the negative ones. Basing on the pertinent scientific literature, the present study proposes to investigate the presence of the RE and of the RP in humans PA and connecting them with cellular proliferation in vitro, under the influence of these hormones. Immunohistochemistry technique was used for the detection of RE and RP in paraffin embedded 10 PAs from the files of the Department of Oral Pathology, School of Dentistry, University of São Paulo, and two PA cell lines one from a male patient and other female. The culture midia was supplied with, 17-b-estradiol and progesterone. A growth curve was performed (24 hours, 48 hours and 72 hours) to verify the influence of the respective hormones in the cellular proliferation. As a positive control T-47-D cells derived from a hormone dependent metastatic breast carcinoma were used, and as negative control HN30 cells, derived from a tongue squamous cell carcinoma. 7 of 10 PAs were positive (4 in men and 3 in women) for RP and 8 of 8 PAs (4 in women and 4 in men) for RE. The statistical analysis verified a significant difference in the proliferative index between the control cells and the ones submitted to the action of the 17-b-estradiol and of the progesterone: for male derived lineage a difference was only observed in the last 72 hours. In the other hand, for the female derived lineage a significant difference was verified starting from 48 hours, suggesting that PA can be influenced by hormonal action.

RESUMO A similaridade entre o tecido da mama e o da glândula salivar está bem estabelecida. A porção das estruturas acinares e ductais destes órgãos são basicamente semelhantes. Estes aspectos, associados ao fato de que uma coexistência de carcinomas da mama e de glândula salivar, têm sido relatados em uma incidência maior do que a esperada. Guiaram estudos tentando determinar a importância dos receptores de estrógeno e progesterona em adenomas pleomórficos (AP). A neoplasia é mais freqüente nas glândulas salivares e exibe uma predileção para o sexo feminino. Recentemente a presença do receptor de estrógeno (RE) e do receptor de progesterona (RP) tem sido investigada no AP, entre outras neoplasias de glândula salivar, questionando-se a possibilidade da existência da dependência hormonal. A expressão dos receptores hormonais nos carcinomas de mama é importante para determinar o prognóstico e a probabilidade de responder à manipulação hormonal. Neoplasias que apresentam positividade para ambos os receptores, estrógeno e progesterona, exibem maior probabilidade de resposta à terapia anti-estrogênica do que as neoplasias que são negativas para estes receptores. Baseando-se na literatura científica pertinente, o presente trabalho se propõe a investigar a presença da proteína RE e da proteína RP em APs humanos, relacionando-os com a proliferação de linhagens celulares sob a influência destes hormônios. A técnica utilizada foi a imuno-histoquímica para a pesquisa dos RE e RP em 10 APs emblocados em parafina pertencentes ao arquivo do Serviço de Patologia Cirúrgica da FOUSP, e de duas linhagens de APs estabelecidas no mesmo serviço: uma derivada de um paciente do sexo masculino e a outra de um paciente do sexo feminino. No meio de cultivo onde subculturas destas células proliferavam foram diluídos 17-b-estradiol e progesterona. Através de contagens destas células em períodos pré-determinados (24 horas, 48 horas e 72 horas), pretendeu-se verificar a influência dos respectivos hormônios na multiplicação celular. Como controle positivo utilizou-se uma linhagem denominada T-47D, que foi largamente estudada na literatura. A T-47D é derivada de um carcinoma metastático de mama, reconhecidamente hormônio dependente. E como controle negativo, utilizou-se de uma linhagem de carcinoma epidermóide, denominada HN30. Encontrou-se positividade para o RE em 7 de 10 APs estudados (4 em homens e 3 em mulheres) e positividade para o RP em 8 Aps estudados (4 em mulheres e 4 em homens). Pela análise estatística, constatou-se que existe uma diferença significativa no índice proliferativo entre o controle e as células submetidas à ação do 17-b-estradiol e da progesterona. Para a linhagem derivada do paciente do sexo masculino houve diferença entre o controle e as células expostas ao 17-b-estradiol e a progesterona somente nas últimas 72 horas. Para a linhagem derivada do sexo feminino constatou-se uma diferença significativa entre o controle e as células sob a influência da progesterona, a partir de 48 horas de proliferação celular. A diferença significativa entre o controle e as células sob a ação do 17-b-estradiol ocorreu somente a partir das 72 horas, sugerindo que o AP poderia ser uma neoplasia influenciada pela ação hormonal. / SUMARY It is well established the similarity between mammary and salivary glands especially between the acinic and ductile structures. These aspects, associated to the fact of coexistence of breast carcinomas and of salivary gland tumors been described, leaded studies in attempt to determine the importance of the ERs and Pr in pleomorphic adenomas (PA), the most frequent salivary gland tumor and with predilection for the females. Lately, the presence of ERs and of the PRs has been investigated in PA and other salivary gland tumors pointing out their hormonal dependency. The expression of hormone receptors in breast carcinomas is crucial to determine a presence for both receptors. These tumors exhibit better response to anti-estrogenic therapy than the negative ones. Basing on the pertinent scientific literature, the present study proposes to investigate the presence of the RE and of the RP in humans PA and connecting them with cellular proliferation in vitro, under the influence of these hormones. Immunohistochemistry technique was used for the detection of RE and RP in paraffin embedded 10 PAs from the files of the Department of Oral Pathology, School of Dentistry, University of São Paulo, and two PA cell lines one from a male patient and other female. The culture midia was supplied with, 17-b-estradiol and progesterone. A growth curve was performed (24 hours, 48 hours and 72 hours) to verify the influence of the respective hormones in the cellular proliferation. As a positive control T-47-D cells derived from a hormone dependent metastatic breast carcinoma were used, and as negative control HN30 cells, derived from a tongue squamous cell carcinoma. 7 of 10 PAs were positive (4 in men and 3 in women) for RP and 8 of 8 PAs (4 in women and 4 in men) for RE. The statistical analysis verified a significant difference in the proliferative index between the control cells and the ones submitted to the action of the 17-b-estradiol and of the progesterone: for male derived lineage a difference was only observed in the last 72 hours. In the other hand, for the female derived lineage a significant difference was verified starting from 48 hours, suggesting that PA can be influenced by hormonal action.

No presente estudo, observamos aumentada expressão de iNOS e de proteínas s-nitrosiladas (S-NT) em aorta (AO) e concentração de NO no plasma de ratas diabéticas (DB), que foram corrigidas pelo tratamento com insulina (INS), que foi incapaz de normalizar a glicemia. O tratamento com o inibidor da iNOS L-NIL reduziu a expressão de S-NT e a concentração de NO. A contração induzida por agonistas adrenérgicos (ADRs), mas não por cloreto de potássio, que estava reduzida em anéis de AO sem endotélio de ratas DB, foi corrigida pelos tratamentos com INS e L-NIL. A expressão dos receptores de estrógeno ESR2 e GPER estava aumentada em AO de ratas DB e foi corrigida pelo tratamento com INS. Nossos resultados mostram que o aumento da expressão da iNOS/geração de NO é responsável pela redução da contração mediada por receptor ADR, mas não daquela induzida por despolarização direta da membrana. A INS modula negativamente a expressão da iNOS e dos receptores ESR2 e GPER em aorta de ratas DB, efeito que pode contribuir com a restauração da contração induzida por agonistas ADRs. / In the present study, we observed that in aortas (AO) of diabetic (DB) female rats have an increase in iNOS and S-nitrosilated (S-NT) proteins expression along with higher levels of plasmatic NO. Although insulin (INS) treatment did not normalize blood glucose levels, it corrected protein expression and NO concentrations. The iNOS inhibitor treatment reduced the altered expression of S-NT proteins and NO levels. The reduced adrenergic agonists (ADR)-induced contractions in DB without endothelium were corrected by INS and L-NIL treatments, such treatments did not affect the reduced vasoconstriction response to KCl in DB AO. The increase expression of estrogen receptors GPER and ESR2 found in DB AO was recovered by INS treatment. Our results showed that the increased expression of iNOS/NO generation is responsible for reducing ADR-induced contraction, but not for membrane depolarization-induced contraction. INS negatively modulates protein expression of iNOS, ESR2, and GPER receptors in DB AO; such effect may contribute to restore ADR-induced vascular contraction.

O Bisfenol A (BPA) é usado na fabricação de plásticos de policarbonato e resinas epóxi. A exposição pré-natal a esse agente pode causar diversos efeitos, tais como: antecipação da puberdade, hiperplasia de próstata, diminuição do número de espermatozoides, diminuição dos níveis de testosterona, alteração do desenvolvimento e organização tecidual da glândula mamária, diminuição da resposta celular induzida por hormônios, câncer de mama, diabetes, doenças cardiovasculares, alterações das funções de enzimas hepáticas, além de efeitos sobre o desenvolvimento cognitivo. Poucos estudos avaliam os efeitos do BPA sobre as células neuronais, porém existem evidências de que este agente induza a apoptose. O presente trabalho tem como objetivo estudar a neurotoxicidade do BPA, avaliando vias de sinalização que levam a indução da apoptose em cultura primária de hipocampo. As células foram expostas ao BPA nas concentrações de 50, 100, 150, 200, e 250 µM (0,1% DMSO v/v) pelos períodos de 6, 12, 24, e 48 horas para a realização dos ensaios da atividade mitocondrial (MTT) e citotoxicidade pela liberação da enzima Lactato Desidrogenase (LDH). A partir dos resultados de MTT e LDH, foram adotados novos horários de exposição (3, 6 e 9 horas) utilizando somente as concentrações de 200 e 250 µM. Neste novo desenho experimental, foi realizada a quantificação da concentração de BPA na cultura primária por HPLC-PDA, determinação da concentração de Ca2+ intracelular pela quantificação da fluorescência do Fluo-4 AM, caracterização dos mecanismos envolvidos na morte celular por citometria de fluxo e Western Blotting, e avaliação dos receptores de estrógeno ER-α e ER-β por Western Blotting. Nossos resultados apontam que aproximadamente 20% de BPA na concentração de 250 µM após 6 horas de exposição e 18% para a concentração de 200 µM com 9 horas de exposição foram absorvidos pela cultura celular. O ensaio do MTT mostrou que as células expostas a 200 e 250 µM de BPA, por 12, 24 e 48 horas, apresentaram diminuição significativa da função mitocondrial em relação ao controle. Porém, não houve liberação de LDH para o meio de cultura para nenhuma das concentrações de BPA em nenhum dos períodos de incubação, o que sugere que não houve rompimento da membrana plasmática. Foi observada atividade apoptótica somente com a concentração de 250 µM no período de exposição de 6 horas por citometria de fluxo. Não foram encontradas células em necrose, nem alteração na concentração de cálcio intracelular em nenhuma das condições estudadas. Na avaliação dos marcadores de morte celular, observamos aumento da razão de Bax/Bcl-2 para a concentração de 250 µM em todos os períodos de exposição e aumento das caspases 8, 9 e 3 para a concentração de 250 µM no período de exposição de 6 horas, indicando que o BPA deve ativar tanto a via intrínseca como a extrínseca no processo de apoptose. Verificamos ainda, por Western Blotting, que a cultura primária de hipocampo apresenta os receptores de estrógeno ER-α e ER-β. A exposição ao BPA aumentou os ER-α e ER-β avaliados por Western Blotting para as duas concentrações estudadas no período de 6 horas de exposição e, para o período de exposição de 9 horas, houve um aumento do ER-α para a concentração de 250 µM e do ER-β para a concentração de 200 µM. É possível concluir que o BPA pode levar a morte das células neuronais hipocampais por apoptose por ambas as vias intrínseca e extrínseca, sendo o processo de morte celular mais evidente para a concentração de 250 µM no período de 6 horas de exposição. Sugerimos ainda que o aumento observado em ambos os receptores de estrógeno possa representar uma tentativa de interrupção ou reversão do processo de morte celular. / Bisphenol A (BPA) is used in the manufacture of polycarbonate plastics and epoxy resins. The prenatal exposure to this agent may cause several effects, such as anticipation of puberty, prostate hyperplasia, reduced number of sperm, reduced testosterone levels, alteration in the development and tissue organization of the mammary gland, decreased cellular response induced by hormones, breast cancer, diabetes, cardiovascular disease, changes in the functions of liver enzymes, and effects on cognitive development. Few studies have evaluated the effects of BPA in neuronal cells, however there are evidences that this agent may induce apoptosis. This work aims to study the neurotoxicity of BPA, by analyzing the signaling pathways of apoptosis in hippocampus primary culture. Cells were exposed to BPA at 50, 100, 150, 200, and 250 µM (0.1% DMSO v/v) for 6, 12, 24, and 48 hours for the assay of mitochondrial activity (MTT) and the release of the enzyme lactate dehydrogenase (LDH). From the results of MTT and LDH, new exposure times (3, 6 and 9 hours) and only 200 and 250 µM were used. In this new experimental design we performed the quantification of the BPA concentration in the primary culture by HPLC-PDA, intracellular Ca2+ quantification by Fluo-4 AM assay and the characterization of the mechanisms involved in cell death by flow cytometry and Western Blotting assays. Furthermore, evaluation of the estrogen receptor ER-α and ER-β was done by Western Blotting. Our results demonstrate that about 20% of the BPA concentration of 250 µM after 6 hours of exposure and 18% for the concentration of 200 µM with 9 hours of exposure were absorbed by the cell culture. Cells exposed to 200 and 250 µM of BPA for 12, 24 and 48 hours, showed a significant decrease in mitochondrial function, by the MTT assay, compared to control. However, there was no release of LDH into the culture medium for any of the BPA concentrations in any of incubation times studied, which suggests no rupture of the plasma membrane by BPA. Apoptotic activity was observed after 6 hours of exposure to 250µM BPA by flow cytometry. It was not observed cell necrosis and changes in intracellular calcium concentration in any of the studied conditions. Regarding the cell death markers, exposure to 250 µM BPA in all periods of exposure resulted in an increased Bax/Bcl-2 ratio; moreover, an increase in caspase 8, 9 and 3 was detected after exposure to 250 µM BPA for 6 hours. Taken together, these findings indicate that BPA activates both the intrinsic and the extrinsic pathway during the apoptotic process. We also verified by Western Blotting the presence of the estrogen receptors ER-α and ER-β at the primary culture of hippocampus, and that they can be modulated by BPA. The exposure to 200 and 250 µM BPA for 6 hours caused an increase of ER-α and ER-β, however, 9 hours of exposure to 200 µM and 250 µM BPA increased the expression of ER-α and ER-β, respectively. In conclusion, BPA can lead hippocampal neuronal cells to death by both, intrinsic and extrinsic, apoptotic pathways and this process is more evident at 250 µM BPA after 6 hours of exposure. Furthermore, we suggest that the increase of both estrogen receptors might represent an attempt to interrupt or reverse the cell death process.

O Bisfenol A (BPA) é usado na fabricação de plásticos de policarbonato e resinas epóxi. A exposição pré-natal a esse agente pode causar diversos efeitos, tais como: antecipação da puberdade, hiperplasia de próstata, diminuição do número de espermatozoides, diminuição dos níveis de testosterona, alteração do desenvolvimento e organização tecidual da glândula mamária, diminuição da resposta celular induzida por hormônios, câncer de mama, diabetes, doenças cardiovasculares, alterações das funções de enzimas hepáticas, além de efeitos sobre o desenvolvimento cognitivo. Poucos estudos avaliam os efeitos do BPA sobre as células neuronais, porém existem evidências de que este agente induza a apoptose. O presente trabalho tem como objetivo estudar a neurotoxicidade do BPA, avaliando vias de sinalização que levam a indução da apoptose em cultura primária de hipocampo. As células foram expostas ao BPA nas concentrações de 50, 100, 150, 200, e 250 µM (0,1% DMSO v/v) pelos períodos de 6, 12, 24, e 48 horas para a realização dos ensaios da atividade mitocondrial (MTT) e citotoxicidade pela liberação da enzima Lactato Desidrogenase (LDH). A partir dos resultados de MTT e LDH, foram adotados novos horários de exposição (3, 6 e 9 horas) utilizando somente as concentrações de 200 e 250 µM. Neste novo desenho experimental, foi realizada a quantificação da concentração de BPA na cultura primária por HPLC-PDA, determinação da concentração de Ca2+ intracelular pela quantificação da fluorescência do Fluo-4 AM, caracterização dos mecanismos envolvidos na morte celular por citometria de fluxo e Western Blotting, e avaliação dos receptores de estrógeno ER-α e ER-β por Western Blotting. Nossos resultados apontam que aproximadamente 20% de BPA na concentração de 250 µM após 6 horas de exposição e 18% para a concentração de 200 µM com 9 horas de exposição foram absorvidos pela cultura celular. O ensaio do MTT mostrou que as células expostas a 200 e 250 µM de BPA, por 12, 24 e 48 horas, apresentaram diminuição significativa da função mitocondrial em relação ao controle. Porém, não houve liberação de LDH para o meio de cultura para nenhuma das concentrações de BPA em nenhum dos períodos de incubação, o que sugere que não houve rompimento da membrana plasmática. Foi observada atividade apoptótica somente com a concentração de 250 µM no período de exposição de 6 horas por citometria de fluxo. Não foram encontradas células em necrose, nem alteração na concentração de cálcio intracelular em nenhuma das condições estudadas. Na avaliação dos marcadores de morte celular, observamos aumento da razão de Bax/Bcl-2 para a concentração de 250 µM em todos os períodos de exposição e aumento das caspases 8, 9 e 3 para a concentração de 250 µM no período de exposição de 6 horas, indicando que o BPA deve ativar tanto a via intrínseca como a extrínseca no processo de apoptose. Verificamos ainda, por Western Blotting, que a cultura primária de hipocampo apresenta os receptores de estrógeno ER-α e ER-β. A exposição ao BPA aumentou os ER-α e ER-β avaliados por Western Blotting para as duas concentrações estudadas no período de 6 horas de exposição e, para o período de exposição de 9 horas, houve um aumento do ER-α para a concentração de 250 µM e do ER-β para a concentração de 200 µM. É possível concluir que o BPA pode levar a morte das células neuronais hipocampais por apoptose por ambas as vias intrínseca e extrínseca, sendo o processo de morte celular mais evidente para a concentração de 250 µM no período de 6 horas de exposição. Sugerimos ainda que o aumento observado em ambos os receptores de estrógeno possa representar uma tentativa de interrupção ou reversão do processo de morte celular. / Bisphenol A (BPA) is used in the manufacture of polycarbonate plastics and epoxy resins. The prenatal exposure to this agent may cause several effects, such as anticipation of puberty, prostate hyperplasia, reduced number of sperm, reduced testosterone levels, alteration in the development and tissue organization of the mammary gland, decreased cellular response induced by hormones, breast cancer, diabetes, cardiovascular disease, changes in the functions of liver enzymes, and effects on cognitive development. Few studies have evaluated the effects of BPA in neuronal cells, however there are evidences that this agent may induce apoptosis. This work aims to study the neurotoxicity of BPA, by analyzing the signaling pathways of apoptosis in hippocampus primary culture. Cells were exposed to BPA at 50, 100, 150, 200, and 250 µM (0.1% DMSO v/v) for 6, 12, 24, and 48 hours for the assay of mitochondrial activity (MTT) and the release of the enzyme lactate dehydrogenase (LDH). From the results of MTT and LDH, new exposure times (3, 6 and 9 hours) and only 200 and 250 µM were used. In this new experimental design we performed the quantification of the BPA concentration in the primary culture by HPLC-PDA, intracellular Ca2+ quantification by Fluo-4 AM assay and the characterization of the mechanisms involved in cell death by flow cytometry and Western Blotting assays. Furthermore, evaluation of the estrogen receptor ER-α and ER-β was done by Western Blotting. Our results demonstrate that about 20% of the BPA concentration of 250 µM after 6 hours of exposure and 18% for the concentration of 200 µM with 9 hours of exposure were absorbed by the cell culture. Cells exposed to 200 and 250 µM of BPA for 12, 24 and 48 hours, showed a significant decrease in mitochondrial function, by the MTT assay, compared to control. However, there was no release of LDH into the culture medium for any of the BPA concentrations in any of incubation times studied, which suggests no rupture of the plasma membrane by BPA. Apoptotic activity was observed after 6 hours of exposure to 250µM BPA by flow cytometry. It was not observed cell necrosis and changes in intracellular calcium concentration in any of the studied conditions. Regarding the cell death markers, exposure to 250 µM BPA in all periods of exposure resulted in an increased Bax/Bcl-2 ratio; moreover, an increase in caspase 8, 9 and 3 was detected after exposure to 250 µM BPA for 6 hours. Taken together, these findings indicate that BPA activates both the intrinsic and the extrinsic pathway during the apoptotic process. We also verified by Western Blotting the presence of the estrogen receptors ER-α and ER-β at the primary culture of hippocampus, and that they can be modulated by BPA. The exposure to 200 and 250 µM BPA for 6 hours caused an increase of ER-α and ER-β, however, 9 hours of exposure to 200 µM and 250 µM BPA increased the expression of ER-α and ER-β, respectively. In conclusion, BPA can lead hippocampal neuronal cells to death by both, intrinsic and extrinsic, apoptotic pathways and this process is more evident at 250 µM BPA after 6 hours of exposure. Furthermore, we suggest that the increase of both estrogen receptors might represent an attempt to interrupt or reverse the cell death process.