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Uso de Babesia bovis como uma vacina de vetor vivo para o controle do carrapato bovino Rhipicephalus microplus

Oldiges, Daiane Patrícia January 2016 (has links)
O carrapato Rhipicephalus microplus é um ectoparasito hematófago de grande importância para a pecuária por ser responsável por perdas massivas na produção animal, de forma que o seu controle é economicamente relevante. Este carrapato, além dos danos que causa por si só, é também um importante vetor para a transmissão de microorganismos patogênicos, entre eles o hemoprotozoário intraeritrocítico Babesia bovis. O presente trabalho descreve o desenvolvimento de uma linhagem de B. bovis capaz de expressar um antígeno protetor, uma glutationa S-transferase do carrapato Haemaphysalis longicornis (HlGST), e o teste desta linhagem como uma vacina de vetor vivo para o controle do carrapato R. microplus. B. bovis, em cultivo, da linhagem S74-T3B foram eletroporados em presença de plasmídeo contendo o promotor bidirecional de B. bovis Ef-1 aresponsável pela expressão independente de dois genes: o repórter fusionado ao agente para seleção (GFP-BSD) e HlGST fusionada à sequência codificadora do peptídeo sinal de MSA-1 (merozoite surface antigen-1). Após a eletroporação, foi feita a seleção com blasticidina para obtenção da linhagem nomeada HlGST. A linhagem HlGST é composta por parasitos contendo diferentes padrões de inserção dos genes exógenos, tanto dentro quanto fora do locus Ef-1. Uma linhagem clonal denominada HlGST-Cln expressando HlGST e GFP-BSD foi obtida a partir da linhagem HlGST. Dois ensaios, independentes, de imunização de bovinos com os parasitos clonais foram realizados, sendo usado como controle uma linhagem clonal previamente caracterizada denominada GFP-Cln. Todos os animais inoculados desenvolveram uma forma branda de babesiose, indicando que ambas as linhagens clonais são atenuadas, mas apenas os animais imunizados com a linhagem HlGST-Cln foram capazes de produzir anticorpos anti-HlGST. O segundo procedimento de imunização foi seguido por um desafio com larvas de R. microplus. O desenvolvimento dessas larvas no hospedeiro levou a fêmeas adultas de menor peso e fertilidade. Coletivamente, esses dados mostram a possibilidade de uso de linhagens transfectadas de B. bovis como vacinas de vetor vivo. / The tick Rhipicephalus microplus is a notorious blood-feeding ectoparasite of cattle, responsible for massive losses in animal production. It is the main vector of pathogenic microorganisms, including Babesia bovis, an intraerythrocytic apicomplexan protozoan parasite responsible for bovine babesiosis. This study describes the development and testing of a live B. bovis vaccine expressing the protective tick antigen glutathione S-transferase from Haemaphysalis longicornis (HlGST). The B. bovis S74- T3B parasites were electroporated with a plasmid containing the bidirectional Ef-1 promoter of B. bovis controlling expression of two independent genes, the selectable marker GFP-BSD, and HlGST fused to the MSA-1 (merozoite surface antigen-1) signal peptide from B. bovis. Electroporation followed by blasticidin selection resulted in the emergence of a mixed B. bovis transfected line (termed HlGST) in in vitro cultures, containing parasites with distinct patterns of insertion of both exogenous genes, either in or outside the Ef-1 a locus. A B. bovis clonal line termed HlGST-Cln expressing HlGST and GFP-BSD was then derived from the mixed parasite line HlGST. Two independent calf immunization trials were performed via intravenous inoculation of the HlGST-Cln and a control consisting of an irrelevant transfected clonal line of B. bovis designated GFP-Cln. The control GFP-Cln line contains a copy of the GFP-BSD gene inserted into the Ef-1 locus of B. bovis in an identical fashion as the HIGST-Cln parasites. All animals inoculated with the HlGST-Cln and GFP-Cln transfected parasites developed mild babesiosis indicating that both transfected cloned parasite lines are attenuated. All animals immunized with HlGST-Cln produced detectable anti-glutathione-S-transferase antibodies. After immunization with HlGST-Cln, calves were challenged with R. microplus larva. Development of these larva produce fully engorged female tick with reduced weight and fertility. Collectively, these data show that transfected B. bovis parasites can be used as vectors in live vectored vaccines.
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Agrupamentos gênicos envolvidos na biosíntese de metabólitos secundários no fungo entomopatogênico Metarhizium anisopliae : identificação genômica e padrões de expressão em cutículas do carrapato Rhipicephalus microplus

Oliveira, Nicolau Sbaraini January 2016 (has links)
O gênero Metarhizium abriga fungos cosmopolitas que infectam hospedeiros artrópodes. Curiosamente, enquanto algumas espécies do gênero infectam um amplo espectro de hospedeiros (hospedeiro-generalistas), outras espécies infectam apenas alguns artrópodes (hospedeiro-especialistas). Esse traço evolutivo singular permite comparações únicas, a fim de determinar como patógenos e fatores de virulência surgem. Dentre os diversos fatores de virulência descritos, se destacam os metabólitos secundários que hipoteticamente desempenhem papéis essenciais na infecção fúngica. No entanto, a maioria dos genes para a produção de metabólitos secundários em Metarhizium spp. não foram ainda caracterizados, e pouco se sabe sobre a organização gênomica, expressão e regulação destes genes. A fim de melhor compreender estes aspectos, nós realizamos uma análise e descrição detalhada de agrupamentos gênicos (clusters) envolvidos na biossíntese de metabólitos secundários em M. anisopliae, analisamos dados de um estudo transcritômico onde o fungo foi cultivado em cutículas de carrapato avaliando a expressão diferencial destes clusters, bem como avaliamos a conservação destes genes entre espécies do gênero Metarhizium. Ademais, nossa análise se estendeu avaliando aspectos evolutivos e filogenéticos para três clusters: MaPKS1 cujo produto é putativamente assemelhado a tropolonas e citrininas, MaNRPS-PKS2 cujo produto é putativamente assemelhado a pseurotina e MaTERP1 cujo produto putativo é o ácido helvólico. Dentre os 73 clusters identificados no genoma de M. anisopliae, 20 % estavam positivamente regulados na condição experimental de infecção inicial, com presumível papel na virulência do fungo. Dentre os clusters positivamente regulados estão genes já caracterizados envolvidos na biossíntese de destruxinas, NG39x e ferricrocina, em conjunto com genes putativamente envolvidos na biossíntese do ácido helvólico, produtos assemelhados a pseurotina e tropolonas e citrininas, além de genes envolvidos na biossíntese de compostos desconhecidos. Curiosamente, diversos clusters positivamente regulados na condição de infecção inicial não estão presentes em espécies hospedeiro-especialistas do gênero Metarhizium, indicando que existem diferenças nas estratégias metabólicas empregadas por espécies hospedeiro-generalistas e hospedeiro-especialistas no ciclo infeccioso. Estas diferenças no potencial metabólico podem ter sido parcialmente moldadas por eventos de transferência horizontal, conforme sugere nossa análise filogenética sobre a origem do o cluster putativamente envolvido na biossíntese do ácido helvólico em Metarhizium spp. Em conclusão, diversos clusters desconhecidos são descritos e aspectos da sua organização, regulação e origem são discutidos, fornecendo evidências sobre o impacto dos metabólitos secundários no ciclo de vida e infecção de espécies do gênero Metarhizium. / The Metarhizium genus harbors cosmopolitan fungi that infect arthropod hosts. Interestingly, while some species infect a wide range of hosts (host-generalists), other species infect only a few arthropods (host-specialists). This singular evolutionary trait permits unique comparisons to determine how pathogens and virulence determinants emerge. Among the several virulence determinants that have been described, secondary metabolites (SMs) are suggested to play essential roles during fungal infection. However, the majority of genes related to SM production in Metarhizium spp. are uncharacterized, and little is known about their genomic organization, expression and regulation. To better understand these aspects, we have performed a deep survey and description of SM biosynthetic gene clusters (BGCs) in M. anisopliae, analyzed RNA-seq data from fungi grown on cattle-tick cuticles, evaluated the differential expression of BGCs, and assessed conservation within the Metarhizium genus. Furthermore, our analysis extended to the construction of a phylogeny for the following three BGCs: a tropolone/citrinin-related compound (MaPKS1), a pseurotin-related compound (MaNRPS-PKS2), and a putative helvolic acid (MaTERP1). Among 73 BGCs identified in M. anisopliae, 20% were up-regulated during initial tick cuticle infection and presumably possess virulence-related roles. These up-regulated BGCs include known clusters, such as destruxin, NG39x and ferricrocin, together with putative helvolic acid and pseurotin- and tropolone/citrinin-related compound clusters, as well as uncharacterized clusters. Interestingly, several up-regulated BGCs were not conserved in host-specialist species from the Metarhizium genus, indicating differences in the metabolic strategies employed by generalist and specialist species to overcome and kill their host. These differences in metabolic potential may have been partially shaped by horizontal gene transfer (HGT) events, as our phylogenetic analysis provided evidence that the putative helvolic acid cluster in Metarhizium spp. originated from an HGT event. In conclusion several unknown BGCs are described, and aspects of their organization, regulation and origin are discussed, providing evidence for the impact of SMs on the Metarhizium genus lifestyle and infection process.
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Caracterização da rVTDCE de Rhipicephalus (Boophilus) microplus : uma peptidase antimicrobiana

Oldiges, Daiane Patrícia January 2012 (has links)
O carrapato bovino, Rhipicephalus (Boophilus) microplus, é um artrópode hematófago, responsável por importantes perdas na pecuária. Durante o desenvolvimento do embrionário do carrapato a cisteíno endopeptidase degradadora de vitelina (VTDCE) participa do processo de hidrólise de vitelina (Vt), a principal fonte de energia e aminoácidos durante esse período. Devido à sua importância na fisiologia do parasita, a VTDCE é um alvo potencial para o desenvolvimento de vacinas anti-carrapatos. Estudos anteriores demonstraram que a VTDCE nativa, purificada de ovos confere proteção contra R. microplus, desencadeada pela resposta imune dos bovinos após a administração deste antígeno. Entretanto, o extenso e dispendioso processo de purificação desta proteína, acrescido do baixo rendimento e fonte escassa de material (ovos de carrapato) inviabiliza a utilização da proteína nativa para fins comerciais. Tais dificuldades podem ser ultrapassadas por meio do uso de uma proteína recombinante. O presente trabalho tem por objetivo a expressão, purificação e caracterização da VTDCE recombinante (rVTDCE). Parte da sequência de aminoácidos da VTDCE nativa foi obtida por sequenciamento de edman e pela análise por especrometria de massas de petídeos obtidos pelo tratamento da proteína com tripsina e. As sequências obtidas assim obtidas foram utilizadas para buscar a sequência da ORF da VTDCE em um banco de cDNA. Por meio de PCR, a ORF da enzima foi clonada em vetor de clonagem e posteriormente de expressão. A rVTDCE expressa em Escherichia coli foi purificada por cromatografia de afinidade e utilizada para determinar algumas de suas propriedades, como atividade enzimática e antimicrobiana. A atividade enzimática foi avaliada através de ensaios fluorimétricos, onde a rVTDCE mostrou características similares à VTDCE nativa. Ensaios antimicrobianos foram realizados para avaliar a possível atividade sugerida após análise da sequencia da ORF da VTDCE. A análise molecular mostrou que a sequência da VTDCE apresenta semelhança com peptídeos antimicrobianos, fato comprovado através de ensaios antimicrobianos. Efetivamente, a VTDCE apresentou atividade antimicrobiana tanto na sua forma nativa como na forma desnaturada desprovida de atividade peptidásica, demonstrando que ambas as atividades são independentes. Foram feitos também ensaios imunológicos, onde anticorpos policlonais anti-rVTDCE foram produzidos em coelhos e bovinos. Por Western blot foi observado que os anticorpos policlonais produzidos contra VTDCE recombinante reconheceram a VTDCE nativa, e o inverso também, indicando que a forma recombinante pode ser utilizada para experimentos de vacinação. / The cattle tick, Rhipicephalus (Boophilus) microplus is a hematophagous arthropod, responsible for significant losses in livestock. During the tick embryo the vitellin-degrading cysteine endopeptidase (VTDCE) participates in the vitellin (Vt) hydrolysis, the main energy source and amino acids during this period. Due to the importance of this enzyme in parasite physiology the VTDCE is a potential target for development of anti-tick vaccine. In previous studies, the immunization with native VTDCE, purified from tick egg, conferred protection against R. microplus. However, the extensive and expensive purification process, plus the low achievement precludes the use of the native protein for commercial purposes. This difficulty can be overcome by the expression of a recombinant protein in heterologous organism. This work aims the expression, purification and characterization of recombinant VTDCE (rVTDCE). Part of the native VTDCE amino acid sequence was determined by Edman sequencing. Native protein was also trypsinized and peptides sequenced by mass spectrometry. The sequences obtained from mass spectrometry and Edman sequencing were used to search the ORF sequence of VTDCE in a tick cDNA library. Through PCR enzyme ORF was cloned into a cloning vector and further into an expression vector. The rVTDCE expressed in Escherichia coli was purified by affinity chromatography and used to determine some of its properties such as antimicrobial and enzyme activity. The enzymatic activity was measured using fluorimetric assays, where rVTDCE had similar characteristics to VTDCE. Antimicrobial assays were performed to evaluate the possible activity suggested after sequence analysis. Molecular analysis showed that the sequence of VTDCE shows similarity with antimicrobial peptides, which was proven through antimicrobial assays. Effectively, the VTDCE presented antimicrobial activity even when the protein didn’t present enzymatic activity, demonstrating that both activities are independent. Immunological assays were also performed. Polyclonal anti-rVTDCE serum were produced in rabbits and cattle. Western blot showed that the polyclonal antibodies raised against recombinant VTDCE recognized the native form, indicating that the recombinant form may be used for vaccination experiments.
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Secretoma do fungo biocontrolador Metarhizium anisopliae relacionado à infecção do carrapato bovino Rhipicephalus microplus

Scherer, Karine 23 February 2016 (has links)
Submitted by FERNANDA DA SILVA VON PORSTER (fdsvporster@univates.br) on 2016-09-22T18:55:12Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) 2016KarineScherer.pdf: 501039 bytes, checksum: ba846d16b9e36cfee8ac3c7682596d48 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Paula Lisboa Monteiro (monteiro@univates.br) on 2016-09-29T19:18:09Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) 2016KarineScherer.pdf: 501039 bytes, checksum: ba846d16b9e36cfee8ac3c7682596d48 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-29T19:18:09Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) 2016KarineScherer.pdf: 501039 bytes, checksum: ba846d16b9e36cfee8ac3c7682596d48 (MD5) Previous issue date: 2016-09 / Prosup/CAPES / O controle biológico é considerado uma alternativa natural e ecológica para o controle de pragas, evitando os problemas causados pela utilização de agentes químicos. Na comparação entre as duas alternativas, o controle biológico apresenta inúmeras vantagens, principalmente quanto ao impacto ambiental, custo, manuseio, especificidade e não desenvolvimento de resistência. No entanto, os biopesticidas necessitam, na maioria das vezes, de mais tempo para efetivar o controle das pragas-alvo, quando comparado ao controle químico. Entre os microrganismos utilizados no controle biológico de pragas, o fungo Metarhizium anisopliae está entre os mais estudados e aplicados para diversas pragas, inclusive para o controle do carrapato bovino Rhipicephalus microplus, um ectoparasita hematófago responsável por grandes prejuízos econômicos no Brasil e no mundo. O estudo do processo de infecção do hospedeiro pode contribuir muito na otimização do processo de biocontrole visando a redução do tempo de morte da praga a ser controlada. Neste trabalho, utilizando shotgun proteomics e um sistema de cultura in vitro indutor do sistema de infecção, identificamos mais de 400 proteínas. Destas, 133 foram exclusivas da condição de infecção e 56 diferencialmente reguladas quando comparadas ao controle. Nestes resultados, foram identificadas proteínas responsáveis pela degradação e penetração da cutícula, além de moduladores da resposta do hospedeiro e proteção do fungo. Muitas das proteínas foram identificadas pela primeira vez neste sistema e 12 aparentemente são compartilhadas na infecção de M. anisopliae em insetos, portanto, não estando relacionadas à especificidade ao hospedeiro. Este perfil de proteínas secretadas, identificadas neste trabalho, representa uma contribuição para o entendimento da interação patógeno-hospedeiro e futuramente podem contribuir na otimização do controle biológico e na seleção de isolados mais eficientes especificamente para o carrapato bovino R. microplus. / The biological control is considered a natural and ecologic alternative to control pests avoiding the issues related to the use of chemical compounds. The biocontrol presents several benefits as the lower environmental impact, cost, handling, specificity, and the non-development of resistant pest strains. However, normally biopesticides need more time to kill and control pests when compared to chemical control. Among microorganisms used in biological control the fungus Metarhizium anisopliae is one of the most studied and applied to control several pests, including the cattle tick Rhipicephalus microplus. The understanding of the host infection process may contribute to optimize the biocontrol through the reduction of the time to kill the target pest. In this work, applying shotgun proteomics and an in vitro culture strategy to induce the infection system in R. microplus we identified more than 400 proteins. Among these proteins, 133 were exclusively identified in the infection condition and 56 were differentially regulated when compared to control. Several of these proteins are related to host-cuticle digestion and penetration, fungal defense and modulators of host immune system. Besides, many of these proteins are being reported for the first time linked to M. anisopliae infection and 12 are shared in infection of insects and probably not connected to host specificity. The secreted protein profile identified here represents a contribution to the understanding of host-pathogen interaction and may help to optimize the biocontrol and to select fungal isolates more specific and effiicent to control the cattle tick R. microplus.
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Perfil inibitório e antigenicidade da cistatina JpIocys2a de Ixodes ovatus

Sabadin, Gabriela Alves January 2015 (has links)
Cistatinas são um grupo de inibidores de cisteíno proteases que atuam na regulação da proteólise e estão presentes em uma ampla variedade de organismos. Estudos sobre essa classe de inibidores em parasitas têm contribuído para elucidar suas funções na regulação de processos fisiológicos como a digestão do sangue e a supressão da resposta imune do hospedeiro durante a alimentação. Por isso, cistatinas são um alvo interessante na pesquisa para o desenvolvimento de novos métodos de controle de parasitas. Além disso, a caracterização de proteínas compartilhadas por diferentes espécies de parasitas representa uma estratégia viável para encontrar potenciais alvos para uma vacina multi-espécie. Entretanto, as funções das cistatinas nos carrapatos permanecem obscuras, especialmente na espécie Ixodes ovatus. Neste trabalho, foi caracterizado o perfil inibitório de rJpIocys2a, uma cistatina de I. ovatus, para as catepsinas B, C e L. O perfil de inibição enzimática de rJpIocys2a se mostrou variável entre catepsinas envolvidas na digestão do sangue pelo carrapato e na evasão da resposta imune do hospedeiro. Além disso, um peptídeo baseado na sequência de aminoácidos do inibidor JpIocsy2a (STQ-pep) foi sintetizado e utilizado para imunização de coelhos. O soro anti-STQ-pep foi usado para analisar a antigenicidade cruzada entre cistatinas dos carrapatos Rhipicephalus microplus e I. ovatus. A análise da antigenicidade cruzada revelou que anticorpos gerados contra o peptídeo são capazes de reconhecer cistatinas nativas e recombinante de R. microplus. A habilidade de rJpIocys2a de inibir catepsinas relacionadas a diferentes funções sugere múltiplas funções para esse inibidor. Os resultados obtidos neste trabalho forneceram bases para outros experimentos que utilizem esta proteína como antígeno vacinal. / Cystatins are a group of cysteine protease inhibitors that act on the regulation of physiological proteolysis and are present in a wide range of organisms. Researches on this class of inhibitors in parasites have contributed to clarify their roles in the regulation of important physiological processes, such as blood digestion and suppression of the host immune response during blood feeding. Thus, cystatins are a topic of research for the development of new parasite control methods. Additionally, the characterization of proteins shared by different parasite species represents a valuable strategy to identify potential targets for a multi-species vaccine. However, cystatin functions in ticks remain undetermined, especially in Ixodes ovatus. This work characterized the inhibitory profile of rJpIocys2a, an I. ovatus cystatin, to cathepsins B, C, and L. The enzymatic inhibition profile of JpIocys2a shows a distinct modulation of cathepsins related to tick blood digestion and evasion of host immune response. In addition, a peptide from JpIocys2a amino acid sequence (STQ-pep) was synthesized and used for rabbit immunization. Anti-STQ-pep serum was used to analyze the cross-antigenicity between Rhipicephalus microplus and I. ovatus cystatins. Crossantigenicity assays revealed that antibodies against the JpIocys2a peptide are able to recognize native and recombinant R. microplus ticks cystatins. The ability of rJpIocys2a to inhibit cathepsins related to different functions suggests multiple roles for JpIocys2a. The results obtained in this work provided basis for further experiments using this protein as a vaccine antigen.
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Secretoma de Beauveria bassiana relacionado à infecção no carrapato bovino Rhipicephalus microplus

Klein, Lisete Aparecida Silva 24 November 2016 (has links)
Submitted by FERNANDA DA SILVA VON PORSTER (fdsvporster@univates.br) on 2017-06-22T18:56:45Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) 2016LiseteAparecidaSilvaKlein.pdf: 1141562 bytes, checksum: 5b220c02ace2690bb07ba88bb7aeebe6 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Paula Lisboa Monteiro (monteiro@univates.br) on 2017-06-26T18:50:11Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) 2016LiseteAparecidaSilvaKlein.pdf: 1141562 bytes, checksum: 5b220c02ace2690bb07ba88bb7aeebe6 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-26T18:50:11Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) 2016LiseteAparecidaSilvaKlein.pdf: 1141562 bytes, checksum: 5b220c02ace2690bb07ba88bb7aeebe6 (MD5) Previous issue date: 2017-06 / O controle biológico é considerado uma ferramenta natural e alternativa ecológica para superar os problemas causados pela utilização de métodos químicos no controle de pragas. Além disso, os biocontroladores apresentam inúmeras vantagens quando comparados aos seus análogos químicos, principalmente quanto ao impacto ambiental, custo, manuseio, especificidade e desenvolvimento de resistência. Entre os diversos microrganismos utilizados no controle biológico, os fungos se destacam e, entre estes, o fungo filamentoso e patógeno de artrópodes Beauveria bassiana está entre os mais estudados e aplicados. Neste estudo, utilizando proteômica e ferramentas de bioinformática, foram identificadas um total de 256 proteínas. Proteínas envolvidas em diferentes processos importantes para o biocontrole como degradação da cutícula (proteases, lipases), defesa/antioxidantes (catalases, oxidoredutases) e efetoras (glicosil hidrolases) foram observadas. A maioria destas proteínas parecem ser secretadas, seja por rotas clássicas como não clássicas. A identificação dos mecanismos moleculares de infecção do fungo em pragas específicas possibilita o entendimento mais refinado do biocontrole e, consequentemente, no desenvolvimento de estratégias para otimizar este processo. A identificação de proteínas em um sistema que mimetiza as condições de infecção possibilita a busca orientada de microrganismos mais eficientes com maior virulência e especificidade no controle biológico do artrópode R. microplus. / The biological control is considered a natural and ecological alternative tool to overcome the problems caused by the use of chemical methods in pest control. In addition, the biocontrol presents several advantages when compared to its chemical analogues, regarding to environmental impact, cost, handling, specificity and resistance development. Among microorganisms used in biological control, fungi stand out and, the filamentous fungus and arthropod pathogen Beauveria bassiana. This fungus is one of the most studied and applied worldwide. In this study, using proteomics and bioinformatics approaches, a total of 256 proteins were identified. Proteins involved in different important processes for the biocontroling, including degradation of the cuticle (proteases, lipase), defense/antioxidants (catalases, oxidoreductases) and effectors (glycoside hydrolases) were observed. The identification of the molecular mechanisms involved in the fungal infection on specific pests provides understanding of biocontrol and consequently helping to develop strategies to optimize this process. The identification of proteins in a model that mimics the infection condition enables the oriented search for more efficient micro-organisms with greater virulence and specificity in the biological control of R. microplus tick.
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Atividade acaricida, inibi??o da acetilcolinesterase e an?lise qu?mica de res?duos agroindustriais

Bispo, Jorge Luiz Peixoto 27 April 2018 (has links)
Submitted by Verena Pereira (verenagoncalves@uefs.br) on 2018-07-12T21:46:04Z No. of bitstreams: 1 JORGE LUIZ PEIXOTO BISPO.pdf: 1928389 bytes, checksum: 3d95674032c8b830a0db8b942fc740ae (MD5) / Made available in DSpace on 2018-07-12T21:46:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 JORGE LUIZ PEIXOTO BISPO.pdf: 1928389 bytes, checksum: 3d95674032c8b830a0db8b942fc740ae (MD5) Previous issue date: 2018-04-27 / The aim of this study was to analyze the in vitro efficacy of crude extracts of agroindustrial residues obtained from fruits against engorged females of Rhipicephalus microplus, using the adult immersion test. The first chapter gathers studies about the fruits used in this study and the bovine ectoparasites of economic importance. In the second chapter, the fruit residues of Spondias mombin, Tamarindus indica, Genipa americana and Citrus latifolia were submitted to maceration with ethanol to obtain the extracts. Engorged females were collected for acaricidal evaluation. The treatments consisted of six groups with extracts at 50 mg mL-1 concentration and two control groups (positive: fipronil and negative: 70 % ethanol). The extract of S. mombin fruit peel showed an acaricidal efficiency of 96.37 %. In order to investigate the mechanism of acaricide action, the in vitro effect of the extracts against acetylcholinesterase was evaluated and only the extract of the bagasse of C. latifolia showed a correlation with the acaricide effect. The extracts were monitored by high performance liquid chromatography and identified derivatives of phenolic compounds. In the third chapter, the fruit extract of S. mombin presented an acaricidal efficacy of 98.4 % at a concentration of 12.5 mg mL-1 and larvicidal efficacy of 84.8 % at a concentration of 25 mg mL-1. After fractionation of the S. mombin extract, the fraction with the major inhibition potential of the acetylcholinesterase enzyme was identified. The active fraction was analyzed by gas chromatography and a mixture of unsaturated fatty acids and terpenoids were identified, which act synergistically in the acaricidal action / O presente trabalho teve como objetivo analisar a efic?cia in vitro dos extratos bruto de res?duos agroindustriais contra f?meas ingurgitadas de Rhipicephalus microplus, utilizando o teste de imers?o de adultos. O primeiro cap?tulo re?ne estudos sobre os frutos utilizados neste trabalho e os ectoparasitos bovinos de import?ncia econ?mica. No segundo cap?tulo, os res?duos dos frutos de Spondias mombin, Tamarindus indica, Genipa americana e Citrus latifolia foram submetidos a macera??o com etanol para obten??o dos extratos. F?meas ingurgitadas foram coletadas para avalia??o acaricida. Os tratamentos foram constitu?dos por seis grupos com extratos na concentra??o 50 mg mL-1 e dois grupos controles (positivo: fipronil; e negativo: etanol 70 %). O extrato da casca do fruto de S. mombin apresentou efic?cia de 96,37 %. Com o intuito de investigar o mecanismo de a??o acaricida, foi avaliado o efeito in vitro dos extratos frente a acetilcolinesterase e apenas o extrato do baga?o de C. latifolia apresentou correla??o com o efeito acaricida. Os extratos foram monitorados por cromatografia l?quida de alta efici?ncia e identificado derivados de compostos fen?licos. No terceiro cap?tulo o extrato da casca do fruto de S. mombin apresentou uma efic?cia acaricida de 98,4 % a uma concentra??o de 12,5 mg mL-1 e efic?cia larvicida de 84,8 % a uma concentra??o 25 mg mL-1. Ap?s o fracionamento do extrato de S. mombin, foi identificada a fra??o com maior potencial de inibi??o da enzima acetilcolinesterase. A fra??o ativa foi analisada por cromatografia gasosa e identificou-se mistura de ?cidos graxos insaturados e terpen?ides, que agem sinergicamente na a??o acaricida
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Caracterização molecular da resistência de populações do carrapato dos bovinos do estado de Minas Gerais às principais bases químicas carrapaticidas

Faza, Aline Pasqualini 05 February 2013 (has links)
Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2016-03-01T11:26:21Z No. of bitstreams: 1 alinepasqualinifaza.pdf: 137982 bytes, checksum: e21d6fd4a1c5c88aa1f281694e8ca1bc (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2016-03-03T14:35:16Z (GMT) No. of bitstreams: 1 alinepasqualinifaza.pdf: 137982 bytes, checksum: e21d6fd4a1c5c88aa1f281694e8ca1bc (MD5) / Made available in DSpace on 2016-03-03T14:35:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 alinepasqualinifaza.pdf: 137982 bytes, checksum: e21d6fd4a1c5c88aa1f281694e8ca1bc (MD5) Previous issue date: 2013-02-05 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais / O monitoramento da resistência de populações do carrapato dos bovinos às bases químicas em uso tem se limitado ao perfil fenotípico, havendo escassez de registros abordando perfil genotípico da resistência para carrapaticidas no Brasil. Portanto, o presente trabalho teve como objetivo efetuar a caracterização molecular e traçar perfil genético da resistência de populações de Rhipicephalus microplus aos grupos químicos dos organofosforados e piretroides. Para tal, foram genotipadas larvas constituintes de 893 populações (587 para piretroides e 306 para organofosforados) do carrapato dos bovinos, utilizando a técnica de Reação em Cadeia da Polimerase. Foi constatado que 75,49 e 97,44% das amostras processadas apresentavam resistência para organofosforados e piretroides, respectivamente. Entre as populações resistentes a piretroides, verificou-se que 91,9% são heterozigotas, evidenciando que a maior parte das populações resistentes apresenta apenas um alelo responsável pela resistência. Assim, é possível concluir que as populações genotipadas provenientes do estado de Minas Gerais, apresentam alto grau de resistência aos organofosforados e principalmente aos piretroides. Estas informações são fundamentais para melhor compreensão dos mecanismos de resistência de R. microplus aos carrapaticidas, o que pode contribuir para aprimorar técnicas de controle. / The monitoring of the resistance of cattle tick populations in Brazil to the chemical bases in use is largely limited to investigation of the phenotypic profile. There are few studies investigating the role played by the genotypic profile in acaricide resistance in the country. Therefore, the aim of the present study was to carry out molecular characterization and trace out the genetic profile of populations of Rhipicephalus microplus with respect to resistance to the organophosphate and pyrethroid chemical groups. For that purpose, were genotyped larvae belonging to 893 populations (587 for pyrethroids and 306 for organophosphates), using the polymerase chain reaction technique. It was found that 75.49% and 97.44% of the samples studied showed resistance to the organophosphates and pyrethroids, respectively. Among the populations resistant to pyrethroids, 91.9% were heterozygotes, showing that most of the resistant populations have only one allele responsible for resistance. Therefore, it is possible to conclude that the genotyped populations have high resistance to organophosphates, and even more so to pyrethroids. This information are fundamental to understanding the mechanisms of resistance of R. microplus to acaricides, which can help to improve control techniques.
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A Combined functional genomics and in silico approach for the identification of anti-Rhipicephalus vaccine candidates

Van Zyl, W.A. (Willem Andries) January 2013 (has links)
The cattle tick, Rhipicephalus microplus, has a debilitating effect on the livestock industry worldwide, owing to its being a vector of the causative agents of bovine babesiosis and anaplasmosis. In South Africa, co-infestation of livestock with R. microplus and R. decoloratus occurs. An alternative to chemical control methods is sought in the form of an anti-tick vaccine. Using microarray technology, this study aimed at identifying genes that are shared between midgut tissues of adult female R. microplus and R. decoloratus ticks. In addition, results from another study were used and a reverse vaccinology pipeline was devised to identify putative novel vaccine candidates. Using a custom oligonucleotide microarray comprising 13 477 R. microplus sequences, 2476 genes were found to be shared between the two abovementioned tick species. In addition, 136 were found to be more abundantly expressed in R. decoloratus and 1084 in R. microplus. Chi-square analysis revealed that genes involved in lipid transport and metabolism are significantly over-represented in R. microplus and R. decoloratus. With vaccine design in mind, considering genes that are expressed in the midgut of both tick species, 6730 genes were identified and of these, 1224 are predicted to contain membrane-spanning helices. One major limitation to anti-tick vaccine discovery in the past has been a lack of candidates to evaluate, combined with limited knowledge of the transcriptome of R. microplus. This study identified a large pool of transcripts that are expressed in the midgut of both R. microplus and R. decoloratus adult females. Of these, those that are expressed in larvae, nymphs and the midgut were identified in another study and an in silico pipeline was used to predict membrane-bound protective antigens using an alignment-free approach, which led to the identification of seven proteins that were predicted to be both glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored and more likely than Bm86 to be protective antigens. Finally, epitopes were predicted and corresponding synthetic peptides were evaluated using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), resulting in the identification of three epitopes that are recognized to a greater extent than previously published Bm86 epitopes, when using murine serum raised against membrane proteins from the midgut of R. microplus. These results are significant because novel R. microplus proteins that are also present in R. decoloratus were identified. Trials using recombinant protein are under way and this will ultimately validate the experimental methodology discussed in this dissertation. Finally, regardless of whether the next-generation anti-tick vaccine has been discovered, this study also led to the identification of novel reference genes that can be used for real-time PCR experiments. / Dissertation (MSc)--University of Pretoria, 2013. / gm2014 / Biochemistry / Unrestricted
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Characterisation of the genetic diversity of the southern cattle tick, Rhipicephalus microplus, populations from South Africa

Oberholster, Tanzelle January 2014 (has links)
Rhipicephalus microplus belongs to the Ixodidae, the largest family of ticks, which are of great economic importance due to their negative socio-economic impact on agriculture (BROUQUI 2011; PORTO NETOA et al. 2011; SONENSHINE 1991). Acaricides have been the first choice in tick control for cattle farmers, but R. microplus rapidly acquires resistance to these chemicals. Replication slippage and recombination drive genetic diversity in tick populations (BAFFI et al. 2007; GUERRERO et al. 2007; LI et al. 2007); generating point mutations and frame shifts within the genes targeted by acaricides, resulting in resistance (BAFFI et al. 2007; HERNANDEZ et al. 2002; HERNANDEZ et al. 2000; JONSSON et al. 2010; MORGAN et al. 2009). In addition, resistance can quickly accumulate in a population due to the pangamy mating structure of ticks (CHEVILLON et al. 2007b; CUTULLÉ et al. 2010) and their ability to produce multiple generations within one season (BUDELI et al. 2009; LI et al. 2007). Vaccines have become increasingly important to control ticks, as acaricide resistance can be acquired by field tick populations within two years (RODRIGUEZ-VIVAS et al. 2011). Although Bm86 has been successful against multiple-acaricide resistant ticks, recent reports indicate that the Bm86 vaccine has become ineffective, possibly due to resistance (PARIZI et al. 2009). Also, Bm86 vaccines display great variability in terms of their efficacy against ticks isolated across Argentina (GARCIA-GARCIA et al. 2000; PARIZI et al. 2009). This is hypothesised to be due to the genetic variability between R. micoplus populations. The majority of phylogenetic studies on ticks have been based on slow evolving sequences, such as 18S or 28S rRNA, which provide genus-level resolution. The COI, D3, ANT and ITS2 genes have the potential to resolve intra-specific and interspecies variation, and may assist with the identification of cryptic speciation within R. microplus of South Africa (ANSTEAD et al. 2011; BARKER 1998; CAREW et al. 2009; MURRELL et al. 2000; SONGA et al. 2011). Phylogeography is a multidisciplinary field that utilises phylogenetic (molecular evidence of speciation) and population genetic principles (coalescence theory), in combination with additional data (such as geography and population history), to determine the genetic relationships of populations within a species (AVISE 2009) and was one of the main aspects of this study. The phylogenetic and population genetic structure of R. microplus will provide valuable information to geneticists, farmers and acaricide/vaccine suppliers about the different R. microplus tick populations of South Africa. The information will facilitate more efficient and targeted tick control whether acaricide or vaccine based as opposed to the inefficient approaches generally adopted to tick control. / Dissertation (MSc)--University of Pretoria, 2014. / lk2014 / Genetics / MSc / Unrestricted

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