Diversas linhagens de células de carrapatos já foram estabelecidas em outras regiões do mundo para isolamento de patógenos. O objetivo deste estudo é obter cultivos de células de Rhipicephalus sanguineus para testar o crescimento de alguns bioagentes. O primeiro capítulo trata do estabelecimento da linhagem celular e o segundo, do uso da linhagem como substrato para infecção de patógenos. Ovos de R. sanguineus foram preparados em meio L-15B e mantidos à 30 °C. Quando as células se tornaram confluentes, as culturas foram propagadas e criopreservadas. O descongelamento foi bem sucedido a partir da terceira passagem e a identidade celular foi confirmada por sequenciamento utilizando o fragmento 16S rDNA mitocondrial. As células foram infectadas com Erhlichia canis, Leishmania infantum chagasi e Trypanosoma cruzi, sendo eficientes somente para E. canis. / Several lines of embryonic cells of ticks already been established in other regions of the world, and are used to isolate and propagate pathogens. The aim of this study, is to obtain cell cultures from Rhipicephalus sanguineus to test the growth of some bioagents.The first addressing consists of the establishment of the cells and the second, using the cell lineage as a substrate for the pathogens infection. The egg masses of R. sanguineus were prepared in L-15B medium and cultures were maintained at 30 °C. When a confluent cellular monolayer was obtained, the cultures were passaged and frozen. Defrosting of cryopreserved cultures from the third passage was successful. Cell identity was confirmed by sequencing using 16S rDNA gene fragment. Cells were infected with Erhlichia canis, Leishmania infantum chagasi and Trypanosoma cruzi. Only for E. canis the cells of R. sanguineus were effective as a substrate for growth of this pathogen.

Própolis é uma substância resinosa produzida por Apis mellifera, contendo principalmente resinas vegetais e cera das próprias abelhas. É usada na colmeia para diversas finalidades, como vedar aberturas, reparar as células e envolver invasores que foram mortos na colméia, além de contribuir para a quase constância da temperatura dentro da colmeia (28 - 30oC). A própolis é importante para as abelhas, pois é responsável pela manutenção de um ambiente quase estéril, agindo contra bactérias, fungos e até larvas invasoras. Em virtude do amplo espectro de atividades biológicas e farmacológicas associadas a esse produto, a própolis vem sendo extensivamente utilizada em medicina alternativa, bem como na indústria cosmética e alimentícia. Apesar dos numerosos estudos já realizados com própolis, os poucos que foram feitos visando ao uso em veterinária relacionavam-se a combate de endoparasitas. Muitas doenças de animais vêm acometendo o homem atualmente, tais como as transmitidas pelos carrapato vermelho do cão (Rhipicephalus sanguineus) e carrapato-estrela (Amblyomma cajennense). Problemas de saúde para o gado e queda da produtividade pecuária é causada pelo carrapato do boi (Rhipicephalus microplus). Além disso, é crescente o interesse de profissionais veterinários pelo uso de produtos naturais, sobretudo em relação aos animais domésticos. Vale lembrar que o uso indiscriminado de acaricidas levou à seleção de carrapatos resistentes, de modo que outras estratégias para o controle dessas pragas são de grande importância. Com isso, o intuito do presente projeto foi a determinação da atividade de extratos brutos de própolis brasileira e seus constituintes no controle de carrapatos específicos e generalistas. Foram preparados extratos clorofórmicos de amostras de própolis verde de Lavras (MG) e própolis preta de Picos (PI), anteriormente analisadas quimicamente. Os extratos foram concentrados à secura e redissolvidos para administração a carrapatos mantidos em laboratório. Os ensaios com extratos brutos foram realizados in vitro para avaliar seu efeito nos artrópodos, empregando-se o teste de pacote de larvas. Foram realizados isolamentos biomonitorados, na tentativa de obtenção de substâncias ativas presentes nas própolis analisadas. O extrato bruto de Picos não revelou atividade acaricida. Por outro lado, o extrato bruto de Lavras mostrou-se bastante ativo e, então, foi fracionado por cromatografia em coluna de gel de sílica. As frações resultantes foram novamente avaliadas em ensaios in vitro em carrapatos. Novo fracionamento e novos bioensaios foram realizados, e foi identificada uma subfração com atividade acaricida. Análises por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) foram desenvolvidas e quatro substâncias majoritárias (ácido 2,2-dimetil-cromeno-6-propenoico-dicafeoil glucosídeo, artepilina-C, bacarina e ácido 2,2-dimetil-cromeno-8-prenil-6-propenoico) dessa subfração ativa foram isoladas em CLAE-preparativo. As substâncias obtidas foram identificadas por meio de análises espectroscópicas correntes em química de produtos naturais (IV, UV, massas e RMN). Por fim, novos bioensaios foram realizados com a espécie de carrapato mais suscetível, Rhipicephalus microplus, porém não se observou atividade acaricida significativa para as substâncias isoladas. Assim sendo, talvez a alta atividade acaricida constatada na subfração ativa seja decorrente do sinergismo entre substâncias. / Propolis is a resinous substance produced by bees Apis mellifera, containing mainly plant exudates and bee waxes. It is used in the hive to close holes, repair cells and involve intruders that are killed inside the hive. Propolis is important to the bees, as it is responsible for the maintenance of the hive as a sterile environment, acting against bacteria, fungus and even invading larvae. Because of the wide range of biological and pharmacological activities of propolis, it has been extensivelly used in alternative medicine, as well as in cosmetic and food industries. However, few studies have been developed concerning the use of propolis to animal health. Nowadays, many animal diseases have affected humans, such as those transmited by ticks, the brown dog tick (Rhipicephalus sanguineus) and the star tick (Amblyomma cajennense). Cattle health problems and decrease of livestock productivity is caused by the cattle tick (Rhipicephalus microplus). In addition, the interest of veterinary professionals toward the use of natural products to animal health is increasing, mainly for the treatment of domestic animals. It is worth remembering that the indiscriminate use of acaricides leads to resistence selection. Thus, new strategies are of great importance for tick control. Hence, the aim of this project was to determine the activity of crude extracts of Brazilian propolis and their constituents for the control of specific and generalist ticks. Chloroform extracts were prepared from samples of green propolis from Lavras (state of Minas Gerais) and black propolis from Picos (state of Piauí), previously analyzed chemically. The extracts were concentrated to dryness and redissolved for ticks administration in laboratory. The bioassays were carried out in vitro to verify the effectivness of the extracts using the larval package test. Bioassays-guided isolations were carried out to obtain active constituents presented in the studied samples. The crude extract of propolis sample from Picos did not show any acaricide activity. On the other hand, the sample propolis from Lavras showed high activity, and then was fractionated by colunm chromatography in silica gel. The fractions obtained were tested, and a subfraction with acaricide activity was obtained. Analyses by high performance liquid chromatography (HPLC) were developed and four compounds (2,2-dimethyl-cromene-6-propenoic-dicafeoyl glucoside acid, artepillin-C, baccarin and 2,2-dimethyl-cromene-8-prenyl-6-propenoic acid) of the active subfraction were isolated using preparative HPLC. These compounds were identified by means of current spectroscopic analysis in chemistry of natural products (IR, UV, mass and NMR). Finally, new bioassays were carried out with the most susceptible tick specie, Rhipicephalus microplus, but no effect was observed testing the isolated compounds. Thus, probably the high acaricidal activity observed in the active subfraction was due to a synergism among the subfraction constituents.

Carrapatos são artrópodes hematófagos de distribuição cosmopolita que parasitam vertebrados e transmitem uma grande variedade de agentes infecciosos para o homem e animais domésticos. Cobaias, diferentemente de cães e camundongos, são capazes de desenvolver resistência a carrapatos Rhipicephalus sanguineus após sucessivas infestações. Ao comparar o tipo de resposta imune desenvolvida por cobaias e cães frente a carrapatos observou-se que cobaias re-infestadas desenvolvem uma pequena reação de hipersensibilidade imediata e uma forte reação de hipersensibilidade tardia à inoculação cutânea com antígenos de carrapatos. Já em cães e camundongos, é notada somente uma forte reação de hipersensibilidade imediata. Também foi verificado que células dos linfonodos de cobaias infestadas três vezes com carrapatos (resistentes) proliferam intensamente na presença de saliva de carrapatos, diferentemente do que ocorre com células de cães e camundongos re-infestados (suscetíveis) que não proliferam. Esses achados sugerem o envolvimento de um padrão Th1 de resposta imune na aquisição de resistência, no entanto essa hipótese ainda não foi confirmada. Assim sendo, no atual trabalho procurou-se verificar a expressão de mRNA de citocinas na pele e linfonodos de cobaias infestadas e re-infestadas com carrapatos. Para tal foram delineados primers e padronizadas reações de PCR para detectar a expressão de mensagem das citocinas IL-12p40, IFN-gama e TNF-alfa, pertencentes a um padrão Th1, e IL-4, IL-5, IL-10 e TGF-beta, pertencentes a um padrão Th2 de resposta imune. Os resultados obtidos demonstraram que cobaias sucessivamente infestadas apresentaram um aumento significativo na intensidade de mensagem para IL-12p40 nos linfonodos, tanto comparado com animais uma vez infestados (aumento de 2,6 vezes), quanto comparado com os controles (aumento de 13 vezes). Embora a análise estatística não tenha apontado uma diferença significativa houve elevação consistente na intensidade de mRNA para IFN-gama nos linfonodos de cobaias re-infestadas comparadas às infestadas apenas uma vez (aumento de 2,4 vezes). Também foi observado um aumento significativo na intensidade da mensagem para IL-5 nos linfonodos de cobaias infestadas uma vez quando comparadas aos controles (aumento de 5 vezes). Não foi detectada expressão de mensagem para IL-4 e IL-10 nas amostras analisadas. Já a expressão de mensagem para TGF-beta foi observada em todos os animais (experimentais ou controles), sugerindo que essa citocina possa ter uma expressão constitutiva em cobaias. Tomados em conjunto, os resultados sugerem o envolvimento predominante de um perfil de citocinas de padrão Th1 na aquisição de resistência em cobaias a carrapatos. Nossos resultados poderão auxiliar o desenvolvimento de novas abordagens para o controle de carrapatos, como, por exemplo, sugerir adjuvantes mais adequados a serem utilizados em vacinas anti-carrapatos. O conhecimento gerado não se restringe à indução de proteção contra carrapatos como também a possibilidade de aumentar a resistência de hospedeiros a patógenos transmitidos por carrapatos que poderiam ser controlados por uma resposta tipo Th1. / Ticks are hematophagous arthropods of cosmopolitan distribution and are significant vectors of several diseases for humans and animals. Guinea pigs, unlike dogs and mice, develop resistance to Rhipicephalus sanguineus ticks after successive infestations. When the immune reaction between tick-infested guinea pigs and dogs/mice are compared, guinea pigs develop both immediate and strong delayed type hypersensitivity reactions while dogs and mice develop only a strong immediate reaction. Additionally was shown that lymph node cells from tick-infested guinea pigs (resistant hosts) proliferate intensely when cultured with tick saliva, differently to what is observed with cells from tick-infested dogs and mice (susceptible hosts). These findings propose the contribution of a Th1 cytokine pattern on the acquired immune response to ticks; however this hypothesis still has to be tested. This being so, in this study we investigated the expression profile of genes coding for selected cytokines on R. sanguineus infested guinea-pigs. Messenger RNA for IL-12-p40, IFN-gamma and TNF-alfa (Th1 cytokine pattern) and IL-4, IL-5, IL-10 and TGF-beta (Th1 cytokine pattern) was measured in skin and lymph nodes biopsies from tick-infested guinea pigs. Our results demonstrated that repeatedly tick-infested guinea pigs presented a significant increase on the intensity of message for IL-12p40 in the lymph nodes compared to both, one time tick-infested guinea pigs (raise of 2.6 times) or controls (raise of 13 times). Although the statistical analysis did not point out differences, there was a consistent increase on the mRNA intensity for IFN-gamma on the lymph nodes from re-infested guinea pigs compared to one time tick-infested animals (raise of 2.4 times). In addition, a significant enhance on the intensity of message for IL-5 on the lymph nodes from one time tick-infested guinea pigs compared to the controls (raise of 5 times). No message for IL-4 and IL-10 was detected on the analyzed tissues. In contrast, TGF-beta was detected on tissues collected from all animals (experimental or controls), suggesting a spontaneous production of this cytokine in guinea pigs. Taken together, these data suggest that a T helper 1-type pattern of cytokine production might be associated with the resistance expressed by guinea-pigs to ticks. Moreover, our results can provide new approaches to control ticks, i.e. suggest adjuvants to be added to anti-tick vaccines that preferably induce a Th1-type of response.

No Brasil, carrapatos do gênero Rhipicephalus são representados pelas espécies Rhipicephalus sanguineuss.l. (Latreille) e Rhipicephalus (Boophilus) microplus (Canestrini), sendo que a primeira espécie possui especificidade com cães domésticos e a segunda com bovinos. Para o cão, R. sanguineus s.l. é o principal vetor de agentes causadores da babesiose canina e da erliquiose, enquanto que nos bovinos, R. microplus é responsável, principalmente, pela transmissão de agentes causadores da babesiose e anaplasmose. Alguns dos patógenos causadores dessas doenças são difíceis de serem cultivados in vitro, e não crescem em meios artificiais, especialmente Anaplasma spp. Assim, muitas linhagens celulares de carrapatos foram desenvolvidas nos últimos 40 anos e têm sido amplamente utilizadas para isolamento e propagação de microrganismos patogênicos. Cultivos celulares obtidos de células embrionárias de carrapatos oferecem um sistema de vetor in vitro, que é útil principalmente para estudos de agentes intracelulares. Dessa forma, a obtenção de culturas de células embrionárias de R. sanguineus (origens tropical e temperada) e de R. (B.) microplus, bem como, sua infecção com Ehrlichia canis e Anaplasma marginale, respectivamente, são objetivos do presente estudo. Os cultivos celulares dessas espécies de carrapatos foram preparados com massas de ovos de diferentes idades e mantidos à 30 °C em meio de cultura L15-B, suplementado com 10% de Triptose Fosfato e 20% de Soro Fetal Bovino. Subcultivos foram realizados após a formação da monocamada celular confluente. As identidades celulares foram confirmadas pela PCR e sequenciamento, utilizando um fragmento do gene mitocondrial 16S rDNA. As sequências das culturas de células de R. sanguineus (tropical e temperada) e de R. microplus foram depositadas no GenBank. Essas culturas de células foram infectadas com E. canis e A. marginale (cepas Jaboticabal), respectivamente, e mantidas em meio L-15B (Vitrocell) suplementado com Soro Fetal Bovino enriquecido com ferro (Hyclone) nas concentrações de 2% e 5%. As células infectadas foram mantidas em propagações sucessivas até a terceira passagem, para novas culturas de células não infectadas, sendo então criopreservadas. O DNA extraído das células infectadas e não infectadas de R. sanguineus (de ambas as origens) e de R. microplus, foi analisado pela PCR quantitativa em tempo real (qPCR), utilizando os genes E. canis-dsb e msp1β, respectivamente. Propagações de células de carrapatos infectadas para as novas culturas de R. sanguineus (origem tropical) e R. (B) microplus, foram bem sucedidas. Por outro lado, as células de R. sanguineus (origem temperada) não se tornaram infectadas no presente estudo. / In Brazil, ticks of the genus Rhipicephalus are represented by the species Rhipicephalus sanguineus s.l. (Latreille) and Rhipicephalus (Boophilus) microplus (Canestrini), being that the first one has specificity with domestic dogs and the second with cattle. For dogs, R. sanguineus s.l. is the main vector of causative agents of canine babesiosis and ehrlichiosis, whereas in cattle, R. microplus is responsible, mainly, for the transmission of agents that cause babesiosis and anaplasmosis. Some of the pathogens that cause these diseases are difficult to grow in vitro, and do not grow on artificial media, especially Anaplasma spp. Therefore, many tick cell lines were developed in the last 40 years and have been used for the isolation and propagation of pathogenic microorganisms. Cell cultures obtained from embryonic tick cells offer an in vitro vector system, which is mainly useful for studies of intracellular agents. The aim of the present study was to obtain cultures of R. sanguineus (tropical and temperate lineages) and R. microplus embryonic cells and their infection with Ehrlichia canis and Anaplasma marginale. Cell cultures from the tick species were prepared with egg masses of different ages and kept at 30 ° C in L15-B culture medium supplemented with 10% Tryptose Broth and 20% Fetal Bovine Serum. Subcultures were done after confluent cell monolayer formation. Cellular identities were confirmed by PCR and sequencing using a 16S rDNA mitochondrial gene fragment. Sequences of R. sanguineus (tropical and temperate) and R. microplus cell cultures were deposited on GenBank. These cell cultures were infected with E. canis and A. marginale (Jaboticabal strains), respectively, and maintained in L-15B medium and Fetal Bovine Serum with iron (Hyclone) supplemented at 2% and 5% concentrations. The infected cells were maintained in successive propagations until the third passage, to new cultures of uninfected cells, and then were cryopreserved. DNA extracted from infected and uninfected R. sanguineus (both origin) and R. microplus cells was analyzed by quantitative real-time PCR (qPCR) using the E. canis-dsb and msp1β genes, respectively. Propagations of infected tick cells to the new cultures of R. sanguineus (tropical origin) and R. microplus, were successful. On the other hand, the R. sanguineus cells (temperate origin) did become infected in the present study.

Os carrapatos são artrópodes hematófagos, vetores de doenças. Vacinas são uma alternativa para o seu controle, já que esses parasitas durante a infestação, estimulam as respostas imunes do hospedeiro, as quais são implicadas em sua rejeição. As glândulas salivares do parasita são importantes para permitir a alimentação e para mediar os mecanismos de escape às defesas do hospedeiro. Diversas evidências indicam que ocorre reatividade cruzada entre espécies de carrapatos e que reações de hipersensibilidade cutânea tardia (DTH) são correlacionadas com resistência ao carrapato. A possibilidade de vacinar cachorros que são parasitados pelo R. sanguineus com antígenos do carrapato do boi, o R microplus, foi investigada por meio da análise in silico de 45 GIs de R microplus clonados em vetor plasmidial (TOPO VR2001), dentre os quais 14 Gls de R microplus se revelaram mais similares a sequências do R sanguineus, e foram empregados para avaliar: 1) A capacidade em elicitar reações cutâneas tardias em cobaias imunes a carrapatos por meio de infestações prévias com R sanguineus. 2) A capacidade de vacinas contendo GIs individuais em afetar infestações de camundongos com adultos de R sanguineus. 3) a capacidade do GI induzir anticorpos específicos após vacinação em camundongos. Dos 14 GIs testados, apenas dois não induziram reações cutâneas, quatro não afetaram nenhum parâmetro parasitológico da infestação, e três não induziram a produção de anticorpos nesses animais. Dentre os GIs, sete foram escolhidos para compor uma vacina multigênica contra o carrapato do cão R sanguineus. A vacina foi capaz de induzir resistência á infestação por R sanguineus em camundongos e em cachorros vacinados evidenciadoa pela diminuição do número de fêmeas que conseguiram colocar ovos, do peso médio da massa de ovos produzidos por essas fêmeas, do índice reprodutivo dessas fêmeas, e da taxa de eclosão das larvas, demonstrando que GIs de R microplus podem ser alvos para formulação de uma vacina contra o carrapato R sanguineus. / Ticks are arthropod vectors of disease. Vaccines are an alternative to chemicals for controlling ticks because during infestations these parasites stimulate host immune responses such as delayed hypersensitivity skin reactions (DTH), which are involved in their rejection and are correlated with resistance to ticks. Tick salivary glands are important for the parasite to acquire blood meals because their products mediate escape mechanisms from host defenses. The possibility of vaccinating dogs against infestations with the brown dog tick, Rhipicephalus sanguineus, with antigens derived from salivary glands of the cattle tick, R. microplus, was investigated by in silica analysis of 45 genes from R. microplus. These genes were targeted because of their putative biological function and had been cloned into the plasmid vector TOPO VR2001. Of them, 14 were chosen to be evaluated in a vaccine because their sequences were the most similar to several genes expressed in salivary glands of R. sanguineus. The plasmids containing the genes of interest (GIs) were used to assess: 1) The ability of the product of the genes to elicit delayed skin reactions in guinea pigs immune to ticks by previous infestations with R sanguineus. 2) The ability of individual GIs delivered as DNA vaccines to affect infestations of mice with adult R sanguineus. 3) The ability of the genes to induce specific antibodies after vaccination in mice. Only two of the 14 genes delivered to guinea pigs via intradermal injection of DNA did not elicit delayed skin reaction, four used in a vaccine did not affect any parameter of tick infestations, and three did not induce production of antibodies in these animals after DNA vaccination. Of the 14 genes, seven were chosen to formulate a multigene vaccine against the dog tick R. sanguineus. The vaccine was able to significantly affect several parameters of infestations by R sanguineus in vaccinated dogs and mice. This was reflected in the reduction of the number of females that were able to lay eggs, of the average weight of the egg mass produced by these females, of the reproductive rate of these females, and of hatching rate of larvae, demonstrating that GIs from R microplus may be targets for development of a vaccine against the tick R sanguineus.

Carrapatos são parasitas hematófagos transmissores de doenças para humanos e animais, e responsáveis por prejuízos econômicos de bilhões de dólares para os sistemas pecuários mundiais. A emergência de carrapatos multirresistentes a acaricidas torna urgente o desenvolvimento de vacinas efetivas contra este parasita. Neste trabalho, nós utilizamos dados de sialotranscriptomas de carrapatos R. microplus para selecionar antígenos secretados pelo parasita para serem testados como uma vacina multicomponente. Os antígenos produzidos de forma recombinante em E. coli foram utilizados como imunógenos em animais suscetíveis à carrapatos para testes de proteção vacinal contra infestações por R. microplus em bovinos e por R. sanguineus em cães. No primeiro ensaio, bovinos imunizados com oito antígenos recombinantes adjuvantados com um polímero sintético apresentaram indução de IgG sérica específica para cinco antígenos, e redução de 22% na infestação por carrapatos R. microplus. No segundo ensaio, a imunização de bovinos com nove antígenos adjuvantados com sais de alumínio gerou IgG específica para todos os antígenos inoculados, e proteção vacinal crescente de 70% e 75% em duas infestações sucessivas com carrapatos R. microplus, sem revacinação, indicando boost natural pela infestação. No terceiro ensaio, a imunização de cães com nove antígenos recombinantes associados à hidróxido de alumínio induziu a soroconversão de IgG dos animais para todos os antígenos, e proteção vacinal de 36% contra a infestação por carrapatos R. sanguineus. Todas as formulações afetaram principalmente o número de fêmeas ingurgitadas após a infestação. O efeito protetor de antígenos derivados de carrapatos R. microplus sobre carrapatos R. sanguineus (proteção cruzada) indica ser possível o desenvolvimento de uma vacina multicomponente efetiva contra os dois parasitas. / Ticks are hematophagous parasites which transmit diseases to humans and animals, and are responsible for billions of dollars of damage to the world\'s livestock systems. The emergence of ticks resistant to multiple acaricides makes urgent the development of effective vaccines against this parasite. In this work, we used data from the R. microplus tick sialotranscriptome to select antigens secreted by the parasite to be tested as a multicomponent vaccine. Recombinant antigens expressed in E. coli were used as antigens in tick\'s susceptible hosts to evaluate it efficacy in protect animals against R. microplus and R. sanguineus infestations. In the first assay, bovines immunized with eight recombinant antigens adjuvanted with a synthetic polymer presented the induction of serum IgG reactive for five antigens, and reduction of R. microplus infestation in 22%. In the second trial, immunization of cattle with nine antigens adjuvanted with aluminum salts generated serum IgG against all antigens, and vaccine protection against R. microplus parasitism was calculated in 70% and 75% for each infestation. In the third trial, the immunization of dogs with recombinant antigens adjuvanted with aluminum hydroxide induced IgG seroconversion against all antigens, and a 36% of protection against infestation by R. sanguineus ticks in immunized animals. All formulations reduced mainly the number of engorged females recovered from infestation. The cross reactive protection induced by R. microplus derived antigens R. sanguineus tick infestation indicate that it is possible to develop a unique multicomponent vaccine against the two parasites.

Carrapatos são parasitas hematófagos transmissores de doenças para humanos e animais, e responsáveis por prejuízos econômicos de bilhões de dólares para os sistemas pecuários mundiais. A emergência de carrapatos multirresistentes a acaricidas torna urgente o desenvolvimento de vacinas efetivas contra este parasita. Neste trabalho, nós utilizamos dados de sialotranscriptomas de carrapatos R. microplus para selecionar antígenos secretados pelo parasita para serem testados como uma vacina multicomponente. Os antígenos produzidos de forma recombinante em E. coli foram utilizados como imunógenos em animais suscetíveis à carrapatos para testes de proteção vacinal contra infestações por R. microplus em bovinos e por R. sanguineus em cães. No primeiro ensaio, bovinos imunizados com oito antígenos recombinantes adjuvantados com um polímero sintético apresentaram indução de IgG sérica específica para cinco antígenos, e redução de 22% na infestação por carrapatos R. microplus. No segundo ensaio, a imunização de bovinos com nove antígenos adjuvantados com sais de alumínio gerou IgG específica para todos os antígenos inoculados, e proteção vacinal crescente de 70% e 75% em duas infestações sucessivas com carrapatos R. microplus, sem revacinação, indicando boost natural pela infestação. No terceiro ensaio, a imunização de cães com nove antígenos recombinantes associados à hidróxido de alumínio induziu a soroconversão de IgG dos animais para todos os antígenos, e proteção vacinal de 36% contra a infestação por carrapatos R. sanguineus. Todas as formulações afetaram principalmente o número de fêmeas ingurgitadas após a infestação. O efeito protetor de antígenos derivados de carrapatos R. microplus sobre carrapatos R. sanguineus (proteção cruzada) indica ser possível o desenvolvimento de uma vacina multicomponente efetiva contra os dois parasitas. / Ticks are hematophagous parasites which transmit diseases to humans and animals, and are responsible for billions of dollars of damage to the world\'s livestock systems. The emergence of ticks resistant to multiple acaricides makes urgent the development of effective vaccines against this parasite. In this work, we used data from the R. microplus tick sialotranscriptome to select antigens secreted by the parasite to be tested as a multicomponent vaccine. Recombinant antigens expressed in E. coli were used as antigens in tick\'s susceptible hosts to evaluate it efficacy in protect animals against R. microplus and R. sanguineus infestations. In the first assay, bovines immunized with eight recombinant antigens adjuvanted with a synthetic polymer presented the induction of serum IgG reactive for five antigens, and reduction of R. microplus infestation in 22%. In the second trial, immunization of cattle with nine antigens adjuvanted with aluminum salts generated serum IgG against all antigens, and vaccine protection against R. microplus parasitism was calculated in 70% and 75% for each infestation. In the third trial, the immunization of dogs with recombinant antigens adjuvanted with aluminum hydroxide induced IgG seroconversion against all antigens, and a 36% of protection against infestation by R. sanguineus ticks in immunized animals. All formulations reduced mainly the number of engorged females recovered from infestation. The cross reactive protection induced by R. microplus derived antigens R. sanguineus tick infestation indicate that it is possible to develop a unique multicomponent vaccine against the two parasites.

Carrapatos são artrópodes hematófagos de distribuição cosmopolita que parasitam vertebrados e transmitem uma grande variedade de agentes infecciosos para o homem e animais domésticos. Cobaias, diferentemente de cães e camundongos, são capazes de desenvolver resistência a carrapatos Rhipicephalus sanguineus após sucessivas infestações. Ao comparar o tipo de resposta imune desenvolvida por cobaias e cães frente a carrapatos observou-se que cobaias re-infestadas desenvolvem uma pequena reação de hipersensibilidade imediata e uma forte reação de hipersensibilidade tardia à inoculação cutânea com antígenos de carrapatos. Já em cães e camundongos, é notada somente uma forte reação de hipersensibilidade imediata. Também foi verificado que células dos linfonodos de cobaias infestadas três vezes com carrapatos (resistentes) proliferam intensamente na presença de saliva de carrapatos, diferentemente do que ocorre com células de cães e camundongos re-infestados (suscetíveis) que não proliferam. Esses achados sugerem o envolvimento de um padrão Th1 de resposta imune na aquisição de resistência, no entanto essa hipótese ainda não foi confirmada. Assim sendo, no atual trabalho procurou-se verificar a expressão de mRNA de citocinas na pele e linfonodos de cobaias infestadas e re-infestadas com carrapatos. Para tal foram delineados primers e padronizadas reações de PCR para detectar a expressão de mensagem das citocinas IL-12p40, IFN-gama e TNF-alfa, pertencentes a um padrão Th1, e IL-4, IL-5, IL-10 e TGF-beta, pertencentes a um padrão Th2 de resposta imune. Os resultados obtidos demonstraram que cobaias sucessivamente infestadas apresentaram um aumento significativo na intensidade de mensagem para IL-12p40 nos linfonodos, tanto comparado com animais uma vez infestados (aumento de 2,6 vezes), quanto comparado com os controles (aumento de 13 vezes). Embora a análise estatística não tenha apontado uma diferença significativa houve elevação consistente na intensidade de mRNA para IFN-gama nos linfonodos de cobaias re-infestadas comparadas às infestadas apenas uma vez (aumento de 2,4 vezes). Também foi observado um aumento significativo na intensidade da mensagem para IL-5 nos linfonodos de cobaias infestadas uma vez quando comparadas aos controles (aumento de 5 vezes). Não foi detectada expressão de mensagem para IL-4 e IL-10 nas amostras analisadas. Já a expressão de mensagem para TGF-beta foi observada em todos os animais (experimentais ou controles), sugerindo que essa citocina possa ter uma expressão constitutiva em cobaias. Tomados em conjunto, os resultados sugerem o envolvimento predominante de um perfil de citocinas de padrão Th1 na aquisição de resistência em cobaias a carrapatos. Nossos resultados poderão auxiliar o desenvolvimento de novas abordagens para o controle de carrapatos, como, por exemplo, sugerir adjuvantes mais adequados a serem utilizados em vacinas anti-carrapatos. O conhecimento gerado não se restringe à indução de proteção contra carrapatos como também a possibilidade de aumentar a resistência de hospedeiros a patógenos transmitidos por carrapatos que poderiam ser controlados por uma resposta tipo Th1. / Ticks are hematophagous arthropods of cosmopolitan distribution and are significant vectors of several diseases for humans and animals. Guinea pigs, unlike dogs and mice, develop resistance to Rhipicephalus sanguineus ticks after successive infestations. When the immune reaction between tick-infested guinea pigs and dogs/mice are compared, guinea pigs develop both immediate and strong delayed type hypersensitivity reactions while dogs and mice develop only a strong immediate reaction. Additionally was shown that lymph node cells from tick-infested guinea pigs (resistant hosts) proliferate intensely when cultured with tick saliva, differently to what is observed with cells from tick-infested dogs and mice (susceptible hosts). These findings propose the contribution of a Th1 cytokine pattern on the acquired immune response to ticks; however this hypothesis still has to be tested. This being so, in this study we investigated the expression profile of genes coding for selected cytokines on R. sanguineus infested guinea-pigs. Messenger RNA for IL-12-p40, IFN-gamma and TNF-alfa (Th1 cytokine pattern) and IL-4, IL-5, IL-10 and TGF-beta (Th1 cytokine pattern) was measured in skin and lymph nodes biopsies from tick-infested guinea pigs. Our results demonstrated that repeatedly tick-infested guinea pigs presented a significant increase on the intensity of message for IL-12p40 in the lymph nodes compared to both, one time tick-infested guinea pigs (raise of 2.6 times) or controls (raise of 13 times). Although the statistical analysis did not point out differences, there was a consistent increase on the mRNA intensity for IFN-gamma on the lymph nodes from re-infested guinea pigs compared to one time tick-infested animals (raise of 2.4 times). In addition, a significant enhance on the intensity of message for IL-5 on the lymph nodes from one time tick-infested guinea pigs compared to the controls (raise of 5 times). No message for IL-4 and IL-10 was detected on the analyzed tissues. In contrast, TGF-beta was detected on tissues collected from all animals (experimental or controls), suggesting a spontaneous production of this cytokine in guinea pigs. Taken together, these data suggest that a T helper 1-type pattern of cytokine production might be associated with the resistance expressed by guinea-pigs to ticks. Moreover, our results can provide new approaches to control ticks, i.e. suggest adjuvants to be added to anti-tick vaccines that preferably induce a Th1-type of response.

Os carrapatos são artrópodes hematófagos, vetores de doenças. Vacinas são uma alternativa para o seu controle, já que esses parasitas durante a infestação, estimulam as respostas imunes do hospedeiro, as quais são implicadas em sua rejeição. As glândulas salivares do parasita são importantes para permitir a alimentação e para mediar os mecanismos de escape às defesas do hospedeiro. Diversas evidências indicam que ocorre reatividade cruzada entre espécies de carrapatos e que reações de hipersensibilidade cutânea tardia (DTH) são correlacionadas com resistência ao carrapato. A possibilidade de vacinar cachorros que são parasitados pelo R. sanguineus com antígenos do carrapato do boi, o R microplus, foi investigada por meio da análise in silico de 45 GIs de R microplus clonados em vetor plasmidial (TOPO VR2001), dentre os quais 14 Gls de R microplus se revelaram mais similares a sequências do R sanguineus, e foram empregados para avaliar: 1) A capacidade em elicitar reações cutâneas tardias em cobaias imunes a carrapatos por meio de infestações prévias com R sanguineus. 2) A capacidade de vacinas contendo GIs individuais em afetar infestações de camundongos com adultos de R sanguineus. 3) a capacidade do GI induzir anticorpos específicos após vacinação em camundongos. Dos 14 GIs testados, apenas dois não induziram reações cutâneas, quatro não afetaram nenhum parâmetro parasitológico da infestação, e três não induziram a produção de anticorpos nesses animais. Dentre os GIs, sete foram escolhidos para compor uma vacina multigênica contra o carrapato do cão R sanguineus. A vacina foi capaz de induzir resistência á infestação por R sanguineus em camundongos e em cachorros vacinados evidenciadoa pela diminuição do número de fêmeas que conseguiram colocar ovos, do peso médio da massa de ovos produzidos por essas fêmeas, do índice reprodutivo dessas fêmeas, e da taxa de eclosão das larvas, demonstrando que GIs de R microplus podem ser alvos para formulação de uma vacina contra o carrapato R sanguineus. / Ticks are arthropod vectors of disease. Vaccines are an alternative to chemicals for controlling ticks because during infestations these parasites stimulate host immune responses such as delayed hypersensitivity skin reactions (DTH), which are involved in their rejection and are correlated with resistance to ticks. Tick salivary glands are important for the parasite to acquire blood meals because their products mediate escape mechanisms from host defenses. The possibility of vaccinating dogs against infestations with the brown dog tick, Rhipicephalus sanguineus, with antigens derived from salivary glands of the cattle tick, R. microplus, was investigated by in silica analysis of 45 genes from R. microplus. These genes were targeted because of their putative biological function and had been cloned into the plasmid vector TOPO VR2001. Of them, 14 were chosen to be evaluated in a vaccine because their sequences were the most similar to several genes expressed in salivary glands of R. sanguineus. The plasmids containing the genes of interest (GIs) were used to assess: 1) The ability of the product of the genes to elicit delayed skin reactions in guinea pigs immune to ticks by previous infestations with R sanguineus. 2) The ability of individual GIs delivered as DNA vaccines to affect infestations of mice with adult R sanguineus. 3) The ability of the genes to induce specific antibodies after vaccination in mice. Only two of the 14 genes delivered to guinea pigs via intradermal injection of DNA did not elicit delayed skin reaction, four used in a vaccine did not affect any parameter of tick infestations, and three did not induce production of antibodies in these animals after DNA vaccination. Of the 14 genes, seven were chosen to formulate a multigene vaccine against the dog tick R. sanguineus. The vaccine was able to significantly affect several parameters of infestations by R sanguineus in vaccinated dogs and mice. This was reflected in the reduction of the number of females that were able to lay eggs, of the average weight of the egg mass produced by these females, of the reproductive rate of these females, and of hatching rate of larvae, demonstrating that GIs from R microplus may be targets for development of a vaccine against the tick R sanguineus.

Made available in DSpace on 2016-04-28T20:15:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2007-Raquel Moreira Pires dos Santos Melo.pdf: 931840 bytes, checksum: 8bf91d313bc9957a8e14c9fcb0238d3c (MD5) Previous issue date: 2007-02-27 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior / The purpose of this study is to follow up the morphology and biology of Rhipicephalus sanguineus after being submitted to the arthropods growth regulator fluazuron on rabbits. This study took place in the dependence of the Laboratories of Development of Parasiticides Products (LDPP) and Acari Morfophisiology (LAM), both part of the Department of Animal Parasitology of Veterinary Institute of Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro (UFRRJ), in Serop?dica, (22?44'38"S, 43?42'27"W). The growth regulators represents a new category that has been employed as ectoparasiticide on pets. This chemical group do not presents a knockdown effect, but does act slowly and gradually interfering on parasite s growth and development. The AGRs are classified as per their mechanism of action. The first group is a juvenile hormone analogue, benzoilphenil-urea inhibiting the chitin synthesis. The second are the inhibitors of deposition of chitin, triazin s and pyrimidin s derived. The FZN was the first growth regulator registered for ixodides tick s control. Four phases were analyzed; each one using ten rabbits divided in control and treated. At phase I (larvae stage), the animals were infested with R. sanguineus larvae on the ratio of 2500 larvae/rabbit. At phase II (nymph stage), with the ratio of 200 nymphs/rabbit. At phase III (adults), the animals were infested with 25 males and 25 females/rabbit. At phase IV, the infestation was done with 2500 larvae from engorged female ticks recovered on phase III. Fluazuron was applied as a pour on formulation on each phase using 10mg/kg. The experimentations during the parasitic phase had been carried through in ambient conditions, the period of August the November of 2006, and of the not parasitic phase in controlled conditions of laboratory (27 ? 1 ?C and 80 ? 10% UR, in escotofase). Parasitic and not parasitic stages of larvae, nymphs and adults were evaluated in different parameters. The FZN changed the biology of R. sanguineus, such as: increasing the pre-posture period; reducing the weight of eggs mass; increasing the incubation period of eggs; reducing the rate of reproductive efficiency, inhibiting the ecdyse process from larvae to nymph and from nymph to adult, efficacy in the inhibition of female reproduction and all recovered specimen from all the stages in the treated group showed sensible tegument, elliptical body and lethargic behavior. It is concluded that fluazuron employed in the dose of 10mg/kg of corporal weight in rabbits promoted alterations morphologies, biological and mannering in R. sanguineus that they indicate the possibility of job of this AGR in the control of this carrapato, with the particularitity in the reduction of the reinfesta??o tax. However new studies need to be carried through aiming at the effectiveness of fluazuron in the control of R. sanguineus when used in dogs. The use of rabbits was a preliminary test to indicate or not it activity of fluazuron on sanguineus carrapato R. sanguineus. / A realiza??o deste estudo teve como objetivo acompanhar a morfologia e biologia de Rhipicephalus sanguineus submetidos ao regulador de crescimento de artr?podes (AGR s), fluazuron, (FZN) em coelhos. O trabalho foi realizado nas depend?ncias dos Laborat?rios de Desenvolvimento de Produtos Parasiticidas (LDPP) e de Morfofisiologia de ?caros (LMA), ambos pertencentes ao Departamento de Parasitologia Animal do Instituto de Veterin?ria da Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro (UFRRJ), localizada no munic?pio de Serop?dica (latitude 22?44'38" sul, longitude 43?42'27" oeste). Os reguladores de crescimento representam uma nova categoria que vem sendo empregada amplamente no controle de ectoparasitos de pequenos animais. Este grupo qu?mico n?o apresenta efeito knockdown , atua de forma lenta e gradual interferindo no seu crescimento e desenvolvimento. Os AGR s foram divididos de acordo com o seu mecanismo de a??o, em an?logo s do horm?nio juvenil, benzoilfenil ur?ias - atuando na inibi??o da s?ntese de quitina e inibidores da deposi??o de quitina, derivados da triazina e da pirimidina. O FZN foi o primeiro regulador de crescimento a ser registrado para o controle de carrapatos ixod?deos O experimento foi dividido em 4 etapas, sendo que em cada uma delas utilizados 10 coelhos, divididos em grupos controle e tratado. Na etapa I (fase de larva) os coelhos foram infestados com larvas de R. sanguineus na raz?o de 2500 larvas/coelho. Na etapa II (fase de ninfa), na raz?o de 200 ninfas/coelho. Na etapa III (adultos), os coelhos foram infestados com 25 machos e 25 f?meas/coelho. Na etapa IV, os coelhos foram infestados com 2500 larvas oriundas das tele?ginas recuperadas na etapa III. A dose de FZN aplicada sob a forma pour-on em todas as etapas foi de 10mg/kg. As experimenta??es durante a fase parasit?ria foram realizadas em condi??es ambientais, no per?odo de agosto a novembro de 2006, e da fase n?o parasit?ria em condi??es controladas de laborat?rio (27 ? 1 ?C e 80 ? 10% UR, em escotofase). Foram analisados par?metros de fase parasit?ria e n?o parasit?ria, para larvas, ninfas e adultos. O FZN causou altera??es na biologia de R. sanguineus tais como: aumento no per?odo de pr?-postura, diminui??o no peso da massa de ovos, aumento no per?odo de incuba??o dos ovos, diminui??o do ?ndice de efici?ncia reprodutiva, inibi??o do processo de ecdise entre os est?gios de larva para ninfa e de ninfa para adulto, efic?cia na inibi??o da reprodu??o das f?meas e todos os est?gios recuperados do grupo tratado tinham tegumento sens?vel, corpo el?ptico e comportamento let?rgico. Conclui-se que o fluazuron empregado na dose de 10mg/kg de peso corporal em coelhos promoveu altera??es morfologias, biol?gicas e comportamentais em R. sanguineus que indicam a possibilidade de emprego deste AGR no controle desse carrapato, com a particularidade na redu??o da taxa de reinfesta??o. Entretanto novos estudos necessitam ser realizados visando a efic?cia do fluazuron no controle de R. sanguineus quando empregado em c?es. O uso de coelhos foi um teste preliminar para indicar ou n?o a atividade do fluazuron sobre o carrapato R. sanguineus.